CN102864095B - 一株用于青贮苜蓿的植物乳杆菌及其使用方法 - Google Patents
一株用于青贮苜蓿的植物乳杆菌及其使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
一株能够改善苜蓿青贮饲料品质的一株用于青贮苜蓿的植物乳杆菌。技术方案是：其特征在于：所述植物乳杆菌(L.plantarum Ps-9)是从100株植物乳杆菌中筛选出来的具有良好的耐酸性、生长能力强、产酸速度快的乳酸菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.5489，保藏日期为：2011年11月23日。本发明还公开了其应用方法。
Description
技术领域
本发明涉及一株青贮用乳酸菌，具体是一株能够改善苜蓿青贮饲料品质的一株用于青贮苜蓿的植物乳杆菌及其使用方法。
背景技术
紫花苜蓿（Medicago sativa）是一种优质的多年生豆科牧草,其产量高,一年可以刈割多次，并且富含蛋白质、维生素和矿物质等营养物质。对于畜牧,苜蓿适口性好,瘤胃降解率高,粗蛋白含量高，因此苜蓿是畜牧业生产中不可缺少的优质牧草资源。然而长期以来，苜蓿的保存主要以晒制干早为主，这种方法的最大缺点是营养物质损失严重。青贮饲料由于具有鲜嫩多汁、营养价值高、适口性好和长期贮存的特性,已经成为反刍动物不可缺少的基础饲料,所以苜蓿青贮逐渐成为近几年人们研究的热点。
青贮是通过乳酸发酵快速降低pH值并维持厌氧环境，以利于青贮作物长期保存的一种贮藏方式。与饲草晾晒成干草相比，饲草青贮可以大幅度缩短从收割到贮藏的时间，避免不良天气造成的饲草损失，使青绿饲草的营养成分得到最大限度的保存。然而苜蓿水分含量高,糖分相对较低，缓冲能较高,所以一般条件下不易青贮。乳酸菌是近年来正在推广的青贮微生物添加剂，其主要作用是有目的地调节青贮料内微生物组成，调控青贮发酵过程，促进乳酸菌大量繁殖，抑制有害菌活动，更快地产生乳酸，促进多糖与粗纤维的转化，提高干物质回收率，从而有效提高青贮饲料的质量，具有较大潜力和广阔的发展前景。
发明内容
本发明的目的在于提供能够改善苜蓿青贮饲料品质的一株用于青贮苜蓿的植物乳杆菌及其使用方法。
本发明是通过下述技术方案实现的。
一株植物乳杆菌，其特征在于：所述植物乳杆菌（L.plantarum Ps-9）是从100株植物乳杆菌中筛选出来的具有良好的耐酸性、生长能力强、产酸速度快的乳酸菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，保藏号：CGMCC No.5489，保藏日期为：2011年11月23日。
所述植物乳杆菌在苜蓿青贮中的应用。
植物乳杆菌的活化和培养，其特征在于：将冷冻保存的L.plantarum Ps-9接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养18-22h，如此传代培养2-3次得到所述的活化L.plantarum Ps-9菌种；所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。
菌液制备：将上述活化的菌种离心后，加入适量的灭菌水，制成菌体悬浮液，使其含乳酸菌活菌数在1×108cfu/mL。
植物乳杆菌在苜蓿青贮饲料中的使用方法，其特征在于包括下列步骤：将苜蓿原料切碎至2-3cm，并控制水分含量在65%-70%，称取100g原料装入真空包装塑料袋中，将制备的菌液以1×105cfu/g的接种量接种到苜蓿原料中，采用真空包装机真空包装后，置于储藏室进行发酵。
青贮苜蓿的品质检测：青贮苜蓿发酵20-30天即发酵成熟后，取出部分青贮苜蓿进行感官评定、微生物组成和发酵品质分析等。
植物乳杆菌在苜蓿半干青贮饲料中的使用方法，其特征在于包括下列步骤：将紫花苜蓿在孕蕾期至初花期收割后，切碎至2-3cm，晾晒24-36h控制水分含量在45%-55%，称取100g原料装入真空包装塑料袋中，制备的菌液以1×105cfu/g的接种量接种到苜蓿原料中，采用真空包装机真空包装后，置于储藏室进行发酵。
本发明提供的植物乳杆菌具有下述的积极效果：
本发明通过乳酸菌的生长特性研究、对苜蓿青贮成熟和品质的影响筛选出提高苜蓿青贮品质等功能性强的菌种L.plantarum Ps-9。
