KR101791850B1

KR101791850B1 - 반추가축용 완전배합사료 및 사일리지 발효 촉진제

Info

Publication number: KR101791850B1
Application number: KR1020150092414A
Authority: KR
Inventors: 이찬호; 강정선; 조원탁; 조경진
Original assignee: (주)진바이오텍
Priority date: 2015-06-29
Filing date: 2015-06-29
Publication date: 2017-11-01
Also published as: KR20170002767A

Abstract

본 발명은 TMR 발효촉진용 스타터에 관한 것으로서, 기존 시판 제품에 비해 저온, 고온조건에서의 발효특성이 우수하고, 저장안정성이 우수하여, 사료로서의 가치가 보다 현저한 것인 것을 특징으로 한다.

Description

반추가축용 완전배합사료 및 사일리지 발효 촉진제{TOTAL MIXED RATION AND SILAGE FERMENTATION ACCELERATOR FOR RUMINANT}

본 발명은 반추가축용 완전배합사료 및 사일리지 발효 촉진제에 관한 것이다.

완전배합사료(total mixed ration, TMR)란 조사료와 농후사료(또는 상업용 배합사료)를 반추가축에게 필요한 영양소 요구량에 맞도록 적절한 비율로 배합한 사료를 말하며, 본 명세서에서는 이를 TMR 이라고도 한다.

구체적으로, 가축용 사료로서 시판되고 있는 배합사료(농후사료)는 대상동물이 필요로 하는 영양분을 배합 설계한 것인데, 보통 고형의 섬유성물질은 많이 포함하고 있지 않다. 그러나, 소나 양과 같은 반추위를 가진 가축이 섭취한 사료는 위 내에 장시간 체류함으로써 위 운동에 의해 적합하게 교반되고 위 내의 각종 세균이나 효소의 작용에 의해 발효되어 영양분으로 흡수되어야 하나, 사료 중에 고형의 섬유성물질이 적을 경우에는 상기 교반과 발효가 충분히 진행되지 못하여 여러 가지 장해가 야기될 수 있다. 이에, 반추위를 가진 가축에게 배합사료를 급여할 때에는 고형의 섬유성 물질로 이루어진 조사료를 섞어서 줄 필요가 있는데, 이것을 완전배합사료라 한다.

즉, 완전배합사료는 조사료와 배합사료의 완전한 혼합을 통해 개체간의 채식 다툼을 막을 수 있을 뿐만 아니라, 영양성분의 균형을 통해 대사성 질병의 예방, 반추위내 발효의 안정화, 사료섭취량의 개선, 영양소의 이용효율 증가 및 일당증체량 증가 등의 가축 생산성의 증가라는 효과를 얻는데 있어 중요한 역할을 한다.

TMR 제품은 사일리지 발효 촉진용 스타터(starter)를 첨가한 제품과 첨가하지 않은 제품으로 구분할 수 있는데, 스타터를 첨가하지 않은 제품의 경우에는 조사료용 자원 부족 및 고가 현상으로 인해, 제품의 전체적인 단가에 있어서 경쟁력이 떨어진다. 이에, 대한민국 특허공보 제 1982-0001405호에는 99.5-90 % 의 식물성섬유물질과 0.5-10 % 의 비단백질태 질소화합물을 포함하는 혼합물을 알코올발효성균, 유기산발효성균 및 에스테르생성균으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 발효균으로 발효시킨 사료가 게시되어 있다.

대한민국 특허공보 제 1982-0001405호

그러나, 사일리지 발효 촉진용 스타터를 첨가한 TMR 제품 중 시판되는 5종의 TMR 및 사일리지(silage)에 사용되는 스타터를 수거하여 미생물 분석을 시도해본 결과 모든 제품이 초기에는 규격 기준 균수를 유지 하였으나, 저장 기간이 지남에 따라서 생균수가 감소 되었으며, 특히 아래의 표 1 의 B제품의 경우에는 초기 균수는 3.1X10¹⁰ CFU/g 이였지만 6개월 경과 후의 균수는 2X10⁷ CFU/g으로 저장 안정성이 매우 좋지 않음을 확인 할 수 있었다.

