CN103750077A - 不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法，包括以下步骤：选择青宝II号添加剂、乳酸菌添加剂I、乳酸菌添加剂II三种乳酸菌，另设一组FM生理盐水对照；将虉草留茬2cm～3cm刈割，就地自然萎蔫2h～3h，收获人工运回实验室，用铡刀将虉草切成2cm～3cm后混合均匀并加入青宝II号添加剂、乳酸菌添加剂I、乳酸菌添加剂II添加剂；再次混匀后装入30cm×25cm的聚乙烯青贮袋中，每袋300g，用真空封口机抽真空后密封，置于室温储藏60d后，开封取样分析青贮发酵品质和化学成分；测定青贮原料和青贮饲料的常规成分、青贮饲料的pH值及有机酸和氨态氮；数据采用Excel2003和SPSS17软件进行方差分析，用Duncan法对平均值进行多重比较。本发明提高了虉草青贮的效率。

Description

不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法

技术领域

本发明属于川西北高寒牧区青贮添加剂技术领域，尤其涉及一种不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法。

背景技术

虉草属于禾本科虉草属，广泛分布于北美、北欧和亚洲等温带地区，在我国各地都有分布，因其具有较强的抗逆性、较高产量和营养价值而被广泛应用于饲草、人工湿地、生物能源等领域。然而由于其具有较高的N带走量而一直被作为入侵草来研究，因而如何有效利用虉草成为当今的热点。四川省草原科学研究院选育的川草引3号虉草适宜于川西北高原地区及周边省区的高寒牧区推广种植，最适宜在海拔2800～3600m的寒温-亚寒草甸地区种植。但是其收获时期恰值雨季，干草调制困难，不利于牧草的有效存储，导致饲草营养价值流失严重，饲草利用率低下。青贮调制能够很好地保藏虉草的营养成分，为牲畜提供优质的虉草青贮饲料。附着在青贮原料表面上的乳酸菌能够在厌氧条件下通过乳酸发酵有效将可溶性碳水化合物转化为乳酸，致使青贮体pH下降，抑制有害微生物的活动，从而有效保存青贮饲料。虉草表面附着微生物数量远远低于青贮发酵所需要的微生物数量，不易自然青贮成功。乳酸菌添加剂能够加速乳酸发酵进程，有效改善青贮饲料的发酵品质、营养价值和有氧稳定性，为牲畜提供优质的青贮饲料。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法，旨在解决现有的虉草表面附着微生物数量远远低于青贮发酵所需要的微生物数量，不易自然青贮成功的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法，该不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法包括以下步骤：

步骤一，选择青宝II号添加剂、乳酸菌添加剂I、乳酸菌添加剂II三种乳酸菌，每种乳酸菌添加剂选择3个添加剂梯度，另设一组FM生理盐水对照；

步骤二，将虉草留茬2cm～3cm刈割，就地自然萎蔫2h～3h，收获人工运回实验室，用铡刀将虉草切成2cm～3cm后混合均匀并加入青宝II号添加剂、乳酸菌添加剂I、乳酸菌添加剂II添加剂；

步骤三，再次混匀后装入30cm×25cm的聚乙烯青贮袋中，每袋300g，用真空封口机抽真空后密封，置于室温储藏60d后，开封取样分析青贮发酵品质和化学成分；

步骤四，测定青贮原料和青贮饲料的虉草干物质含量、粗蛋白、可溶性碳水化合物、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维成分、青贮饲料的pH值及有机酸和氨态氮；

步骤五，数据采用Excel2003和SPSS17软件进行方差分析，用Duncan法对平均值进行多重比较。

进一步，在步骤一中，FM生理盐水的添加量为5ml·kg^-1；青宝II号添加剂的3个添加剂梯度添加量分别为：0.01ml·kg^-1；0.03ml·kg^-1；0.05ml·kg^-1；乳酸菌添加剂I的3个添加剂梯度添加量分别为：0.073ml·kg^-1；0.22ml·kg^-1；0.37ml·kg^-1；乳酸菌添加剂II的3个添加剂梯度添加量分别为：0.011ml·kg^-1；0.033ml·kg^-1；0.055ml·kg^-1。

进一步，在步骤四中，青贮原料和青贮饲料的虉草干物质含量、粗蛋白、可溶性碳水化合物、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维成分的测定具体方法为：在65℃条件下烘干48h测定干物质，使用微型植物样粉碎机粉碎原料，过1mm筛，采用凯式定氮法测定粗蛋白，采用范氏方法测定中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维，采用蒽酮-硫酸法测定可溶性碳水化合物；