本发明还涉及将本发明菌种添加到青贮苜蓿中发酵成熟后，青贮苜蓿气味芳香、呈黄绿色、组织结构保持良好。经检验，在发酵前期可以快速降低pH值，乳酸菌数迅速增加，加速发酵成熟，而且乳酸和乙酸的含量也得以提高，明显改善了青贮发酵苜蓿的品质。因此本发明所述的乳酸菌具有加速苜蓿青贮成熟和提高苜蓿青贮品质等优点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明；下述实施例只是说明性的，并不限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：
一株植物乳杆菌，所述植物乳杆菌（L.plantarum Ps-9）是从100株植物乳杆菌中筛选出来的具有良好的耐酸性、生长能力强、产酸速度快的乳酸菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.5489。
所述植物乳杆菌在苜蓿青贮中的应用。
植物乳杆菌的活化和培养，将冷冻保存的L.plantarum Ps-9接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养18-22h，如此传代培养2-3次得到所述的活化L.plantarum Ps-9菌种；所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。
菌液制备：将上述活化的菌种离心后，加入适量的灭菌水，制成菌体悬浮液，使其含乳酸菌活菌数在1×108cfu/mL。
植物乳杆菌在苜蓿青贮饲料中的使用方法，包括下列步骤：
将活化的菌种离心后，加入适量的灭菌水，制成菌体悬浮液，使其含乳酸菌活菌数在1×108cfu/mL。以1×105cfu/g的接种量接种到苜蓿原料中，添加同体积的灭菌蒸馏水作为对照组，采用真空包装机真空包装后，置于储藏室进行发酵。发酵30天后进行微生物组成和发酵特性分析。
微生物组成分析包括乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌、霉菌、一般细菌和大肠杆菌的计数。称取10g发酵成熟的青贮饲料，加入90ml灭菌水，充分震荡，再用灭菌水以十倍稀释法对样品进行梯度稀释，分别选取适当的稀释液100μL涂布于大肠菌群显色培养基（Blue Light Broth）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar）、营养琼脂（Nutrients Agar）和梭状芽孢杆菌计数培养基（Clostridia Count Agar）上，并置于30℃恒温培养箱中培养48h后，其中梭状芽孢杆菌计数培养基需要厌氧培养，以此分别对乳酸菌、大肠菌群、酵母菌、霉菌、好氧细菌和梭状芽孢杆菌进行计数。取原液进行pH、有机酸和氨态氮的测定，并取适量青贮饲料置于65℃烘箱中风干至恒重，测定其含水量。将烘干的饲料粉碎后，称取1g左右进行可溶性糖的测定。
表1苜蓿青贮30天后的微生物组成
注：同列数据上标不同字母表示差异显著(P<0.05)；ND：未检出
通过表1中微生物组成分析可知，添加乳酸菌的青贮苜蓿和对照组相比，乳酸菌数量显著增加，芽孢杆菌、酵母菌和有害菌梭状芽孢杆菌已经完全被抑制。结果证明添加乳酸菌后可以抑制饲料中的有害菌，从而进一步提高饲料的品质。
表2苜蓿发酵30天后的发酵品质
注：同列数据上标不同字母表示差异显著(P<0.05)；ND：未检出
由表2可知，30天后，试验组的pH值下降到4.82，显著低于对照组的pH值。同时，添加乳酸菌的青贮苜蓿饲料中的乳酸、醋酸含量显著高于对照组，丁酸和氨态氮的含量显著低于对照组，这表明饲料品质得到很大的改善。
实施例2：
植物乳杆菌在苜蓿青贮饲料中的使用方法，包括下列步骤：
将紫花苜蓿原料自然晾干到含水量为45%-55%时进行半干青贮。以1×105cfu/g的接种量接种到苜蓿原料中，添加同体积的灭菌蒸馏水作为对照组，采用真空包装机真空包装后，置于储藏室进行发酵。发酵30天即发酵成熟后，取出部分青贮饲料微生物组成和发酵品质分析等。
微生物组成分析包括乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌、霉菌、一般细菌和大肠杆菌的计数。称取10g发酵成熟的青贮饲料，加入90ml灭菌水，充分震荡，再用灭菌水以十倍稀释法对样品进行梯度稀释，分别选取适当的稀释液100μL涂布于大肠菌群显色培养基（Blue Light Broth）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar）、营养琼脂（Nutrients Agar）和梭状芽孢杆菌计数培养基（Clostridia Count Agar）上，并置于30℃恒温培养箱中培养48h后，其中梭状芽孢杆菌计数培养基需要厌氧培养，以此分别对乳酸菌、大肠菌群、酵母菌、霉菌、好氧细菌和梭状芽孢杆菌进行计数。取原液进行pH、有机酸和氨态氮的测定，并取适量青贮饲料置于65℃烘箱中风干至恒重，测定其含水量。将烘干的饲料粉碎后，称取1g左右进行可溶性糖的测定。