이와 같이, 시중에 판매되는 TMR 및 사일리지용 스타터는 저장성이 취약한 것으로 판단되는데, 저장 기간의 경과로 스타터 균수가 낮아지게 되면 발효 성능의 저하로 인해 TMR 및 사일리지 제품의 품질 변이가 심하게 나타날 수 있다.

시판 starter 저장 안정성 분석 결과(단위: CFU/g)

Starter	균 주 명	균수 규격	초기 균수	6개월 저장 후 균수
A	L. plantarum	1.0.E+10	2.10E+10	6.00E+08
B	L. plantarum	1.00E+10	3.10E+10	2.00E+07
C	L. acidophillus	4.40E+09	9.44E+10	2.52E+09
	L. plantarum	9.50E+08
	P. acidilactici	8.90E+10
D	L. plantarum	1.00E+09	1.52E+10	1.30E+08
C	L. plantarum	1.00E+10	3.70E+10	5.30E+08

본 발명자는 위 시판제제의 단점을 극복하고자, 본 발명을 상도하기에 이르렀다.

본 발명은 다음의 수단을 통해 전술한 과제를 해결한다.

(1) 저온 조건에서도 발효 특성이 우수한 TMR 또는 사일리지 발효촉진용 스타터인 락토바실러스 파라카세이 GB-TS5(Lactobacillus paracasei GB-TS5, KCCM11535P).

(2) 저온 조건에서도 발효 특성이 우수한 TMR 또는 사일리지 발효촉진용 스타터인 락토바실러스 플란타럼 GB-LP2(Lactobacillus plantarum GB-LP2, KCCM11259P).

(3) 저온 조건에서도 발효 특성이 우수한 TMR 또는 사일리지 발효촉진용 스타터인 락토바실러스 아시도필러스 GB-LC2(Lactobacillus acidophilus GB-LC2, KCCM10671P).

(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 따른 균주를 하나 이상 함유하는 TMR.

(5) 상기 (1) 내지 (3) 에 따른 균주를 1 : 1 : 1 의 균수 비율로 혼합한 것을 함유하는 TMR.

시판 중인 사일리지 발효촉진용 스타터를 첨가한 TMR 은 일반적으로 겨울철 발효 시 하절기에 비해 발효가 잘 되지 않아, 제품 내 유산균 및 효모 등의 유익균의 증가는 없이 대장균/군을 비롯한 곰팡이 균주 등의 유해균의 균수가 증가하고, pH 가 높아 발효 품질 자체에 문제가 있으며, 매번 제조 시마다 일정한 품질을 유지할 수 없다는 단점이 있으나, 본 발명에 따른 TMR 은 본 발명에 따른 균주를 스타터로 활용함으로써 완전배합사료 및 사일리지의 발효 시 저온 및 고온 조건에서도 균 성장이 잘되어 일정한 품질을 확보할 수 있다. 아울러, 본 발명에 따른 TMR 은 저장안정성이 우수하며, 반추동물의 생산성을 향상시킬 수 있다.

도 1 은 시판 TMR과 본 발명에 따른 TMR의 발효일자별 pH 변화를 나타낸 것이다.
도 2 는 시판 TMR과 본 발명에 따른 TMR의 발효일자별 대장균군 균수 변화를 나타낸 것이다.
도 3 은 시판 TMR 과 본 발명에 따른 TMR의 발효일자별 유산균 균수 변화를 나타낸 것이다.

제 1 본 발명은 TMR 및 사일리지 발효촉진제용 스타터 균주에 관한 것으로서, 저온조건에서의 발효 특성, 유해균에 대한 항균활성, 내산성, 내한성, 내열성, 섬유소 분해능, 유기산 생성능, 및 당과 질소 이용성 등이 우수하다는 것이 특징이다. 제 2 본 발명은 제 1 본 발명에 따른 사일리지 발효촉진용 스타터(starter)를 첨가한 TMR 에 관한 것으로서, 특히 제 1 본 발명에 따른 3 종의 균주를 1 : 1 : 1 의 균수 비율로 첨가한 TMR 에 관한 것이다. 제 3 본 발명은 제 2 본 발명에 따른 TMR 의 대량 생산 제조 공정에 관한 것이다. 이하 각 발명에 대해 상세히 설명한다.

