CN102643767A - 一株植物乳杆菌及其在红薯茎叶发酵和青贮中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株植物乳杆菌及其在红薯茎叶发酵和青贮中的应用。该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.5027。该菌株能够提高红薯茎叶发酵的营养价值，与自然发酵相比，红薯茎叶经该菌株发酵3d～7d，红薯茎叶的氨基酸总量、粗蛋白和可溶性总糖含量较高，而粗纤维含量较低。红薯茎叶与麸皮或玉米糁混合制成含水量为60％～70％的混合物接种该菌株青贮30d～60d天开封，pH较低，乳酸含量较高。应用本发明所提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027发酵或青贮红薯茎叶具有效率高、成本低廉等优点，可用于生产发酵食品或绿色环保生物饲料。
Description
技术领域
本发明涉及一株植物乳杆菌及其在红薯茎叶发酵和青贮中的应用。
背景技术
红薯(IPomoea batatas)茎叶含有丰富的氨基酸、粗纤维、维生素及一些微量元素等，可以食用，也是畜禽良好的饲料来源，但在收获期存在着量大易脱水，营养物质损耗快的特点，非常不易贮藏。红薯茎叶在我国资源丰富，但除了少部分被利用外，大部分被废弃，以堆积等形式直接倾入环境，造成极大的污染和浪费。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株植物乳杆菌，该菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3-1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.5027。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027的菌落呈现乳白色，边缘整齐；细胞显微形态为短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性；接触酶阴性，氧化酶阴性；具有较强的生长及产酸性能，30℃条件下，在MRS液体培养基中培养24h，菌体浓度可达到108～109cfu/mL，pH≤3.5；其碳源发酵实验结果如表1所示；16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027具有以下生物学特性：
1)在起始pH2.5～pH9.0的条件下能够生长；
2)在5℃～10℃或50℃温度环境下呈现微弱生长，在15℃～45℃条件下生长状况良好；
3)在≤6.5％NaCl的条件下生长状况良好。
本发明所提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027可用于发酵红薯(Ipomoea batatas)茎叶。
本发明的另一个目的是提供一种红薯茎叶发酵食品的制备方法，包括如下步骤：用所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1发酵红薯(Ipomoea batatas)茎叶，得到所述红薯茎叶发酵食品。
在上述红薯茎叶发酵食品的制备方法中，所述发酵按照每克所述红薯(Ipomoeabatatas)茎叶接种105cfu～106cfu所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027进行。
在上述红薯茎叶发酵食品的制备方法中，所述发酵按照包括如下步骤的方法进行：将所述红薯(Ipomoea batatas)茎叶、NaCl和水按照80∶1∶20～80∶3∶20的质量比混合后接种所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027。
在上述红薯茎叶发酵食品的制备方法中，所述发酵的温度为25℃～30℃，所述发酵的时间为3～7d。
本发明还提供一种青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：用所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027对如下1)或2)的青贮原料进行固体发酵，收集所有发酵产物，得到所述青贮饲料：
1)红薯(Ipomoea batatas)茎叶和麸皮以72.99∶27.01～90.42∶9.58的质量比混合制成的含水量为60％～70％的混合物；
2)红薯(Ipomoea batatas)茎叶和玉米糁以72.95∶27.05～90.4∶9.6的质量比混合制成的含水量为60％～70％的混合物；
所述青贮饲料是将所述青贮原料在厌氧的条件下进行发酵得到的饲料。
在上述青贮饲料的制备方法中，所述发酵按照每克所述青贮原料接种105cfu～106cfu所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027进行。
