CN107828681A - 高寒牧区裹包青贮用混合乳酸菌制剂 - Google Patents

高寒牧区裹包青贮用混合乳酸菌制剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高寒牧区裹包青贮用混合乳酸菌制剂，它由保藏编号为CGMCC No.14117的植物乳杆菌，保藏编号为CGMCC No.14116的副干酪乳杆菌，保藏编号为CGMCC No.14183的耐乙醇片球菌组成。使用该混合乳酸菌制剂后青贮饲料乳酸和总酸含量大于它们单独使用及现有市售产品，pH值、有害微生物数量、丙酸含量、氨态氮/总氮比值低于它们单独使用及现有市售产品；有氧稳定性提高，进一步改善青贮饲料发酵品质，提高青贮饲料粗蛋白含量和体外干物质消化率，可将青贮调制延长至8月中旬。

Description

高寒牧区裹包青贮用混合乳酸菌制剂
技术领域
本发明属于畜牧业领域，具体涉及一种高寒牧区裹包青贮用混合乳酸菌制剂。
背景技术
随着畜牧业的发展，乳酸菌制剂在青贮饲料中应用越来越广泛。大量研究表明，乳酸菌 添加效果因代谢类型、原料特性和气候环境的不同而有所差异。冷凉地区饲草附着乳酸菌数 量和组成不同于温带地区和热带地区。目前使用的商业乳酸菌主要来源于温带环境，同时有 部分研究旨在筛选热带地区适应青贮调制的优势乳酸菌。
裹包青贮饲料的保存与大部分常规青贮饲料保存方式相似，但裹包青贮饲料的营养成分 和微生物组成与常规青贮不一致。相对于常规青贮，裹包青贮料开启乳酸菌发酵较晚，发酵 酸浓度较低，pH值降低速率较慢，使得裹包青贮料易于感染有害微生物。小型裹包青贮能 够使养殖数量较少的农牧民从事青贮饲料生产，无需投入大量资金进行青贮设施修筑和机械 设备购买，但很多因素也影响裹包青贮饲料的发酵品质和营养成分，包括原料特性、包膜质 地、贮存管理等。
由于川西北高寒牧区特殊的气候环境，小型裹包青贮能够确保农牧民根据饲草品质、牲 畜数量来合理进行饲草保存。在青贮饲料生产过程中，低温往往抑制乳酸菌发酵，增加青贮 损失。目前，已通过添加有机酸(甲酸、乙酸和丙酸)、提前饲草物候期、适时萎蔫等相应 措施来提高青贮饲料品质，但这些措施均有一定的局限性。添加乳酸菌能够提高裹包青贮饲 料品质和动物生产性能。通过筛选适合高寒牧区裹包青贮用的乳酸菌，促进青贮初期乳酸菌 发酵，快速产生乳酸，使青贮体快速形成酸性环境，减少青贮损失。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种适合于高寒牧区裹包青贮用的乳酸菌制剂。
本发明的技术方案为：高寒牧区裹包青贮用混合乳酸菌制剂，它由保藏编号为CGMCC No.14117的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)148，保藏编号为CGMCCNo.14116的副 干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)171和保藏编号为CGMCC No.14183的耐乙醇片球菌 (Pediococcus ethanolidurans)P-14组成。
植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)148简称为菌株148，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)171简称为菌株171，耐乙醇片球菌(Pediococcusethanolidurans) P-14简称为菌株P-14。
植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)148于2017年5月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14117，保藏地址为：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)171于2017年5月11日保藏在中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14116，保藏地址为：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