凯氏定氮法包括以下步骤：

称取0.5g的样品，使用定性滤渣包裹好，放入消化管中，加入硫酸钾-硫酸铜15∶1混合粉末；加入10ml浓硫酸，与420℃下进行消煮；消煮液至清亮蓝色为宜；配制40％氢氧化钠，l％的硼酸吸收液和0.1M盐酸溶液，用全自动定氮仪进行测定；

范式法测定中、酸性洗涤纤维的测定包括以下步骤：

称取30.0g分析纯十六烷基硫酸钠；18.6lg分析纯乙二胺四乙酸二钠；6.8lg分析纯十水四硼酸钠；4.56g分析纯无水磷酸氢二钠，10.0ml分析纯三甘醇；全部溶解于lL蒸馏水中，控制pH值在6.9-7.1之间；酶活性在340000M.W.U／ml的Alpha-淀粉酶；分析纯无水亚硫酸钠，称取烘干至恒重、过2mm筛的样品0.45-0.55g放入已经称重的滤袋中，距离袋口4cm封口；称取一个空白袋作为对照；滤袋架上最多放24个样品包，九个托盘不用区分样品编号，每个托盘放置3个滤袋，托盘间呈120度放置，将放置好滤袋的支架放入纤维分析容器中，放入重锤保证第九层托盘可以浸入液面下；遵循ANKOM2000全自动分析仪的操作；NDF分析及洗涤过程结束，打开盖子取出样品，轻压滤袋将水挤出，把滤袋放入250ml烧杯中，加入足够丙酮覆盖滤袋浸泡3-5min，从丙酮中取出滤袋风干，在烘箱中102℃烘干至恒重，冷却沉重后计算NDF的含量；

酸性洗涤纤维的测定包括以下步骤：

酸性洗涤剂2％十六烷基三甲基溴化铵的配制：称取20g化学纯十六烷基溴化铵溶于1000ml，1.00mol硫酸溶液中，搅拌均匀，必要时过滤；

1.00mol／L硫酸溶液的配制：量取55.74ml浓硫酸，化学纯，90％，比重1.84，慢慢加入已经装有1000ml蒸馏水的烧杯中，冷却至室温，定容至1000ml容量瓶中定容，标定；

称取烘干至恒重、过2mm筛的样品0.45-0.55g放入已经称重的滤袋中，距离袋口4cm封口；称取一个空白袋作为对照，滤袋架上最多放24个样品包，九个托盘不用区分样品编号，每个托盘放置3个滤袋，托盘间呈120度放置，将放置好滤袋的支架放入纤维分析容器中，放入重锤保证第九层托盘可以浸入液面下；遵循ANKOM2000全自动分析仪的操作；NDF分析及洗涤过程结束，打开盖子取出样品，轻压滤袋将水挤出，把滤袋放入250ml烧杯中，加入足够丙酮覆盖滤袋浸泡3-5min，从丙酮中取出滤袋风干，在烘箱中102℃烘干至恒重，冷却沉重后计算NDF的含量；

蒽酮-硫酸比色法测定可溶性碳水化合物方法为：

蔗糖标准溶液的配制100ug／ml；称取100mg分析纯无水蔗糖，溶于蒸馏水中，并定容至100ml容量瓶中，使用时再稀释10倍，即浓度为100ug／ml；

蒽酮试剂：称取1.0g蒽酮溶于1000ml浓硫酸中，冷却至室温后置于棕色瓶中，冰箱中4℃保存，备用

蔗糖标准曲线的制作：取标准容易分别稀释成0、20、40、60、80、100ug／ml不同梯度的标准溶液，量取稀释后的标准溶液1.0ml，加入蒽酮溶液5ml，迅速摇匀，待冷却后620nm波长下比色；用线性回归方程制定标准曲线；

测定方法：称取烘干至恒重的粉末样品0.5g，放入试管中，加入15ml蒸馏水，沸水浴30min，取出冷却过滤，定容至50ml，得到待测样品提取液；

取待测样品提取液1.0ml，加入蒽酮试剂5.0ml，迅速摇匀，冷却后在紫外分光光度计620nm波长下比色；将吸光值带入回归方程即可算出样品中可溶性糖浓度。

进一步，在步骤四中，青贮饲料的pH值及有机酸的测定具体方法为：准确称取20g样品，加入180ml蒸馏水，搅拌均匀，置于4℃冰箱中浸提24h，四层粗纱布过滤，用pH测定仪测滤液pH；将滤液3500r·min^-1离心15min，取上清液0.45um滤膜过滤后用HPLC测定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量。

进一步，在步骤四中，氨态氮的测定使用苯酚-次氯酸钠比色法测定，具体步骤以下步骤：

苯酚试剂：称取0.15g亚硝基铁氰化氯25g溶解于1.5L蒸馏水中，再加入33ml90％w／v苯酚溶液，定容至3L后，储存在棕色瓶中，备用；

次氯酸钠试剂：将15g分析纯氢氧化钠溶解于2L蒸馏水中，再次加入113.6g分析纯七水磷酸氢二钠，中火加热并不断搅拌至完全溶解；冷却后加入150m15.25％次氯酸钠，混匀，定容至3L，贮存于棕色瓶中备用；