在上述青贮饲料的制备方法中，所述发酵的温度为室温，所述发酵的时间为30d～60d，所述室温为15℃～25℃。
上述任一所述方法制备得到的所述红薯茎叶发酵食品及上述任一所述方法制备得到的所述青贮饲料均属于本发明的保护范围。
实验证明，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027能够提高红薯茎叶发酵的营养价值。与自然发酵相比，接种发酵3d后红薯茎叶中的各种氨基酸含量都有不同程度的增加，氨基酸总量增加了42.04％，其中赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和异亮氨酸分别增加了54.24％、58.33％、38.89％和42.86％。
红薯茎叶与麸皮或玉米糁混合制成含水量为60％～70％的混合物青贮，30d～60d开封，每克发酵产物中的乳酸菌均为107～108cfu，未检测到大肠杆菌、酵母及霉菌，且不含易引起恶臭的丁酸。与红薯茎叶单独青贮相比，红薯茎叶和麸皮或玉米糁混合青贮，pH较低，乳酸含量明显较高，说明红薯茎叶适合与麸皮或玉米糁混合作为青贮原料。将含水量较高的红薯茎叶和含水量较低的麸皮或玉米糁混合成含水量为60％～70％的混合物青贮，不仅可以把含水量调整到适合青贮的水平，还由于混合后的饲料营养成分较为全面、均衡，饲喂此混合青贮饲料能够在保证干物质摄入量的同时，有效增加乳酸菌及其代谢产物的摄入量。
使用本发明所提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027发酵或青贮红薯茎叶具有效率高、成本低廉等优点，可用于生产发酵食品或绿色环保生物饲料。
保藏说明
菌种名称：植物乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus plantarum
菌株编号：Z3-1
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2011年7月5日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5027
附图说明
图1为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027发酵液对革兰氏阳性及阴性指示菌的抑菌圈。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
MRS液体培养基：溶剂为水，溶质为蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温-801.0g/L，乙酸钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，pH值为6.5。
MRS固体培养基：每升上述MRS液体培养基添加15g琼脂制备得到的培养基。
红薯茎叶：为发育至红薯成熟时期的红薯(Ipomoea batatas)茎叶经过刈割处理后得到的，平均粒径为2mm，含水量为75.5％，切割为5cm长度。
麸皮：为小麦最外层的表皮，小麦被磨面机加工后得到的，含水量为18.1％。
玉米糁：将玉米的成熟籽粒去皮后磨成的小颗粒，平均粒径为1mm，含水量为18.2％。
豆粕：含水量为10％。
花菜外包叶：为发育至花菜成熟时期的花菜(Brassica oleracea)外包叶，含水量为81.1％，切割长度为5cm。
实施例1、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027的分离、纯化与鉴定
取河南郑州地区青贮玉米秸秆10g，加入90mL蒸馏水，用震荡器震荡5min，10-1-10-5梯度稀释。分别从各梯度稀释液中取20μL涂布于MRS固体培养基上，静置厌氧培养48h，挑取菌落形态、大小、颜色和光泽度等有明显差别的单菌落，重复划线，直至得到纯菌落。将菌株接种于MRS液体培养基中30℃培养24h，10000rpm离心10min后，取20μL上清液，以藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella enterica)、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和大肠杆菌(Escherichia coli)分别作为指示菌，用牛津杯双层平板法进行抑菌试验，如图1所示，从中筛选出抑菌效果好的Z3-1菌株。