耐乙醇片球菌(Pediococcus ethanolidurans)P-14于2017年5月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14183，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的菌株P-14、菌株148和菌株171的最适生长温度为15℃，具有生长速度快、产酸多等特征，为青贮调制提供有利条件，能够在低温条件下快速完成发酵(≤20d)，增 加乳酸和总酸含量，降低pH值、氨态氮/总氮比值、丙酸和丁酸含量，改善青贮饲料发酵品 质，提高青贮饲料粗蛋白含量和体外干物质消化率，可在青贮调制过程中作为添加剂使用。
将它们3株菌制成混合乳酸菌制剂后使用，青贮饲料乳酸和总酸含量大于它们单独使用 及现有市售产品，pH值、有害微生物数量、丙酸含量、氨态氮/总氮比值低于它们单独使用 及现有市售产品；有氧稳定性提高，进一步改善青贮饲料发酵品质，提高青贮饲料粗蛋白含 量和体外干物质消化率，可将青贮调制延长至8月中旬。
附图说明
图1接种菌株绿汁液发酵48h后的pH值和菌体吸光度(OD600)；
图2接种乳酸菌株后绿汁发酵液OD600曲线；
图3接种乳酸菌株后绿汁发酵液pH曲线；
图4接种菌株绿汁液发酵48h后的乳酸、乙酸、丙酸和乙醇含量；
图5接种乳酸菌株后绿汁发酵液乳酸曲线；
图6温度对接种乳酸菌绿汁发酵液pH值的影响(48h)；
图7参考乳酸菌PCR扩增片段电泳图谱；
图8所筛选乳酸菌PCR扩增片段电泳图谱；
图9乳酸菌对青贮饲料pH值的影响；
图10乳酸菌对青贮饲料乳酸含量的影响；
图11低温乳酸菌对青贮饲料氨态氮/总氮比值的影响；
图12乳酸菌对裹包青贮饲料有氧稳定性的影响。
具体实施方式
1材料与方法
1.1乳酸菌的分离
采集川西北高寒牧区天然青贮饲料(老芒麦、燕麦)样本共计86份，无菌镊子夹入无 菌自封袋中，密封，车载冰箱运回实验室，-80℃低温保藏备用。
将冰冻样品置于超净工作台室温解冻，取5g样品于250mL无菌三角瓶中，加入45mL 0.9％无菌生理盐水，保鲜膜封口，震荡2～3h，用无菌纱布过滤，取滤液1m进行梯度稀释，分别取10-3、10-4、10-5稀释度样品液1mL涂布于无菌培养基中。每个稀释度涂布3～5 个平板(Φ10cm)。培养基分别为MRS培养基、CaCO3+MRS复合培养基、M17培养基和 GYP培养基(所有培养基由成都力天世纪科技有限公司提供，下同)。采用厌氧培养箱培养， 培养温度为15℃，时间48-96h。选择乳白色、黄色或者具有溶盖圈的菌落进行多次纯化， 通过革兰氏染色(阳性)、过氧化氢酶反应(阴性)初步鉴定为乳酸菌(127株)。根据伯爵 仕手册，通过菌落形态、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、H2S产气试验、吲哚试验、葡萄 糖产酸产气试验、碳水化合物发酵产酸试验等(所有生化管和鉴定管由成都力天世纪生物科 技有限公司提供)，归类为44株乳酸菌。根据初步筛选出的菌株再次纯化后于MRS broth/ M17broth+甘油-20℃冰箱保藏备用。
1.2乳酸菌的筛选及接种后绿汁发酵液特性
将拔节期青贮玉米(或花期苜蓿)榨汁，用无菌纱布过滤，收集滤液作为绿汁发酵液评 价筛选出的乳酸菌pH和发酵产物组成(乳酸、乙酸、丙酸和丁酸)。绿汁发酵液4500r/min 离心后取上清液，加入2％蔗糖，搅拌均匀。将保存的菌株从超低温冰箱中取出后接种于 MRS broth或者M17broth中进行活化，5％(v/v)接种量逐步扩大培养，通过分光光度计调整菌悬液同一吸光度，之后再按照5％(v/v)接种量接种于绿汁发酵液中，15℃厌氧培养箱中分别培养3、6、12、24、48h。同时，分别接种不同菌株于绿汁发酵液中，在不同温度 (5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃)下培养48h。采用梅特勒酸度计(A20， 上海阔思电子有限公司)测定绿汁发酵液pH值；采用分光光度计(Shimadzu model UV- 2501；ShimadzuCorp.,Tokyo,Japan)测定绿汁发酵液吸光度(OD 600)；培养48h的绿汁发 酵液发酵液10000r/min低温(4℃)离心后采用第一章1.4的方法测定乳酸和挥发性脂肪酸， 并且通过高效液相色谱(SCR-101H,10μm8.0mm×30cm,Shim-pack,Shimadzu，日本；柱 温30℃；流速0.6mL/min(高氯酸)；210nm，SPD检测器)测定乙醇含量。此过程筛选出 31株能够快速降低绿汁发酵液pH和增加有机酸含量的乳酸菌菌株。
