CN105441349A - 一株新型植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株新型植物乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。所述植物乳杆菌(Lactobacillus？plantarum)tlj-2014保藏号为CGMCC？NO.9405。该菌株乳酸生产速率可以达到35g/L/d，经过71小时发酵后乳酸浓度达到95g/L；具有耐酸性，在pH？1.80时存活良好；降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到9.8mg/h/kg，能够耐1％胆盐。该菌株在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在5mg/kg以下，远低于国家标准GB2714-2003中规定的含量。

Description

一株新型植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一株新型植物乳杆菌及其应用。

背景技术

乳酸菌(lacticacidbacteria，LAB)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。乳酸菌应用在食品中，不仅可以提高食品的营养价值，改善食品风味，提高食品保藏性和附加值，而且大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。由此可见，乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关。可以说，如果乳酸菌停止生长，人和动物就很难健康生存。也正因为如此，乳酸菌被广泛用于各类轻工业、食品、医药及饲料工业等许多行业上。

泡菜是我国传统特色发酵食品的典型代表之一，历史悠久，文化深厚，因其鲜嫩脆爽，酸甜可口，有开胃健脾的作用，备受青睐，深受广大消费者喜爱。四川泡菜的制作是以乳酸菌种发酵为主，兼有酒精发酵、醋酸发酵等微生物的活动等，泡菜的生产是冷加工方法，而这对于蔬菜的营养成分、色泽、气味等的保持均是极其有利。

目前一般采用传统的自然接种发酵或通过人工接种乳杆菌等纯种发酵法进行泡菜的发酵生产。采用人工接种发酵生产泡菜，在提高产品质量的稳定性，缩短发酵的生产周期，保持发酵环境的稳定性等方面优于自然接种。但如果人工接种所用发酵剂对环境的耐受性不够，则对泡菜的色泽、风味、特别是活菌量均有一定的影响。如公开号为CN101720901S的发明专利公开了一种发酵剂发酵泡菜及其制备方法，特别涉及几种纯乳酸菌发酵剂发酵泡菜及其制备方法。该专利所用发酵菌种为植物乳杆菌LP-115、肠膜明串珠菌LM-57和乳酸片球菌P-751，以上菌种对环境的耐受性也比较低，在泡菜保藏销售过程中活菌量很容易降低，不能够很好的突出其活菌的保健功能。

在泡菜的发酵过程中，还存在一难以克服的安全隐患，那就是亚硝酸盐的产生。由于蔬菜在生长过程中很容易积累土壤中的氮元素而形成硝酸盐，蔬菜中的硝酸盐在厌氧发酵的过程中，会因硝酸盐还原作用形成亚硝酸盐。亚硝酸盐对人体有很大的伤害，0.2-0.5g的摄入量会使人中毒，而且其还是强致癌物质亚硝胺的前体，因此，寻求一种降低泡菜中亚硝酸盐含量的方法是很有必要的。如公开号为CN102899262A的发明专利公开了一种植物乳杆菌及其快速降解发酵过程中亚硝酸盐的方法，利用在黄帝椒发酵过程中接入经扩陪的植物乳杆菌种子液进行发酵，发酵结束后加12％的高盐调味；利用此方法发酵黄帝椒亚硝酸盐含量显著降低，也很好的保持了辣椒原有的风味，但是辣椒含盐量过高，长期食用对人体健康有一定的危害。

因此，寻求一种产酸量高、耐受性强且能够降低亚硝酸盐含量的发酵菌剂，对泡菜的发酵工艺具有重要的意义。

发明内容

本发明提供了一株植物乳杆菌，该菌株产酸量高、耐受性强且能够有效降低泡菜生产过程中亚硝酸盐的含量。

本发明的技术方案：

一株植物乳杆菌tlj-2014，所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)tlj-2014于2014年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNO.9405，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

