CN105661415A - 蔬菜生物发酵生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蔬菜生物发酵生产方法，特别涉及蔬菜发酵的方法。其主要步骤包括：蔬菜清洗，切分，放入泡菜生产容器，按照蔬菜原料质量比0.2-2％加入混合菌发酵剂，加入蔗糖、食盐及香辛料的混合料包，密封容器；控制温度在23-36℃进行10-15小时的前期发酵；后期控制温度在18-22℃进行15-25小时后发酵，整个发酵期间容器密封；发酵完毕调味：取出泡菜，加入混合调味料，然后经真空包装冷藏销售或包装灭菌均可。所述混合菌发酵剂含有植物乳杆菌。本发明借助调温发酵，使泡菜产品具有良好的风味，产品中富含益生菌和多种营养成分。采用本发明方法生产产品质量好，风味佳，安全性高，既可适合工业化大规模生产，又可用于手工作坊式生产，产品有较大的应用市场。

Description

蔬菜生物发酵生产方法

技术领域：

本发明属于蔬菜深加工领域，特别涉及蔬菜发酵的方法。

背景技术：

国内企业和民间泡菜生产多采用自然发酵工艺，该工艺的弊端有：(1)发酵周期相对较长(630天),生产力低下；(2)受卫生条件、生产季节和用盐量影响,发酵易失败；(3)发酵质量不稳定，不利于工厂化、规模化及标准化生产；(4)沿用老泡渍盐水的传统工艺，难以实现大规模的工业化生产；(5)异地生产，难以保证产品的一致性；(6)亚硝酸盐、食盐含量高，食用安全性差。为了解决上述问题，国内开展了乳酸菌纯菌种发酵和直投式乳酸菌菌种发酵的研究，但上述技术尚未进入应用阶段；国外已开始采用纯乳酸菌接种的方法生产泡菜，这种方法在一定程度上促进了泡菜传统生产工艺的革新和发展。但由于采用的菌种多为乳酸菌、菌群单一，且在泡菜制作基质的特定环境中无法生产出风味独特、品质高的泡菜产品。

泡菜由于有益菌的发酵作用，产生的代谢产物又赋予泡菜一定的功能性。为此，泡菜成为民间几千年来经久不衰的产品。

由此可见，泡菜产品生产用发酵剂及相应的泡菜生产工艺是影响泡菜工业进一步发展的关键问题。

发明内容：

本发明解决的技术问题是提供一种蔬菜生物发酵生产方法。

本发明中蔬菜发酵生产的主要步骤包括：蔬菜清洗，切分，放入泡菜生产容器，按照蔬菜原料质量比0.2-2％加入混合菌发酵剂，加入蔗糖、食盐及香辛料的混合料包，密封容器；控制温度在23-36℃进行10-15小时的前期发酵；后期控制温度在18-22℃进行15-25小时后发酵，整个发酵期间容器密封；发酵完毕调味：取出泡菜，加入混合调味料，然后经真空包装冷藏销售或包装灭菌均可。所述混合菌发酵剂含有植物乳杆菌。

香辛料的混合料包主要包括花椒、八角、山奈、排草或其他香辛料；

混合调味料包括大蒜、辣椒粉、鲜姜、味素或其他调味料；

所述植物乳杆菌为CGMCC11763。

本发明混合菌发酵剂的制备

1)植物乳杆菌和干酪乳杆菌的制备工艺为：

斜面培养基(g/L)：20葡萄糖，5酵母粉，10大豆蛋白胨，10牛肉膏，5NaCl，10乙酸钠，2柠檬酸铵，0.2MgSO₄·7H₂O，0.05MnSO₄·7H₂O，15琼脂，pH6.5。

发酵培养基(g/L)：40葡萄糖，10酵母粉，10大豆蛋白胨，无机盐(0.01NaCl,0.5乙酸钠，0.2柠檬酸铵，0.2KH₂PO₄,0.2MgSO₄·7H₂O,0.05MnSO₄·7H₂O)，pH6.5。

发酵方法：在斜面上取1环接种到500mL摇瓶中，装液量为150mL,在37℃下，150rpm培养24h至对数期,收集菌液。

2)酵母的制备工艺：

斜面培养基：10-12°Brix麦芽汁，15琼脂，pH自然。

发酵培养基：10-12°Brix麦芽汁，pH自然。

发酵方法：在斜面上取1环接种到500mL摇瓶中，装液量为150mL,在个不同菌的最适温度下，150rpm培养至对数期,收集菌液。

3)混合菌发酵剂的制备

将培养得到的植物乳杆菌、干酪乳杆菌和酿酒酵母以发酵液体积比为1-2:0.1-0.3:0.05-0.2混合。

本发明中植物乳杆菌为CGMCC11763。干酪乳杆菌可以选择cicc23185，cicc23183，酿酒酵母菌选择cicc1525，cicc1415，cicc1558，上述菌种均购于中国工业微生物菌种保藏中心(北京市朝阳区霄云路32号，邮政编码100027)。