标准铵溶液：称取0.6607g烘干至恒重的分析纯硫酸铵溶于蒸馏水中，定容至100ml，配制成100mmol／L的铵储备液；将储备液稀释成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol／L不同梯度的标准液；

具体操作步骤：向每只试管中加入50ul经稀释的样本液或标准液，空白为50ul的蒸馏水，各试管中加入2.5ml的苯酚试剂，摇匀；再次加入2ml的次氯酸钠试剂，摇匀；将混合液于95℃恒温水浴5min；冷却后630nm波长下分光光度计下比色，记录吸光值并计算。

进一步，该不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法得出采用乳酸菌添加剂I，添加量为0.37g·kg^-1FM作为青贮添加剂。

本发明提供的不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法，通过以抽穗期虉草为研究对象，探讨青宝II号、乳酸菌添加剂I、乳酸菌添加剂II三种乳酸菌添加剂的不同添加比例对川西北虉草青贮品质的影响，表明虉草自然青贮不易成功；各乳酸菌添加剂均能够显著降低虉草青贮饲料的pH、氨态氮与总氮比值(P<0.05)，显著增加乳酸和乙酸含量(P<0.05)，改善虉草青贮饲料的发酵品质；乳酸菌添加剂能够有效改善虉草青贮饲料的营养成分；各乳酸菌添加剂的不同添加比例对虉草青贮饲料的发酵品质和营养成分影响不同，采用乳酸菌添加剂I(0.37g·kg^-1FM)作为川西北高寒牧区青贮添加剂，致使青贮体pH下降，抑制有害微生物的活动，从而有效保存青贮饲料。本发明的飞风机的，操作方便，较好的解决了现有的虉草表面附着微生物数量远远低于青贮发酵所需要的微生物数量，不易自然青贮成功的问题。

附图说明

图1是本发明实施例提供的不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

如图1所示，本发明实施例的不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法包括以下步骤：

S101：选择青宝II号添加剂、乳酸菌添加剂I、乳酸菌添加剂II三种乳酸菌，每种乳酸菌添加剂选择3个添加剂梯度，另设一组FM生理盐水对照；

S102：将虉草留茬2cm～3cm刈割，就地自然萎蔫2h～3h，收获人工运回实验室，用铡刀将虉草切成2cm～3cm后混合均匀并加入青宝II号添加剂、乳酸菌添加剂I、乳酸菌添加剂II添加剂；

S103：再次混匀后装入30cm×25cm的聚乙烯青贮袋中，每袋约300g，用真空封口机抽真空后密封，置于室温储藏60d后，开封取样分析青贮发酵品质和化学成分；

S104：测定青贮原料和青贮饲料的常规成分、青贮饲料的pH值及有机酸和氨态氮；

S105：数据采用Excel2003和SPSS17软件进行方差分析，用Duncan法对平均值进行多重比较。

在步骤S101中：FM生理盐水的添加量为5ml·kg^-1；青宝II号添加剂的3个添加剂梯度添加量分别为：0.01m1·kg^-l；0.03ml·kg^-1；0.05ml·kg^-1；

乳酸菌添加剂I的3个添加剂梯度添加量分别为：0.073ml·kg^-1；0.22ml·kg^-1；0.37ml·kg^-1；

乳酸菌添加剂II的3个添加剂梯度添加量分别为：0.011ml·kg^-1；0.033ml·kg^-1；0.055ml·kg^-1；

在步骤S104中，青贮原料和青贮饲料的虉草干物质含量、粗蛋白、可溶性碳水化合物、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维成分的测定具体方法为：在65℃条件下烘干48h测定干物质，使用微型植物样粉碎机粉碎原料，过1mm筛，采用凯式定氮法测定粗蛋白，采用范氏方法测定中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维，采用蒽酮-硫酸法测定可溶性碳水化合物；

(1)凯氏定氮法：

准确称取0.5g的样品，使用定性滤渣包裹好，放入消化管中，加入加入硫酸钾-硫酸铜(15∶1)混合粉末；加入10ml浓硫酸，与420℃下进行消煮。消煮液至清亮蓝色为宜。配制40％氢氧化钠，1％的硼酸吸收液和0.1M盐酸溶液，用全自动定氮仪进行测定(由FOSS公司生产)；

