CN104293706B - 泡菜生产用微生物菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于泡菜生产的微生物菌剂，属于微生物制剂生产领域。所述微生物菌剂产品，含有植物乳杆菌CGMCC NO.9405,所述微生物菌剂产品由如下菌剂组成：植物乳杆菌CGMCC NO.9405、醋酸杆菌和酵母菌，首先对植物乳杆菌，醋酸杆菌、酿酒酵母菌种进行单独培养，培养到预定时间后经离心后收集菌体，利用常规微生物制剂的生产方法制备各菌的粉状微生物菌粉；将制备的菌种粉剂根据配比进行混和调配。上述菌种的选择和配比保障了泡菜产品的生产速度、泡菜产品良好的风味及质量，使泡菜生产安全性高，产品标准一致，既可适合工业化大规模生产，又可用于手工作坊式生产，产品有较大的应用市场。

Description

泡菜生产用微生物菌剂
技术领域
本发明属于微生物制剂生产领域，特别是涉及制备一种用于泡菜生产的微生物制剂及其生产方法。
背景技术
目前，泡菜生产所用的微生物主要有两种方法，一种是利用自然发酵法制备泡菜产品，采用泡菜生产环境中存在的自然菌种生产，国内生产的发酵型泡菜几乎都采用此法，但此类产品质量不稳定，产品标准极不规范、存在严重食品安全隐患；第二种方法是采用培养的纯乳酸菌进行生产，其中菌种有植物乳杆菌、干酪乳杆菌和其他乳酸菌，沈国华等于《中国调味品》2002年第六期发表的“纯菌接种发酵技术在腌渍蔬菜加工上的应用研究(二)纯菌接种发酵技术最佳发酵模式的确定与应用”这篇文章，报道了采用分别培养的乳酸菌发酵剂制造泡菜的工艺。但利用纯乳酸菌生产泡菜尚处于试验室研究开发阶段。然而，目前乳酸菌纯种生产泡菜还处于起步阶段，采用的乳酸菌均为酸奶、乳酸等产品的专有菌种，没有开发出适合泡菜生产的专用菌种。此类菌群在泡菜制作基质的特定环境中适应性差，生长繁殖困难，无法酿制出发酵泡菜独有的品位。
申请号为201310574525.1的中国发明专利申请，提供了“一种泡菜发酵菌剂及发酵菌粉的制备方法”，该制备方法包括植物乳杆菌、短乳杆菌、戊糖乳杆菌和副干酪乳杆菌的菌株活化、增菌培养基制备、对活化后菌株的增菌培养、泡菜发酵菌剂的离心浓缩、保护剂制备和泡菜发酵菌剂与保护剂的喷雾干燥等工艺。该方法制备的泡菜发酵菌剂及发酵菌粉能够有效降低泡菜中亚硝酸盐的含量；增菌培养基选用泡菜常用蔬菜，不仅能够有效增殖乳酸菌，而且具有天然绿色、不添加其他化学试剂的特点；制备发酵菌粉的干燥方式采用喷雾干燥法，其能有效降低生产成本。
申请号为200710048203.8的发明专利，公开了“高活性泡菜直投式菌剂的制备技术”，该发明将植物乳杆菌、短乳杆菌、肠膜明串珠菌按0.15～2％的量分别接入蔬菜汁培养液中进行振荡培养,并通过滴加10％NAOH溶液控制培养液中的酸度,培养液经离心浓缩,得离心沉淀物,在其中添加冻干保护剂后进行真空冷冻干燥,得乳酸菌菌剂；酵母菌经增菌培养、离心浓缩,得离心沉淀物,加入麸皮后干燥、粉碎,得酵母菌菌剂。将植物乳杆菌、短乳杆菌、肠膜明串珠菌、酵母菌按2～3∶1～2∶1～2∶0.5～1的比例复配后得到泡菜直投式菌剂；将此菌剂按0.02～0.1％的量接入泡菜坛中,进行泡菜发酵。该发明有利于泡菜的规模化、标准化生产。
申请号为200810172333.7的发明专利，公开了“一种发酵剂发酵泡菜及其制备方法”，该发明特别涉及几种纯乳酸菌发酵剂发酵泡菜及其制备方法，其制备的步骤如下:(1)原料蔬菜的处理:清洗、淋干；(2)盐水的制备；(3)发酵剂溶液的制备；(4)蔬菜装瓶并加入盐水和发酵剂溶液；(5)发酵；此发明不但提供了一种含益生菌的食品发酵剂的一种新的深加工途径,而且得到了一种新的传统健康的泡菜。
申请号为201110421967.3的发明专利，公开了生物法快速发酵泡菜的制备方法，特别涉及利用复合菌粉生产泡菜的方法。该发明的主要步骤有：(1)加料密封：蔬菜原料切分后放入容器中，加入含有醋酸杆菌、酿酒酵母菌的复合菌粉和含有食盐的辅料，密封容器；(2)发酵：控制温度在23-36℃进行前期发酵，随后将温度控制在15-25℃进行后发酵，整个发酵时间在20-40小时；(3)脱水调配：发酵完毕脱去泡菜水分，加入调味料混合均匀即可。该方法适用于不同规模的泡菜生产，可以明显缩短生产时间，泡菜产品营养丰富、口味纯正，在泡菜生产领域具有广阔的应用前景。
由此可知，因微生物菌种的原因，泡菜的工业化生产还是受到了较大的限制；面对人们生活水平的提高和日益增长的市场需求，泡菜生产用微生物制剂的开发对泡菜的工业化开发具有重要的现实意义。
发明内容：
本发明解决的技术问题是提供一种用于泡菜生产用微生物菌剂；
所述微生物菌剂产品，含有植物乳杆菌CGMCC NO.9405；
所述微生物菌剂产品由如下菌剂组成：植物乳杆菌CGMCC NO.9405、醋酸杆菌和酵母菌，所述菌剂的重量份数组成为：植物乳杆菌CGMCC9405 10-20份、醋酸杆菌3-5份，酵母菌0.5-2份。
本发明中各种菌种组成比例也是经过精心试验研究得到，上述菌种的选择和配比保障了泡菜产品的生产速度、泡菜产品良好风味和泡菜产品的良好质量。
本发明的技术方案概述如下：
本发明首先对植物乳杆菌，醋酸杆菌、酿酒酵母菌种进行单独培养，培养到预定时间后经离心后收集菌体，利用常规微生物制剂的生产方法制备各菌的粉状微生物菌粉；将制备的菌种粉剂根据配比进行混和调配。