[정의]

“선발균주” 라 함은 본 발명에 따른 균주를 말하는 것으로서, 본 출원 전에 기탁기관에 기탁을 완료한 Lactobacillus paracasei GB-TS5(KCCM11535P), Lactobacillus plantarum GB-LP2(KCCM11259P) 또는 Lactobacillus acidophilus GB-LC2(KCCM10671P) 을 나타낸다.

“개발제품” 이라 함은 본 명세서에서 언급한 최적의 조합으로 이루어진 본 발명에 따른 TMR 을 말한다.

[본 발명에 따른 균주의 특성]

반추동물용 완전배합사료의 주요 품질변이 요인으로는 제조공정 중 계절적 기온변화에 따른 TMR 또는 silage 내 균총 또는 균수의 변화를 들 수 있으며, 이는 가축의 생산성에 직접 또는 간접적인 영향을 미치는 원인이 되고 있다. TMR 또는 silage 제품의 제조 시 하절기에는 유산균의 성장이 촉진되어 젖산(lactic acid) 함량이 증가되고, 이로 인해 유산균과 같은 유용미생물 외에 대장균, 효모 및 곰팡이 균주를 포함하는 다양한 호기성 미생물의 생육은 강하게 억제하게 된다. 이에 반해 시판 중인 TMR 또는 silage 제품의 제조 시 동절기의 저온조건 (-0.5~10℃, TMR 제조시설 실내 온도기준)에서는 하절기에 비해 유산균의 증식 속도가 느려지고, 이로 인해 하절기와 동일한 발효시간 기준으로 lactic acid를 포함하는 유기산의 함량이 약 50% 수준이하로 낮아져, 곰팡이 및 효모를 포함하는 다양한 미생물들의 제어가 용이하지 않아 이들이 높은 균수로 존재하게 되어 하절기 대비 품질적인 차이가 발생되게 된다. 따라서, 본 발명자는 다량의 유기산 (Acetic acid, lactic acid 등) 생성능을 가지고 있으면서, 동시에 여름과 겨울의 극명한 온도 차이가 존재하는 한국형 기후 조건에 적용이 가능하도록 저온 및 고온에서 모두 성장이 가능하며, 당 이용성이 높고 단백질 이용성은 상대적으로 낮은 특성을 보유하는 균주를 선발하고자 했다. 균주 선발을 위한 샘플링은 발효용 starter가 들어가지 않은 숙성된 TMR 및 자연계의 다양한 샘플을 대상으로 하였으며, 균주 특성 중 유기산 생성능이 우수한 균주를 우선적으로 선발하기 위해 1%의 탄산칼슘이 첨가된 MRS배지(protease peptone 10g/L, beef extract 10 g/L, yeast extract 5 g/L, glucose 20 g/L, Tween 80 1 g/L, sodium acetate 5 g/L, ammonium citrate 1 g/L, magnesium sulfate 7H₂O 0.1 g/L, manganese sulfate 0.05 g/L, dipotassium phosphate 2g/L)를 이용하여 샘플링한 각각의 시료들을 0.85 % NaCl 용액으로 추출 및 희석하여 탄산칼슘이 첨가된 MRS 배지에 도말 한 후 30℃의 온도에서 48시간 배양하여 유기산 생성에 따른 배지에서의 투명환이 큰 균주를 대상으로 1차 후보 균주를 선발하였다.

