CN105018379A - 一株具高抗氧化活性的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株具高抗氧化活性的乳酸菌，该乳酸菌命名为植物乳杆菌BLCC2-0015(Lactobacillus？plantarum？BLCC2-0015)，保藏编号为CCTCC？NO:M2015126，保藏日期为2015年3月18日，保藏于中国典型培养物保藏中心。本发明的具高抗氧化活性的乳酸菌从众多乳酸菌中筛选得到的，不仅具高抗氧化活性，还可以具有良好的耐酸耐胆盐特性。将该乳酸菌制备成菌粉后制成机体抗氧化食品或保健品，直接食用或冲服饮用，使用方便，可增强机体免疫力。

Description

一株具高抗氧化活性的植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株具高抗氧化活性的植物乳杆菌及其应用。

背景技术

生物氧化是机体新陈代谢的重要生理过程，但此过程中会产生自由基等各种活性氧分子(ROS)。尽管正常情况下，机体存在着自由基清除系统，但如果机体受到某些因素影响，自由基清除系统出现故障导致体内自由基过度产生，则会作用于机体内的蛋白质、核酸等分子，造成细胞损伤，给机体健康带来很大威胁。通过膳食中补充抗氧化物质可以增强机体的抗氧化能力，但许多化学合成的抗氧化剂存在安全问题。乳酸菌作为肠道常驻菌群，可以直接在机体氧化损伤的重点部位-肠道发挥抗氧化作用，维持肠道处于氧化还原平衡状态。并且乳酸菌在肠道定植后还能不断增殖，产生更多能够发挥抗氧化作用的乳酸菌，源源不断地在肠道扮演ROS清道夫的角色。因此乳酸菌的抗氧化作用与传统的抗氧化剂相比有更多的优势。

近些年许多体外和体内实验已证明一些乳酸菌具有良好的抗氧化活性，Li等对分离自中国传统发酵食物中的11株植物乳杆菌体内外抗氧化能力进行了研究，发现植物乳杆菌C88乳酸菌的抗氧化活性已经得到体内及体外试验的证实。能较好地缓解D-半乳糖诱导的小鼠氧化应激；Kullisaar等利用人体实验表明发酵乳杆菌ME-3具有抗氧化活性。

本研究从市售泡菜中分离得到的7株菌并对其进行抗氧化性能筛选，筛选到一株具强抗氧化性能的植物乳杆菌，分析其抗氧化机理，并对其耐受性进行研究，为将乳酸菌的抗氧化作用应用于功能性食品或保健品的开发和生产提供理论依据。

发明内容

本发明的目的之一是筛选出一株高抗氧化活性植物乳杆菌，分析其抗氧化机理，并对其耐受性进行研究，为将该菌的抗氧化作用应用于功能性食品或保健品的开发和生产奠定基础。

本发明提供一株具高抗氧化活性的植物乳杆菌，该菌命名为植物乳杆菌BLCC2-0015(Lactobacillus plantarum BLCC2-0015)，保藏编号为CCTCC NO:M2015126，保藏日期为2015年3月18日，保藏于中国武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心。

本发明还提供一种上述植物乳杆菌BLCC2-0015，在制备用于机体抗氧化的食品或保健品中的应用。

本发明再提供一种用于机体抗氧化的食品或保健品，其特征在于，包括上述植物乳杆菌BLCC2-0015。

进一步的，将所述植物乳杆菌BLCC2-0015制备成菌粉与载体混匀即可。

进一步的，所述菌粉通过以下步骤得到的：

取植物乳杆菌BLCC2-0015冻干粉菌种； 

将所述冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上活化；

取活化后的固体斜面培养基，在无菌条件下接种于种子液体培养基中，培养得到一级种 子液；

将所述一级种子液接种于另一种子液体培养基中，培养得到二级种子液；

将所述二级种子液接种于液体发酵培养基中发酵；

待所述液体发酵培养基中发酵液黏度达12000-15000cP时，收集发酵液；

将所述发酵液干燥得到菌粉成品。

进一步的，所述发酵液干燥得到菌粉成品的步骤为将所述发酵液离心并用清水清洗，如此重复2-3遍后冷冻干燥，粉碎，即为菌粉成品；或发酵结束后，将所述发酵液立即喷雾干燥，得菌粉成品。

