CN103598420A - 一种香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂及其制备方法，包括以下几个步骤：步骤A:制备植物乳杆菌冻干菌剂；步骤B:制备冻干产朊假丝酵母；步骤C:制备冻干单宁酶；步骤D：依次复活植物乳杆菌冻干菌剂、产朊假丝酵母和单宁酶；步骤E：将所得到的复活菌剂充分搅拌后制成复活水，保持复活水中含菌量在10⁸cfu/mL~10¹⁰cfu/mL；步骤F:将香蕉茎叶切成2-4cm大小，处理至其含水量在60%~65%左右，将步骤E所得的复活水与香蕉茎叶搅拌均匀，装入发酵桶中，压实、密封后在常温下避光，即可制得香蕉茎叶青贮饲料。本发明采用以上方法，可以变废为宝，能清除和钝化香蕉茎叶中不利于消化的单宁，降低纤维素含量，开发出优质的青贮饲料，产生巨大的经济效益。

Description

一种香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种微生物饲料添加剂领域中的复合菌剂及其制备方法，尤其涉及一种用于香蕉茎叶青贮饲料中的微生物复合菌剂及其制备方法。

背景技术

青贮饲料就是把青（半干）饲料装入青贮窖内，在厌氧条件下，靠乳酸菌发酵制成能长期保存的饲料。这种饲料能有效地保存青绿植物的营养成分，保证原料青绿时的鲜嫩汁液，气味芳香，质地柔软，适口性强，采食量高，内含营养物质的消化利用率最高。实践证明，青贮饲料是科学养畜，特别是饲养反刍家畜必不可少的基础饲料。

青贮饲料经过厌氧微生物发酵后，营养物质得以保存，而且在发酵过程中微生物的活动可以产生很多动物所需要的小分子营养物质。微生物菌体本身可提供菌体蛋白，添加一定的微生物可以降解原料中的纤维素成分转化为小分子的单糖、寡糖或者低聚糖，所以微生物菌剂与化学添加剂相比，有着安全、易操作、无污染等优点，近年来被广泛采用。

常用青贮原料有玉米、苜蓿、甘薯和南瓜等，但香蕉茎叶作为青贮饲料原料比较少见。香蕉的茎叶是香蕉生产的主要副产品，长期以来这些茎叶、果轴等产物往往被作为废弃物处理，不仅污染环境，也造成了很大的浪费。研究发现，香蕉果轴中含有大量的纤维素和半纤维素，香蕉茎叶中含有蛋白质、脂肪、纤维素等营养物质，如香蕉茎叶干物质中含有23.7%的粗纤维，6.4%的粗蛋白，0.8%的粗脂肪和56%的无氮浸出物。与其他农作物秸秆相比，其无氮浸出物含量丰富，粗纤维含量低，营养价值和能量高，可作为优质的饲料资源。

如将香蕉茎秆加工成青贮饲料，对充分利用农作物资源，促进畜牧业的科学发展，扩大饲料资源、降低饲料成本，循环发展农牧业，减少环境污染，提高农民增收等一系列国计民生都有着巨大的现实意义和深远的战略意义。

香蕉茎叶中含有大量有毒性的聚合程度小而活性大的单宁（鞣酸），它不但影响适口性，而且能抑制多种酶的活性，随动物的采食量增加而使消化率下降，同时它还影响到对其它饲料蛋白质的吸收，因此，将新鲜的香蕉茎叶直接作为饲料资源是不科学的，而如何除去单宁是开发利用香蕉茎叶的关键。

香蕉茎叶的粗蛋白很低，制约着它的深加工发展。另外，香蕉茎叶富含纤维素、半纤维素和木质素，很难被降解，近几十年来国内外都采用物理、化学等处理方法，但降解率仍然很低，故营养价值提高幅度不大，制约着其发展。

并且，香蕉栽培在北纬30o以内，广西尤其是香蕉主产区，有着丰富的资源，如果能把香蕉茎叶作为青贮饲料的技术难题克服，无疑对广西甚至全国的香蕉种植产业有巨大的经济效益和社会效益。

发明内容

本发明针对香蕉茎叶作为饲料本身单宁含量高、粗纤维多、粗蛋白含量少等不足，提供一种微生物复合菌剂，使青贮饲料具有更好的适口性、更低的纤维素含量和更高的蛋白含量，全面提升其营养价值。