1차 선발된 후보 균주들을 대상으로 저온조건에서의 성장능이 우수한 균주를 선발하기 위해 동절기의 평균 기온인 5℃를 선발기준 온도로 설정하여 2차 균주 선발을 진행하였다. 1차 선발된 균주들을 대상으로 각각의 선발균주를 MRS 액상배지에서 30℃로 48시간 동안 1차 배양하였으며, 저온 성장 유무를 확인하기 위하여 새로운 MRS 액체 배지에 1차 배양액을 0.1% 접종 후, 5℃에서 48시간 배양을 실시하였다. 놀랍게도 본 발명자는 1차 분리한 후보 균주 250종 중 아래의 표 2 와 같이 5℃의 저온 조건에서 성장능이 특이하게 우수한 것이 있음을 최초로 발견하여 이를 본 발명에 따른 균주로 선정하였다.

선발 균주의 저온 배양 결과 (단위: CFU/ml)

Strains	0일	2일
Lactobacillus plantarum GB-LP2	4.10.E+05	1.76.E+08
Lactobacillus paracasei GB-TS5	2.50.E+05	1.60.E+07
Lactobacillus acidophilus GB-LC2	2.30.E+05	3.12.E+07

위 본 발명에 따른 균주에 대해 균주 동정을 위해 API 50CHL Kit를 이용하여 1차 동정 후 각 균주의 genomic DNA를 분리하여 16S rRNA 유전자를 PCR 방법으로 증폭한 후에 염기서열을 분석한 후 GeneBank에 등록된 다른 균주들의 염기서열을 비교하여 최종 균주를 동정하였으며, 그 결과는 아래의 표 3 과 같았다.

선발 균주들의 동정 결과

No.	Strains
Lactobacillus plantarum GB-LP2	Lactobacillus plantarum
Lactobacillus paracasei GB-TS5	Lactobacillus paracasei
Lactobacillus acidophilus GB-LC2	Lactobacillus acidophilus

선발된 균주를 대상으로 지표 유해미생물인 E. coli O157, Salmonella typhimurium에 대한 항균활성을 각각 확인하였다. 항균활성을 확인하기 위하여 두 종의 유해미생물을 LB 액체배지에 접종 한 후 37℃ 항온 진탕배양기에서 180rpm으로 24시간 배양한 후 LB 한천 배지에 1% 첨가하여 유해균주가 포함된 한천배지를 제조하였다. 제조된 배지에 천공기를 이용하여 배양액이 첨가될 부위를 천공한 후 각 선발균주 배양액을 첨가하여 각 균주별 지표균주에 대한 항균활성을 평가하였다. 선발 균주 배양액의 제조는 선발 균주별로 MRS 액체배지를 이용하여 30℃의 온도조건에서 48시간 배양한 후 배양액을 제조하였으며, 제조된 배양액을 0.45㎛ filter로 제균한 제균액 100㎕를 유해균이 포함된 천공배지에 첨가 하여 4℃에서 12시간 동안 냉장 보관 하여 배양액이 agar에 충분히 퍼지도록 한 후 37℃ 항온 배양기에서 12시간 동안 배양하여 투명환의 생성 유무를 확인 하였다. 선발 균주 모두 유해 미생물인 E. coli O-157과 Salmonella typhimurium에 대한 항균활성이 나타남을 확인하였다.

TMR 및 silage의 발효과정 중 오염균에 의한 변이를 최소화하기 위해서는 발효 초기 빠른 시간 내에 유산균 발효에 의한 낮은 pH 환경을 조성함으로써 유해균의 증식을 억제하는 것이 바람직하다. 하지만 낮은 pH 환경은 유해균뿐 아니라 유익한 유산균의 성장을 억제하는 문제도 일어날 수 있기 때문에 선발된 유산균은 낮은 pH환경에서도 성장할 수 있는 내산성을 필수적으로 가져야 한다.

이에 본 발명에 따른 균주의 내산성을 확인하기 위하여 MRS액체 배지에 각 균주들을 접종하여 30℃에서 180rpm으로 48시간 진탕배양하여 배양액을 제조한 후 1N HCl을 이용하여 pH 3, 4, 5로 보정된 MRS 액체 배지에 상기 배양액 0.1%를 접종 하여 30℃, 180rpm으로 배양하면서 배양 시간별로 배양액을 취해 생균수 분석을 통해 선발된 균주들의 각 pH 별 안정성을 확인 하였다.