本发明中蔬菜原料为市场上常见各种蔬菜，如大白菜、胡萝卜、黄瓜、甘蓝菜等或是它们的混合。

有益效果：本发明中在泡菜的前发酵阶段，添加在泡菜容器中的食盐使蔬菜中的水分迅速渗出，在23-36℃的生长环境下，复合菌粉中的植物乳杆菌、干酪乳杆菌、酵母菌迅速生长繁殖，密闭发酵容器中的植物乳杆菌、干酪乳杆菌和酵母菌分别进行繁殖代谢产生各自特有的代谢产物；而酵母菌为兼性厌氧菌，前发酵阶段主要进行繁殖子代和发酵产生乙醇和CO₂；植物乳杆菌和干酪乳杆菌在前发酵阶段通常代谢产生以乳酸为主的代谢产物。由于在复合菌粉中酵母菌数量比例最低，故其代谢产生的乙醇数量较少；经过短暂的前发酵后，由于乳酸的迅速形成，泡菜的酸度急剧增加、pH值迅速下降；经过泡菜的前发酵阶段，随后进入较低温度的后发酵阶段。在后发酵阶段，由于采用了特殊菌种植物乳杆菌的作用，发酵控制技术使得代谢产物缓慢产生，但代谢产物之间发生反应形成泡菜产品特有的香味物质，泡菜中形成了乳酸乙酯等泡菜产品的主体香味成分。

本发明借助调温发酵，使泡菜产品具有良好的风味，产品中富含益生菌和多种营养成分。

采用本发明方法生产产品质量好，风味佳，安全性高，既可适合工业化大规模生产，又可用于手工作坊式生产，产品有较大的应用市场。

具体实施方式：

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

所述植物乳杆菌CGMCCNO.11763于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

植物乳杆菌益生特性如下：

本发明所提供的植物乳杆菌CGMCCNO.11763经实验发现能够在pH为1.50的条件下存活，在1％胆盐培养4小时后仍处于存活状态；植物乳杆菌CGMCCNO.11763降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到10.9mg/h/kg，该菌种在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在4.8mg/kg以下；CGMCCNO.11763在发酵60h小时后，对胆固醇降解率可达到64.76％。CGMCCNO.11763黏附能力测定的自凝集率为95.71％。

CGMCCNO.11763对胆固醇降解能力研究和测定：

取1mlCGMCCNO.11763母液接种于10mL的MRS胆固醇液体培养基(胆固醇含量0.1mg/ml,pH6.2)中，37℃的恒温静置分别培养20h、40h、60h备用，以接入1mL无菌水的MRS胆固醇培养基为对照，取以上培养不同时间的菌液样品及对照液各1ml,9000r/min，4℃下离心10min，得到发酵上清液，邻苯二甲醛法测定上清液中胆固醇含量(具体为：取各上清液0.1ml于相应的试管中,加冰醋酸0.3ml,1mg/ml的邻苯二甲醛0.15ml，缓缓加入浓硫酸1.0ml，混合均匀。室温静置10min，于550nm下测吸光值)。每一处理3个重复，以同样方法制作胆固醇标准曲线，计算上清液中胆固醇含量及降解率,结果见表1。可知，CGMCCNO.11763对胆固醇有很好的降解作用，在发酵60h小时后，降解率可达到64.76％。

表1对胆固醇的降解情况。

菌CGMCCNO.11763菌株的耐胆盐试验：

取CGMCCNO.11763菌液1mL接种菌种于含有不同胆盐(含量梯度为0.0％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％)的10mLMRS液体培养基(PH＝6.4)，置于37℃下分别培养0、2、4h，每个处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释度溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37℃生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录计算平板上的菌数个数。结果见表2。可知该菌在胆盐浓度为1％处理4h后菌的生长量依然达到0.59±0.92×10⁷(cfu/ml)，有很好的耐胆盐能力。表2耐胆盐能力检测[(±s)×10⁷cfu/ml]