为评价乳酸菌的生长特性，设置不同培养温度、pH和NaCl浓度的培养基，观察其生长 状况。接种乳酸菌于MRS broth或M17broth，15℃厌氧培养48h，调整菌悬液浓度(OD560)，待用。取0.1mL乳酸菌菌悬液，接种于MRS broth或M17broth，分别在10℃、 15℃、30℃、45℃恒温厌氧培养箱中培养48～72h，观察乳酸菌生长状况；同时分别接种于 不同pH值(2.0、3.0、4.0)液体培养基、不同NaCl浓度(2.5、4.5、6.5，g/L％)液体培养 基和乳酸浓度(1.0、3.0、5.0，v/v％)液体培养基，以pH7.0液体培养基为对照，厌氧恒温(15℃)培养48h，测定不同发酵液的吸光度(OD 560)，如果接种乳酸菌培养基的吸光度 (OD 560接种)与对照培养基的吸光度(OD 560对照)比值大于1.0，说明乳酸菌能够在该种培 养条件下生长。每个处理设置3～5个平行。
1.3乳酸菌的安全性评价
采用纸片扩散法测定筛选乳酸菌菌株的耐药性。不同菌株接种于MRS broth或者M17 broth，厌氧恒温(15℃)培养48h，用生理盐水调整菌悬液为同一吸光度(OD560)。在超净工作台中吸取1mL菌悬液于无菌培养皿中，加入无菌培养基MRS或者M17，摇匀，固定， 贴上自制圆形耐药纸片(Φ10mm)，厌氧恒温(15℃)培养48h，观察抑菌圈。使用的抗 生素为庆大霉素(10μg/mL)、阿米卡星(30μg/mL)、环丙沙星(5μg/mL)、万古霉素(30 μg/mL)、氯霉素(30μg/mL)、青霉素(10μg/mL)和四环素(30μg/片)，每种抗生素设置3～5 个平行。
采用琼脂空穴扩散法测定乳酸菌菌株发酵液抗菌活性。指示菌(大肠杆菌，Escherichia coli DH5a；绿脓杆菌，Pseudomonas aeruginosa；枯草芽孢杆菌，Bacillussubtilis；沙门氏菌， Salmonella derby；产气荚膜梭菌，Clostridium perfringens；黑曲霉，Aspergillus niger；巴斯 德毕赤酵母，Pichia pastoris)由四川省草原科学研究院从青贮饲料中分离筛选得到，细菌采 用LB培养基保存，真菌采用YPD培养基保存。取出已经筛选出的菌株，接种于MRS broth 或者M17broth，5％接种量逐级扩大培养，取其上清液，加入适量过氧化氢酶，于37℃恒 温水浴锅中温浴1h，用0.1mol/L NaOH溶液调整其pH 6.0，排除乳酸菌生长代谢过程中 产生一些过氧化物及酸性物质对抑菌效果的影响。将指示菌菌悬液调整至同一浓度，取50 mL菌悬液于指示菌固体培养基混匀后倒平板，待其凝固后用无菌打孔器打孔(Φ10mm)， 孔中加入0.1mL乳酸菌菌株发酵上清液，正面放置，37℃培养18～24h，观察抑菌效果，并 以pH相同的缓冲液作为阴性对照，Amp(30ug/mL)作为阳性对照。每株乳酸菌设置3～5 个平行。
1.4乳酸菌的鉴定
采用16S rRNA细菌通用引物(7F 1540R5’-CAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’和27F 1492R，5’-AGTTTGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行乳酸菌的鉴定。筛选的 乳酸菌菌株在适宜的温度下培养成菌悬液。取菌悬液2mL于无菌EP管中，8000r/min离 心5min，收集菌体，加入含2.0mg/mL溶菌酶580mL TE缓冲液，37℃处理1h，破坏乳酸 菌细胞壁，用细菌基因组DNA提取试剂盒(SK8255，上海生工生物工程技术服务有限公司) 获得乳酸菌基因组DNA。将染色体DNA作为PCR扩增的模板，PCR扩增体系(50μL)： 4.0μL2.5mmol/L dNTP，25μL 10×buffer Mg2+，两种引物(50μmol/L)各0.4μL rTaq DNA聚合酶和2.0μL模板DNA，补ddH2O至50μL。PCR反应程序：94℃4min，94℃ 45s，55℃45s，72℃1.0min，30个循环；最后72℃延伸10min。取扩增产物3.0μL， 用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳、电压为150V 100mA 20min、电泳液为50×TAE。电泳后、 用溴化乙锭(EB)染色10min、紫外灯下观察。将扩增成功的PCR产物送至上海生工生物 工程技术服务有限公司进行测序，测序的16S rDNA序列后截取峰型较好的片段调整反向互 补的序列后，与GenBank中的已知序列进行了分析比对，从LPSN数据库中获得有关菌种 的公认标准序列数据。