선발된 균주들은 pH 3에서 2시간까지는 균수의 감소가 확인 되지 않았으나, 24시간 경과 후에는 약 10배 정도의 균수 감소가 확인되었다. 하지만, pH 4 이상에서는 시간이 경과함에 따라 균수가 증가함을 확인 하였으며 TMR 및 silage의 경우 완전 숙성되었을 때의 pH는 4를 유지하기 때문에 선발된 균주들은 TMR 및 silage에 충분히 적용 가능한 것으로 확인되었다(표 4).

　
균주

pH3

pH4

pH5

0
시간

1
시간

2
시간

12
시간

24
시간

0
시간

1
시간

2
시간

12
시간

24
시간

0
시간

1
시간

2
시간

12
시간

24
시간

A

1.32E+05

1.33E+05

1.36E+05

6.80E+04

6.80E+03

1.32E+05

1.36E+05

1.41E+05

2.83E+06

1.70E+08

1.32E+05

1.43E+05

1.71E+05

6.84E+06

3.42E+08

B

8.80E+05

8.89E+05

9.07E+05

4.53E+05

4.53E+04

8.80E+05

9.06E+05

9.43E+05

1.89E+07

7.54E+08

8.80E+05

9.50E+05

1.14E+06

4.56E+07

2.28E+09

C

4.50E+05

4.55E+05

4.64E+05

2.32E+05

2.32E+04

4.50E+05

4.64E+05

4.82E+05

9.64E+06

5.78E+08

4.50E+05

4.86E+05

5.83E+05

2.33E+07

1.17E+09

A = Lactobacillus plantarum GB-LP2, B = Lactobacillus paracasei GB-TS5, C = Lactobacillus acidophilus GB-LC2

온도에 따른 선발균주의 성장을 확인하기 위하여 MRS액체 배지에 각 균주를 접종하여 30℃에서 180rpm으로 48시간 배양하여 1차 배양액을 만들었다. 준비된 MRS 액체배지 200ml에 1차 배양액 0.1%를 접종하여 5, 15, 20, 25, 40℃ 조건에서 총 7일 동안 48시간 간격으로 생균수를 분석하여 온도에 따른 영향을 조사하였다.

선발된 균주에 대한 내한성 및 내열성 실험 결과 발효 1일차에 저온 조건인 5℃에서 10⁷ CFU/ml 이상으로 성장하는 것으로 확인되어 저온도에서 초기 발효특성이 양호한 것으로 판단되었다. 선발 균주 모두 15℃~25℃ 조건에서는 30℃에서와 비슷하게 성장에는 전혀 문제가 없는 것으로 확인되었으나, 3일 이후부터는 영양원 고갈, 대사산물 축적 (유기산 등)에 따라 균 성장이 둔화된 것을 관찰할 수 있었다. 고온 조건인 40℃에서는 모든 균주에서 중온 조건에 비해 성장이 저해되는 것을 확인하였으며, 배양 5일이 넘어가면서 전체적인 균수 감소가 확인되었다(표 5).

