CN107586731A - 一种酿酒酵母及其在水果酵素产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SITCC No.20012，其保藏编号为CCTCC M 2017367，其胞内物质、代谢产物中的DPPH自由基清除率分别为3.2%、30.6%。将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SITCC No.20012用于水果酵素产品的第一次发酵，沪酿1.01醋酸菌第二次发酵，所得的水果酵素产品酒精度均小于0.5%，DPPH自由基清除率较自然发酵的水果酵素产品至少提高40%，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SITCC No.20012在水果酵素产品中具有非常好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种酿酒酵母，特别涉及一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012及其在水果酵素产品中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
氧化应激是指机体遭受各种有害刺激，打破体内氧化与抗氧化体积、系统之间的平衡关系，导致自由基产生过多或清除能力下降，从而引起细胞衰老死亡。氧化应激是自由基在体内产生的一种负面作用，是导致衰老的一个重要因素，因而，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(以下简称DPPH)自由基清除率是抗氧化性的一个重要指标。研究表明，抗氧化剂是一类能够干扰自由基链式反应及扩散过程，并抑制自由基反应过程、延缓衰老作用的化合物。常用的抗氧化剂主要是通过化学合成的，然而近年来的研究证实，许多化学合成的抗氧化物存在安全问题。随着安全和健康意识的提高，人们越来越青睐于天然的功能性食品和绿色药品。所以研究开发天然抗氧化功能性食品就成为一大趋势。
微生物来源的抗氧化剂是当下研究的热点，随着科学技术不断发展以及研究方法的多样化和实用化，高抗氧化活性的菌株大量被发现。酵母菌一般指的是能够发酵糖类的各类单细胞真菌，在人类的历史长河中，酵母菌是被我们的祖先最早利用起来的微生物，被广泛应用于发酵食品中，而且在发酵过程中，可以代谢出对人体有益的各种物质。研究证实，酵母菌具有不同的抗氧化活性，在合适条件下，这些具有氧化活性的菌种，有可能成为应用微生物学和科学食品工业的理想材料。
酵素产品是近年来新兴起来的食品品类，是含有丰富的维生素、矿物质和次生代谢产物等营养成分的功能性微生物发酵产品。但就目前而言，酵素产品中大多采用自然发酵的方式生产，存在发酵时间长、发酵不可控等缺陷。研究表明，将酵母菌应用于酵素产品的生产，不仅能很大程度上改善食品的风味，还可以增加产品的生物活性，提高产品的整体可接受性。但酵母菌在发酵过程中会产生一定的酒精，限制了其在饮料产品中的应用，故一般需要与醋酸菌共同作用，将一部分酒精转化为醋酸。故筛选具有生物活性且产酒精度低的酵母菌生产兼具生物活性的酵素食品具有十分重要的研究意义和价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对现有技术中缺乏高抗氧化性的酵母菌的不足，提供一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012及其在水果酵素产品制备中的应用。
本发明的技术方案
一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012，属于酵母菌属的菌株，该菌株是从黄酒酒糟中筛选的高抗氧化性的酵母菌野生菌株，并通过DPPH自由基清除法确定菌株具有抗氧化性，该菌种已保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，邮编：430072，保藏日期：2017年6月23日，其保藏编号为CCTCC.M 2017367。
上述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012具有如下微生物学特征：
(1)、菌落特征：
菌株在PDA平板上划线分离，30℃厌氧培养48-72h，菌株生长良好。菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色。
(2)、菌体特征：
菌体呈球形或者卵形，比细菌的单细胞个体要大得多，直径一般为5–10μm。
(3)、培养特征：
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012在25-34℃生长温度最佳；最高和最低初始生长pH为8.0和3.0，最适生长初始pH为4.0；
菌株SITCC No.20012在6h进入对数生长期，26h达到稳定期。
(4)、遗传学特征
与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012同源性最高菌株的是Saccharomyces cerevisiae strain CEC Y518(Sequence ID：JN083824.1)，同源性为99％，其16S rDNA见SEQ IDNO：1。
上述的一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012，由于来源于传统发酵食品，属公认安全(Generally Recognized As Safe，GRAS)菌种，且由于其具有高DPPH自由基清除率，因此可在发酵食品制备中应用，其中，所述的发酵食品是水果酵素产品，优选为苹果酵素、梨酵素、草莓酵素或黄桃酵素等。
上述的一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012在水果酵素产品制备过程中的应用，具体包括如下步骤；
(1)、发酵原料液的制备
将浓缩果汁用纯净水按体积比计算，浓缩果汁：纯净水为1：5-10的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0-7.0，然后控制温度为95℃进行灭菌20min，然后自然冷却至37-40℃，即得到发酵原料液；
所述的浓缩果汁为浓缩苹果汁、浓缩梨汁、浓缩黄桃汁或浓缩草莓汁等，优选为德乐食品饮品配料上海有限公司生产；
葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为0.5-5g：100mL的比例计算；
上述优选的，浓缩果汁：纯净水为1：6的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0，然后控制温度为95℃进行灭菌20min，然后自然冷却至40℃，即得到发酵原料液；
葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为2g：100mL的比例计算；
(2)、菌种活化
①、用接种环取无菌水溶解的冷冻干燥管保存的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SITCC No.20012菌种一环在PDA琼脂培养基平板上划线，在30℃培养箱中培养36-72h至长出单菌落，即得到平板活化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012菌菌种；
②、用接种环取无菌水溶解的沪酿1.01醋酸菌菌种一环在醋酸菌琼脂培养基平板上划线，在30℃培养箱中培养36-72h至长出单菌落，即得到平板活化沪酿1.01醋酸菌菌种；
(3)、工作发酵剂的制备
①、酿酒酵母工作发酵剂的制备
用接种环取步骤(2)中①所得的平板活化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012菌菌种一环接入装有50mL MEB肉汤液体培养基的250mL规格的三角瓶中，置于30℃的培养箱中控制转速100-150rpm培养24-36h，优选的在控制转速120rpm培养26h，得到酿酒酵母培养液；