1.5乳酸菌的实验室青贮评价
所筛选出的10株低温乳酸菌，逐级扩大培养，调整菌悬液菌体浓度1×109cfu/mL。以 乳熟期玉米和分枝期～花期紫花苜蓿(萎蔫至含水量70％左右)为试验材料，切碎至1～2cm， 装入专用青贮袋中(30cm×50cm×0.14mm，每袋1kg)，加入菌悬液(105cfu/g FM)，并且 以无添加剂处理为阴性对照(CK，3mL/kg FM)，蔗糖处理(S,2％FM)、柠檬酸钾(PC,6.7g/kg FM)、甲酸(FA,5mL/kg FM)和青宝Ⅱ号(FS,3g/t FM)为阳性对照，混匀，采用 真空包装机(DZQ-600,上海申越包装机械有限责任公司)真空密封，至于恒温培养箱 (15℃)贮藏5d、10d、15d、20d、30d、60d、90d、120d，开启，测定青贮饲料的发 酵品质、营养成分、微生物数量，具体方法参照国标。每个处理每个时间点设置3个重复。
1.6数据分析
采用excel 2007对数据进行整理；采用SPSS19.0软件对数据进行方差分析(ANOVA) 和多重比较；用Graph prime 5对发酵参数作图分析；差异显著水平为P<0.05。
2结果与分析
2.1乳酸菌的分离
从老芒麦和燕麦天然青贮饲料中分离到1990株细菌。经革兰氏染色和过氧化氢酶反应 和生理生化特征初步鉴定为乳酸菌127株。根据伯爵仕手册，通过菌落形态、生理生化特征、 糖代谢反应等归类为44株优势乳酸菌。
2.2乳酸菌的筛选
44株优势乳酸菌接种绿汁发酵液中，48h玉米绿汁发酵液的吸光度为0.102～2.644，pH 为2.64～4.88；48h苜蓿绿汁发酵液吸光度为0.791～2.797，pH为2.64～4.78(图1)。其中31 株菌能够快速利用绿汁发酵液中的可溶性碳水化合快速增值，较短时间内进入对数期(图2)。
在筛选过程中，68、101、108、139、146、151、WK5、WK6、WK88、WK121、 WK130、CC3、CC31等13株菌在绿汁发酵液中生长较差，不能够有效降低pH，在此过程 中被淘汰。部分菌株的产酸能力相对比较强，能够快速降低绿汁发酵液的pH值(图3)。
分析不同乳酸菌株在绿汁发酵液末期(48h)的代谢产物可知，接种不同乳酸菌菌株后 绿汁发酵液中乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量差异显著。玉米绿汁发酵液中的乳酸含量为 2.15～3.40g/L，乙酸含量为0.51～0.73g/L，丙酸含量为0.01～0.18g/L，总酸含量为1.73～4.11 g/L，乙醇含量为1.73～4.54mg/L(图4)。苜蓿绿汁发酵液中的乳酸含量为1.18～2.85g/L， 乙酸含量为0.40～0.58g/L，丙酸含量为0.01～0.04g/L，总酸含量为1.83～3.57g/L，乙醇含量 为2.78～5.38mg/L(图4)。通过比较，发现CC1、CC7、SC2、SC4、SC7、SC29、SC1、 WK3、CC17等9株乳酸菌具有较低的乳酸产量，较高的乙醇产量，筛选过程中被淘汰。发酵产物以乳酸为主，属于同型发酵，以菌株P-8、P-11、P-14、65、148、157、159、171、 192、220等10株乳酸菌的乳酸产生速度最快，绿汁发酵液乳酸含量较高(如图5)。
不同温度、酸度、NaCl、乳酸培养条件下菌株生长情况如表1所示。所有菌株在高温条 件下(45℃)不能够生长；菌株MU4Y-5、MU4Y-7和MU4Y-25在较低温度(10℃)不能 够生长；菌株MU4Y-5、MU4Y-25和M17-171在高于30℃不能够生长。并且，菌株MU4Y- 5、MU4Y-7、MU4Y-25和M17-171均不能够耐受高浓度高乳酸生长环境。部分乳酸菌能够 在较低的温度下快速降低绿汁发酵液的pH值，最适生长温为20℃(图6)。
表1：不同温度、酸度、NaCl、乳酸培养条件下菌株生长情况
注：菌株生长用接种菌株吸光度除以对照吸光度(△OD560＝OD560接种/OD560对照)表示(+，△OD560>1；－，△OD560<1)。
