CN104336416B - 一株植物乳杆菌及其在苜蓿青贮中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株植物乳杆菌及其在苜蓿青贮中的应用。本发明提供了植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZU 208 CGMCC NO.8990或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在作为苜蓿青贮添加剂或制备苜蓿青贮添加剂中的应用。本发明的实验证明了，从玉米青贮饲料中分离纯化到的乳酸菌ZZU 208能够在较低可溶性糖的环境下生长并产酸，对致病菌具有较好的抑菌活性。在苜蓿青贮中能够有效降低pH，降低纤维含量，提高粗脂肪和粗蛋白含量，在作为青贮添加剂方面具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株植物乳杆菌及其在苜蓿青贮中的应用。
背景技术
苜蓿(Medicago sativa)属于多年生豆科牧草，蛋白含量高，营养成分全面，富含维生素和微量元素，抗寒耐旱，是一种优质、高产、适应性强、适合大面积种植的经济饲草。在苜蓿生产实践中，传统的干草制备法在湿热的雨季受到极大限制，而青贮则是解决此问题的好方法。青贮是通过乳酸菌以可溶性糖为主要基质发酵产生乳酸等有机酸，降低青贮饲料的pH值，抑制其它有害微生物(如酪酸菌)的活性。与燕麦、青贮稻与青贮玉米等材料相比，苜蓿的可溶性糖含量低，仅为3.07％～4.56％，而缓冲能值高达414～580mE/kgDM(每千克干物质中毫克当量数)，致使自然青贮发酵进程慢，稳定性差，并伴有过多的呼吸、发热和渗液等情况，因而青贮难度较大，自然青贮十分困难。为促进苜蓿青贮发酵，添加糖蜜、酸类、纤维素酶及乳酸菌等青贮添加剂是当前广泛使用的一些方法。在苜蓿青贮中乳酸菌通常与糖蜜或纤维素酶等联合添加才能达到理想的青贮效果，这无疑增加了青贮的成本和操作的复杂性，因此筛选适合苜蓿材料和青贮特点的苜蓿青贮专用优良乳酸菌尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZU 208CGMCCNO.8990或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在作为苜蓿青贮添加剂或制备苜蓿青贮添加剂中的应用。
上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZU 208CGMCC NO.8990或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备苜蓿青贮饲料中的应用也是本发明保护的范围。
上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZU 208CGMCC NO.8990或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在降低苜蓿青贮饲料pH值、降低苜蓿青贮饲料纤维含量、提高苜蓿青贮饲料粗脂肪和/或提高苜蓿青贮饲料粗蛋白含量中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述苜蓿为苜蓿WL343或苜蓿标杆。
所述纤维含量为中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维总量或中性洗涤纤维含量。
本发明的另一个目的是提供一种制备苜蓿青贮的方法，包括如下步骤：将植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZU 208CGMCC NO.8990添加到苜蓿中，青贮，得到苜蓿青贮饲料。
上述方法中，所述植物乳杆菌和所述苜蓿的配比为107-108cfu/100g。
上述方法中，所述植物乳杆菌是以植物乳杆菌培养液或菌悬液加入。
上述方法中，所述青贮的条件为青贮袋抽真空厌氧25℃；
所述植物乳杆菌菌悬液为将植物乳杆菌培养液收集菌体悬浮水中得到的菌悬液；所述植物乳杆菌培养液的培养条件为30℃培养48h，培养采用的培养基为MRS液体培养基。
本发明另一个目的是提供一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZU 208。
本发明提供的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZU 208，其保藏号为CGMCCNO.8990。
乳酸菌ZZU 208于2014年4月2日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.8990，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
本发明的实验证明了，从玉米青贮饲料中分离纯化到的乳酸菌ZZU 208能够在较低可溶性糖的环境下生长并产酸，对致病菌具有较好的抑菌活性。在苜蓿青贮中能够有效降低pH，降低纤维含量(中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维总量)，提高粗脂肪和粗蛋白含量，在作为苜蓿青贮添加剂方面具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为recA基因的PCR扩增产物电泳图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、植物乳杆菌的获得
1、分离纯化