将所得的酿酒酵母培养液控制转速为4000-6000rpm进行离心15-30min，优选为5000r/min进行离心20min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液1(所述的无菌磷酸盐缓冲溶液1，按每升计算，含磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g、氯化钾0.2g，余量为蒸馏水，121℃灭菌20min，冷却并在4℃下保存)清洗2-3次，然后在清洗后的沉淀中加入再加入无菌磷酸盐缓冲溶液2(同上述无菌磷酸盐缓冲溶液1)经4000-6000rpm，优选5000rpm下涡旋震荡重悬菌体，得到酿酒酵母工作发酵剂，无菌磷酸盐缓冲溶液2的加入量以保证所得的酿酒酵母工作发酵剂中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012的活菌数至少为109cfu/mL为标准；
②、沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂的制备
用接种环取步骤(2)中②所得的平板活化沪酿1.01醋酸菌菌种一环接入装有50mL醋酸菌液体培养基的250mL规格的三角瓶中，置于30℃的培养箱中控制转速100-150rpm恒温培养24-36h，优选120rpm恒温培养36h得到沪酿1.01醋酸菌培养液；
将所得的沪酿1.01醋酸菌培养液控制转速为4000-6000rpm进行离心15-30min，优选转速为5000rpm进行离心20min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液3(同上述无菌磷酸盐缓冲溶液1)清洗2-3次，然后在清洗后的沉淀中加入无菌磷酸盐缓冲溶液4(同上述无菌磷酸盐缓冲溶液1)经4000-6000rpm，优选5000rpm下涡旋震荡重悬菌体，得到沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂，无菌磷酸盐缓冲溶液4(同上述无菌磷酸盐缓冲溶液1)的加入量以保证所得的沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂中沪酿1.01醋酸菌的活菌数至少为107cfu/mL为标准；
(4)、发酵培养
按体积百分比计算，接种量1-5％的比例，将步骤(3)中①所得的酿酒酵母工作发酵剂接种入到步骤(1)所得的发酵原料液中，然后控制35-40℃，转速为100-200rpm，进行第一次发酵24-72h，得到含有酿酒酵母的第一次发酵液；优选按1％的接种量将酿酒酵母工作发酵剂接种入到步骤(1)所得的发酵原料液中，然后控制温度为37℃，转速为100rpm，进行第一次发酵42h，从而提高发酵液中DPPH自由基清除率，即得到含有酿酒酵母的第一次发酵液；
然后，按体积百分比计算，接种量1-10％的比例，将步骤(3)中②所得的沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂接种入上述所得的含有酿酒酵母的第一次发酵液中，控制温度为25-35℃、转速为100-200rpm进行第二次发酵12-36h，第二次发酵的目的是除去含有酿酒酵母的第一次发酵液中大部分的酒精，使酒精含量低于0.5％，最终得到含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的水果酵素产品；
优选按含有酿酒酵母的第一次发酵液体积的1％的比例，向含有酿酒酵母的第一次发酵液中加入沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂，控制转速为200rpm，温度为25℃，进行第二次发酵12h。
上述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的胞内物质中的DPPH自由基清除率为3.2％，代谢产物中的DPPH自由基清除率为30.6％，因此酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012可用于水果酵素产品制备中进行应用，特别是在苹果酵素、草莓酵素、梨酵素及黄桃等水果酵素产品制备中的应用。
本发明的有益效果
本发明的一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012，经试验证明它具有DPPH自由基清除能力，其胞内物质中的DPPH自由基清除率为3.2％，代谢产物中的DPPH自由基清除率为30.6％，因此可以用于水果酵素产品制备中的进行应用；特别是在苹果酵素、黄桃酵素、梨酵素或草莓酵素等水果酵素制备中的应用。
进一步，本发明的一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012用于水果酵素产品制备过程中，由于制备过程中利用低温杀菌、严格控制发酵温度，有效的降低了水果酵素产品营养成分的损失，最大限度的保留了水果酵素的活性。
更进一步的，利用本发明的一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012发酵的水果酵素产品，其DPPH自由基清除率比自然发酵的水果酵素产品至少提高40％，且发酵时间短，发酵过程可控，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012在发酵过程中酒精产量低(酒精度为1.5％)，进一步通过其沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂协同作用的二次发酵，最终所得水果酵素产品酒精含量低于0.5％，因此该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012在酵素产品尤其是水果酵素产品中有非常好的应用前景。
附图说明
图1、实施例2中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的细胞形态(×1600)；
图2、实施例3中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的生长曲线；
图3、实施例3中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012在不同温度下培养的培养液的OD600nm值情况；
图4、效果实施例1-4得到的应用实施例1-4含有酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SITCC No.20012的水果酵素产品和相应对比实施例1-4中的空白水果酵素产品对DPPH自由基清除率的柱状图对比情况。
具体实施方式
下面通过具体的实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。
本发明各实施例中所用的高DPPH自由基清除率的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株SITCC No.20012，其生物学名称为：Saccharomyces cerevisiae，于2017年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。邮编：430072，其保藏编号为CCTCC M 2017367。
本发明各实施例中所用的沪酿1.01醋酸菌为巴氏醋酸杆菌巴氏亚种Acetobacterpasteurianus subsp.Pasteurianus De Ley et Frateur，购买自上海市酿造科学研究所。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
本发明的各实施例中所用的无菌磷酸盐缓冲溶液1、2、3、4相同，以无菌磷酸盐缓冲溶液1为例，按每升计算，含磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g、氯化钾0.2g，余量为蒸馏水，121℃灭菌20min，冷却并在4℃下保存待用，其配制方法如下：
分别称取磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g、氯化钾0.2g，用蒸馏水定容到1L，121℃灭菌20min，冷却并在4℃下保存，即得到无菌磷酸盐缓冲溶液1。
PDA琼脂培养基(酵母菌选择性培养基，北京陆桥公司购得)；
MEB肉汤液体培养基(酵母菌选择性培养基，北京陆桥公司购得)；
醋酸菌琼脂培养基的配制(1L)：酵母粉10g、葡萄糖10g、琼脂20g、碳酸钙10g，用蒸馏水定容到1L，121℃灭菌20min，冷却至60-70℃，然后加入3-4％(v/v)的食用酒精；
醋酸菌液体培养基的配制(1L)：酵母粉10g、葡萄糖10g，用蒸馏水定容到1L，121℃灭菌20min，冷却至60-70℃，然后加入3-4％(v/v)的食用酒精。