선발균주의 온도조건에 따른 성장 확인

배양 시간

0일

1일

3일

5일

7일

균주

초기 접종

5
℃

15
℃

20
℃

25
℃

40
℃

5
℃

15
℃

20
℃

25
℃

40
℃

5
℃

15
℃

20
℃

25
℃

40
℃

5
℃

15
℃

20
℃

25
℃

40
℃

A

4.10E+05

7.50E+07

2.90E+08

3.00E+09

7.30E+09

3.30E+08

3.20E+08

3.40E+08

3.30E+09

7.70E+09

4.95E+09

2.56E+08

1.70E+07

6.60E+07

1.54E+08

9.90E+07

2.84E+08

1.65E+07

6.40E+07

1.49E+08

9.60E+07

B

3.10E+05

3.30E+07

1.25E+09

1.80E+09

3.70E+09

1.10E+08

7.80E+07

2.50E+09

3.30E+09

5.10E+09

1.65E+09

6.24E+07

1.25E+08

6.60E+07

1.02E+08

3.30E+07

6.93E+07

1.21E+08

6.40E+07

9.89E+07

3.20E+07

C

4.10E+05

9.00E+07

2.03E+09

3.50E+09

6.60E+09

3.30E+08

4.40E+08

3.90E+09

5.10E+09

7.10E+09

4.95E+09

3.52E+08

1.95E+08

1.02E+08

1.42E+08

9.90E+07

3.91E+08

1.89E+08

9.89E+07

1.38E+08

9.60E+07

TMR 및 silage에 사용되는 조사료 및 부산물에는 이용성이 낮은 섬유소가 풍부하게 함유되어 있기 때문에 섬유소 분해효소를 인위적으로 첨가 해주기도 한다. 섬유소 분해효소의 첨가는 생산성 및 유량 개선에 효과적이라고 보고되기도 하였다. 그렇지만, 이러한 부가적인 효과를 얻기 위해 TMR 및 silage 제작 시 농가에서 효소제를 혼합 및 배합하는 과정은 2차 오염의 원인이 될 수도 있어 주의가 요구된다. 따라서 선발 균주의 특성 중 섬유소 분해효소 활성을 점검하여 섬유소 분해능이 있는 균주를 선발하고자 하였다. 대표적인 섬유소 분해 효소인 Cellulase, Xylanase의 생성 유무와 lactate, glucose, nitrogen 분석을 통하여 선발된 균주의 섬유소 분해능, 유기산 생성능과 당 및 질소 이용성을 확인하였다.

Cellulase 활성 검증용 배지는 1.5% agar에 1% CMC를 첨가하여 121℃에서 15분간 멸균후 petri dish에 부어서 완전히 굳혀 배지를 제조하였다. Cellulase 활성을 확인하기 위하여 선발된 8종의 유산균을 MRS액체 배지에 접종 하여 30℃ 진탕배양기에서 180rpm으로 48시간 배양하여 배양액을 확보하였다. 확보된 배양액을 0.45㎛ filter로 여과한 제균액 100㎕를 천공된 배지에 첨가하여 37℃ 항온 배양기에서 24시간동안 배양한 후 효소 활성 확인을 위해서 1% Congo red 용액을 첨가하여 30분간 염색 후 1M NaCl용액을 이용하여 10분간 탈색하여 선발균주별 cellulase활성을 확인하였다. Cellulase 활성 분석 결과 Lactobacillus plantarum GB-LP2 및 Lactobacillus paracasei GB-TS5 균주에서 높은 cellulase활성을 확인하였다(표 6).

Xylanase 활성 검증용 배지는 1.5% agar에 Oat spelt xylan을 1% 첨가 하여 121℃에서 15분간 멸균 후 petri dish에 부어서 완전히 굳혀 xylanase 활성 측정용 배지를 제조하였다. Xylanase 활성을 확인하기 위하여 선발된 8종의 유산균을 MRS액체 배지에 접종 하여 30℃의 진탕배양기에서 180rpm으로 48시간 배양하여 배양액을 확보하였다. 확보된 배양액을 0.45㎛ filter로 여과한 제균액 100㎕를 천공된 배지에 첨가하여 37℃ 항온 배양기에서 24시간동안 배양하였다. 24시간 경과 후 효소 활성 확인을 위해서 1% Congo red 용액을 첨가하여 30분간 염색 후 1M NaCl용액을 이용하여 10분간 탈색하여 선발균주별 xylanase활성을 확인하였다. Xylanase 활성 분석 결과 cellulase 활성이 높게 나타났던 Lactobacillus plantarum GB-LP2 및 Lactobacillus paracasei GB-TS5 균주에서 높은 활성이 나타난 것을 확인하였다(표 6).

선발균주의 CMCase, Xylanase 배지 활성 결과(단위: Cm)

균주	CMC	Xylan
Lactobacillus plantarum GB-LP2	1.7	2.0
Lactobacillus paracasei GB-TS5	1.8	2.0
Lactobacillus acidophilus GB-LC2	1.1	1.1

선발균주의 cellulase 및 xylanase 활성을 정량적으로 확인하기 위해 분리된 선발 균주를 표 7 에 제시한 최소배지에서 48시간 동안 배양한 후 배양액을 13,000rpm에서 15min 동안 원심분리하여 상층액을 취해 효소활성을 분석하였다.