从玉米(品种：郑超甜2号)青贮饲料中分离纯化到乳酸菌ZZU 208，为同型发酵乳酸菌，具体如下：
称取10g玉米青贮产物样品加入灭菌的90ml蒸馏水中，利用漩涡振荡器震荡30s，10倍梯度稀释，然后分别取10-1、10-3和10-5倍样品稀释液涂布在MRS固体培养基上，放置于厌氧培养箱培养48h，然后将其取出，依据菌落的大小、形态和颜色，挑取MRS上生长的单菌落，进行过氧化氢酶实验及革兰氏染色。将过氧化氢酶阴性及革兰氏染色阳性者暂定为乳酸菌，于MRS固体培养基上继续划线纯化2次。-80℃保存于10％二甲基亚砜的Nutrient肉汤培养基中，该菌株命名为ZZU 208，为同型发酵乳酸菌。
2、生理生化检测
乳酸菌ZZU 208在10℃-45℃条件下及pH3.5-9.0条件生长良好，能够耐受3.0％的盐浓度，部分理化特性如表1所示。
表1菌株ZZU 208的生理生化特性
该菌株能够利用的碳源如表2所示。
表2菌株ZZU 208的碳源发酵试验结果
注：+代表反应为阳性；—代表反应为阴性；w代表反应为弱阳性
3、分子鉴定
1)16rRNA基因序列鉴定
将固体平板上培养48h的乳酸菌ZZU 208，采用菌落PCR扩增，进行16rRNA基因序列鉴定。引物选用细菌的16S rRNA基因扩增通用引物：27F(5’-AGAGTTTGA-TCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR反应体系为50μl：Premix Taq25μl，27F和1492R(均为20μM)1μl，补充灭菌蒸馏水至50μl，直接将菌落加入反应体系，进行PCR扩增，得到PCR产物。
将PCR产物送去测序，结果为序列表中序列1所示。将PCR产物送去测序，结果为序列表中序列1所示。
2)recA基因检测
将固体平板上培养48h的乳酸菌ZZU 208，采用菌落PCR扩增，进行recA基因检测。引物选用基于recA基因的引物：
paraF(5’-GTCACAGGCATTACGAAAAC-3’),pentF(5’-CAGTGGCGCGGTTGATATC-3’),planF(5’-CCGTTTATGCGGAACACCTA-3’)和pREV(5’-TCGGGATTACCA AACAT CAC-3’)。PCR扩增体系(40μl)包括Premix Taq20μl，引物paraF,pentF,和pREV(各0.25μM),引物planF0.12μM，补充灭菌蒸馏水至40μl，用10μl无菌枪头在单菌落挑取少许，加入反应体系，进行PCR反应。
结果如图1所示，1：LactobacilluscaseiJCM 16167T(阴性对照)；2：L.paraplantarum JCM 12533T；3：L.pentosus JCM 1558T；4：L.plantarum subsp.plantarum JCM 1149T；5：L.plantarum subsp.argentoratensisJCM 16169T；6：ZZU 208；M：DNA Markers，可以看出，得到318bp的PCR产物。
经过上述鉴定，乳酸菌ZZU 208于2014年4月2日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.8990，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
实施例2、乳酸菌ZZU 208在抑菌中的应用
乳酸菌ZZU 208接种到MRS液体培养基，30℃培养48h，得到的发酵液经10000rpm离心5min，收集上清液，将上清液采用牛津杯双层平板法进行抑菌活性检测，结果菌株ZZU 208发酵上清液对革兰氏阳性及阴性指示菌都有较强的抑菌活性，如表3所示。
表3菌株ZZU 208发酵上清液的抑菌活性
注：抑菌活性以抑菌圈直径表示，牛津杯外径为7.80mm。+，抑菌圈直径：8.00-12.00mm；++，12.00-16.00mm；+++，16.00-20.00mm；++++，＞20.00mm
其发酵上清液在排除酸和过氧化氢的作用后对革兰氏阳性及阴性指示菌仍然有较强的抑菌活性，然而在经过蛋白酶K或胰蛋白酶的作用后抑菌活性消失，结果如表4所示，表明该发酵上清液中的抑菌活性物质可能为蛋白类或肽类物质。具体方法为：用2mol/L NaOH调发酵上清液pH值至6.0，并用2mol/L HCL调未接种的MRS液体培养基pH值至6.0作为对照，按照过氧化氢酶、胰蛋白酶或蛋白酶K的终浓度分别为1.0mg/mL、100μg/mL及100μg/mL分别加入到发酵液中，37℃水浴2h，采用牛津杯双层平板法进行抑菌活性检测。
表4不同处理后菌株ZZU 208发酵上清液的抑菌活性
注：抑菌活性以抑菌圈直径表示，牛津杯外径为7.80mm。+，抑菌圈直径：8.00-12.00mm；++，12.00-16.00mm；+++，16.00-20.00mm；++++，＞20.00mm；-，≤7.80mm
乳酸菌ZZU 208接种到MRS液体培养基，30℃培养48h，得到的发酵液经10000rpm离心5min，收集上清液，在不同的温度条件下处理不同时间，或用2mol/L NaOH或2mol/L HCL将上清液调至不同的pH值，应用采用牛津杯双层平板法进行抑菌活性检测，结果如表5所示，
表5温度和pH对菌株ZZU 208发酵上清液抑菌活性的影响
注：抑菌活性以抑菌圈直径表示，牛津杯外径为7.80mm。+，抑菌圈直径：8.00-12.00mm；++，12.00-16.00mm；+++，16.00-20.00mm；++++，＞20.00mm；-，≤7.80mm
该抑菌活性物质(发酵上清液)在100℃保持60min具有较好的稳定性，在pH≤6的条件下具有抑菌活性，且随pH降低活性增强。