(2)范式法测定中、酸性洗涤纤维NDF的测定：

称取30.0g十六烷基硫酸钠(分析纯)；18.6lg乙二胺四乙酸二钠(分析纯)；6.8l g十水四硼酸钠(分析纯)；4.56g无水磷酸氢二钠(分析纯)，10.0ml三甘醇(分析纯)；全部溶解于1L蒸馏水中，控制pH值在6.9-7.1之间；酶活性在340000M.W.U／ml的Alpha-淀粉酶。无水亚硫酸钠(分析纯)；

称取烘干至恒重、过2mm筛的样品0.45-0.55g放入已经称重的滤袋中，距离袋口4cm封口。准确称取一个空白袋作为对照。滤袋架上最多放24个样品包，九个托盘不用区分样品编号，每个托盘放置3个滤袋，托盘间呈120度放置，将放置好滤袋的支架放入纤维分析容器中，放入重锤保证第九层托盘可以浸入液面下。遵循ANKOM2000全自动分析仪的操作。NDF分析及洗涤过程结束，打开盖子取出样品，轻压滤袋将水挤出，把滤袋放入250ml烧杯中，加入足够丙酮覆盖滤袋浸泡3-5min，从丙酮中取出滤袋风干，在烘箱中102℃烘干至恒重，冷却沉重后计算NDF的含量；

ADF的测定：

酸性洗涤剂(2％十六烷基三甲基溴化铵)的配制：称取20g十六烷基溴化铵(CTAB，化学纯，364.47)溶于1000ml，1.00mol硫酸溶液中，搅拌均匀，必要时过滤；

1.00mol／L硫酸溶液的配制：量取约55.74ml浓硫酸(化学纯，90％，比重1.84)慢慢加入已经装有1000ml蒸馏水的烧杯中，冷却至室温，定容至1000ml容量瓶中定容，标定。

称取烘干至恒重、过2mm筛的样品0.45-0.55g放入已经称重的滤袋中，距离袋口4cm封口。准确称取一个空白袋作为对照。滤袋架上最多放24个样品包，九个托盘不用区分样品编号，每个托盘放置3个滤袋，托盘间呈120度放置，将放置好滤袋的支架放入纤维分析容器中，放入重锤保证第九层托盘可以浸入液面下。遵循ANKOM2000全自动分析仪的操作。NDF分析及洗涤过程结束，打开盖子取出样品，轻压滤袋将水挤出，把滤袋放入250ml烧杯中，加入足够丙酮覆盖滤袋浸泡3-5min，从丙酮中取出滤袋风干，在烘箱中102℃烘干至恒重，冷却沉重后计算NDF的含量。

(3)蒽酮-硫酸比色法测定可溶性碳水化合物(WSC)：

蔗糖标准溶液的配制(100ug/ml)；准确称取100mg分析纯无水蔗糖，溶于蒸馏水中，并定容至100ml容量瓶中，使用时再稀释10倍，即浓度为100ug/ml。

蒽酮试剂：称取1.0g蒽酮溶于1000ml浓硫酸中，冷却至室温后置于棕色瓶中，冰箱中4℃保存，备用。

蔗糖标准曲线的制作：取标准容易分别稀释成0、20、40、60、80、100ug／ml不同梯度的标准溶液，量取稀释后的标准溶液1.0ml，加入蒽酮溶液5ml，迅速摇匀，待冷却后620nm波长下比色。用线性回归方程制定标准曲线。

测定方法：称取烘干至恒重的粉末样品0.5g，放入试管中，加入15ml蒸馏水，沸水浴30min，取出冷却过滤，定容至50ml，得到待测样品提取液。

取待测样品提取液1.0ml，加入蒽酮试剂5.0ml，迅速摇匀，冷却后在紫外分光光度计620nm波长下比色。将吸光值带入回归方程即可算出样品中可溶性糖浓度。

青贮饲料的pH值及有机酸的测定具体方法为：准确称取20g样品，加入180ml蒸馏水，搅拌均匀，置于4℃冰箱中浸提24h，四层粗纱布过滤，用pH测定仪测滤液pH(奥立龙pH计)。将滤液3500r·min^-1离心15min，取上清液0.45um滤膜过滤后用HPLC(KC-811column，Shodex；Shimadzu，日本；柱温35℃；流速0.7mL·min^-1；210nm，SPD检测器)测定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量。

氨态氮的测定使用苯酚-次氯酸钠比色法测定：

苯酚试剂：准确称取0.15g亚硝基铁氰化氯(K2Fe(CN)5(NO)·2H20，297.95，化学纯，25g)溶解于1.5L蒸馏水中，再加入33ml(90％w／v)苯酚溶液，定容至3L后，储存在棕色瓶中，备用。

次氯酸钠试剂：将15g氢氧化钠(分析纯)溶解于2L蒸馏水中，再次加入113.6g七水磷酸氢二钠(分析纯)，中火加热并不断搅拌至完全溶解。冷却后加入150m15.25％次氯酸钠，混匀，定容至3L。贮存于棕色瓶中备用。