本发明提供一种用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂，包括：植物乳杆菌冻干菌剂、产朊假丝酵母冻干粉剂和单宁酶冻干粉剂。

本发明还提供一种制备用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，包括以下几个步骤：

步骤A: 制备植物乳杆菌冻干菌剂：将植物乳杆菌NL4-10，接种于MRS培养基中，静置培养至稳定期，离心后去上清液，菌泥用无菌磷酸盐缓冲液洗涤后，离心后重悬于无菌磷酸盐缓冲液，加入等体积的脱脂乳溶液作为保护剂，预冻，再后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，即可获得植物乳杆菌冻干菌剂；

步骤B: 制备冻干产朊假丝酵母：将产朊假丝酵母GIM2.148接种量，接种于麦芽汁培养基中，静置培养至稳定期，离心后去上清液，菌泥用无菌磷酸盐缓冲液洗涤后，离心再重悬于无菌磷酸盐缓冲液，加入聚乙二醇和L-谷氨酸钠的混合溶液作为保护剂，预冻后进行冷冻干燥，即可获得产朊假丝酵母冻干粉剂；

步骤C: 制备冻干单宁酶：将黑曲霉NC22接种于查氏液体发酵培养基培养，定性滤纸过滤后得胞外单宁粗酶液，再离心，上清液为胞外单宁酶液，将得到的上清液加入硫酸铵沉淀，再经蒸馏水透析除盐得到浓缩的单宁酶液，再将单宁酶液按体积比加入聚乙二醇和甘露醇的混合液作为保护剂，预冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，即可获得单宁酶冻干粉剂。

步骤D：依次复活植物乳杆菌冻干菌剂、产朊假丝酵母和单宁酶：

D1： 植物乳杆菌复活：用水溶解MRS培养基，再加入植物乳杆菌冻干剂，常温下复活；

D2：产朊假丝酵母复活：用水溶解麦芽汁培养基，加入产朊假丝酵母冻干粉剂，常温下复活；

D3：单宁酶复活：在柠檬酸钠盐酸缓冲液中，加入单宁酶冻干粉剂，常温下复活；

步骤E：将步骤D1、D2和D3所得到的复活菌剂充分搅拌后制成复活水，保持复活水中含菌量在10⁸cfu/mL~10¹⁰ cfu/mL；

步骤F:将香蕉茎叶切成2-4cm大小，处理至其含水量在60%~65%左右，将步骤E所得的复活水与香蕉茎叶搅拌均匀，装入发酵桶中，压实、密封后在常温下避光，即可制得香蕉茎叶青贮饲料。

优选的，所述植物乳杆菌NL4-10与MRS培养基，产朊假丝酵母GIM2.148与麦芽汁培养基的质量比均为1:10，冻干单宁酶与柠檬酸钠盐酸缓冲液培养基的质量比为2:1。

优选的，所述查氏液体发酵培养基含质量分数2%的单宁酸。

优选的，所述步骤A和步骤B中，静置培养的温度为37℃和28℃，时间均为36小时。

优选的，所述步骤C中，培养的温度为30℃，速率为120r/min，时间为72小时。

优选的，所述步骤A和步骤B中，离心的温度为4℃，时间为10分钟，速度为10000×g，无菌磷酸盐的pH值为6.5。

优选的，所述步骤A、B和C中的预冻方法包括：-20℃预冻2小时后，-80℃再预冻8小时，预冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷阱温度为-60℃，真空度为4-6Pa，真空冷冻干燥时间为16小时。

优选的，步骤A中，所述脱脂乳溶液的质量浓度为10%，所述步骤C中，硫酸铵沉淀的浓度为2mol/mL，与胞外单宁酶液的体积比5%。

优选的，步骤B中的保护剂中聚乙二醇的体积比1%和L-谷氨酸钠的质量分数为7%；所述步骤C中的保护剂中聚乙二醇和甘露醇的混合液与浓缩后的单宁酶液体积比均为1%。

本发明采用以上方法，可以变废为宝，能清除和钝化香蕉茎叶中不利于消化的单宁，降低纤维素含量，开发出优质的青贮饲料，产生巨大的经济效益。

 