进一步的，所述种子液体培养基包括：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L和酵母膏5g/L，调节pH至5.5-6.5，115℃条件下灭菌20min；所述得到一级种子液和所述得到二级种子液的培养条件均为30-37℃静置培养12-16h。

进一步的，所述固体斜面培养基为所述种子液体培养基中添加1.5-2.0％的琼脂粉；菌种活化条件为30-37℃培养20-30h。

进一步的，所述液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L和吐温-801mL/L，使用时，调节pH至5.5-6.5；所述发酵条件为30-37℃条件下，静置培养10-24h。

进一步的，所述一级种子液和二级种子液的接种量均为1-5％。

本发明的有益效果在于：本发明的具高抗氧化活性的植物乳杆菌从众多乳酸菌中筛选得到的，不仅具高抗氧化活性，还可以具有良好的耐酸耐胆盐特性。将该菌菌粉制成机体抗氧化食品或保健品，直接食用或冲服饮用，使用方便，可增强机体免疫力。

本发明提供的可用于抗氧化的乳杆菌命名为植物乳杆菌BLCC2-0015(Lactobacillus plantarum BLCC2-0015)，已于2015年3月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2015126。

附图说明

图1为本发明植物乳杆菌BLCC2-0015的生长曲线；

图2为菌株BLCC2-0015的菌体形态(油镜观察)；

图3为菌株BLCC2-0015PCR扩增产物琼脂凝胶电泳结果；

图4为菌株BLCC2-0015的系统进化分析；

图5为菌株BLCC2-0015对胆盐耐受性结果。

具体实施方式

下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

实施例1

1、乳酸菌的分离纯化

取适量泡菜至80mL MRS培养基中37℃富集培养20h，取培养液于含CaCO₃的MRS琼脂培养基上划线，37℃恒温静止培养24h后，挑取培养基上具有明显透明圈的单菌落，经革兰氏染色和接触酶反应，挑出革兰氏染色阳性、接触酶阴性菌株斜面保存。

2、具有抗氧化活性乳酸菌的筛选

2.1乳酸菌的培养及发酵液的制备

乳酸菌在MRS液体培养基中37℃培养24h，6000r/min，4℃离心10min，收集上清液即为发酵液。

2.2乳酸菌在不同浓度H₂O₂溶液中的耐受能力测定

在l00mL灭菌的三角瓶中加入60mL的MRS液体培养基，分别添加过氧化氧溶液，使培养基中的起始H₂O₂浓度分别为0.4mmol/L、0.7mmol/L和1.0mmol/L，并按1％的接种量接入分离所得的菌株培养液，置于37℃恒温培养箱中培养24h，取样测定值，观察每株菌在不同起始过氧化氢浓度下的生长趋势，挑选具有过氧化氢耐受性较高的菌株进行后续实验。

2.3 DPPH清除率的测定 

2mL DPPH自由基甲醇溶液(0.2mmol/L)中，加入2mL发酵液，室温避光条件下反应30min后，3000rpm离心10min，收集上清液于517nm测吸光度，以纯净水替代乳酸菌发酵液反应液作为空白对照，以纯净水与甲醇1:1比例混合液调零。

DPPH自由基清除率＝[1-A517(样品)/A517(空白)]×100％

2.4羟自由基·OH清除率的测定 

1mL的PBS(pH＝7.4)中加入1mL邻菲罗啉(2.5mmol/L)、1mL FeSO₄(2.5mmol/L)、H₂O₂(浓度为20mmol/L)，再加入0.5mL样品，37℃恒温水浴反应1.5h后，在536nm处测吸光值。

清除率(％)＝[(A₂-A₁)/(A₀-A₁)]×100％

注：A₀为不含样品和H₂O₂；A₁为不含样品，含H₂O₂；A₂为含样品和H₂O₂。

2.5超氧自由基(O₂·-)清除率的测定

浓度为3mmol/L的二乙三胺五乙酸，150mmol/L Tris-HCl(pH＝8.2)、浓度为1.2mmol/L邻苯三酚各1mL，然后加入0.5mL样品，总的反应体积为3.5mL。25℃恒温水浴中反应10min，325nm处测吸光值。