菌CGMCCNO.11763菌株的耐酸试验

取HLX37母液按1ml接种菌种于不同pH值(pH梯度为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0)的10mLMRS液体培养基，置于37℃下分别培养0、2、4h，每一处理3个重复。各取1ml样品菌液于9ml生理盐水中混匀，制备稀释溶液，取0.1ml稀释液于MRS中涂布，于37℃生化培养箱中倒置培养48小时(每个稀释度做3个平行)记录平板上的菌落个数。结果见表3。说明该菌具有很强的耐酸能力。

表3耐酸能力检测[(±s)×10⁷cfu/ml]

菌CGMCCNO.11763的黏附能力测定

培养CGMCCNO.11763(MRS液体培养基)、大肠杆菌DH5α(LB液体培养基)24h得发酵液，分别置于3000r/min、4℃下离心10min，收集菌泥，分别用pH＝7.0的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤菌泥2次(即在菌落中加入PBS，震荡混合均匀后，置于3000r/min、4℃下离心10min，收集菌体)。自凝集率(％)：用无菌的PBS将菌泥CGMCCNO.11763制成在波长600nm处的吸光值为0.4±0.1(A0)的悬浮菌液及菌悬液,静置24h后测定吸光值A24，自凝集率(％)公式为(A0—A24)/A0。；他凝集率(％)：将CGMCCNO.11763和大肠杆菌DH5α的悬菌液调节成在波长600nm处的吸光值为0.6±0.1(A0)的混合悬浮菌液。静置24H后测定吸光值A24，他凝集率(％)公式为(A0—A24)/A0。测定结果见表5，可知CGMCCNO.11763的自凝集率为95.71％，有很强的黏附能力。

表4黏附能力表

菌株生理特性

所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)XH于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNO.11763，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

该菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，不产芽孢；在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。

理化特征为：过氧化氢酶(-)，明胶液化(-)，吲哚实验(+)，运动性(-)，发酵产气(-)，亚硝酸盐还原(-)，发酵产气(-)，产硫化氢气体(-)，pH4.0MRS培养基中生长(+)。经过生理生化鉴定为为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)XH。

菌株能够在57℃下生长良好，葡萄糖耐受能力为275g/L。

本发明植物乳杆菌由采集人李建树，从新疆维吾尔族老乡家中酸奶中分离得到，采集时间2015年6月2日。

5L发酵罐试验

(1)取斜面上的植物乳杆菌CGMCCNO.11763一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。

(2)将对数期的菌种接入装有3LMRS液体培养基(初始葡萄糖为150g/L)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌CGMCCNO.11763的乳酸产量达到110g/L。这样的产乳酸速率利于泡菜的快速发酵。

(4)将对数期的菌种接入装有3L亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速率流加20g/L的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌CGMCCNO.11763对亚硝酸钠的降解速率。结果发现：在该条件下，XH对亚硝酸钠的降解速率可以达到653mg/h/L。

(5)将对数期的菌种10mL接入装有2kg预处理过的白菜中，按照传统泡菜方法进行加工，每12小时测定泡菜中的亚硝酸盐含量。结果发现，在整个发酵过程中，XH菌对亚硝酸钠的分解速率为10.9mg/h/kg白菜。泡菜中的亚硝酸钠含量始终低于4.8mg/kg，远低于国家标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。

实施例1

100公斤白菜经拣选洗涤切条后分装放入容器中，加入1公斤食盐、蔗糖1.5公斤、加入1公斤混合菌发酵剂，加入香辛料的混合料包，密封容器；控制温度在23℃进行10小时的前期发酵；调温后发酵：控制温度在18℃进行20小时后发酵整个发酵期间容器密封；发酵完毕调味：取出泡菜，加入混合调味料，然后经真空包装冷藏销售或包装灭菌均可。

香辛料的混合料包：花椒1公斤，八角0.1公斤、山奈0.1公斤、排草0.1公斤；

混合调味料：0.5公斤大蒜、0.1公斤辣椒粉、0.2公斤鲜姜、0.05公斤味素粉碎混合；

将发酵制的植物乳杆菌、干酪乳杆菌和酿酒酵母菌粉以重量份数比为1:0.1:0.05混合。

菌粉制备按照常规制备工艺处理获得。

植物乳杆菌和干酪乳杆菌的制备工艺为：

斜面培养基(g/L)：20葡萄糖，5酵母粉，10大豆蛋白胨，10牛肉膏，5NaCl，10乙酸钠，2柠檬酸铵，0.2MgSO₄·7H₂O，0.05MnSO₄·7H₂O，15琼脂，pH6.5。