所述植物乳杆菌tlj-2014采用下述流程进行选育：

原始出发菌种→试管活化→硫酸二乙酯(DES)诱变→亚硝基胍(NTG)诱变→等离子体诱变→平板初筛→摇瓶复筛→传代稳定性试验。

所述植物乳杆菌tlj-2014具有下述性质：

(1)乳酸生产速率可以达到35g/L/d，该菌株经过71小时发酵后乳酸浓度达到95g/L；

(2)具有耐酸性，在pH1.80时存活良好；

(3)降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到9.8mg/h/kg(自然发酵过程亚硝酸盐积累的速率大约为1.1mg/h/kg)，能够耐1％胆盐。

有益效果：

本发明所提供的植物乳杆菌tlj-2014经实验发现遗传稳定性较强，在斜面上可连续十次传代，且性状没有明显变化，各项性能指标都正常；乳酸生产速率可以达到35g/L/d，该菌株经过71小时发酵后乳酸浓度达到95g/L；能够在pH为1.80的条件下存活，能够耐1％胆盐；降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到9.8mg/h/kg，该菌种在生产泡菜时，整个发酵过程中亚硝酸盐浓度在5mg/kg以下，远低于国家标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。

具体实施方式

实施例1

菌株特性

所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)tlj-2014于2014年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNO.9405，保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

该菌株特点如下：在显微镜下观察，该菌株为短杆状，革兰氏染色呈阳性，无鞭毛，不产芽孢；在固体培养基上，该菌菌落为白色，表面光滑，致密，形态为圆形，边缘较整齐。

理化特征为：过氧化氢酶(-)，明胶液化(-)，吲哚实验(+)，运动性(-)，发酵产气(-)，亚硝酸盐还原(-)，发酵产气(-)，产硫化氢气体(-)，pH4.0MRS培养基中生长(+)。

实施例2菌株的筛选

本发明植物乳杆菌tlj-2014是自原始出发菌株植物乳杆菌L诱变筛选获得的，所述原始出发菌株植物乳杆菌L由采集人李政，采集于宁夏盐池县育肥羊场的青储饲料，采集时间2013年9月15日。

本发明所采用的出发菌株在MRS葡萄糖培养基中，其乳酸的生产速率为1.5g/L/d,当培养基pH为3.5时几乎停止生长，对亚硝酸钠的分解速率为0.34mg/h/kg白菜。

为了提高其乳酸生产速率、耐酸能力和亚硝酸盐的分解速率，依次采用DES和NTG技术对该菌种进行诱变，诱变后菌株采用MRS碳酸钙平板进行初筛，然后采用500mL摇瓶发酵，生物传感器分析仪对高产菌进行复筛，选育优良的植物乳杆菌菌株，然后做传代实验，评价其遗传稳定性，具体操作步骤如下：

1.DES诱变选育

(1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌L一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂，葡萄糖20g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。

(2)取5mL菌液，5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。

(3)用pH7.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。

(4)取32mLpH7.0的磷酸钾缓冲液、8mL菌悬液、0.4mLDES在预先放入转子的150mL三角瓶中充分混合，使DES最终浓度为1％(v/v)。

(5)在37℃摇床中150rpm反应30min，取1mL混合液，加入0.5mL25％Na2S2O3溶液中止反应。

(6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸钙筛选培养基(含100g/L葡萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中。在37℃培养2～3天后，采用影印法将该筛选平板的菌株转印到pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS培养基(低pH值改性MRS培养基)上和亚硝酸钠筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上。

(7)在37℃培养2～3天后，挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钠筛选培养基上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取出的菌落命名为植物乳杆菌L1。

2.亚硝基胍诱变

(1)在超净台上取试管斜面上的植物乳杆菌L1一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)培养基(葡萄糖浓度为60g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长前期。

(2)取5mL菌液5000rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤2次。

(3)用pH6.0磷酸缓冲液稀释成107个/mL菌悬液。

(4)取10mL菌悬液转移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓度为10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。

(5)在37℃下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。

(6)适当稀释，取最后稀释度的菌液0.2mL，涂布于碳酸钙筛选培养基(含100g/L葡萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中。在37℃培养2～3天后，采用影印法将该筛选平板的菌株转印到pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS培养基(低pH值改性MRS培养基)上和亚硝酸钠筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上。