标准铵溶液：称取0.6607g烘干至恒重的硫酸铵(化学纯)溶于蒸馏水中，定容至100ml，配制成100mmol／L的铵储备液。将上诉储备液稀释成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol／L不同梯度的标准液。

具体操作步骤：向每只试管中加入50ul经适当稀释的样本液或标准液，空白为50ul的蒸馏水，各试管中加入2.5ml的苯酚试剂，摇匀。再次加入2ml的次氯酸钠试剂，摇匀；将混合液于95℃恒温水浴5min；冷却后630nm波长下分光光度计下比色，记录吸光值并计算。

通过以下具体实施例和分析对本发明做进一步的说明：

1材料与方法：

1.1试验材料与添加剂

2011年7月选择红原县二农场处于抽穗期的“川草引3号”虉草(Phalarisarundinacea L.)作为青贮原料，添加剂为青宝II号(FS)由北京塔山科技有限公司提供，乳酸菌添加剂I(LAB I，以异型乳酸菌为主)和乳酸菌添加剂II(LABII，以同型乳酸菌为主)由Medipharm USA公司提供。

1.2试验设计

试验采用完全随机区组设计，每种乳酸菌添加剂添加剂选择3个添加剂梯度，另设一组对照(CK，5m1·kg^-1FM生理盐水)，各种乳酸菌添加剂的添加比列如表1所示：

表1虉草青贮试验设计方案

1.3试验方法：

1.3.1青贮饲料的调制：

将虉草留茬2cm～3cm刈割，就地自然萎蔫2h～3h，收获人工运回实验室，用铡刀将虉草切成2cm～3cm后混合均匀并加入添加剂，再次混匀后装入30cm×25cm的聚乙烯青贮袋中，每袋约300g，用真空封口机抽真空后密封，置于室温储藏60d后，开封取样分析青贮发酵品质和化学成分；

1.3.2分析项目及方法：

依据农业部《青贮饲料质量评定标准》，从色泽、气味、质地和霉变等方面对青贮饲料进行感官评定。

青贮原料和青贮饲料的常规成分的测定：在65℃条件下烘干48h测定干物质(DM)，使用微型植物样粉碎机粉碎原料，过1mm筛，采用凯式定氮法测定粗蛋白(CP)，采用范氏方法测定中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)，采用蒽酮-硫酸法测定可溶性碳水化合物(WSC)。

青贮饲料的pH值及有机酸的测定：准确称取20g样品，加入180ml蒸馏水，搅拌均匀，置于4℃冰箱中浸提24h，四层粗纱布过滤，用pH测定仪测滤液pH(奥立龙pH计)。将滤液3500r·min^-1离心15min，取上清液0.45um滤膜过滤后用HPLC(KC-811column，Shodex；Shimadzu，日本；柱温35℃；流速0.7mL·min^-1；2l0nm，SPD检测器)测定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量。

氨态氮的测定：使用苯酚-次氯酸钠比色法测定。

1.4数据处理：

数据采用Excel2003和SPSS17软件进行方差分析，用Duncan法对平均值进行多重比较。

2结果与分析：

2.1虉草青贮原料的化学成分：

虉草青贮原料的化学成分如表2所示。虉草干物质含量(DM)、粗蛋白(CP)、可溶性碳水化合物(WSC)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)分别为374.76％、106.9l％、171.63％、655.7l％、318.70％。

表2虉草的化学成分

2.2虉草青贮饲料的感官评定：

所有虉草青贮饲料为黄色，具有酸香味，质地柔软不黏手，无霉变和腐臭味道。

2.3虉草青贮饲料的发酵品质：

虉草青贮饲料的发酵品质如表3所示。所有处理的pH均显著低于对照(P<0.05)，LAB I3处理的pH值为3.89，显著低于其他各处理(P<0.05)。各添加剂处理的乳酸含量随着添加量的增加呈上升趋势，LAB I3处理的乳酸含量显著高于其他各处理(P<0.05)。所有处理的乙酸含量高于对照，随着添加量增加，FS处理和LABII处理的乙酸含量具有降低趋势，LAB I处理的乙酸含量具有增加趋势。FS处理的乳酸／乙酸均高于对照，LAB I处理的乳酸／乙酸均显著低于对照(P<0.05)，LABII处理的乳酸／乙酸比值与对照差异不显著。所有处理的丙酸含量显著低于对照(P＜0.05)。所有处理的氨态氮／总氮比值显著低于对照(P＜0.05)，随着添加量的增加，FS处理和LABII处理的氨态氮／总氮比值逐渐降低，LAB I处理的氨态氮／总氮比值具有先降低再升高的趋势。

表3虉草青贮饲料的发酵品质

注：各处理均未检测到丁酸；同一列中不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)