将Z3-1菌株在MRS固体培养基上培养24h后，观察菌落的大小、颜色、边缘状况及革兰氏染色镜检细菌形态。利用API 50CH检测Z3-1菌株对49种不同碳源的同化能力。结果：Z3-1菌株菌落呈现乳白色，边缘整齐；Z3-1菌株细胞显微形态为短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性；Z3-1菌株接触酶阴性，氧化酶阴性；Z3-1菌株具有较强的生长及产酸性能，在MRS液体培养基中培养24h，菌体浓度可达到108～109cfu/mL，pH≤3.5。Z3-1菌株的碳源发酵实验结果如表1所示；16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示。根据细胞显微形态、碳源发酵实验结果和16S rRNA基因序列数据，将菌株Z3-1鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，并于2011年7月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记编号为CGMCC No.5027。
表1.Z3-1菌株的碳源发酵实验结果
| 碳源 | Substrate | Z3-1 |
| 甘油 | Glycerol | - |
| 赤藓醇 | Erythritol | - |
| D-阿拉伯糖 | D-Arabinose | - |
| L-阿拉伯糖 | L-Arabinose | + |
| 核糖 | Ribose | + |
| D-木糖 | D-Xylose | - |
| L-木糖 | L-Xylose | - |
| 阿东醇 | Adonitol | - |
| β-甲基-D木糖甙 | β-Methyl-xyloside | - |
| 半乳糖 | Galactose | + |
| D-葡萄糖 | D-Glucose | + |
| D-果糖 | D-Fructose | + |
| D-甘露糖 | D-Mannose | + |
| L-山梨糖 | L-Sorbose | - |
| 鼠李糖 | Rhamnose | - |
| 卫茅醇 | Dulcitol | - |
| 肌醇 | Inositol | - |
| 甘露醇 | Mannitol | + |
| 山梨醇 | Sorbitol | + |
| α-甲基-D-甘露糖甙 | α-Methyl-D-mannoside | + |
| α-甲基-D-葡萄糖甙 | α-Methyl-D-glucoside | - |
| N-乙酰-葡萄胺 | N-acetyl glucosamine | + |
| 苦杏仁甙 | Amygdaline | + |
| 熊果甙 | Arbutine | + |
| 七叶灵 | Esculine | + |
| 柳醇 | Salicine | + |
| 纤维二糖 | Cellobiose | + |
| 麦芽糖 | Maltose | + |
| 乳糖 | Lactose | + |
| 蜜二糖 | Melibiose | + |
| 蔗糖 | Saccharose | + |
| 海藻糖 | Trehalose | + |
| 菊糖 | Inuline | - |
| 松三糖 | Melezitose | + |
| D-棉子糖 | D-Raffinose | w |
| 淀粉 | Starch | - |
| 糖原 | Glycogene | - |
| 木糖醇 | Xylitol | - |
| β-牻牛儿糖 | β-Gentiobiose | + |
| D-松二糖 | D-Turanose | + |
| D-来苏糖 | D-Lyxose | - |
| D-塔格糖 | D-Tagatose | - |
| D-岩糖 | D-Fucose | - |
| L-岩糖 | L-Fucose | - |
| D-阿拉伯糖醇 | D-Arabitol | w |
| L-阿拉伯糖醇 | L-Arabitol | - |
| 葡萄糖酸盐 | Gluconate | + |
| 2-酮基-葡萄糖酸盐 | 2-ceto-gluconate | - |
| 5-酮基-葡萄糖酸盐 | 5-ceto-gluconate | - |
注：“+”为阳性；“-”为阴性；“w”为弱阳性。
以下实施例中所述Z3-1如无特殊说明，均为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3-1CGMCC No.5027。
实施例2、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027在不同pH、温度及盐浓度环境条件下的生长
用1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠将MRS培养基的起始pH值分别调至2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0，30℃恒温静置培养植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.502724h，培养过程中不调酸，用分光光度计测定600nm处光吸收值(OD600)。结果如表2所示，Z3-1菌株能够在起始pH2.5～pH9.0的条件下生长。