(7)挑选菌株方法：挑选菌落较大，分别能在LPHMRS培养基、亚硝酸钠筛选培养基上生长并且在碳酸钙筛选培养基上。经初步筛选，挑取100支符合以上条件的菌落。

3.摇瓶复筛

(1)在超净台上分别取各试管斜面上的植物乳杆菌一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)培养基(葡萄糖浓度为100g/L)的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养15h左右，使菌体处于对数生长中期。

(2)分别取5mL菌液，接入装有50mL碳酸钙筛选液体培养基(含250g/L葡萄糖的碳酸钙MRS培养基)平皿中、pH为1.5、1.8和2.0的LPHMRS液体培养基(低pH值改性MRS培养基)和亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)上(注：采用250mL三角瓶)。200rpm，37℃培养3-4天，每天分别检测碳酸钙筛选液体培养基中L-乳酸产生速率、LPHMRS液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速率。发酵结束后，比较100株菌种的碳酸钙筛选液体培养基中L-乳酸产生速率、LPHMRS液体培养基中的生物量和亚硝酸钠液体筛选培养基中亚硝酸盐的消耗速率。

(3)选择兼具高L-乳酸产生速率、耐受低pH(该菌种仅能在最低为pH1.8的培养基中生长)和亚硝酸盐的消耗速率高的菌株，将其命名为L2菌。

4.遗传稳定性试验

将L2菌在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。菌株命名为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)tlj-2014。

实施例35L发酵罐试验

(1)取斜面上的植物乳杆菌L2一环，接入装有50mL培养基MRS(无琼脂)(葡萄糖浓度为150g/L)培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃培养12h左右，使菌体处于对数生长中期。

(2)将对数期的菌种接入装有3LMRS液体培养基(初始葡萄糖为150g/L)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧培养63小时。发酵结束后，植物乳杆菌L2的乳酸产量达到95g/L。这样的产乳酸速率利于泡菜的快速发酵。

(3)将对数期的菌种接入装有3LpH为1.8的LPHMRS液体培养基(初始葡萄糖为50g/L)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧，整个过程用0.5mol/L的氢氧化钠将发酵液pH控制在1.8，总培养时间为48小时。发酵结束后，检测植物乳杆菌L2的生物量为2.5g/L，说明植物乳杆菌L2能够在pH1.8的环境中生存。

(4)将对数期的菌种接入装有3L亚硝酸钠液体筛选培养基(单一氮源为2g/L亚硝酸钠的改性MRS筛选培养基)的5L发酵罐中。接种量为10％，37℃下100rpm培养8小时，对数前期溶氧控制10％(通气0.5L/min)，后期厌氧，发酵过程根据亚硝酸盐的消耗速率流加20g/L的亚硝酸钠溶液，培养2-3天。发酵结束后，计算发酵过程植物乳杆菌L2对亚硝酸钠的降解速率。结果发现：在该条件下，L2对亚硝酸钠的降解速率可以达到563mg/h/L。

(5)将对数期的菌种10mL接入装有2kg预处理过的白菜中，按照传统泡菜方法进行加工，每12小时测定泡菜中的亚硝酸盐含量。结果发现，在整个发酵过程中，L2菌对亚硝酸钠的分解速率为9.8mg/h/kg白菜。泡菜中的亚硝酸钠含量始终低于5mg/kg，远低于国家标准GB2714-2003中规定的含量(20mg/kg)。

Claims (5)

1.一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)tlj-2014，该菌株已于2014年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNO.9405。

2.根据权利要求1所述植物乳杆菌tlj-2014，其特征在于，所述植物乳杆菌乳酸生产速率可以达到35g/L/d，该菌株经过71小时发酵后乳酸浓度达到95g/L。

3.根据权利要求1所述植物乳杆菌tlj-2014，其特征在于，所述植物乳杆菌具有耐酸性，在pH1.80时存活良好。

4.根据权利要求1所述植物乳杆菌tlj-2014，其特征在于，所述植物乳杆菌降解亚硝酸盐速度快，分解能力达到9.8mg/h/kg。

5.权利要求1-4任一权利要求所述植物乳杆菌tlj-2014在发酵生产泡菜中的应用。