具体实施方式

下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：

实施例1：

1、微生物复合菌剂制作

1.1 制备植物乳杆菌冻干菌剂

将植物乳杆菌NL4-10按1%接种量，接种于MRS培养基中，37℃静置培养36小时至稳定期。在4℃时，10000×g离心10分钟，去上清液，菌泥用浓度为60mM、 pH值为6.5的无菌磷酸盐缓冲液洗涤2次后，再10000×g离心10分钟，重悬于200mL无菌磷酸盐缓冲液，加入等体积的浓度为10%（m/v）的脱脂乳溶液作为保护剂，-20℃预冻2小时后，-80℃再预冻8小时，预冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷阱温度为-60℃，真空度为4-6Pa，真空冷冻干燥时间为16小时，即可获得植物乳杆菌冻干菌剂。

其中，植物乳杆菌NL4-10的制备方法：称取50g新鲜香蕉叶，剪成0.5cm小块后装入3cm×20cm的无菌试管中，加入无菌水至没过所有物料，30℃、120r/min 振荡 30min，取悬浮液用于MRS固体培养基平板划线进行分离纯化。挑取单菌落用MRS液体培养基进行培养至培养基浑浊，培养液继续用平板划线进行分离纯化，多次划线分离直至平板菌落无其他杂菌出现。

1.2 制备冻干产朊假丝酵母

将产朊假丝酵母GIM2.148按1%接种量，接种于麦芽汁培养基中，28℃恒温静置培养36小时至稳定期，在4℃时，10000×g离心10分钟，去上清液，菌泥用浓度为60mM、 pH值为6.5的无菌磷酸盐缓冲液洗涤2次后，再10000×g离心10分钟，重悬于200mL无菌磷酸盐缓冲液，加入1%聚乙二醇和7%L-谷氨酸钠作为保护剂，-20℃预冻2小时后，-80℃再预冻8小时，预冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷阱温度为-60℃，真空度为4-6Pa，真空冷冻干燥时间为16小时，即可获得产朊假丝酵母冻干粉剂。

其中，产朊假丝酵母GIM2.148保藏于广东省微生物研究所菌种保藏中心，产朊假丝酵母 GIMCC编号：GIM2.148。

1.3 冻干单宁酶

将黑曲霉NC22按1%接种量，接种于含2%单宁酸的查氏液体发酵培养基，在30℃、120r/min条件下培养72小时，定性滤纸过滤后得胞外单宁粗酶液，粗酶液在4℃环境中10000×g离心30分钟，上清液为胞外单宁酶液。上清液以体积比5%的2mol/mL硫酸铵沉淀，蒸馏水透析除盐得到浓缩的单宁酶液。单宁酶液按体积比加入1%聚乙二醇和1%甘露醇作为保护剂，-20℃预冻2小时后，-80℃再预冻8小时，预冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷阱温度为-60℃，真空度为4-6Pa，真空冷冻干燥时间为16小时，即可获得单宁酶冻干粉剂。

其中，黑曲霉NC22的制备方法：称取 20g 新鲜香蕉叶，粉碎后加入 90mL 0.1%的蛋白胨水溶液中，30℃、120r/min 振荡 30min，过滤得到分离原液，将分离原液进行梯度稀释后涂布于马丁氏琼脂培养基，挑取生长较好的单菌落，接种于PDA 培养基，多次划线分离直至得到该黑曲霉菌株。

2、使用方法：

2.1 植物乳杆菌复活：取MRS培养基100g以500mL 42℃水溶解，加入冻干植物乳杆菌冻干剂10g，常温下复活30分钟；

2.2 产朊假丝酵母复活：取麦芽汁培养基50g以42℃水溶解，加入产朊假丝酵母冻干粉剂5g，常温下复活30分钟；

2.3 单宁酶复活：在5g柠檬酸钠盐酸缓冲液中，加入单宁酶冻干粉剂10g，常温下复活30分钟；

2.4 将步骤2.1-2.3所复活菌剂充分搅拌后制成复活水，保持复活水中含菌量在10⁸cfu/mL~10¹⁰ cfu/mL；

2.5 将200kg香蕉茎叶切成2-4cm左右大小，处理至含水量在60%~65%左右，将步骤2.4所得的复活水与香蕉茎叶搅拌均匀，装入50L的发酵桶中，压实、密封后在常温下避光培养25天，即可制得复合要求的香蕉茎叶青贮饲料。