本发明的实施例中采用的DPPH自由基清除法，见“钟远声,李熙灿,谢学明,等.荜茇清除DPPH自由基能力的研究[J].辽宁中医药大学学报,2007,9(1):144-145.”。
本发明各实施例中所用的原料浓缩果汁如浓缩苹果汁、浓缩梨汁、浓缩草莓汁、浓缩黄桃汁等，为德乐食品饮品配料上海有限公司生产。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。
实施例1
一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株SITCC No.20012的采集、分离，步骤如下：
(1)、样品采集
从自然发酵果蔬制品、传统发酵乳制品(乳扇、乳饼、酸奶、酸马奶酒等)、生牛乳、生面团、开菲尔粒(藏灵菇)、青贮饲料、黄酒酒糟等中取样。将收集的样品放入冰盒内冷藏，保持在较低温度下带回实验室并放置于4℃冰箱内，尽快将乳酸菌进行分离；
(2)、样品预处理
取固体样品10g(液体样品20mL)放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶(含玻璃珠)中，振荡后静置20min，备用。
(3)、具有高DPPH自由基清除能力酵母菌的初步分离
使用无菌水以体积计按照1:10对上述样品进行连续稀释，在每个稀释度取0.1mL稀释样品，分别涂布PDA琼脂平板在30℃兼性厌氧条件下恒温培养36-72小时，用无菌牙签挑取粘稠且有明显拉丝的单菌落。然后在相应的琼脂平板上划线分纯，得到纯的单菌落。纯化菌株保藏在相应的分离培养基中，添加30％的甘油作为保护剂，-20℃冻存。
不同样品在PDA琼脂培养基共分离出367株菌。这些菌株在分离平板上表现出粘丝状、粘稠状和粘液状。
(4)、菌株代谢产物中的DPPH自由基清除率
将从平板上得到的分离株接种到MEB肉汤液体培养基中，在30℃培养30h。4℃4000rpm离心15min，取上清液，采用DPPH自由基清除法测定菌株代谢产物的抗氧化性。实验结果列于下表1中；
表1.具有高DPPH自由基清除率的酵母菌的初步分离(30℃，30h培养)
| 菌株 | 自由基清除率(％) |
| 1# | 20.45±0.50 |
| 2# | 20.19±0.32 |
| 3# | 29.23±0.60 |
| 4# | 30.60±0.21 |
| 5# | 29.01±0.51 |
| 6# | 28.35±0.09 |
| 7# | 25.41±0.08 |
| 8# | 21.59±0.15 |
| 9# | 19.44±0.24 |
| 10# | 21.46±0.25 |
| 11# | 29.16±0.41 |
| 12# | 21.17±0.35 |
| 13# | 27.98±0.47 |
| 14# | 27.68±0.35 |
| 15# | 22.42±0.62 |
| 16# | 28.56±0.70 |
| 17# | 19.14±0.09 |
| 18# | 18.82±0.13 |
| 19# | 26.91±0.42 |
| 20# | 18.92±0.31 |
从表1中可以看出，菌株3#、4#、5#、6#、11#、13#、14#、16#的代谢产物的抗氧化性较高，结合菌落的拉丝性能，选取这几株菌进行复筛。
(5)、酵母菌的复筛
将菌株3#、4#、5#、6#、11#、13#、14#、16#分别接种到无菌果汁中，37℃下发酵42小时，测其DPPH自由基清除率及酒精度，情况见下表2。
表2酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株SITCC No.20012的复筛(37℃，42h发酵)
| 菌株 | DPPH自由基清除率(％) | 酒精度(％) |
| 3# | 71.55±0.5 | 2.5±0.10 |
| 4# | 76.76±0.04 | 1.5±0.05 |
| 5# | 73.98±0.08 | 1.7±0.10 |
| 6# | 69.34±0.6 | 2.6±0.15 |
| 11# | 70.9±0.5 | 1.9±0.00 |
| 13# | 73.27±0 | 3.7±0.25 |
| 14# | 60.24±0.3 | 3.1±0.05 |
| 16# | 72.34±0.2 | 2.1±0.25 |
根据表2中发酵液的DPPH自由基清除率及酒精度，最终选取菌株4#，并名为菌株SITCC No.20012。
实施例2
将实施例1的菌株SITCC No.20012进行微生物学鉴定
(1)、菌落特征：
菌株在PDA平板上划线分离，30℃厌氧培养48-72h，菌株生长良好。大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色；
(2)、菌体特征：
菌株SITCC No.20012菌体呈球形或者卵形，具体见图1所示，比细菌的单细胞个体要大得多，直径一般为5–10μm；
(3)、培养特征：
菌株SITCC No.20012在25-34℃生长温度最佳；最高和最低初始生长pH为8.0和3.0，最适生长初始pH为4.0；菌株SITCC No.20012在6h进入对数生长期，26h达到稳定期；
(4)、遗传学特征
菌株SITCC No.20012基因组DNA提取方法：
挑取纯化的菌株SITCC No.20012单菌落接种到10mL MEB液体培养基中，30℃培养24h后将菌液离心(4000rpm，15min)收集菌体。采用基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取。PCR扩增采用两种合成的通用引物(26s NL1:GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG，具体见SEQ IDNO：2；16s NL4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG具体见SEQ IDNO：3)PCR产物采用柱式PCR产物纯化试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)回收，纯化后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。所得菌株SITCC No.20012的26s DNA核苷酸序列为607bp(序列表中的SEQ ID NO：1)，送GenBank(GenBank accetion number：GQ359860)做Blast分析。菌株SITCC No.20012同源性最高菌株的是Saccharomycescerevisiae strain CEC Y518(Sequence ID：JN083824.1)，同源性为99％；
根据Goodfellow和O′Donnell所说的DNA的G+C(mol％)≤10％～12％及26S rDNA的序列同源性≥95％的种可归为一个属，并且Embley和Stackebrangdt认为当26S rRNA的序列同源性≥97％时可以认为是一个种。由此可以推断：菌株SITCC No.20012与Saccharomyces cerevisiae strain CEC Y518属于同一个种，即菌株SITCC No.20012鉴定为酿酒酵母菌。
依据形态特征、生理生化特征等微生物学特性及其遗传特性26S rDNA对菌株SITCC No.20012鉴定为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，该菌株已于2017年6月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，其保藏编号为CCTCC M 2017367。
实施例3
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的生长特性
(1)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的生长曲线的绘制
将活化好的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012按2％(v/v)接种量接入MEB液体培养基中，30℃恒温培养30h，每隔1-2h在600nm测定培养液的OD值，以OD值对时间作图得到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012在MEB液体培养基中的生长曲线，结果如图2所示，从图2中可以看出：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SITCC No.20012在MEB液体培养基中6h左右进入对数期，26h左右进入稳定期。