将活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027菌株接种于MRS液体培养基，分别在5，10，15，20，25，30，35，40，42，50℃等温度下培养24h，用分光光度计测定600nm处光吸收值(OD600)。结果如表2所示，Z3-1菌株在5℃～10℃或50℃温度环境下呈现微弱生长，在15℃～45℃条件下生长状况良好。
将活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027菌株分别接种于含NaCl的质量百分含量为3％和6.5％的MRS液体培养基中培养24h，用分光光度计测定600nm处光吸收值(OD600)。结果如表2所示，Z3-1菌株能够在3％和6.5％NaCl的条件下生长。
表2.Z3-1菌株CGMCC No.5027在不同环境条件下的生长情况
| pH | Z3-1 | 温度 | Z3-1 | NaCl(％) | Z3-1 |
| 2.5 | + | 5℃ | w | 3.0 | + |
| 3.0 | + | 10℃ | w | 6.5 | + |
| 3.5 | + | 15℃ | + | ||
| 4.0 | + | 20℃ | + | ||
| 4.5 | + | 25℃ | + | ||
| 5.0 | + | 30℃ | + | ||
| 5.5 | + | 35℃ | + | ||
| 6.0 | + | 40℃ | + | ||
| 7.0 | + | 45℃ | + | ||
| 8.0 | + | 50℃ | w | ||
| 9.0 | + |
注：“+”表示生长，“-”表示不生长“W”表示微弱生长。
实施例3、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027发酵红薯茎叶
制备菌悬液：无菌条件下，取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCCNo.5027，接种于MRS液体培养基中30℃培养，得到Z3-1含量为108～109cfu/mL的菌悬液。
方法I
1、设2个处理(每个处理3次重复，结果以平均值表示)：
处理1(接种Z3-1发酵)：取200g红薯茎叶、50g水和2.5gNaCl混合，再按每克红薯茎叶加105cfu Z3-1的比例加入上述Z3-1菌悬液，将获得混合物装入青贮袋中混匀，抽气后(袋中的气压为零)厌氧25℃放置3d。
处理2(自然发酵)：取200g红薯茎叶、50g水和2.5g NaCl混合，再加入与处理1中的Z3-1菌悬液体积相同但不含Z3-1的MRS液体培养基，将上述混合物装入青贮袋中混匀，抽气后(袋中的气压为零)厌氧25℃放置3d。
分别记录两个处理发酵后青贮袋内液体的pH值，并对经过自然发酵与接种Z3-1发酵的红薯茎叶中游离氨基酸组成及含量、粗蛋白、可溶性总糖及粗纤维含量进行检测分析(由农业部农产品质量监督检验测试中心(郑州)测试，检测依据分别为GB/T5009.124-2003、GB/T 6432-1994、参GB/T 5009.9-2008、GB/T 5009.10-2003)
2、实验结果
放置3天后，自然发酵与接种Z3-1发酵红薯茎叶的pH值分别为4.12和3.65；其它结果如表3和表4所示。与自然发酵相比，接种Z3-1发酵后红薯茎叶中各种氨基酸含量都有不同程度的增加，氨基酸总量增加了42.04％，其中，赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和异亮氨酸分别增加了54.24％、58.33％、38.89％和42.86％。与自然发酵相比，接种Z3-1发酵后红薯茎叶的可溶性总糖含量较高，粗蛋白含量提高了20.34％，而粗纤维含量降低了17.68％。结果表明，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCCNo.5027能够明显提高红薯茎叶发酵的营养价值。
表3.自然发酵与接种Z3-1发酵后的红薯茎叶中游离氨基酸的组成及含量
| 游离氨基酸 | 自然发酵(g/Kg) | 接种Z3-1发酵(g/Kg) |
| 天冬氨酸 | 1.97 | 2.59 |
| 苏氨酸 | 0.90 | 1.25 |
| 丝氨酸 | 0.82 | 1.03 |
| 谷氨酸 | 2.25 | 3.10 |
| 甘氨酸 | 1.03 | 1.45 |
| 丙氨酸 | 1.12 | 1.59 |
| 胱氨酸 | 0.13 | 0.15 |
| 缬氨酸 | 1.08 | 1.48 |
| 蛋氨酸 | 0.24 | 0.38 |
| 异亮氨酸 | 0.84 | 1.20 |
| 亮氨酸 | 1.63 | 2.32 |
| 酪氨酸 | 0.77 | 1.11 |
| 苯丙氨酸 | 1.19 | 1.71 |
| 赖氨酸 | 1.18 | 1.82 |