本发明中菌粉的制备方法如下：所述醋酸杆菌、植物乳杆菌粉状菌粉制备步骤如下：将斜面菌种转接到液体培养基并逐级扩培到要求的体积；将扩培得到的菌液进行离心分离，收集沉淀菌体；向沉淀菌体中加入保护剂并进行稀释；利用干燥设备制备粉状菌剂，上述方法制得植物乳杆菌菌粉中活细胞数为0.1×1010-6.0×1010个/克,醋酸杆菌菌粉中活细胞数为0.1×109-6.0×109个/克,另采用活性干酵母的制造方法制得活性酵母菌粉，其中活性酵母菌数量在0.05×109-5.0×109个/克。
植物乳杆菌菌粉的具体生产方法已有较多报道，报道文章有黄良昌的硕士学位论文“真空冷冻干燥法生产干酸奶发酵剂工艺的研究”(2002年)，刘宇峰等在中国乳品工业杂志发表的“直接使用型酸奶发酵剂的研制”发表于1995年第5期。酵母菌菌粉的生产方法参见肖冬光著“酿酒活性干酵母的生产与应用技术”，内蒙古人民出版社1994年出版。
本发明中植物乳杆菌菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，不产芽孢；在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。
理化特征为：过氧化氢酶(-)，明胶液化(-)，吲哚实验(+)，运动性(-)，发酵产气(-)，亚硝酸盐还原(-)，发酵产气(-)，产硫化氢气体(-)，pH4.0 MRS培养基中生长(+)。
本发明植物乳杆菌采用下述流程进行选育：
原始出发菌种→试管活化→硫酸二乙酯(DES)诱变→亚硝基胍(NTG)诱变→等离子体诱变→平板初筛→摇瓶复筛→传代稳定性试验。
本发明所采用的出发菌株在MRS葡萄糖培养基中，其乳酸的生产速率为1.5g/L/d,当培养基pH为3.5时几乎停止生长，对亚硝酸钠的分解速率为0.34mg/h/kg白菜。出发菌株为李政采集于宁夏盐池县育肥羊场的青储饲料，采集时间2013年9月15日。
为了提高其乳酸生产速率、耐酸能力和亚硝酸盐的分解速率，依次采用DES和NTG技术对该菌种进行诱变，诱变后菌株采用MRS碳酸钙平板进行初筛，然后采用500mL摇瓶发酵，生物传感器分析仪对高产菌进行复筛，选育优良的植物乳杆菌菌株，然后做传代实验，评价其遗传稳定性。
植物乳杆菌tlj-2014遗传稳定性结果表明：经过连续传代十次，各项性能指标都比较稳定，遗传性较好，性状没有回复，因此把植物乳杆菌tlj-2014作为选育得到的目的菌株。
经验证发现：该诱变菌株的乳酸生产速率可以达到35g/L/d，该菌株经过71小时发酵后乳酸浓度达到95g/L；能够在pH为1.80的条件下存活。降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到9.8mg/h/kg(自然发酵过程亚硝酸盐积累的速率大约为1.1mg/h/kg)，能够耐1％胆盐。
因此采用该菌种生产泡菜，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在5mg/kg以下，远低于国家标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2014，该菌株已于2014年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮编：100101)，保藏号为CGMCC NO.9405。
1.DES诱变选育
1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌L一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂，葡萄糖20g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。
2)取5mL菌液，5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
3)用pH7.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。
4)取32mL pH7.0的磷酸钾缓冲液、8mL菌悬液、0.4mL DES在预先放入转子的150mL三角瓶中充分混合，使DES最终浓度为1％(v/v)。
5)在37℃摇床中150rpm反应30min，取1mL混合液，加入0.5mL 25％ Na2S2O3溶液中止反应。
6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸钙筛选培养基(含100g/L葡萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中。在37℃培养2～3天后，采用影印法将该筛选平板的菌株转印到pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS培养基(低pH值改性MRS培养基)上和亚硝酸钠筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上。
7)在37℃培养2～3天后，挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钠筛选培养基上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取出的菌落命名为植物乳杆菌L1。
2.亚硝基胍诱变