菌株的耐药性和抑菌性如表2和表3所示。菌株MQ0-2对阿米卡星、氯霉素、青霉素和四环素均有较强耐药性，菌株177对庆大霉素、阿卡米星和四环素均有较强耐药性，菌株MU4Y-8和MU4Y-15对万古霉素和青霉素具有较强耐药性，U4Y-14对万古霉素和氯霉素具 有较强耐药性。菌株9、P-5和NZ-2的发酵液无抑菌效果。因此，筛选过程中，由于菌株9、 177、MQ0-2、P-5、MUY4-8、MUY4-14、MU4Y-15、NZ-2等具有较强耐药性或较弱的抑菌 性，均被淘汰。
表2：不同乳酸菌株的耐药性
注：抗生素耐药性用抑菌圈直径表示(－，10mm(抗生素纸片直径)；w，10—15 mm；+，>15mm)。
表1-3不同菌株的抑菌效果
注：抑菌活性用抑菌圈直径表示(－，10mm(打孔器口直径)；w，10—15mm； +，>15mm)。
2.3乳酸菌的鉴定
将所有提取的模式菌株DNA进行PCR引物扩增，琼脂凝胶电泳后放入凝胶成像仪进行 拍照和观察，在1500bp左右位置出现清晰条带(图7)，则表明扩增成功。将所筛选出的低温乳酸菌DNA进行PCR引物扩增，扩增产物进行琼脂凝胶电泳，放入凝胶成像仪拍照和观 察(图8)，通过对其16S rRNA片段扩增测序后鉴定为7株植物乳杆菌(L.plantarum)、1 株粪链球菌(E.faecium)、1株耐乙醇片球菌(P.ethanolidurans)和1株副干酪乳杆菌(L.paracasei)(表4)。
表4：乳酸菌的分子生物学鉴定
2.4乳酸菌的实验室青贮评价
2.4.1青贮原料的营养成分
玉米青贮原料干物质、可溶性碳水化合物、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量 和干物质消化率分别为281.6g/kg、100.7g/kg DM、113.8g/kg DM、487.0g/kg DM、275.8 g/kg DM、608.9g/kg DM。苜蓿青贮原料干物质、可溶性碳水化合物、粗蛋白、中性洗涤纤 维、酸性洗涤纤维含量和干物质消化率分别为308.7g/kg、70.1g/kg DM、224.3g/kgDM、 426.3g/kg DM、381.4g/kg DM、632.6g/kg DM。
2.4.2青贮原料和青贮饲料的微生物组成
青贮原料和青贮饲料微生物组成如表5所示。经过120d常温贮存，青贮饲料酵母菌、 丝状真菌和大肠杆菌数量显著低于青贮原料(P<0.05)。菌株P-14、148和171处理后青贮 饲料乳酸菌数量显著高于CK(P<0.05)。所有菌株处理青贮饲料大肠杆菌数量低于CK。除菌株P-14、148和171外，其他菌株处理青贮饲料丝状真菌数量与对照差异不显著 (P>0.05)。除菌株220外，其他菌株处理青贮饲料大肠杆菌数量显著低于CK(P<0.05)。 菌株处理青贮饲料乳酸菌数量高于CK，菌株P-14、148和171处理青贮饲料乳酸菌数量显 著高于其他菌株处理(P<0.05)。
表5：乳酸菌对青贮饲料微生物组成的影响(log cfu/g FM)
2.3优势乳酸菌对青贮饲料发酵品质的影响
玉米青贮饲料的发酵品质如表6所示。除菌株65和157外，其他菌株均能够显著降低 玉米青贮饲料pH值(P<0.05)，菌株148处理的青贮饲料pH值最低(4.16)。低温乳酸菌处理的玉米青贮饲料乳酸含量显著高于CK(P<0.05)，并且氨态氮/总氮比值、乙酸和丙酸含量显著高于CK(P<0.05)。玉米青贮饲料中，菌株148处理乳酸含量最高(41.0g/kg DM)， 菌株65处理乙酸含量最低(5.8g/kg DM)，菌株171处理丙酸含量最低(0.4g/kg DM)，菌 株148处理总酸含量最高(48.5g/kg DM)，菌株171处理氨态氮/总氮比值最低(68.6g/kg TN)。所有玉米青贮饲料中并未检测到丁酸。综合评价发现，筛选出的10株乳酸菌添加到 青贮饲料中，菌株P-11、65、157、159和220产酸能力相对较弱，氨态氮/总氮比值相对较 高，在筛选过程中被淘汰。
表6：乳酸菌对玉米青贮饲料发酵品质的影响
注：SEM,平均值标准误；同一列中不同小写字母表示平均值差异显著(P<0.05)，下同。