2.4虉草青贮饲料的化学成分：

虉草青贮饲料的化学成分如表4所示。各处理的干物质含量均显著低于对照(P＜0.05)。FS2处理和LAB I l处理的可溶性碳水化合物含量显著增加(P＜0.05)。随着添加量的增加，FS处理的中性洗涤纤维含量逐渐降低，酸性洗涤纤维含量先降低再增加；LAB I处理和LABII处理的中性洗涤纤维含量逐渐增加，LAB I处理的酸性洗涤纤维先降低再增加，LABII处理的酸性洗涤纤维具有降低趋势。

表4虉草青贮饲料的化学成分

注：同一列中不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)

3讨论：

青贮饲料微生物添加剂作为绿色添加剂，应用方便、简洁，克服了其他青贮添加剂具有刺激性、家畜采食安全隐患等缺陷，越来越受到世界各国的重视，并取得了很快的发展。许多研究表明，当青贮原料表面的附着乳酸菌相对较少，添加微生物制剂可以改善青贮饲料的发酵品质和营养价值，为牲畜提供优质的青贮饲料。青贮是不同微生物相互作用的过程。由于同型乳酸菌在青贮过程中能够有效、快速地将可溶性碳水化合物转化成乳酸而成为青贮乳酸菌添加剂的首选。但不是所有的同型乳酸菌都能够快速生长，而且调制出的青贮饲料有氧稳定性较差。最近，大量研究表明，异型乳酸菌能够将乳酸转化成乙酸、丙酸和乙醇，从而提高青贮饲料的好氧稳定性：。虉草在自然青贮条件下pH为4.67，未达到优质青贮饲料的pH在3.8～4.2的范围内，可能原因是虉草生物碱含量较高，影响了青贮饲料的缓冲能值，同时虉草表面附着乳酸菌数量远远低于霉菌、酵母菌等其他有害菌的数量，使得虉草的青贮调制较为困难。

不同乳酸菌添加剂对虉草青贮饲料发酵品质的影响不同。给青贮饲料添加乳酸菌的主要目的是加速乳酸发酵，快速生成乳酸，形成酸性环境，有效保存营养成分^[14]。本发明添加乳酸菌后，与对照相比，虉草青贮饲料的pH值显著降低，乳酸和乙酸含量提高，丙酸及氨态氮与总氮比值降低，提高了虉草青贮饲料的发酵品质。添加青宝II号后，随着添加量的增加，虉草青贮饲料的pH值、乙酸含量和氨态氮与总氮比值逐渐降低，乳酸含量增加，但是乳酸与乙酸的比值却先降低再增加，可能原因是：青宝II号是一种混合乳酸菌添加剂，新添加的乳酸菌菌种与青贮原料表面附着的乳酸菌相互作用，使得不同比例乳酸菌添加量处理后的青贮饲料中各类型乳酸菌优势度发生改变，最终导致乳酸和乙酸的比值不同。异型乳酸菌能够将乳酸转化成乙酸和丙酸等好氧微生物抑制剂，有效抑制霉菌、酵母菌、丁酸菌等的活性，改善青贮饲料的有氧稳定性。本发明中，LAB I处理后的虉草青贮饲料pH值和氨态氮与总氮比值显著降低，乳酸和乙酸含量显著增加，但是乳酸与乙酸的比值显著降低，说明异型乳酸菌在青贮发酵过程中起支配作用；随着LAB I添加量的增加，丙酸的含量逐渐降低，可能是青贮饲料中异型乳酸菌发酵产生大量的乙酸，导致丙酸生成途径受到抑制。添加同型乳酸菌能够加速pH值下降，提高青贮饲料的发酵品质。本发明中，随着LABII添加量的增加，pH、乳酸含量、乙酸含量、丙酸含量等均无显著性变化，但是氨态氮与总氮比值显著降低，说明同型乳酸菌能够快速生成乳酸，有效降低青贮饲料pH值，抑制有害微生物对青贮饲料中粗蛋白的分解消耗，改善青贮饲料的发酵品质；同时乙酸含量随着随着LABII添加量的增加具有降低趋势，说明青贮饲料中同型乳酸菌起主导作用。