在仅含有0.5％葡萄糖的MRS培养基中发酵12h、24h、36h和48h，菌株ZZU 208发酵液pH分别为4.63、4.03、3.64和3.58，表明菌株ZZU 208能够在较低可溶性糖的环境下生长并产酸。
实施例3、ZZU 208在青贮中的应用
1、菌悬液的制备
乳酸菌ZZU 208接种到MRS液体培养基，30℃培养48h，收集培养液；或将所述植物乳杆菌在MRS固体培养基30℃厌氧培养箱培养48h，收集培养后单菌落重悬于水中，制备菌悬液(≥108cfu/ml)。
2、ZZU 208在青贮中的应用
将上述ZZU 208菌悬液加入苜蓿WL343或苜蓿标杆中，菌种与苜蓿的配比为107-108cfu/100g(具体采用107cfu/100g)，装于青贮袋，抽真空，室温(25℃)条件下进行青贮，分别得到苜蓿WL343青贮产物和苜蓿标杆青贮产物。
青贮过程中微生物含量(cfu/g FM)及pH变化结果如表6、表7所示，
表6为WL343苜蓿样品青贮过程中微生物含量(cfu/g FM)及pH变化
表7标杆苜蓿样品青贮过程中微生物含量(cfu/g FM)及pH变化
可以看出，与对照组相比，添加菌株ZZU 208组pH下降速度较快，两种苜蓿青贮60d，添加菌株ZZU 208组pH均低于5.0，而对照组pH均高于5.0，表明添加菌株ZZU208有助于苜蓿在青贮过程中pH的降低。添加菌株ZZU 208能够提高青贮前期(3d-15d)乳酸菌数量，在青贮30d和60d大肠杆菌数量显著降低。
WL343和标杆两种苜蓿样品在添加菌株ZZU 208青贮60d的有机酸及营养成分，有机酸采用高效液相色谱法测定(柱子规格：Carbomix H-NP 10:8％，7.8×300mm 10um，流动相为2.5mM硫酸，流速是0.6ml/min，柱温箱55℃样品注入量10ul)，干物质(DM)、粗蛋白(CP)和粗脂肪(EE)的分析：适量样品放置于65℃烘箱48h烘干水分，粉碎，过1mm筛，按AOAC记述的方法进行分析，分析结果如表8所示，
表8青贮前及60d后有机酸及营养成分分析
注：表中的数值均为三个样品测定的平均值，*代表与对照组相比有显著差异(P<0.05)。DM：干物质重量，FM：鲜重，NDF：中性洗涤纤维，ADF：酸性洗涤纤维，EE：粗脂肪，CA：粗灰分，CP：粗蛋白，
ND：未检测到
可以看出，与对照组相比，添加菌株ZZU 208组青贮饲料中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维总量均显著降低，尤其显著减低中性洗涤纤维含量，WL 343苜蓿的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维总量也显著降低，尤其显著减低中性洗涤纤维含量；添加菌株ZZU208组青贮饲料粗脂肪均有所增高，且标杆苜蓿的粗脂肪显著增高；添加菌株ZZU 208组青贮产物粗蛋白含量均显著增高。
综上所述，菌株ZZU 208在苜蓿青贮中能够有效降低pH，降低中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维总量，尤其显著减低中性洗涤纤维含量，提高粗脂肪和粗蛋白含量，在作为青贮添加剂方面具有潜在的应用价值。
Claims (8)
1.植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZU 208 CGMCC NO.8990或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在作为苜蓿青贮添加剂或制备苜蓿青贮添加剂中的应用。
2.植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZU 208 CGMCC NO.8990或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备苜蓿青贮饲料中的应用。
3.植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ZZU 208 CGMCC NO.8990或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在降低苜蓿青贮饲料pH值、降低苜蓿青贮饲料纤维含量、提高苜蓿青贮饲料粗脂肪和/或提高苜蓿青贮饲料粗蛋白含量中的应用。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：
所述苜蓿为苜蓿WL343或苜蓿标杆；
所述纤维含量为中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维总量或中性洗涤纤维含量。
5.一种苜蓿青贮的方法，包括如下步骤：将植物乳杆菌Lactobacillus plantarumZZU 208 CGMCC NO.8990添加到苜蓿中，青贮，得到苜蓿青贮饲料。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述植物乳杆菌和所述苜蓿的配比为107-108cfu/100g。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述植物乳杆菌是以植物乳杆菌培养液或菌悬液加入。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：
所述青贮的条件为青贮袋抽真空厌氧25℃。
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| GR01 | Patent grant |