(2)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的最适生长温度测定
将活化好的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012按2％(v/v)接种量分别接于10mL MEB液体培养基中，分别置于26℃、30℃、32℃和34℃条件下恒温培养24h，以未接种的MEB液体培养基作对照，于600nm测定不同温度下培养的培养液的OD值，依据OD值的大小确定最适生长温度。结果如图3所示，从图3中可以看出酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012在26℃-34℃生长良好，最适生长温度为30℃。
实施例4
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012胞内物质中的DPPH自由基清除率测定，具体步骤如下：
(1)、菌种活化：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012接种于MEB液体培养基中，在30℃条件下培养26h进行活化，连续活化两代所得的菌种活化液控制温度为4℃、转速为10000r/min离心20min，弃上清液，所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液1重悬，使OD600nm＝1，得到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012细胞重悬液；
然后，按体积比计算，加入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012细胞重悬液2％(v/v)的蜗牛酶(购买于生工生物工程(上海)股份有限公司，为褐色粉末(冻干粉)、其淀粉酶活力为0.54U/g、纤维素酶活力为5.40U/g)，在37℃下，控制频率为50Hz，功率为200W进行超声破碎2h，每处理2s停顿2s，在显微镜下观察细胞形态，可以看出无完整细胞结构；
超声破碎结束后，控制温度为4℃条件下，10000r/min离心20min，取上清液作为待测样品液，待用；
(2)、用DPPH清除自由基法测酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012胞内物质中的抗氧化活性即DPPH自由基清除率，具体步骤如下：
①、先进行预实验，取0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液2mL，往其中加入步骤(1)所得的待测样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下待测样品液的加样量，即为最大加样量；
取最大加样量的一半测其DPPH自由基清除率；
②、分别取最大加样量的一半的待测样品液于多孔板的A1、B1孔中，并在A1、B1孔中分别加入与待测样品液体积相等的无水乙醇；C1孔中加入为待测样品2倍体积的无水乙醇，
然后向A1孔中加入0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液；
向B1孔中再加入无水乙醇；
向C1孔中再加入的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液；
上述A1孔中0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液的加入量为A1孔中加入的待测样品液的2倍；
B1孔中加入的无水乙醇的量，与A1孔中加入的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液的量相等；
C1孔中加入的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液的量，与A1孔中加入的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液的量相等；
等体积的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液；
然后，A1、B1、C1孔中的溶液混匀，黑暗环境反应30min；
③、用酶标仪在517nm处分别测A1、B1、C1孔中所得的反应液的OD值，A1、B1、C1孔中所得的反应液，每样至少做3次平行，取其平均值，根据DPPH自由基清除率公式计算酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012胞内物质中的DPPH自由基清除率，测定结果为该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的胞内物质中的DPPH自由基清除率为3.2％，因此酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012可用于水果酵素产品制备中进行应用，特别是在苹果酵素、草莓酵素、梨酵素及黄桃等水果酵素制备中的应用。
DPPH自由基清除率的计算公式如下：
A1-对照组吸光度，即B1孔中的待测样品溶液和无水乙醇溶液的吸光度；
A2-样品组吸光度，即A1孔中的待测样品溶液和DPPH无水乙醇溶液的吸光度；
A0-空白组吸光度，即C1孔中的等体积无水乙醇溶液和等体积DPPH无水乙醇溶液的吸光度。
实施例5
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012代谢产物中的DPPH自由基清除率测定，具体步骤如下：
(1)、菌种活化：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012接种于MEB液体培养基中，在30℃条件下培养26h进行活化，连续活化两代，所得的菌种活化液控制温度为4℃、转速为10000r/min离心20min，取上清液作为待测样品液，待用；
(2)、用DPPH清除自由基法测酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012的代谢产物中的DPPH自由基清除率，步骤如下：
①、先进行预实验，取0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液2mL，往其中加入步骤(1)所得的待测样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下待测样品液的加样量，即为最大加样量；
取最大加样量的一半测其DPPH自由基清除率；
②、分别取最大加样量的一半的待测样品液于多孔板的A1、B1孔中，并在A1、B1孔中分别加入与待测样品液体积相等的无水乙醇；C1孔中加入为待测样品2倍体积的无水乙醇，
然后向A1孔中加入0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液；
向B1孔中再加入无水乙醇；
向C1中再加入的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液；
上述A1孔中0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液的加入量为A1孔中加入的待测样品液的2倍；
B1孔中加入与A1孔中加入的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液等体积的无水乙醇溶液；
C1孔中加入与A1孔中加入的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液等体积的0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液；
混匀，黑暗环境反应30min；