表3苜蓿半干青贮30天后的微生物组成
注：同列数据上标不同字母表示差异显著(P<0.05)；ND：未检出
通过表3中微生物组成分析可知，与对照组相比，试验组中的乳酸菌显著增加，酵母菌显著减少，芽孢杆菌和有害菌梭状芽孢杆菌已经完全被抑制。
表4苜蓿发酵30天后的发酵品质
注：同列数据上标不同字母表示差异显著(P<0.05)；ND：未检出
由表4可知，同对照组相比，添加乳酸菌的半干青贮苜蓿饲料的pH值显著下降，乳酸含量增加，丁酸含量降低，氨态氮含量减少。结果证明乳酸菌提高了半干青贮饲料的品质。
实施例3：
植物乳杆菌在苜蓿青贮饲料中的使用方法，包括下列步骤：
将紫花苜蓿原料自然晾干到含水量为45%-55%时进行半干青贮，分别加入3.0%和5.0%糖蜜，混匀后将菌种Ps-9以1×105cfu/g的接种量接种到苜蓿原中，添加同体积的灭菌蒸馏水作为对照组，采用真空包装机真空包装后，置于储藏室进行发酵。发酵30天即发酵成熟后，取出部分青贮饲料进行微生物组成和发酵品质分析等。
表5添加糖蜜对苜蓿半干青贮微生物组成的影响
注：同列数据上标不同字母表示差异显著(P<0.05)；ND：未检出
由表5中微生物组成分析可知，与对照组相比，添加乳酸菌的糖蜜半干青贮中乳酸菌显著增加，酵母菌和芽孢杆菌已经完全被抑制。其中添加5.0%的糖蜜和菌种Ps-9后，有害菌梭状芽孢杆菌完全被抑制。结果证明，添加糖蜜后增加了苜蓿原料中的糖分，促进乳酸菌的生长繁殖成为优势菌群，抑制了杂菌的生长，从而提高青贮饲料的品质。
表6添加糖蜜对苜蓿半干青贮微生物组成的影响
注：同列数据上标不同字母表示差异显著(P<0.05)；ND：未检出
由表6可知，同对照组相比，添加乳酸菌的糖蜜半干青贮苜蓿饲料的pH值显著下降，乳酸含量增加，丁酸含量降低，氨态氮含量减少。其中添加5.0%的糖蜜和菌种Ps-9的饲料pH值下降到4.27，产乳酸最多，丁酸最少。结果证明添加糖蜜和乳酸菌后，糖蜜为乳酸菌的生长提供了原料，乳酸菌的快速生长产生大量乳酸，降低了青贮饲料的pH值，提高了半干青贮饲料的品质。
Claims (6)
1.一株适用于苜蓿青贮饲料发酵的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）Ps-9菌株，其保藏号为CGMCC No.5489，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏日期为：2011年11月23日。
2.权利要求1所述植物乳杆菌在加速苜蓿青贮成熟和提高苜蓿青贮品质中的应用。
3.权利要求1所述植物乳杆菌的活化方法，其特征在于：将冷冻保存的L.plantarum Ps-9接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养18-22h，如此传代培养2-3次得到活化的L.plantarum Ps-9菌种；所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。
4.权利要求1所述植物乳杆菌菌液的制备方法，其特征在于：将权利要求3所述活化方法得到的活化的菌种离心后，加入适量的灭菌水，制成菌体悬浮液，使其含乳酸菌活菌数在1×108cfu/mL。
5.植物乳杆菌在苜蓿青贮饲料中的使用方法，其特征在于包括下列步骤：将苜蓿原料切碎至2-3cm，并控制水分含量在65%-70%，称取100g原料装入真空包装塑料袋中，将权利要求4制备的菌液以1×105cfu/g的接种量接种到苜蓿原料中，采用真空包装机真空包装后，置于储藏室进行发酵。
6.植物乳杆菌在苜蓿半干青贮饲料中的使用方法，其特征在于包括下列步骤：将紫花苜蓿在孕蕾期至初花期收割后，切碎至2-3cm，晾晒24-36h控制水分含量在45%-55%，称取100g原料装入真空包装塑料袋中，将权利要求4制备的菌液以1×105cfu/g的接种量接种到苜蓿原料中，采用真空包装机真空包装后，置于储藏室进行发酵。
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