经过上述工艺青贮发酵以后制得的香蕉茎叶青贮料具有良好的酸香味、颜色亮、质地柔软，且具固形物和粗蛋白分别提高了14.39%和38.33%，纤维素和单宁分别降低了21.22%和19.9%，菌种在生长过程中利用可溶性化合物从而降低了17.01%，但是氨态氮比对照组降低了15.60%，说明在青贮发酵过程中蛋白质破坏小，营养价值高，达到优等青贮料的品质要求。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂，其特征在于，包括：植物乳杆菌冻干菌剂、产朊假丝酵母冻干粉剂和单宁酶冻干粉剂。

2.一种制备如权利要求1所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

步骤A: 制备植物乳杆菌冻干菌剂：将植物乳杆菌NL4-10，接种于MRS培养基中，静置培养至稳定期，离心后去上清液，菌泥用无菌磷酸盐缓冲液洗涤后，离心后重悬于无菌磷酸盐缓冲液，加入等体积的脱脂乳溶液作为保护剂，预冻，再后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，即可获得植物乳杆菌冻干菌剂；

步骤B: 制备冻干产朊假丝酵母：将产朊假丝酵母GIM2.148，接种于麦芽汁培养基中，静置培养至稳定期，离心后去上清液，菌泥用无菌磷酸盐缓冲液洗涤后，离心再重悬于无菌磷酸盐缓冲液，加入聚乙二醇和L-谷氨酸钠的混合溶液作为保护剂，预冻后进行冷冻干燥，即可获得产朊假丝酵母冻干粉剂；

步骤C: 制备冻干单宁酶：将黑曲霉NC22接种于查氏液体发酵培养基培养，定性滤纸过滤后得胞外单宁粗酶液，再离心，上清液为胞外单宁酶液，将得到的上清液加入硫酸铵沉淀，再经蒸馏水透析除盐得到浓缩后的单宁酶液，再将单宁酶液按体积比加入聚乙二醇和甘露醇的混合液作为保护剂，预冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，即可获得单宁酶冻干粉剂；

步骤D：依次复活植物乳杆菌冻干菌剂、产朊假丝酵母和单宁酶：

D1： 植物乳杆菌复活：用水溶解MRS培养基，再加入植物乳杆菌冻干剂，常温下复活；

D2：产朊假丝酵母复活：用水溶解麦芽汁培养基，加入产朊假丝酵母冻干粉剂，常温下复活；

D3：单宁酶复活：在柠檬酸钠盐酸缓冲液中，加入单宁酶冻干粉剂，常温下复活；

步骤E：将步骤D1、D2和D3所得到的复活菌剂充分搅拌后制成复活水，保持复活水中含菌量在10⁸cfu/mL~10¹⁰ cfu/mL；

步骤F:将香蕉茎叶切成2-4cm大小，处理至其含水量在60%~65%左右，将步骤E所得的复活水与香蕉茎叶搅拌均匀，装入发酵桶中，压实、密封后在常温下避光，即可制得香蕉茎叶青贮饲料。

3.如权利要求2所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，所述植物乳杆菌NL4-10与MRS培养基，产朊假丝酵母GIM2.148与麦芽汁培养基的质量比均为1:10，冻干单宁酶与柠檬酸钠盐酸缓冲液培养基的质量比为2:1。

4.如权利要求3所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，所述查氏液体发酵培养基含质量分数2%的单宁酸。

5.如权利要求2所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，所述步骤A和步骤B中，静置培养的温度为37℃和28℃，时间均为36小时。

6.如权利要求2所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，所述步骤C中，培养的温度为30℃，速率为120r/min，时间为72小时。

7.如权利要求2所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，所述步骤A和步骤B中，离心的温度为4℃，时间为10分钟，速度为10000×g，无菌磷酸盐的pH值为6.5。

8.如权利要求2所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，所述步骤A、B和C中的预冻方法包括：-20℃预冻2小时后，-80℃再预冻8小时，预冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷阱温度为-60℃，真空度为4-6Pa，真空冷冻干燥时间为16小时。

9.如权利要求2所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，步骤A中，所述脱脂乳溶液的质量浓度为10%，所述步骤C中，硫酸铵沉淀的浓度为2mol/mL，与胞外单宁酶液的体积比5%。

10.如权利要求2所述的用于香蕉茎叶青贮的微生物复合菌剂的方法，其特征在于，步骤B中的保护剂中聚乙二醇的体积比为1%，L-谷氨酸钠的质量分数为7%；所述步骤C中的保护剂中聚乙二醇和甘露醇的混合液与浓缩后的单宁酶液体积比均为1%。