苜蓿青贮饲料的发酵品质如表7所示。菌株处理均能够显著降低苜蓿青贮饲pH值和氨 态氮/总氮比值(P<0.05)，菌株171处理的苜蓿青贮饲料pH值最低(4.31)，菌株P-14处理 苜蓿青贮饲料氨态氮/总氮比值最低(82.8g/kg TN)。所有菌株处理苜蓿青贮饲料乳酸含量显 著高于对照(P<0.05)，菌株148处理苜蓿青贮饲料乳酸含量最高(37.2g/kg DM)。除菌株 P-11、148、171和220外，其他菌株均能够显著降低苜蓿青贮饲料乙酸含量(P<0.05)。菌 株157处理苜蓿青贮饲料乙酸含量最低(5.1g/kg DM)。除菌株P-14和148外，其他菌株处理苜蓿青贮饲料丙酸含量显著高于CK(P<0.05)。菌株处理苜蓿青贮饲料丁酸含量显著低于CK(P<0.05)，菌株P-14和171处理苜蓿青贮饲料丁酸含量显著低于其他菌株处理 (P<0.05)。菌株P-8、P-11、65、157、159、192和220处理的苜蓿青贮饲料丁酸含量高于 1.0g/kgDM，品质较差，在筛选过程中被淘汰。菌株P-14、148和171发酵品质较好，利于 青贮饲料的保存。
表7：乳酸菌对苜蓿青贮饲料发酵品质的影响
Table 2-3.The effects of LAB isolates on the fermentation quality ofalfalfa silage
乳酸菌对青贮饲料pH值的影响如图9所示。接种乳酸菌的青贮饲料贮存第20d pH值 即维持相对稳定(P>0.05)，而未添加或添加蔗糖、柠檬酸钾和商业乳酸菌制剂青宝Ⅱ号的 青贮饲料贮存第30d pH值才维持相对稳定(P>0.05)。
乳酸菌对青贮饲料乳酸含量的影响如图10所示。相对于CK和PC,所有低温乳酸菌能 够加速玉米青贮饲料乳酸的产生(P<0.05)；相对于S和FA,菌株P-14、菌株148和菌株171处理的玉米青贮饲料贮存第20d乳酸含量即维持相对稳定(P>0.05)。相对于CK、S、 PC、FA和FS，乳酸菌能够加速苜蓿青贮饲料的乳酸产生(P<0.05)；菌株P-14、148和171 处理的苜蓿青贮饲料贮存20d乳酸含量即维持相对稳定(P>0.05)。
乳酸菌对青贮饲料氨态氮/总氮比值的影响如图11所示。随着贮存时间的增加，S、PC、 FA和FS处理的玉米青贮饲料氨态氮/总氮比值持续增加(P<0.05)，乳酸菌处理的玉米青贮 饲料氨态氮/总氮比值贮存前20d显著增加(P<0.05)，之后维持相对稳定(P>0.05)。PC处 理的苜蓿青贮饲料氨态氮/总氮比值持续增加(P<0.05)，其他处理的苜蓿青贮饲料氨态氮/总 氮比值贮存前30d显著增加(P<0.05)。
2.4优势乳酸菌对青贮饲料营养成分的影响
乳酸菌对玉米青贮饲料营养成分的影响如表8所示。菌株处理的玉米青贮饲料可溶性碳 水化合物和酸性洗涤纤维含量与CK差异不显著(P>0.05)，菌株159处理的玉米青贮饲料 可溶性碳水化合物含量最低(25.0g/kg DM)。菌株P-14、149和171处理的玉米青贮饲料粗 蛋白含量显著高于CK(P<0.05)，菌株P-8和菌株157处理的玉米青贮饲料粗蛋白含量显著 低于CK(P<0.05)，其他菌株处理的玉米青贮饲料粗蛋白含量与CK差异不显著(P>0.05)。 各菌株处理的玉米青贮饲料消化率显著高于CK(P<0.05)，菌株P-14、148、171和192处 理的玉米青贮饲料体外干物质消化率高于其他菌株(P<0.05)。
表8：乳酸菌对玉米青贮饲料营养成分的影响
乳酸菌对苜蓿青贮饲料营养成分的影响如表9所示。菌株148处理的苜蓿青贮饲料可溶 性碳水化合物质含量为24.8g/kg DM，显著高于CK(P<0.05)。除菌株65和157外，其他菌株处理的苜蓿青贮饲料粗蛋白含量显著高于CK(P<0.05)。所有菌株处理的苜蓿青贮饲料干物质消化率显著低于CK，菌株148处理的体外干物质消化率最高(608.3g/kg DM， P<0.05)。
表9：乳酸菌对苜蓿青贮饲料营养成分的影响
3结论
从86份自然青贮样品中分离出127株乳酸菌，通过生理生化、发酵产物组成、耐药性、 抑菌性等筛选出10株低温乳酸菌，分别为7株植物乳杆菌、1株粪链球菌、1株耐乙醇片球 菌和1株拟干酪乳杆菌。这些菌株的最适生长温度为15℃，具有生长速度快、产酸多等特征，为青贮调制提供有利条件。其中，菌株P-14、菌株148和菌株171能够在低温条件下快 速完成发酵(≤20d)，增加乳酸和总酸含量，降低pH值、氨态氮/总氮比值、丙酸和丁酸 含量，改善青贮饲料发酵品质，提高青贮饲料粗蛋白含量和体外干物质消化率，可在青贮调 制过程中作为添加剂使用。