③、用酶标仪在517nm处分别测A1、B1、C1孔中所得的反应液的OD值，A1、B1、C1孔中所得的反应液，每样至少做3次平行，取其平均值，根据DPPH自由基清除率公式(具体与实施例4中的DPPH自由基清除率公式相同)计算酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012的代谢产物的DPPH自由基清除率，测定结果为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SITCC No.20012的代谢产物中的DPPH自由基清除率为30.6％，因此酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012可用于水果酵素产品制备中进行应用，特别是在苹果酵素、草莓酵素、梨酵素及黄桃等水果酵素制备中的应用。
实施例6
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012发酵液的酒精度及pH测定，具体包括如下步骤；
(1)、发酵原料液的制备
将浓缩果汁用纯净水按体积比计算，浓缩果汁：纯净水为1：6的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0，然后控制温度为95℃进行灭菌20min，然后自然冷却至40℃，即得到发酵原料液；
所述的浓缩果汁为德乐浓缩苹果汁，还可以是浓缩梨汁、浓缩黄桃汁或浓缩草莓汁等；本实施例中仅以浓缩苹果汁为例进行了测定；
葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为2g：100mL的
比例计算；
(2)、菌种活化
①、用接种环取无菌水溶解的冷冻干燥管保存的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SITCC No.20012菌种一环在PDA琼脂培养基平板上划线，在30℃培养箱中培养48h至长出单菌落，即得到平板活化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012菌菌种；
②、用接种环取无菌水溶解的沪酿1.01醋酸菌菌种一环在醋酸菌琼脂培养基平板上划线，在30℃培养箱中培养48h至长出单菌落，即得到平板活化沪酿1.01醋酸菌菌种；
(3)、工作发酵剂的制备
①、酿酒酵母工作发酵剂的制备
用接种环取步骤(2)中①所得的平板活化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012菌菌种一环接入装有50mL MEB肉汤液体培养基的250mL规格的三角瓶中，置于30℃的培养箱中控制转速转速120rpm培养26h，得到培养液；
将所得的培养液控制转速为5000r/min进行离心20min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液1清洗3次，然后在清洗后的沉淀中加入无菌磷酸盐缓冲溶液2经5000rpm下涡旋震荡重悬菌体，得到酿酒酵母工作发酵剂，无菌磷酸盐缓冲溶液2的加入量以保证所得的酿酒酵母工作发酵剂中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的活菌数至少为109cfu/mL为标准；
②、沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂的制备
用接种环取步骤(2)中②所得的平板活化沪酿1.01醋酸菌菌种一环接入装有50mL醋酸菌液体培养基的250mL规格的三角瓶中，置于30℃的培养箱中控制转速120rpm恒温培养36h得到培养液；
将所得的培养液控制转速为5000rpm进行离心20min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液3清洗3次，然后在清洗后的沉淀中加入无菌磷酸盐缓冲溶液4经5000rpm下涡旋震荡重悬菌体，得到沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂，无菌磷酸盐缓冲溶液4的加入量以保证所得的沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂中沪酿1.01醋酸菌的活菌数至少为107cfu/mL为标准；
(4)、发酵培养
按体积百分比计算，接种量2％的比例，将步骤(3)中①所得的酿酒酵母工作发酵剂接种入步骤(1)所得的发酵原料液中，然后控制温度为37℃，转速为100rpm，进行第一次发酵42h，得到含有酿酒酵母的第一次发酵液；
然后，按体积百分比计算，接种量1％的比例，将步骤(3)中②所得的沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂接种入上述所得的含有酿酒酵母的第一次发酵液中，控制温度为25℃、转速为200rpm进行第二次发酵12h，即得到含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012的苹果酵素产品。
按照GB 5009.225-2016食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定方法，用蒸馏装置蒸馏测定上述所得的含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的苹果酵素产品中的酒精含量，测定结果为酒精度低于0.5％。
用校准后的pH计测定所得的苹果酵素产品中的pH值，pH为4.7。
应用实施例1
一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012在苹果酵素产品制备过程中的应用，具体包括如下步骤；
(1)、发酵原料液的制备
将浓缩果汁用纯净水按体积比计算，浓缩果汁：纯净水为1：6的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0，然后控制温度为95℃进行灭菌20min，然后自然冷却至40℃，即得到发酵原料液；
所述的浓缩果汁，即为德乐浓缩苹果汁；
葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为2g：100mL的比例计算；
(2)、菌种活化
①、用接种环取无菌水溶解的冷冻干燥管保存的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SITCC No.20012菌种一环在PDA琼脂培养基平板上划线，在30℃培养箱中培养48h至长出单菌落，即得到平板活化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012菌菌种；
②、用接种环取无菌水溶解的沪酿1.01醋酸菌菌种一环在醋酸菌琼脂培养基平板上划线，在在30℃培养箱中培养48h至长出单菌落，即得到平板活化沪酿1.01醋酸菌菌种；
(3)、工作发酵剂的制备
①、酿酒酵母工作发酵剂的制备
用接种环取步骤(2)中①所得的平板活化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012菌菌种一环接入装有50mL MEB肉汤液体培养基的250mL规格的三角瓶中，置于30℃的培养箱中控制转速120rpm培养26h，得到培养液；将所得的培养液控制转速为5000r/min进行离心20min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液1清洗2-3次，然后在清洗后的沉淀中加入无菌磷酸盐缓冲溶液2经5000rpm下涡旋震荡重悬菌体，得到酿酒酵母工作发酵剂，无菌磷酸盐缓冲溶液2的加入量以保证所得的酿酒酵母工作发酵剂中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的活菌数至少为109cfu/mL为标准；
②、沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂的制备
用接种环取步骤(2)中②所得的平板活化沪酿1.01醋酸菌菌种一环接入装有50mL醋酸菌液体培养基的250mL规格的三角瓶中，置于30℃的培养箱中控制转速120rpm恒温培养36h，得到培养液；将所得的培养液控制转速为5000rpm进行离心20min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液3清洗3次，然后在清洗后的沉淀中加入无菌磷酸盐缓冲溶液4经5000rpm下涡旋震荡重悬菌体，得到沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂，无菌磷酸盐缓冲溶液4的加入量以保证所得的沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂中沪酿1.01醋酸菌的活菌数至少为107cfu/mL为标准；