不同乳酸菌添加剂对虉草青贮饲料营养成分的影响不同。在青贮发酵充分的前提下适当提高干物质含量能够增加牲畜的采食量，本发明中，各添加剂处理的干物质含量均显著低于对照，说明乳酸菌会导致青贮饲料的干物质含量降低，这与Filya和Krawutschke的研究基本一致。同型乳酸菌和异型乳酸菌混合使用能够提高青贮饲料的可溶性碳水化合物含量及粗蛋白含量，有效降低酸性洗涤纤维含量，而Conaghan等通过多花黑麦草青贮试验发现同型乳酸菌不能够增加可溶性碳水化合物的含量。可溶性碳水化合物是乳酸菌的发酵底物，青贮饲料中残留的可溶性碳水化合物直接影响青贮饲料的营养价值、适口性及好氧稳定性，本发明中，随着添加量的增加，各乳酸菌处理的可溶性碳水化合物表现出不同的变化趋势，可能由乳酸菌对可溶性碳水化合物的利用率不同造成的。各乳酸菌对青贮饲料中的粗蛋白含量影响不同，可能与微生物中的蛋白水解酶有关。有研究表明，同型乳酸菌对青贮饲料干物质、粗蛋白和中性洗涤纤维的瘤胃降解率无影响，但是能够增加青贮饲料中蛋白质水解，导致真蛋白、中性洗涤不溶性蛋白质的降低及非蛋白氮的增加。

川西北虉草自然青贮较困难，需要添加添加剂来改善青贮饲料的发酵品质。乳酸菌能够改善虉草青贮饲料的发酵品质和营养价值，为川西北高寒牧区提供优质的虉草青贮饲料，采用乳酸菌添加剂I(0.37g·kg^-1FM)作为川西北高寒牧区青贮添加剂。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法，其特征在于，该不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法包括以下步骤：

步骤一，选择青宝II号添加剂、乳酸菌添加剂I、乳酸菌添加剂II三种乳酸菌，每种乳酸菌添加剂选择3个添加剂梯度，另设一组FM生理盐水对照；

步骤二，将虉草留茬2cm～3cm刈割，就地自然萎蔫2h～3h，收获人工运回实验室，用铡刀将虉草切成2cm～3cm后混合均匀并加入青宝II号添加剂、乳酸菌添加剂I、乳酸菌添加剂II添加剂；

步骤三，再次混匀后装入30cm×25cm的聚乙烯青贮袋中，每袋300g，用真空封口机抽真空后密封，置于室温储藏60d后，开封取样分析青贮发酵品质和化学成分；

步骤四，测定青贮原料和青贮饲料的虉草干物质含量、粗蛋白、可溶性碳水化合物、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维成分、青贮饲料的pH值及有机酸和氨态氮；

步骤五，数据采用Excel2003和SPSS17软件进行方差分析，用Duncan法对平均值进行多重比较。

2.如权利要求1所述的不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法，其特征在于，在步骤一中，FM生理盐水的添加量为5ml·kg^-1；青宝II号添加剂的3个添加剂梯度添加量分别为：0.01ml·kg^-1；0.03ml·kg^-1；0.05ml·kg^-1；乳酸菌添加剂I的3个添加剂梯度添加量分别为：0.073ml·kg^-1；0.22ml·kg^-1；0.37ml·kg^-1；乳酸菌添加剂II的3个添加剂梯度添加量分别为：0.011ml·kg^-1；0.033ml·kg^-1；0.055ml·kg^-1。

3.如权利要求1所述的不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法，其特征在于，在步骤四中，青贮原料和青贮饲料的虉草干物质含量、粗蛋白、可溶性碳水化合物、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维成分的测定具体方法为：在65℃条件下烘干48h测定干物质，使用微型植物样粉碎机粉碎原料，过1mm筛，采用凯式定氮法测定粗蛋白，采用范氏方法测定中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维，采用蒽酮-硫酸法测定可溶性碳水化合物；

凯氏定氮法包括以下步骤：

称取0.5g的样品，使用定性滤渣包裹好，放入消化管中，加入硫酸钾-硫酸铜15∶1混合粉末；加入10ml浓硫酸，与420℃下进行消煮；消煮液至清亮蓝色为宜；配制40％氢氧化钠，1％的硼酸吸收液和0.1M盐酸溶液，用全自动定氮仪进行测定；

范式法测定中、酸性洗涤纤维的测定包括以下步骤：

称取30.0g分析纯十六烷基硫酸钠；18.61g分析纯乙二胺四乙酸二钠；6.8lg分析纯十水四硼酸钠；4.56g分析纯无水磷酸氢二钠，10.0ml分析纯三甘醇；全部溶解于1L蒸馏水中，控制pH值在6.9-7.1之间；酶活性在340000M.W.U／ml的Alpha-淀粉酶；分析纯无水亚硫酸钠，称取烘干至恒重、过2mm筛的样品0.45-0.55g放入已经称重的滤袋中，距离袋口4cm封口；称取一个空白袋作为对照；滤袋架上最多放24个样品包，九个托盘不用区分样品编号，每个托盘放置3个滤袋，托盘间呈120度放置，将放置好滤袋的支架放入纤维分析容器中，放入重锤保证第九层托盘可以浸入液面下；遵循ANKOM2000全自动分析仪的操作；NDF分析及洗涤过程结束，打开盖子取出样品，轻压滤袋将水挤出，把滤袋放入250ml烧杯中，加入足够丙酮覆盖滤袋浸泡3-5min，从丙酮中取出滤袋风干，在烘箱中102℃烘干至恒重，冷却沉重后计算NDF的含量；