| 组氨酸 | 0.44 | 0.74 |
| 精氨酸 | 1.01 | 1.66 |
| 脯氨酸 | 0.86 | 1.22 |
| 总和 | 17.46 | 24.80 |
表4.自然发酵与接种Z3-1发酵后的红薯茎叶中的化学成分
| 自然发酵(％) | 接种Z3-1发酵(％) | |
| 粗蛋白 | 2.36 | 2.84 |
| 可溶性总糖 | 0.16 | 0.83 |
| 粗纤维 | 1.81 | 1.49 |
方法II
设2个处理(每个处理3次重复，结果以平均值表示)：
处理1(接种Z3-1发酵)：取200g红薯叶、50g水和7.5gNaCl混合，再按每克红薯茎叶加106cfu Z3-1的比例加入Z3-1菌悬液，将上述混合物装入青贮袋中混匀，抽气后(袋中的气压为零)厌氧30℃放置7天。
处理2(自然发酵)：取200g红薯叶、50g水和7.5gNaCl混合，再加入与处理1中的Z3-1菌悬液体积相同但不含Z3-1的MRS液体培养基，将上述混合物装入青贮袋中混匀，抽气后(袋中的气压为零)厌氧30℃放置7天。
按照与方法I相同的方法，分别记录两个处理发酵后青贮袋内液体的pH值，并对经过自然发酵与接种Z3-1发酵的红薯茎叶中游离氨基酸组成及含量、粗蛋白、可溶性总糖及粗纤维含量进行检测分析。
3、实验结果
放置7d后，自然发酵与接种Z3-1发酵红薯茎叶的pH分别为：3.52和3.25；与自然发酵相比，接种Z3-1发酵后红薯茎叶粗蛋白含量明显提高，而粗纤维含量明显降低。结果表明，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027能够明显提高红薯茎叶发酵的营养价值。
方法III
设2个处理(每个处理3次重复，结果以平均值表示)：
处理1(接种Z3-1发酵)：取200g红薯茎叶、50g水和5gNaCl混合，再按每克红薯茎叶加5×105cfu Z3-1的比例加入Z3-1菌悬液，将上述混合物装入青贮袋中混匀，抽气后(袋中的气压为零)厌氧28℃放置5天。
处理2(自然发酵)：取200g红薯茎叶、50g水和5gNaCl混合，再加入与处理1中的Z3-1菌悬液体积相同的不含Z3-1的MRS液体培养基，将上述混合物装入青贮袋中混匀，抽气后(袋中的气压为零)厌氧28℃放置5d。
按照与方法I相同的方法，分别记录两个处理发酵后青贮袋内液体的pH值，并对经过自然发酵与接种Z3-1发酵的红薯茎叶中游离氨基酸组成及含量、粗蛋白、可溶性总糖及粗纤维含量进行检测分析。
3、实验结果
放置5d后，自然发酵与接种Z3-1发酵红薯茎叶的pH分别为：3.85和3.5；与自然发酵相比，接种Z3-1发酵后红薯茎叶粗蛋白含量明显提高，而粗纤维含量明显降低。结果表明，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027能够明显提高红薯茎叶发酵的营养价值。
实施例4、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027青贮红薯茎叶
方法I
1、制备菌悬液：无菌条件下，取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCCNo.5027，接种于MRS液体培养基中30℃培养，得到Z3-1含量为108～109cfu/mL的菌悬液。
2、设4个处理(每个处理3次重复，结果以平均值表示)
按表5分别取青贮原料100g，按每克青贮原料加105cfu Z3-1取步骤1制备的Z3-1菌悬液，装入青贮袋中混匀，抽气后(袋中的气压为零)厌氧15℃～25℃(室温)存放30d时开封，记录发酵产物的pH值，采用稀释平板计数法测定发酵产物的活菌数，并测定各处理发酵产物中的有机酸组成及含量。
上述有机酸组成及含量测定采用色谱柱Column Type：Carbomix H-NP10：8％，7.8×300mm，柱温：55℃，流速：0.6ml/min，流动相：2.5mM H2SO4，注入样品量：10ul，旋光性：非极性，UV检测器214nm。
表5.4个处理的青贮原料组成及含水量(I)
| 处理 | 青贮原料组成 | 青贮原料含水量 |
| 1 | 红薯茎叶 | 75.5％ |
| 2 | 红薯茎叶与麸皮(以90.42∶9.58的质量比混合) | 70％ |
| 3 | 红薯茎叶与玉米糁(以90.4∶9.6的质量比混合) | 70％ |
| 4 | 红薯茎叶与豆粕(以91.6∶8.4的质量比混合) | 70％ |
3、实验结果
红薯茎叶单独青贮和以红薯茎叶与麸皮或玉米糁混合组成的含水量为70％的混合物青贮，30d开封，各处理组中的乳酸菌在107～108之间，已检测不到大肠杆菌、酵母及霉菌。如表6所示，与红薯茎叶单独青贮相比，红薯茎叶与麸皮或玉米糁混合青贮，pH较低，乳酸含量明显较高。各处理均未检测到容易引起恶臭的丁酸。红薯茎叶与豆粕混合组成的含水量为70％的混合物青贮，30d开封时pH值测定结果为5.0，且气味不佳。