菌株P-14为耐乙醇片球菌(Pediococcus ethanolidurans)，保藏编号为CGMCCNo.14183； 菌株148为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，保藏编号为CGMCCNo.14117；菌株171 为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，保藏编号为CGMCCNo.14116。
4.优化应用
4.1材料
选择7月底“川草2号”老芒麦(蜡熟期)和8月中旬青引2号燕麦(蜡熟期)为试验 材料。菌株P-14(9.60×109cfu/g)、菌株148(6.67×109cfu/g)和副干酪乳杆菌171 (8.25×1010cfu/g)，商业乳酸菌制剂海星微贮王(乌鲁木齐海星资环微生物研究所提供， 有效菌落数>109cfu/g，主要成分为植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母等多种微生物的 纯培养物)和青宝Ⅱ号(FAST SILI，天然乳酸菌冻干粉，有效菌落数6.66×1010cfu/g，北 京塔山科技有限公司提供)。
4.2试验设计
乳酸菌菌干粉使用前分别采用生理盐水配置成1×108cfu/mL菌悬液，采用随机区组设 计，设置处理组：耐乙醇片球菌P-14(PE，1×105cfu/g FM)，植物乳杆菌148(LPL， 1×105cfu/g FM)，副干酪乳杆菌171(LPA，1×105cfu/g FM)和PE+PLP+PLA，以不添加 作为对照(CK)，以海星微贮王(HX，1.5g/t FM)和青宝Ⅱ号(FS，3g/t FM)为阳性对照。 联合收割机齐地刈割老芒麦和燕麦，留茬高度10cm，捡拾运回青贮饲料生产场地，水泥地 平铺晾晒，实时监测含水量，待牧草含水量达到60～65％时，电子地秤称重，均匀喷洒乳酸 菌菌液(老芒麦可溶性碳水化合物较低≤3％DM，在青贮前加入2％FM蔗糖)，采用圆形 打捆机打捆后进行裹包(Φ55cm×50cm，裹膜8层，每层25μm，每个裹包约40kg)， 置于常温下(≤10℃)贮存60d，分析发酵产物、营养成分和有氧稳定性。每个处理设置3 个重复。
4.3测定项目及方法
取样：裹包去膜后置于托架上，圆捆分三层，每层随机取样5个点，每个样点取10～15 cm3青贮饲料，剪碎至2～3cm，同一裹包15个样点的样品混合均匀，装入无菌青贮袋中，真空密封，冷藏带回实验室，-20℃冰箱贮存，待用。
青贮原料和青贮饲料微生物数量、营养品质和发酵品质的检测分析参照国标。
青贮饲料的有氧稳定评价标准：当青贮饲料内部温度与环境温度(25℃)相差2℃时所 需要的时间(h)。
4.4数据分析
采用SPSS19.0软件对数据进行方差分析(ANOVA)和多重比较；用Graph prime 5对青贮饲料有氧稳定性作图分析；差异显著水平为P<0.05。
5结果与分析
5.1青贮原料的营养成分和微生物组成
老芒麦的干物质、可溶性碳水化合物、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量和体 外干物质消化率分别为351.7g/kg、21.1g/kg DM、78.3g/kg DM、558.3g/kg DM、325.4g/kg DM和539.5g/kg DM。燕麦的干物质、可溶性碳水化合物、粗蛋白、中性洗涤纤维、 酸性洗涤纤维含量和体外干物质消化率分别为326.6g/kg、76.7g/kg DM、100.84g/kg DM、521.0g/kg DM、314.8g/kg DM和605.8g/kg DM。青贮原料附着乳酸菌数量低于酵母菌和丝状真菌数量(表10)。
表10：青贮原料和裹包青贮饲料的微生物组成(log10cfu/g FM)
5.2乳酸菌对青贮饲料微生物组成的影响
乳酸菌对青贮饲料微生物组成的影响如表10所示。老芒麦青贮饲料的酵母菌、丝状真 菌、大肠杆菌和乳酸菌数量分别为3.52～5.12log10cfu/g FM、2.29～4.80log10cfu/gFM、 2.28～4.81log10cfu/g FM和5.21～5.89log10cfu/g FM；燕麦青贮饲料的酵母菌、丝状真菌、大 肠杆菌和乳酸菌数量分别为3.36～5.18log10cfu/g FM、2.25～4.36log10cfu/gFM、3.18～3.89 log10cfu/g FM和5.12～7.80log10cfu/g FM。总体上，乳酸菌处理后，青贮饲料的酵母菌、丝 状真菌和大肠杆菌数量低于CK，乳酸菌数量高于CK。