酸性洗涤纤维的测定包括以下步骤：

酸性洗涤剂2％十六烷基三甲基溴化铵的配制：称取20g化学纯十六烷基溴化铵溶于1000ml，1.00mol硫酸溶液中，搅拌均匀，必要时过滤；

1.00mol／L硫酸溶液的配制：量取55.74ml浓硫酸，化学纯，90％，比重1.84，慢慢加入已经装有1000ml蒸馏水的烧杯中，冷却至室温，定容至1000ml容量瓶中定容，标定；

称取烘干至恒重、过2mm筛的样品0.45-0.55g放入已经称重的滤袋中，距离袋口4cm封口；称取一个空白袋作为对照，滤袋架上最多放24个样品包，九个托盘不用区分样品编号，每个托盘放置3个滤袋，托盘间呈120度放置，将放置好滤袋的支架放入纤维分析容器中，放入重锤保证第九层托盘可以浸入液面下；遵循ANKOM2000全自动分析仪的操作；NDF分析及洗涤过程结束，打开盖子取出样品，轻压滤袋将水挤出，把滤袋放入250ml烧杯中，加入足够丙酮覆盖滤袋浸泡3-5min，从丙酮中取出滤袋风干，在烘箱中102℃烘干至恒重，冷却沉重后计算NDF的含量；

蒽酮-硫酸比色法测定可溶性碳水化合物方法为：

蔗糖标准溶液的配制100ug／ml；称取100mg分析纯无水蔗糖，溶于蒸馏水中，并定容至100ml容量瓶中，使用时再稀释10倍，即浓度为100ug／ml；

蒽酮试剂：称取1.0g蒽酮溶于1000ml浓硫酸中，冷却至室温后置于棕色瓶中，冰箱中4℃保存，备用

蔗糖标准曲线的制作：取标准容易分别稀释成0、20、40、60、80、100ug／ml不同梯度的标准溶液，量取稀释后的标准溶液1.0ml，加入蒽酮溶液5ml，迅速摇匀，待冷却后620nm波长下比色；用线性回归方程制定标准曲线；

测定方法：称取烘干至恒重的粉末样品0.5g，放入试管中，加入15ml蒸馏水，沸水浴30min，取出冷却过滤，定容至50ml，得到待测样品提取液；

取待测样品提取液1.0ml，加入蒽酮试剂5.0ml，迅速摇匀，冷却后在紫外分光光度计620nm波长下比色；将吸光值带入回归方程即可算出样品中可溶性糖浓度。

4.如权利要求1所述的不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法，其特征在于，在步骤四中，青贮饲料的pH值及有机酸的测定具体方法为：准确称取20g样品，加入180ml蒸馏水，搅拌均匀，置于4℃冰箱中浸提24h，四层粗纱布过滤，用pH测定仪测滤液pH；将滤液3500r·min^-1离心15min，取上清液0.45um滤膜过滤后用HPLC测定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量。

5.如权利要求1所述的不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法，其特征在于，在步骤四中，氨态氮的测定使用苯酚-次氯酸钠比色法测定，具体步骤以下步骤：

苯酚试剂：称取0.15g亚硝基铁氰化氯25g溶解于1.5L蒸馏水中，再加入33ml90％w／v苯酚溶液，定容至3L后，储存在棕色瓶中，备用；

次氯酸钠试剂：将15g分析纯氢氧化钠溶解于2L蒸馏水中，再次加入113.6g分析纯七水磷酸氢二钠，中火加热并不断搅拌至完全溶解；冷却后加入150m15.25％次氯酸钠，混匀，定容至3L，贮存于棕色瓶中备用；

标准铵溶液：称取0.6607g烘干至恒重的分析纯硫酸铵溶于蒸馏水中，定容至100ml，配制成100mmol／L的铵储备液；将储备液稀释成1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol／L不同梯度的标准液；

具体操作步骤：向每只试管中加入50ul经稀释的样本液或标准液，空白为50ul的蒸馏水，各试管中加入2.5ml的苯酚试剂，摇匀；再次加入2ml的次氯酸钠试剂，摇匀；将混合液于95℃恒温水浴5min；冷却后630nm波长下分光光度计下比色，记录吸光值并计算。

6.如权利要求1所述的不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法，其特征在于，该不同乳酸菌菌制剂添加比例对虉草青贮品质影响的方法得出采用乳酸菌添加剂I，添加量为0.37g·kg^-1FM作为青贮添加剂。

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