发酵培养基(g/L)：40葡萄糖，10酵母粉，10大豆蛋白胨，无机盐(0.01NaCl,0.5乙酸钠，0.2柠檬酸铵，0.2KH₂PO₄,0.2MgSO₄·7H₂O,0.05MnSO₄·7H₂O)，pH6.5。

发酵方法：在斜面上取1环接种到500mL摇瓶中，装液量为150mL,在37℃下，150rpm培养24h至对数期,收集菌液。

酿酒酵母的制备工艺：

斜面培养基：10～12°Brix麦芽汁，15琼脂，pH自然。

发酵培养基：10～12°Brix麦芽汁，pH自然。

发酵方法：在斜面上取1环接种到500mL摇瓶中，装液量为150mL,在个不同菌的最适温度下，150rpm培养至对数期,收集菌液。

本例中本发明中植物乳杆菌CGMCC11763，干酪乳杆菌选择CICC23183,酿酒酵母菌选择CICC1415.

实施例2基本同例1

本发明解决的技术问题是提供一种蔬菜生物发酵生产方法。

本发明中蔬菜发酵生产的主要步骤包括：蔬菜清洗，切分，放入泡菜生产容器，按照蔬菜原料质量比0.2-2％加入混合菌发酵剂，加入蔗糖、食盐及香辛料的混合料包，密封容器；控制温度在30℃进行12小时的前期发酵；后期控制温度在20℃进行20小时后发酵，整个发酵期间容器密封；发酵完毕调味：取出泡菜，加入混合调味料，然后经真空包装冷藏销售或包装灭菌均可。所述混合菌发酵剂含有植物乳杆菌。

香辛料的混合料包主要包括花椒、八角、山奈、排草或其他香辛料；

混合调味料包括大蒜、辣椒粉、鲜姜、味素或其他调味料；

所述植物乳杆菌为CGMCC11763。

将培养得到的植物乳杆菌、干酪乳杆菌和酿酒酵母以发酵液体积比为2:0.3:0.05混合。

实验效果：人工品尝实验：从酸味、香味、气味、适口度、质地和综合7个方面打分，各项10分，品评员10人。从评分结果看，B组采用调温发酵产品的分值明显高于A组约36％。

泡菜质量评分表

B组为例1中采用调温发酵产品；

A组为例1中未采用调温发酵但其他条件相同的产品；

B组在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在4.8mg/kg以下。

Claims (7)

1.一种蔬菜生物发酵生产方法，其特征在于，包括：蔬菜清洗，切分，放入泡菜生产容器，按照蔬菜原料质量比0.2-2％加入混合菌发酵剂，加入蔗糖、食盐及香辛料的混合料包，密封容器；控制温度在23-36℃进行10-15小时的前期发酵；后期控制温度在18-22℃进行15-25小时后发酵，整个发酵期间容器密封；发酵完毕调味：取出泡菜，加入混合调味料，然后经真空包装冷藏销售或包装灭菌均可，所述混合菌发酵剂含有植物乳杆菌。

2.根据权利要求1所述的蔬菜生物发酵生产方法，其特征在于，所述香辛料的混合料包主要包括花椒、八角、山奈、排草或其他香辛料。

3.根据权利要求1所述蔬菜生物发酵生产方法，其特征在于，所述混合调味料包括大蒜、辣椒粉、鲜姜、味素或其他调味料。

4.根据权利要求1所述的蔬菜生物发酵生产方法，其特征在于，所述植物乳杆菌为CGMCC11763。

5.根据权利要求1所述的蔬菜生物发酵生产方法，其特征在于，所述混合菌发酵剂中植物乳杆菌、干酪乳杆菌和酿酒酵母以发酵液体积比为1-2:0.1-0.3:0.05-0.2混合。

6.根据权利要求1所述的蔬菜生物发酵生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

100公斤白菜经拣选洗涤后切条后分装放入容器中，加入1公斤食盐、蔗糖1.5公斤、加入1公斤混合菌发酵剂，加入香辛料的混合料包，密封容器；控制温度在23℃进行10小时的前期发酵；调温后发酵：控制温度在18℃进行20小时后发酵整个发酵期间容器密封；发酵完毕调味：取出泡菜，加入混合调味料，然后经真空包装冷藏销售或包装灭菌均可。

7.根据权利要求1所述的蔬菜生物发酵生产方法，其特征在于，所述混合菌发酵剂比例如下植物乳杆菌、干酪乳杆菌和酿酒酵母菌粉以重量份数比为1:0.1:0.05混合。