表6.红薯茎叶、红薯茎叶与麸皮或玉米糁或豆粕混合成含水量为70％的混合物青贮30d的pH值及有机酸组成
注：FM为新鲜样的重量。
方法II
1、制备菌悬液：无菌条件下，取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCCNo.5027，接种于MRS液体培养基中30℃培养，得到Z3-1含量为108～109cfu/mL的菌悬液。
2、设4个处理(每个处理3次重复，结果以平均值形式表示)
按表7分别取青贮原料100g，按每克青贮原料加106cfu Z3-1取步骤1制备的Z3-1菌悬液，装入青贮袋中混匀，抽气后(袋中的气压为零)厌氧15℃～25℃(室温)存放60d时开封，记录发酵产物的pH值，采用稀释平板计数法测定发酵产物的活菌数，并测定各处理发酵产物中的有机酸组成及含量，结果如表8所示，测定方法同方法I。
表7.4个处理的青贮原料及其含水量(II)
| 处理 | 青贮原料组成 | 青贮原料含水量 |
| 1 | 红薯茎叶 | 75.5％ |
| 2 | 红薯茎叶与麸皮(以72.99∶27.01的质量比混合) | 60％ |
| 3 | 红薯茎叶与玉米糁(以72.95∶27.05的质量比混合) | 60％ |
| 4 | 红薯茎叶与豆粕(以76.34∶23.66的质量比混合) | 60％ |
3、实验结果
以红薯茎叶单独青贮和以红薯茎叶与麸皮或玉米糁混合制成的含水量为60％的混合物青贮，60d开封，各处理组中的乳酸菌在107～108cfu/g FM之间，已检测不到大肠杆菌、酵母及霉菌。如表8所示，与红薯茎叶单独青贮相比，红薯茎叶和麸皮、玉米糁混合青贮，pH较低，乳酸含量明显较高。各处理均未检测到容易引起恶臭的丁酸。红薯茎叶与豆粕混合组成的含水量为60％的混合物青贮，60d开封时pH值测定结果为4.8，且气味不佳。
表8.红薯茎叶、红薯茎叶与麸皮或玉米糁或豆粕混合成含水量为60％的混合物青贮60d的pH值及有机酸组成
注：FM为新鲜样的重量。
实施例5、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027青贮全株小麦
全株小麦：为发育至乳熟期的小麦(Triticum spp.)的茎、叶和种子切割成1～2cm长度，含水量为54％。
方法I
1、制备菌悬液
无菌条件下，取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027，接种于MRS液体培养基中30℃培养，得到Z3-1含量为108～109cfu/mL的菌悬液。
2、设两个处理(每个处理3次重复，结果以平均值形式表示)
处理1(接种Z3-1青贮)：取100g全株小麦，按每克青贮原料加105cfu Z3-1取步骤1制备的Z3-1菌悬液，装入青贮袋中混匀，抽气后(袋内气压为零)厌氧15℃～25℃(室温)存放。
处理2(自然青贮)：取100g全株小麦加入与处理1同样体积的不含Z3-1的MRS液体培养基，装入青贮袋中混匀，抽气后(袋内气压为零)厌氧15℃～25℃(室温)存放。
分别于0、3、5、10、15、30d时开封，记录各处理发酵产物的pH值，并采用稀释平板计数法测定发酵产物中的活菌数。30d开封时测定各处理得到的发酵产物中有机酸组成、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维含量及氨态氮占总氮的百分比。
上述有机酸组成及含量测定条件为：采用色谱柱Column Type：CarbomixH-NP10：8％，7.8×300mm，柱温：55℃，流速：0.6ml/min，流动相：2.5mM H2SO4，注入样品量：10ul，旋光性：非极性，UV检测器214nm。
上述粗蛋白、粗脂肪、粗纤维含量及氨态氮占总氮的百分比的检测由农业部农产品质量监督检验测试中心(郑州)测试，检测依据分别为GB/T 6432-1994、GB/T6433-2006、GB/T 6434-2006和Q/NYNJ 02-2002。
3、实验结果
如表9～11所示，结果表明：全株小麦经青贮后均检测不到容易引起恶臭的丁酸。与自然青贮相比，接种Z3-1青贮后发酵产物的pH降低较快，5d即降到4.0以下，而自然青贮至30d，pH值仍高于4.0。接种Z3-1青贮15d全株小麦大肠杆菌即低于检测线，而自然青贮30d大肠杆菌才低于检测线。接种Z3-1青贮30d有机酸中乳酸的含量较自然青贮提高196％，乙酸提高159％，粗蛋白含量提高8.32％，粗纤维含量降低12.6％。因此，与自然青贮相比，接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCCNo.5027能够明显提高全株小麦青贮的营养价值。
表9.自然青贮和接种Z3-1青贮过程中的pH及微生物含量(1g cfu/g FM)
注：nd为低于检测线；FM为新鲜样的重量。
表10.青贮30d全株小麦的pH及有机酸组成(％FM)
| 青贮方式 | pH | 乳酸 | 乙酸 | 丙酸 | 丁酸 |