(4)、发酵培养
按体积百分比计算，接种量为2％的比例，将步骤(3)中①所得的酿酒酵母工作发酵剂接种入步骤(1)所得的发酵原料液中，然后控制温度为37℃，转速为100rpm，进行第一次发酵42h，得到含有酿酒酵母的第一次发酵液；
然后，按体积百分比计算，接种量为1％的比例，将步骤(3)中②所得的沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂接种入上述所得的含有酿酒酵母的第一次发酵液中，控制温度为25℃、转速为200rpm进行第二次发酵12h，即得到含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012的苹果酵素产品。
应用实施例2
一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012在梨酵素产品制备过程中的应用，具体包括如下步骤；
(1)、发酵原料液的制备
将浓缩果汁用纯净水按体积比计算，浓缩果汁：纯净水为1：6的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0，然后控制温度为95℃进行灭菌20min，然后自然冷却至40℃，即得到发酵原料液；
所述的浓缩果汁，即为德乐浓缩梨汁；
葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为2g：100mL的比例计算；
(2)、菌种活化
同应用实施例1的步骤(2)；
(3)、工作发酵剂的制备
同应用实施例1的步骤(3)；
(4)、发酵培养
按体积百分比计算，接种量为2％的比例，将步骤(3)所得的酿酒酵母工作发酵剂接种入步骤(1)所得的发酵原料液中，然后控制温度为37℃，转速为100rpm，进行第一次发酵42h，得到含有酿酒酵母的第一次发酵液；
然后，按体积百分比计算，接种量为1％的比例，将步骤(3)所得的沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂接种入上述所得的含有酿酒酵母的第一次发酵液中，控制温度为25℃、转速为200rpm进行第二次发酵12h，即得到含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012的梨酵素产品。
应用实施例3
一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012在黄桃酵素产品制备过程中的应用，具体包括如下步骤；
(1)、发酵原料液的制备
将浓缩果汁用纯净水按体积比计算，浓缩果汁：纯净水为1：6的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0，然后控制温度为95℃进行灭菌20min，然后自然冷却至40℃，即得到发酵原料液；
所述的浓缩果汁，即为德乐浓缩黄桃汁；
葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为2g：100mL的比例计算；
(2)、菌种活化
同应用实施例1的步骤(2)；
(3)、工作发酵剂的制备
同应用实施例1的步骤(3)；
(4)、发酵培养
按体积百分比计算，接种量为2％的比例，将步骤(3)所得的酿酒酵母工作发酵剂接种入步骤(1)所得的发酵原料液中，然后控制温度为37℃，转速为100rpm，进行第一次发酵42h，得到含有酿酒酵母的第一次发酵液；
然后，按体积百分比计算，接种量为1％的比例，将步骤(3)所得的沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂接种入上述所得的含有酿酒酵母的第一次发酵液中，控制温度为25℃、转速为200rpm进行第二次发酵12h，即得到含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012的黄桃酵素产品。
应用实施例4
一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012在草莓酵素产品制备过程中的应用，具体包括如下步骤；
(1)、发酵原料液的制备
将浓缩果汁用纯净水按体积比计算，浓缩果汁：纯净水为1：6的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0，然后控制温度为95℃进行灭菌20min，然后自然冷却至40℃，即得到发酵原料液；
所述的浓缩果汁，即为德乐浓缩草莓汁；
葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为2g：100mL的比例计算；
(2)、菌种活化
同应用实施例1的步骤(2)；
(3)、工作发酵剂的制备
同应用实施例1的步骤(3)；
(4)、发酵培养
按体积百分比计算，接种量为2％的比例，将步骤(3)所得的酿酒酵母工作发酵剂接种入步骤(1)所得的发酵原料液中，然后控制温度为37℃，转速为100rpm，进行第一次发酵42h，得到含有酿酒酵母的第一次发酵液；
然后，按体积百分比计算，接种量为1％的比例，将步骤(3)所得的沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂接种入上述所得的含有酿酒酵母的第一次发酵液中，控制温度为25℃、转速为200rpm进行第二次发酵12h，即得到含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012的草莓酵素产品。
对比实施例1
空白苹果酵素产品的制备，步骤如下：
将浓缩苹果汁按体积比，即浓缩苹果汁：蒸馏水为1:6的比例进行稀释后，在95℃下加热杀菌20min，并冷却至40℃，然后分装到玻璃瓶中，加上专用盖子，室温放置20天进行自然发酵，即得空白苹果酵素产品。
对比实施例2
空白梨酵素产品的制备，步骤如下：
将浓缩梨汁按体积比，即浓缩梨汁：蒸馏水为1:6的比例进行稀释后，在95℃下加热杀菌20min，并冷却至40℃，然后分装到玻璃瓶中，加上专用盖子，室温放置20天进行自然发酵，即得空白梨酵素产品。
对比实施例3
空白黄桃酵素产品的制备，步骤如下：
将浓缩黄桃汁按体积比，即浓缩黄桃汁：蒸馏水为1:6的比例进行稀释后，在95℃下加热杀菌20min，并冷却至40℃，然后分装到玻璃瓶中，加上专用盖子，室温放置20天进行自然发酵，即得空白黄桃酵素产品。
对比实施例4
空白草莓酵素产品的制备，步骤如下：
将浓缩草莓汁按体积比，即浓缩草莓汁：蒸馏水为1:6的比例进行稀释后，在95℃下加热杀菌20min，并冷却至40℃，然后分装到玻璃瓶中，加上专用盖子，室温放置20天进行自然发酵，即得空白草莓酵素产品。
效果实施例1
含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的苹果酵素产品和空白酵素产品DPPH自由基清除率对比：
将上述应用实施例1和对比实施例1中的第一次发酵液及最终的苹果酵素产品分别进行DPPH自由基清除率测定，结果表明含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的第一次发酵液及最终苹果酵素饮品的清除率为分别为81.7％、88.2％，而对比实施例1中的空白酵素饮品的清除率为53.0％，DPPH自由基清除率较空白酵素饮品分别提高了54.2％、66.4％，证明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012具有较高的DPPH自由基清除率，并且在发酵过程中可以大幅提高产品DPPH自由基清除率，因此酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012在水果酵素产品中具有广阔的应用前景，并且具有高抗氧化性的潜能。
效果实施例2
含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的梨酵素产品和空白酵素产品DPPH自由基清除率对比：