超氧阴离子清除率＝[1-(A₁₁-A₁₀)/(A₀₁-A₀₀)]*100％

注：A₀₀为不含样品和邻苯三酚的吸光值；A₀₁为不含样品，含邻苯三酚的吸光值；A₁₀为含样品，不含邻苯三酚的吸光值；A₁₁为含样品和邻苯三酚的吸光值。

3、目的菌株的液体培养及生长曲线的确定

将抗氧化性能好的目的菌株以2％接种量接种到于改良的MRS培养基中，37℃静置培养，于0h、4h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、22h、24h、28h、32h取样测定pH值以及活菌数，以培养时间为横坐标，相应的活菌数的对数值为纵坐标，绘制生长曲线，找出最适培养时间。从而确定菌株生长的各个阶段。并取处于稳定生长期的液体菌种作为种子液，进行后续试验。

4、菌株的鉴定 

4.1生理生化鉴定 

根据分离菌的菌落和菌体形态，革兰氏染色以及生理生化反应，按《伯杰氏细菌鉴定手册》进行初步归属。

4.2 16S rDNA的扩增与序列分析

目的菌株接种于新鲜的MRS培养基中培养20h，采用天根公司的试剂盒提取菌体DNA，并对其进行16S rDNA序列扩增。所用引物为通用引物：1492r 5’-ggttaccttgttacgactt-3’27f5’-agagttgatcctggctcag-3’，PCR反应体系(50μL)为：Mixture 25μL(含Taq DNA聚合酶及dNTP等)，上下游引物各1μL，模板DNA 2μL，超纯水21μL。PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，25个循环，72℃延伸10min。PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定。

4.3系统发育分析 

登录GenBank对菌株16S rDNA测序结果利用Blast进行检索，并下载相关属种的16S rDNA序列，采用DNAMAN、DNAclub、MEGA3.1等软件进行同源性分析，并构建系统进化树。

5、耐酸性试验 

取发酵20h的菌液10mL，3000r/min离心15min，弃上清，将菌体用生理盐水洗涤3次，先加人生理盐水5mL，10mol/L的盐酸调节乳酸菌的菌悬液的pH值分别为2.0、3.0、4.0，然后用生理盐水定容至10mL，于37℃处理2h。取菌悬液，在平皿上作菌落计数，从而计算出乳酸菌的存活率，以pH 5.5～6.0的菌液为对照。

存活率(％)＝(待测pH的菌液活菌数/pH 5.5～6.0的菌液活菌数)×100。

6、耐胆盐试验 

菌液按5％(v/v)接种于胆盐浓度为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％(w/v)的MRS培养基中，以不加胆盐的MRS培养基为对照，37℃培养30min，取样进行平板菌落计数，计算乳酸菌存活率。

7、抑菌试验 

将纯菌培养液以40000r/min离心30min，取其上清液。采用钢圈法做抑菌试验。将大肠杆菌O78及金黄色葡萄球菌C56011分别涂布于营养琼脂平板上，每皿均匀内置无菌钢圈3个，在其中两个钢圈内加满上清液，另一钢圈内加入灭菌生理盐水作对照。

8、试验结果与分析

8.1菌株的分离及抗氧化性能测定

8.1.1 H₂O₂耐受性测定

从市售泡菜中分离得到7株细菌菌株，分别接种于含有不同浓度的过氧化氢培养基中37℃培养24h，测定其菌体浓度(以OD600值表示)，结果见表1。

表1 乳酸菌对过氧化氢的耐受能力

从表1可以看出，7株菌对不同浓度H₂O₂敏感度不同，菌株BLCC2-0011、BLCC2-0012、BLCC2-0014、BLCC2-0015对H₂O₂耐受性较好，其中以BLCC2-0015对H₂O₂耐受性最好，选定菌株BLCC2-0015等共4株菌进行后续试验。