1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌L1一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为60g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。
2)取5mL菌液5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。
3)用pH6.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。
4)取10mL菌悬液转移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓度为10 mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
5)在37℃下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。
6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸钙筛选培养基(含100g/L葡萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中。在37℃培养2～3天后，采用影印法将该筛选平板的菌株转印到pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS培养基(低pH值改性MRS培养基)上和亚硝酸钠筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上。
7)挑选菌株方法：挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钠筛选培养基上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取100支符合以上条件的菌落。
3.摇瓶复筛
1)在超净台上分别取各试管斜面上的植物乳杆菌一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为100g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养15 h左右，使菌体处于对数生长中期。
2)分别取5mL菌液，接入装有50mL碳酸钙筛选液体培养基(含250g/L葡萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中、pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS液体培养基(低pH值改性MRS培养基)和亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上(注：采用250mL三角瓶)。200rpm，37℃培养3-4天，每天分别检测碳酸钙筛选液体培养基中L-乳酸产生速率、LPHMRS液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速率。发酵结束后，比较100株菌种的碳酸钙筛选液体培养基中L-乳酸产生速率、LPHMRS液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速率。
3)选择兼具高L-乳酸产生速率、耐受低pH(该菌种仅能在最低为pH1.8的培养基中生长)和亚硝酸盐的消耗速率高的菌株，将其命名为L2菌。
4.遗传稳定性试验
将L2菌在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。菌株命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)tlj-2014。
5.5L发酵罐试验
1)取斜面上的植物乳杆菌L2一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12 h左右，使菌体处于对数生长中期。
2)将对数期的菌种接入装有3L MRS液体培养基(初始葡萄糖为150g/L)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌L2的乳酸产量达到95g/L。这样的产乳酸速率利于泡菜的快速发酵。
3)将对数期的菌种接入装有3L pH为1.8的LPHMRS液体培养基(初始葡萄糖为50g/L)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧，整个过程用0.5mol/L的氢氧化钠将发酵液pH控制在1.8，总培养时间为48小时。发酵结束后，检测植物乳杆菌L2的生物量为2.5g/L，说明植物乳杆菌L2能够在pH1.8的环境中生存。
4)将对数期的菌种接入装有3L亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速率流加20g/L的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌L2对亚硝酸钠的降解速率。结果发现：在该条件下，L2对亚硝酸钠的降解速率可以达到563mg/h/L。