5.3乳酸菌对青贮饲料发酵品质的影响
乳酸菌对老芒麦裹包青贮饲料发酵品质的影响如表11所示。添加乳酸菌后，老芒麦裹 包青贮饲料pH值和氨态氮/总氮比值显著低于CK(P<0.05)，乳酸和总酸含量显著高于CK (P<0.05)。PE处理的老芒麦青贮饲料乙酸含量为6.3g/kg DM，显著高于CK(P<0.05)。 乳酸菌处理的老芒麦青贮饲料丙酸含量为1.0～2.2g/kg DM，显著低于CK(P<0.05)。 PE+LPL+LPA处理的的老芒麦裹包青贮饲料pH值和氨态氮/总氮比值较低，分别为4.01和 57.3g/kg。所有乳酸菌处理的老芒麦裹包青贮饲料中均未检测出丁酸。
表11：乳酸菌对老芒麦裹包青贮饲料发酵品质的影响
注：SEM,平均值标准误；同一列中不同小写字母表示平均值差异显著(P<0.05)；下同
乳酸菌对燕麦裹包青贮饲料发酵品质的影响如表12所示。添加低乳酸菌后，燕麦裹包 青贮饲料的pH值和氨态氮/总氮比值显著低于CK(P<0.05)；乳酸、总酸含量及乳酸/乙酸 比值显著高于CK(P<0.05)。乳酸菌处理降低了燕麦裹包青贮饲料的乙酸和丙酸含量 (P<0.05)，所有乳酸菌处理的燕麦裹包青贮饲料均未检测出丁酸。PE+LPL+LPA处理的燕 麦裹包青贮饲料具有较低pH值(3.97)和氨态氮/总氮比值(51.9g/kg)、较高的乳酸含量(38.5g/kg DM)和总酸含量(44.1g/kg DM)。
表12：乳酸菌对燕麦裹包青贮饲料发酵品质的影响
2.4乳酸菌对青贮饲料营养成分的影响
乳酸菌对老芒麦裹包青贮饲料的营养成分的影响如表13所示。乳酸菌处理的老芒麦裹 包青贮饲料可溶性碳水化合物与CK差异不显著(P>0.05)，LPL、LPA和PE+LPL+LPA处理的老芒麦青贮饲料粗蛋白含量显著高于CK、HX和FA。乳酸菌处理(P<0.05)降低了老 芒麦裹包青贮饲料中性洗涤纤维，但酸性洗涤纤维与CK差异不显著(P>0.05)。乳酸菌处 理(P<0.05)提高了老芒麦裹包青贮饲料体外干物质消化率，PE+LPL+LPA处理的老芒麦青 贮饲料具有较高的体外干物质消化率(509.0g/kg DM)。
表13：乳酸菌对老芒麦裹包青贮饲料营养成分的影响
乳酸菌对燕麦裹包青贮饲料的营养成分和体外干物质消化率的影响如表14所示。乳酸 菌处理的燕麦裹包青贮饲料可溶性碳水化化合物和酸性洗涤纤维分别为8.9～17.7g/kg DM和 286.1～313.5g/kg DM，与CK差异不显著(P>0.05)。LPA处理的燕麦裹包青贮饲料粗蛋白 含量显著高于CK和HX(P<0.05)。PE+LPL+LPA处理的燕麦裹包青贮饲料中性洗涤纤维含 量和体外干物质消化率显著高于其他处理(P<0.05)。
表14：乳酸菌对裹包燕麦青贮饲料营养成分的影响
5.5乳酸菌对青贮饲料有氧稳定性的影响
乳酸菌对裹包青贮饲料有氧稳定性的影响如图12所示。PE处理的青贮饲料有氧稳定性 高于对照(P>0.05)。乳酸菌处理对裹包青贮饲料有氧稳定性无显著性影响(P>0.05)，PE+LPL+LPA处理的裹包青贮饲料有氧稳定性高于单株乳酸菌处理(P>0.05)。老芒麦裹包青贮饲料有氧稳定性高于燕麦裹包青贮饲料(P>0.05)。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因 此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在 不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保 护范围。

Claims (2)

1.高寒牧区裹包青贮用混合乳酸菌制剂，其特征在于，它由保藏编号为CGMCCNo.14117的植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)148，保藏编号为CGMCC No.14116的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)171和保藏编号为CGMCC No.14183的耐乙醇片球菌(Pediococcus ethanolidurans)P-14组成。
2.根据权利要求1所述的高寒牧区裹包青贮用混合乳酸菌制剂在裹包青贮上的应用。
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