8.1.2 DPPH清除率的测定

选定的4株菌进行DPPH清除率的测定，结果如表2所示

表2 4株菌对DPPH清除率的测定结果

8.1.3羟自由基·OH清除率的测定 

选定的4株菌进行羟自由基·OH清除率的测定，结果如表3所示

表3 4株菌对羟自由基·OH清除率的测定结果

8.1.4超氧自由基(O2·-)清除率的测定

选定的4株菌进行超氧自由基(O2·-)清除率测定，结果如表4所示

表4 4株菌对超氧自由基(O2·-)清除率的测定结果

综合表1、2、3、4结果可知，菌株BLCC2-0015具较强抗氧化性能，故选择菌株BLCC2-0015作为目的菌株进行后续实验。

8.2目的菌株的生长曲线

菌株BLCC2-0015的生长曲线如图1所示。

由图1可以看出，在2～10h内菌体生长迅速，在4h左右进入对数期，随后进入稳定期，且持续时间较长，并在24h时活菌数达到最大值2.62×10⁹cfu/ml。菌体在稳定期内各生长因 素达到最高值，故选择培养时间为24h的菌液作为种子液进行试验是正确的。

8.3目的菌株的鉴定

8.3.1目的菌株的生理生化特性

菌株BLCC2-0015在MRS琼脂培养基上生长22h，形成明显乳白色、圆形菌落，中央凸起，边缘光滑，具一定的黏性。如图2所示为菌株BLCC2-0015的菌体形态，显微镜下观察呈杆状，两端钝圆，革兰氏染色阳性。

主要生理生化性质测试结果如表5和6所示。

表5 菌株BLCC2-0015糖发酵试验结果

注：“+”为阳性反应,“—”为阴性反应

表6 菌株BLCC2-0015的部分生理生化性质

注：“—”为阴性反应

根据上述生理生化特性及形态特征，参考《常见细菌系统鉴定手册》，本试验中分离得到的菌株BLCC2-0015与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)基本相同，因此将该菌株初步鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

菌株BLCC2-0015的16S rDNA序列分析

菌株BLCC2-0015的16S rDNA PCR电泳图如图3所示，条带在1000～2000bp之间，约为1500bp。

将菌株BLCC2-0015的16S rDNA序列在NCBI中进行BLAST比对分析后发现其与Lactobacillus plantarum有较高的同源性(100％)。从Genebank中调取并下载相似性最大和该属内其它种相关的16S rDNA，利用MEGA3.1软件的Neighboring-joining方法构建系统发育树，如图4所示。

从图4中可知菌株BLCC2-0015与Lactobacillus plantarum自然聚为一支，经过同源性比对发现菌株BLCC2-0015的与Lactobacillus planttarum的16S rDNA序列同源性超过99％。一般来讲，在种分类等级上，如果2个分类单位间的16S rDNA序列同源性大于97.5％，则认为属于同一个种。综合菌株BLCC2-0015的生理生化特点及16S rDNA系统进化分析，确定该菌株为乳杆菌属(Lactobacillus)的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

8.4耐酸性试验 

菌株BLCC2-0015的耐酸性试验结果如表7所示

表7 菌株BLCC2-0015耐酸性试验结果

由表7可以看出菌株BLCC2-0015在pH值2.0、3.0、4.0时的存活率分别为85.2％、90.9％、97.7％，说明该菌具有较强的耐酸性。

8.5耐胆盐试验 

菌株BLCC2-0015的耐胆盐试验结果如图5所示。

益生菌只有能耐受一定的胆盐浓度，才能在肠道内定植。由图5看出菌株BLCC2-0015在胆盐浓度为0.1％环境中存活率为100％，随着胆盐浓度的增大存活率明显下降，在胆盐浓度0.3％时，存活率为54.7％，其存活率超过50％,因此能够在肠道内增殖。在胆盐浓度为0.4％时存活率仍可达到37.2％，由此可以看出菌株BLCC2-0015具较好的耐胆盐效果。

8.6抑菌试验

菌株BLCC2-0015对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制结果如表8所示

表8 菌株BLCC2-0015发酵液对致病菌的抑制试验结果(Φ：mm)

实施例2

1.实验菌株

选用植物乳杆菌Lactobacillus plantarum BLCC2-0015。

2.培养基

种子液体培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L和酵母膏5g/L，调节pH至6.0(5.5-6.5范围即可)，115℃条件下灭菌20min；固体斜面培养基为种子液体培养基中添加1.5％(1.5-2.0％范围内均可)的琼脂粉。

液体发酵培养基配方为：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L和吐温-801mL/L，使用时，调节pH至6.0(5.5-6.5范围即可)。