5)将对数期的菌种10mL接入装有2kg预处理过的白菜中，按照传统泡菜方法进行加工，每12小时测定泡菜中的亚硝酸盐含量。结果发现，在整个发酵过程中，L2菌对亚硝酸钠的分解速率为9.8mg/h/kg白菜。泡菜中的亚硝酸钠含量始终低于5mg/kg，远低于国家标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。
所述醋酸杆菌菌粉为常见醋酸杆菌制备的菌剂。
所述酿酒酵母菌选择常见食品用酵母菌剂或活性干酵母。
泡菜菌粉产品的使用方法如下：在泡菜生产中按照10～1000克/吨的比例加入，按照泡菜生产工艺进行生产，采用本发明菌剂生产的泡菜可使泡菜发酵时间控制在30-72小时。
本发明中干燥设备最好采用真空冷冻干燥设备，真空冷冻干燥设备可以较其他设备使菌剂中活菌数量多。
本发明中所采用菌种是经长期试验研究得到，所得菌种特别适合泡菜发酵生产，制成直投式，采用泡菜发酵专用菌粉，可以快速制备泡菜产品，生产周期短，产品质量好，风味佳，安全性高，产品标准一致，既可适合工业化大规模生产，又可用于手工作坊式生产，产品有较大的应用市场。
采用泡菜专用菌粉生产泡菜，生产厂家无需专门培养泡菜发酵菌剂；厂家无需建立相关培养设备和设施；节省了人员和设备投资。
泡菜发酵专用菌粉的应用能够有效地解决继代发酵剂的问题，除了具有纯种接种发酵工艺的优点外，还具有其自身的优势：(1)保存和管理简单；(2)易于进行工艺管理和质量控制；(3)接种方便，可直接用于生产，减少了污染环节；(4)保证了泡菜的风味。
泡菜专用菌的使用为泡菜产品的口味和营养价值的保障提供了有利的条件。
泡菜生产菌剂的开发与应用，必将带动我国泡菜产业的技术创新，将是泡菜传统加工工艺的一次技术变革。直投式生物法快速催熟泡菜工艺技术将从根本上解决我国传统泡菜食品安全性问题、统一泡菜产品品质，并可大大缩短发酵周期(30～72小时)、提高泡菜的产业化水平，符合现代泡菜工业化规模生产的发展方向。
具体实施方式：
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
本例中的产品和技术方案概述如下：
一种用于泡菜生产的微生物菌剂；
所述微生物菌剂产品，含有植物乳杆菌CGMCC NO.9405；
所述微生物菌剂产品由如下菌剂组成：植物乳杆菌CGMCC NO.9405、醋酸杆菌和酵母菌，所述菌剂的重量份数组成为：植物乳杆菌CGMCC9405 15份、醋酸杆菌4份，酵母菌1份。
所述醋酸杆菌CICC 21684,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；
所述酵母菌购自安琪活性干酵母。
实施例2
一种用于泡菜生产的微生物菌剂；
所述微生物菌剂产品，含有植物乳杆菌CGMCC NO.9405；
所述微生物菌剂产品由如下菌剂组成：植物乳杆菌CGMCC NO.9405、醋酸杆菌和酵母菌，所述菌剂的重量份数组成为：植物乳杆菌CGMCC9405 10份、醋酸杆菌3份，酵母菌2份。
所述醋酸杆菌CICC 20056,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；
所述酵母菌购自面包发酵用安琪活性干酵母。
实施例3
一种用于泡菜生产的微生物菌剂；
所述微生物菌剂产品由如下菌剂组成：植物乳杆菌CGMCC NO.9405、醋酸杆菌和酵母菌，所述菌剂的重量份数组成为：植物乳杆菌CGMCC9405 20份、醋酸杆菌5份，酵母菌1份。
三种菌均采用其冷冻干燥菌粉。
实施例4 使用和效果实验
100公斤白菜经拣选洗涤后切条后加盐腌渍处理，腌渍处理时间8小时，温度20℃，盐腌渍溶液浓度为2％；蔬菜取出加入泡菜生产容器，按照蔬菜原料质量比0.1％加入本发明实施例1的发酵菌剂，同时加入蔗糖、食盐及香辛料的混合料包，密封容器；控制温度在26℃进行31小时发酵后pH为3.4；发酵完毕取出蔬菜，拌入混合调味料，然后经真空包装冷藏销售。
采用该复合菌剂生产泡菜，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在3mg/kg以下。
腌渍处理时添加蔬菜质量比为2％的八角、鲜姜、花椒和板蓝根，八角、鲜姜、花椒和板蓝根为相同质量份数；
香辛料的混合料包：花椒1公斤、八角0.1公斤、山奈0.1公斤、排草0.1公斤；
混合调味料：0.5公斤大蒜、0.1公斤辣椒粉、0.2公斤鲜姜、0.05公斤味素粉碎混合；
泡菜口感实验结果：
实验效果：人工品尝实验：从酸味、香味、气味、适口度、质地和综合7个方面打分，各项10分，品评员10人。从评分结果看，B组采用本发明发酵产品的分值明显高于A组约30％。
A组产品为来自四川食品发酵院菌剂按照同样方法制作的产品。
产品质量评分表

Claims (3)

1.一种用于泡菜生产用微生物菌剂，其特征在于，所述泡菜生产用微生物菌剂的重量份数组成为：植物乳杆菌CGMCC NO.9405 10-20份、醋酸杆菌3-5份，酵母菌0.5-2份。
2.根据权利要求1所述泡菜生产用微生物菌剂，其特征在于，所述泡菜生产用微生物菌剂的重量份数组成为：植物乳杆菌CGMCC NO.9405 15份、醋酸杆菌4份，酵母菌1份。
3.根据权利要求1所述泡菜生产用微生物菌剂，其特征在于，所述泡菜生产用微生物菌剂的重量份数组成为：植物乳杆菌CGMCC NO.9405 10份、醋酸杆菌3份，酵母菌2份。
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