将上述应用实施例2和对比实施例2中的第一次发酵液及最终的梨酵素产品分别进行DPPH自由基清除率测定，结果表明含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012的第一次发酵液及最终的梨酵素饮品的清除率分别为63.8％、74.5％，而对比实施例1中的空白酵素饮品的清除率为44.6％，DPPH自由基清除率较空白酵素饮品分别提高了43.0％、67.0％，证明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012具有较高的DPPH自由基清除率，并且在发酵过程中可以大幅提高产品DPPH自由基清除率，因此酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012在水果酵素产品中具有广阔的应用前景，并且具有高抗氧化性的潜能。
效果实施例3
含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的黄桃酵素产品和空白酵素产品DPPH自由基清除率对比
将上述应用实施例3和对比实施例3中的第一次发酵液及最终的黄桃酵素产品分别进行DPPH自由基清除率测定，结果表明含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的第一次发酵液及最终的黄桃酵素饮品的清除率为66.2％、73.9％，而对比实施例3中的空白酵素饮品的清除率为43.6％，DPPH自由基清除率较空白酵素饮品分别提高了51.8％、69.5％，证明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012具有较高的DPPH自由基清除率，并且在发酵过程中可以大幅提高产品DPPH自由基清除率，因此酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012在水果酵素产品中具有广阔的应用前景，并且具有高抗氧化性的潜能。
效果实施例4
含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的草莓酵素产品和空白酵素产品DPPH自由基清除率对比：
将上述应用实施例4和对比实施例4中的第一次发酵液及最终的酵素产品分别进行DPPH自由基清除率测定，结果表明含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012的第一次发酵液及最终的草莓酵素饮品的清除率分别为69.5％、78.4％，而对比实施例4中的空白酵素饮品的清除率为47.9％，DPPH自由基清除率较空白酵素饮品分别提高了45.1％、63.7％，证明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012具有较高的DPPH自由基清除率，并且在发酵过程中可以大幅提高水果酵素产品的DPPH自由基清除率，因此酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012在水果酵素产品中具有广阔的应用前景，并且具有高抗氧化性的潜能。
将上述效果实施例1-4得到的应用实施例1-4含有酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SITCC No.20012在水果酵素产品和对比实施例1-4中的空白水果酵素产品对DPPH自由基清除率作图，所得的柱状图如图4所示，图4中苹果酵素、梨酵素、黄桃酵素、草莓酵素对应于实施例1-4所得的含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的苹果酵素产品、含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的梨酵素产品、含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的黄桃酵素产品、含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的草莓酵素产品，图4中的空白苹果酵素、空白梨酵素、空白黄桃酵素、空白草莓酵素对应于对比实施例1-4中所得的空白苹果酵素产品、空白梨酵素产品、空白黄桃酵素产品、空白草莓酵素产品。
从图4中可以看出，含酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的水果酵素产品其DPPH自由基清除率均明显高于自然发酵所得的空白水果酵素产品，且DPPH自由基清除率至少提高40％，由此表明了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012可用于水果酵素产品制备中进行应用，特别是在苹果酵素、草莓酵素、梨酵素及黄桃等水果酵素制备中的应用。
效果实施例5
含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的苹果、梨、黄桃及草莓酵素产品两次发酵液酒精度及pH值测定
将上述应用实施例1、2、3、4中的第一次发酵液，第二次发酵液分别进行酒精度及pH值测定。测定结果表明第一次发酵液的酒精度为1.5±0.5％，pH值为5.0±0.5；第二次发酵液的酒精度均小于0.5％，pH值为4.7±0.5。证明酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012在发酵过程中会产生一定量的酒精，而沪酿1.01醋酸菌的加入，在发酵过程中将其中一部分酒精转化为醋酸。说明二次发酵不仅能够提高终产品的DPPH自由基清除率，又可以降低酒精含量，符合无酒精产品的要求，由此表明了酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SITCC No.20012可用于水果酵素产品制备中进行应用，特别是在苹果酵素、草莓酵素、梨酵素及黄桃等水果酵素制备中的应用。
综上所述，本发明提供的一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012，具有很好的DPPH自由基清除率作用，其胞内物质中DPPH自由基的清除率为3.2％，代谢产物中DPPH自由基的清除率为30.6％，因此可在水果酵素产品制备中进行应用，特别是在苹果酵素、草莓酵素、梨酵素及黄桃等水果酵素制备中的应用，使水果酵素产品的DPPH自由基清除率大幅提高，至少提高40％。
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海应用技术大学
<120> 一种酿酒酵母及其在水果酵素产品中的应用
<130> 2017
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 607
<212> DNA
<213> 酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
tgcatatcaa aaaagcggag gaaaagaaac caaycrggat tgccttagta acggcgagtg 60
aagcggcaaa agctcaaatt tgaaatctgg taccttcggt gcccgagttg taatttggag 120
agggcaactt tggggccgtt ccttgtctat gttccttgga acaggacgtc atagagggtg 180
agaatcccgt gtggcgagga gtgcggttct ttgtaaagtg ccttcgaaga gtcgagttgt 240
ttgggaatgc agctctaagt gggtggtaaa ttccatctaa agctaaatat tggcgagaga 300
ccgatagcga acaagtacag tgatggaaag atgaaaagaa ctttgaaaag agagtgaaaa 360
agtacgtgaa attgttgaaa gggaagggca tttgatcaga catggtgttt tgtgccctct 420
gctccttgtg ggtaggggaa tctcgcattt cactgggcca gcatcagttt tggtggcagg 480
ataaatccat aggaatgtag cttgcctcgg taagtattat agcctgtggg aatactgcca 540
gctgggactg aggactgcga cgtaagtcaa ggatgctgat cagttatatg ccgcccgtct 600
tgaacca 607
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 2
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence )
<400> 3
ggtccgtgtt tcaagacgg 19