| 自然青贮 | 4.20 | 1.25 | 0.37 | - | - |
| 接种Z3-1青贮 | 3.49 | 3.70 | 0.96 | - | - |
注：％FM为新鲜样中有机酸的质量百分含量。
表11.青贮30d全株小麦的营养成分
| 粗蛋白(％DM) | 粗脂肪(％DM) | 粗纤维(％DM) | 氨态氮/总氮(％) | |
| 自然青贮 | 9.62 | 3.24 | 26.28 | 11.0 |
| 接种Z3-1青贮 | 10.42 | 3.32 | 22.97 | 10.8 |
注：％DM为干物质中营养物质的质量百分含量。
方法II
1、制备菌悬液
无菌条件下，取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027，接种于MRS液体培养基中30℃培养，得到Z3-1含量为108～109cfu/mL的菌悬液。
2、设两个处理(每个处理3次重复，结果以平均值形式表示)
处理1(接种Z3-1青贮)：取100g全株小麦，按每克青贮原料加106cfu Z3-1取步骤1制备的Z3-1菌悬液，装入青贮袋中混匀，抽气后(袋内气压为零)厌氧15℃～25℃(室温)存放。
处理2(自然青贮)：取100g全株小麦加入与处理1同样体积的不含Z3-1的MRS液体培养基，装入青贮袋中混匀，抽气后(袋内气压为零)厌氧15℃～25℃(室温)存放。
于60天时开封，分别记录两个处理发酵产物的pH值，并采用稀释平板计数法测定发酵产物中的活菌数。60天开封时按照与方法I相同的方法测定各处理得到的发酵产物中有机酸组成、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维含量及氨态氮占总氮的百分比。
3、实验结果
与自然青贮相比，接种Z3-1青贮全株小麦后乳酸、乙酸和粗蛋白含量明显提高，粗纤维含量明显降低。因此，接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCCNo.5027能够明显提高全株小麦青贮的营养价值。
实施例6、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027青贮花菜外包叶
1、制备菌悬液：无菌条件下，取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCCNo.5027，接种于MRS液体培养基中30℃培养，得到Z3-1含量为108～109cfu/mL。
2、设4个处理(每个处理3次重复，结果以平均值表示)
按表12分别取青贮原料100g，按每克青贮原料加105cfu Z3-1取步骤1制备的Z3-1菌悬液，装入青贮袋中混匀，抽气后(袋中的气压为零)厌氧15℃～25℃(室温)存放30d，并于30d开封，记录发酵产物的pH值，采用稀释平板计数法测定发酵产物的活菌数，并测定各处理发酵产物中的有机酸组成及含量。
上述有机酸组成及含量测定采用色谱柱Column Type：Carbomix H-NP10：8％，7.8×300mm，柱温：55℃，流速：0.6ml/min，流动相：2.5mM H2SO4，注入样品量：10ul，旋光性：非极性，UV检测器214nm。
表12.4个处理的青贮原料及其含水量
| 处理 | 青贮原料组成 | 含水量 |
| 1 | 花菜外包叶 | 81.1％ |
| 2 | 花菜外包叶与麸皮(以82.38∶17.62的质量比混合) | 70％ |
| 3 | 花菜外包叶与玉米糁(以82.35∶17.65的质量比混合) | 70％ |
| 4 | 花菜外包叶与豆粕(以84.39∶15.61的质量比混合) | 70％ |
3、实验结果
以花菜外包叶单独青贮和以花菜外包叶与麸皮或玉米糁混合组成的含水量为70％的混合物青贮，30d开封，各处理组中每克发酵产物中的乳酸菌在107～108cfu之间，已检测不到大肠杆菌、酵母及霉菌。如表13所示，与花菜外包叶单独青贮相比，花菜外包叶与麸皮或玉米糁混合青贮，pH较低，乳酸含量明显较高。各处理均未检测到容易引起恶臭的丁酸。然而，花菜外包叶与豆粕混合组成的含水量为70％的混合物青贮，30d开封时pH值测定结果为5.3，且气味不佳。
表13.花菜外包叶单独、花菜外包叶与麸皮或玉米糁混合制成的含水量为70％的混合物青贮30d的pH值、有机酸组成及微生物组成
注：％FM为新鲜样中有机酸的质量百分含量；cfu/g FM为每克新鲜样中微生物的活菌数。
实施例7、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027青贮花花菜外包叶
1、制备菌悬液：无菌条件下，取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCCNo.5027，接种于MRS液体培养基中30℃培养，得到Z3-1含量为108～109cfu/mL。
2、设4个处理(每个处理3次重复，结果以平均值表示)