3.实验步骤

(1)将冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上，在37℃培养24h进行活化(30-37℃，20-30h)；

(2)取培养好的固体斜面培养基，在无菌条件下接种于种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养12h(30-37℃，12-16h)，制得一级种子液；

(3)按5％(1-5％范围内均可)的接种量，将一级种子液接种于种子液体培养基中，在37℃条件下，静置培养12h(30-37℃，12-16h)，制得二级种子液；

(4)按5％(1-5％范围内均可)的接种量，将二级种子液接于液体发酵培养基中，在 37℃条件下，静置培养24h(30-37℃，10-24h)；

(5)待发酵液黏度达12000-15000cP时，收集发酵液；

(6)发酵结束后，立即将发酵液离心并用清水清洗，如此反复2-3遍后冷冻干燥，粉碎，即为菌粉成品；或发酵结束后，立即喷雾干燥，即得菌粉成品。

一种用于机体抗氧化的食品或保健品，包括植物乳杆菌BLCC2-0015和载体，将植物乳杆菌BLCC2-0015制备成菌粉与载体混匀即可。

本发明的具高抗氧化活性的乳酸菌从众多乳酸菌中筛选得到的，不仅具高抗氧化活性，还可以具有良好的耐酸耐胆盐特性。将该乳酸菌制备成菌粉后制成机体抗氧化食品或保健品，直接食用或冲服饮用，使用方便，可增强机体免疫力。

本文虽然已经给出了本发明的一些实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围的限定。

Claims (10)

1.一株具高抗氧化活性的植物乳杆菌，其特征在于：该菌命名为植物乳杆菌BLCC2-0015(Lactobacillus plantarum BLCC2-0015)，保藏编号为CCTCC NO:M2015126，保藏日期为2015年3月18日，保藏于中国典型培养物保藏中心。

2.如权利要求1所述的植物乳杆菌BLCC2-0015，在制备用于机体抗氧化的食品或保健品中的应用。

3.一种用于机体抗氧化的食品或保健品，其特征在于，包括权利要求1所述的植物乳杆菌BLCC2-0015。

4.如权利要求3所述的用于机体抗氧化的食品或保健品，其特征在于，将所述植物乳杆菌BLCC2-0015制备成菌粉与载体混匀即可。

5.如权利要求4所述的用于机体抗氧化的食品或保健品，其特征在于，所述菌粉通过以下步骤得到的：

取植物乳杆菌BLCC2-0015冻干粉菌种；

将所述冻干粉菌种接种于固体斜面培养基上活化；

取活化后的固体斜面培养基，在无菌条件下接种于种子液体培养基中，培养得到一级种子液；

将所述一级种子液接种于另一种子液体培养基中，培养得到二级种子液；

将所述二级种子液接种于液体发酵培养基中发酵；

待所述液体发酵培养基中发酵液黏度达12000-15000cP时，收集发酵液；

将所述发酵液干燥得到菌粉成品。

6.如权利要求5所述的用于机体抗氧化的食品或保健品，其特征在于，所述发酵液干燥得到菌粉成品的步骤为将所述发酵液离心并用清水清洗，如此重复2-3遍后冷冻干燥，粉碎，即为菌粉成品；或发酵结束后，将所述发酵液立即喷雾干燥，得菌粉成品。

7.如权利要求6所述的用于机体抗氧化的食品或保健品，其特征在于，所述种子液体培养基包括：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L和酵母膏5g/L，调节pH至5.5-6.5，115℃条件下灭菌20min；所述得到一级种子液和所述得到二级种子液的培养条件均为30-37℃静置培养12-16h。

8.如权利要求7所述的用于机体抗氧化的食品或保健品，其特征在于，所述固体斜面培养基为所述种子液体培养基中添加1.5-2.0％的琼脂粉；菌种活化条件为30-37℃培养20-30h。

9.如权利要求8所述的用于机体抗氧化的食品或保健品，其特征在于，所述液体发酵培养基包括：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸铵2g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L和吐温-801mL/L，使用时，调节pH至5.5-6.5；所述二级种子液的发酵条件为30-37℃条件下，静置培养10-24h。

10.如权利要求9所述的用于机体抗氧化的食品或保健品，其特征在于，所述一级种子液和所述二级种子液的接种量均为1-5％。