Claims (6)
1.一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012。
2.如权利要求1所述的一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012，其特征在于所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012具有高DPPH自由基清除率，其胞内物质中的DPPH自由基的清除率为3.2％，代谢产物中的DPPH自由基的清除率为30.6％。
3.如权利要求1或2所述的一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012在发酵食品制备中的应用。
4.如权利要求1或2所述的一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012在水果酵素产品制备中的应用；所述的水果酵素产品为苹果酵素、黄桃酵素、梨酵素或草莓酵素。
5.如权利要求4所述的一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012在水果酵素产品制备中的应用，其特征在于具体包括如下步骤：
(1)、发酵原料液的制备
将浓缩果汁用纯净水按体积比计算，浓缩果汁：纯净水为1：5-10的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用浓度为1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0-7.0，然后控制温度为95℃进行灭菌20min，然后自然冷却至37-40℃，即得到发酵原料液；
所述的浓缩果汁为浓缩苹果汁、浓缩梨汁、浓缩黄桃汁或浓缩草莓汁；
葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为0.5-5g：100mL的比例计算；
(2)、菌种活化
①、用接种环取无菌水溶解的冷冻干燥管保存的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SITCC No.20012菌种一环在PDA琼脂培养基平板上划线，在30℃培养箱中培养36-72h，即得到平板活化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012菌菌种；
②、用接种环取无菌水溶解的沪酿1.01醋酸菌菌种一环在醋酸菌琼脂培养基平板上划线，在30℃培养箱中培养36-72h，即得到平板活化沪酿1.01醋酸菌菌种；
(3)、工作发酵剂的制备
①、酿酒酵母工作发酵剂的制备
用接种环取步骤(2)中①所得的平板活化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012菌菌种一环接入装有50mL MEB肉汤液体培养基的250mL规格的三角瓶中，置于30℃的培养箱中控制转速100-150rpm培养24-36h，得到酿酒酵母培养液；
将所得的酿酒酵母培养液控制转速为4000-6000rpm进行离心15-30min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液1清洗2-3次，然后在清洗后的沉淀中加入再加入无菌磷酸盐缓冲溶液2经4000-6000rpm下涡旋震荡重悬菌体，得到酿酒酵母工作发酵剂，无菌磷酸盐缓冲溶液2的加入量以保证所得的酿酒酵母工作发酵剂中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCC No.20012的活菌数至少为109cfu/mL为标准；
②、沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂的制备
用接种环取步骤(2)中②所得的平板活化沪酿1.01醋酸菌菌种一环接入装有50mL醋酸菌液体培养基的250mL规格的三角瓶中，置于30℃的培养箱中控制转速100-150rpm恒温培养24-36h，得到沪酿1.01醋酸菌培养液；
将所得的沪酿1.01醋酸菌培养液控制转速为4000-6000rpm进行离心15-30min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液3清洗2-3次，然后在清洗后的沉淀中加入无菌磷酸盐缓冲溶液4经4000-6000rpm下涡旋震荡重悬菌体，得到沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂，无菌磷酸盐缓冲溶液4的加入量以保证所得的沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂中沪酿1.01醋酸菌的活菌数至少为107cfu/mL为标准；
上述的无菌磷酸盐缓冲溶液1、无菌磷酸盐缓冲溶液2、无菌磷酸盐缓冲溶液3与无菌磷酸盐缓冲溶液4相同，按每升计算，含磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g、氯化钾0.2g，余量为蒸馏水，121℃灭菌20min，冷却并在4℃下保存待用；
(4)、发酵培养
按体积百分比计算，接种量1-5％的比例，将步骤(3)中①所得的酿酒酵母工作发酵剂接种入到步骤(1)所得的发酵原料液中，然后控制温度为35-40℃，转速为100-200rpm进行第一次发酵24-72h，得到含有酿酒酵母的第一次发酵液；
然后，按体积百分比计算，接种量1-10％的比例，将步骤(3)中②所得的沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂接种入上述所得的含有酿酒酵母的第一次发酵液中，控制温度为25-35℃、转速为100-200rpm进行第二次发酵12-36h，即得到含有酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SITCC No.20012的水果酵素产品。
6.如权利要求5所述的一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S ITCC No.20012在水果酵素产品制备中的应用，其特征在于：
步骤(1)发酵原料液的制备中：
浓缩果汁：纯净水为1：6的比例进行稀释，然后加入葡萄糖，混合均匀后用1mol/L的食用级碳酸钠水溶液调节pH为6.0，然后控制温度为95℃进行灭菌20min，然后自然冷却至40℃，即得到发酵原料液；
葡萄糖的加入量，按质量比计算，葡萄糖：纯净水为2g：100mL的比例计算；
步骤(3)工作发酵剂的制备中：
①、酿酒酵母工作发酵剂的制备中：30℃的培养箱中控制转速120rpm培养26h，得到酿酒酵母培养液；
将所得的酿酒酵母培养液控制转速为5000r/min进行离心20min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液1清洗2-3次，然后在清洗后的沉淀中加入再加入无菌磷酸盐缓冲溶液2经5000rpm下涡旋震荡重悬菌体，得到酿酒酵母工作发酵剂；
②、沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂的制备中：30℃的培养箱中控制转速120rpm恒温培养36h得到沪酿1.01醋酸菌培养液；
将所得的沪酿1.01醋酸菌培养液控制转速为5000rpm进行离心20min，离心所得的沉淀用无菌磷酸盐缓冲溶液3清洗2-3次，然后在清洗后的沉淀中加入无菌磷酸盐缓冲溶液4经5000rpm下涡旋震荡重悬菌体，得到沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂；
步骤(4)发酵培养中：
按体积百分比计算，接种量1％的比例，将步骤(3)中①所得的酿酒酵母工作发酵剂接种入到步骤(1)所得的发酵原料液中，然后控制温度为37℃，转速为100rpm，进行第一次发酵42h，得到含有酿酒酵母的第一次发酵液；
然后，按体积百分比计算，接种量1％的比例，将步骤(3)中②所得的沪酿1.01醋酸菌工作发酵剂接种入上述所得的含有酿酒酵母的第一次发酵液中，控制温度为25℃、转速为200rpm进行第二次发酵12h，即得到含有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SITCCNo.20012的水果酵素产品。
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