按表14分别取青贮原料100g，按每克青贮原料加106cfu Z3-1取步骤1制备的Z3-1菌悬液，装入青贮袋中混匀，抽气后(袋中的气压为零)厌氧15℃～25℃(室温)存放60d，并于60d开封，记录发酵产物的pH值，采用稀释平板计数法测定发酵产物的活菌数，并测定各处理发酵产物中的有机酸组成及含量。
上述有机酸组成及含量的测定方法同实施例6。
表14.4个处理的青贮原料及其含水量
| 处理 | 青贮原料组成 | 含水量 |
| 1 | 花菜外包叶 | 81.1％ |
| 2 | 花菜外包叶与麸皮(以66.51∶33.49的质量比混合) | 60％ |
| 3 | 花菜外包叶与玉米糁(以66.45∶33.55的质量比混合) | 60％ |
| 4 | 花菜外包叶与豆粕(以70.32∶29.68的质量比混合) | 60％ |
3、实验结果
以花菜外包叶单独青贮和以花菜外包叶与麸皮或玉米糁混合制成的含水量为60％的混合物青贮，60d开封，各处理组中每克发酵产物中的乳酸菌在107～108cfu之间，已检测不到大肠杆菌、酵母及霉菌。如表15所示，与花菜外包叶单独青贮相比，花菜外包叶和麸皮、玉米糁混合青贮，pH较低，乳酸含量明显较高。各处理均未检测到容易引起恶臭的丁酸。然而，花菜外包叶与豆粕混合组成的含水量为60％的混合物青贮，60d开封时pH值测定结果为4.69，且气味不佳。
表15.花菜外包叶单独、花菜外包叶与麸皮或玉米糁混合制成的含水量为60％的混合物青贮60d的pH值、有机酸组成及微生物组成
注：％FM为新鲜样中有机酸的质量百分含量；cfu/g FM为每克新鲜样中微生物的活菌数。
将含水量较高的花菜外包叶和含水量较低的麸皮或玉米糁混合成含水量为60％～70％的混合物青贮，不仅可以把含水量调整到适合青贮的水平，还由于混合后的饲料营养成分较为全面、均衡。饲喂此混合青贮饲料能够在保证干物质摄入量的同时，有效增加乳酸菌及其代谢产物的摄入量。
Claims (10)
1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.5027。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027在发酵红薯(Ipomoea batatas)茎叶中的应用。
3.一种红薯茎叶发酵食品的制备方法，包括如下步骤：用权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027发酵红薯(Ipomoeabatatas)茎叶，得到所述红薯茎叶发酵食品。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵按照每克所述红薯(Ipomoeabatatas)茎叶接种105cfu～106cfu所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027进行。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵按照包括如下步骤的方法进行：将所述红薯(Ipomoea batatas)茎叶、NaCl和水按照80∶1∶20～80∶3∶20的质量比混合后接种所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵的温度为25℃～30℃，所述发酵的时间为3d～7d。
7.一种青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：用权利要求1所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027对如下1)或2)的青贮原料进行固体发酵，收集所有发酵产物，得到所述青贮饲料：
1)红薯(Ipomoea batatas)茎叶和麸皮以72.99∶27.01～90.42∶9.58的质量比混合制成的含水量为60％～70％的混合物；
2)红薯(Ipomoea batatas)茎叶和玉米糁以72.95∶27.05～90.4∶9.6的质量比混合制成的含水量为60％～70％的混合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述发酵按照每克所述青贮原料接种105cfu～106cfu所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027进行。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述发酵的温度为室温，所述发酵的时间为30d～60d，所述室温为15℃～25℃。
10.权利要求3-6中任一所述方法制备得到的所述红薯茎叶发酵食品及权利要求7-9任一所述方法制备得到的所述青贮饲料。
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