효소발현을 위한 최소 배지 구성

대상 효소	탄소원	사용량(g/L)	기본 배지 성분	배양 조건
Xylanase	Oat spelt xylan	10	Malto extract 배지, 0.05% Yeast extract	36℃, pH 5.0, 72시간
Cellulase	CMC	20	Malto extract 배지, 0.05% Yeast extract	36℃, pH 5.0, 72시간

상층액에 존재하는 섬유소 분해효소(CMCase)의 역가는 carboxymethyl cellulose로부터 분해되어 나오는 환원당의 함량을 3, 5- Dinitrosalicyclic acid (DNS)로 인해 발색되는 정도를 측정하여 분석하였다. 원심분리한 상등액 0.1ml을 1% CMC solution 50μl와 혼합하여 50℃ water bath에서 1시간동안 반응 시킨 후 300μl DNS solution을 첨가하여 반응을 정지시키고 boiling water에 5분간 반응 후 U.V spectrometer를 이용하여 발색정도를 분석하였다. 효소에 의해 환원되는 glucose의 양을 측정하기 위하여 glucose를 표준물질로 하여 검량선을 작성한 후 배양액에 존재하는 환원당의 농도를 측정하였다. 단위는 Unit/ml로 1 unit은 enzyme 1ml이 1min동안 환원시키는 glucose의 μmol의 양을 의미한다.

상층액에 존재하는 섬유소 분해효소 (Xylanase)의 역가는 Oat spelts xylan으로부터 분해되어 나오는 환원당의 함량을 3, 5- Dinitrosalicyclic acid (DNS)로 인해 발색되는 정도를 측정함으로써 분석하였다. Oat spelts xylan 2g을 50mM sodium acetate buffer (pH 5.5) 100ml 용액에 녹여 2%기질 용액으로 한다. 효소반응 조건은 기질용액 0.5ml과 조효소액 0.5ml을 혼합한 후 40℃에서 30분간 반응 후, DNS 용액 3ml을 첨가하여 반응을 중지했다. 끓는물에 10분간 반응시켜 발색시킨 후, U.V spectrometer를 이용하여 흡광도 A540에서 측정하였다. 효소에 의해 환원되는 xylose의 양을 측정하기 위하여 xylose를 표준물질로 하여 검량선을 작성한 후 배양액에 존재하는 환원당의 농도를 측정하였다. 단위는 Unit/ml로 1 unit은 1min동안 xylose의 1 μmol을 환원시킬 수 있는 효소의 양을 의미한다.

선발균주에 대한 Cellulase, Xylanase 효소활성 분석결과 Lactobacillus plantarum GB-LP2는 Cellulase 100.7 unit/ml, Xylanase 39.8 unit/ml, GB-TS 5는 Cellulase 105.1 unit/ml, Xylanase 39.1 unit/ml로 확인되었다(표 8).

선발균주의 Cellulase, Xylanase 효소 활성

균주	Cellulase (unit/ml)	Xylanase (unit/ml)
Lactobacillus plantarum GB-LP2	100.7	39.8
Lactobacillus paracasei GB-TS5	105.1	39.1
Lactobacillus acidophilus GB-LC2	60.8	18.1

선발 균주의 유기산 생성능 확인을 위해 lactate 함량을 분석하였다. 선발 균주를 MRS 액체 배지에 접종 한 후 30℃ 진탕배양기에서 180rpm으로 배양을 하고, 배양 24시간과 48시간에 샘플을 취하여 0.45㎛ filter를 이용하여 제균 한 후 제균액 1㎖을 취해 YSI 2900 series Biochemistry Analyzer를 이용하여 lactate 함량을 측정했다. 발효 24시간째 균주별 lactate 함량은 0.31 ~ 2.13 g/L의 범위를 보였고, 그 중 Lactobacillus paracasei GB-TS5 균주의 경우 다른 균주에 비해 높은 수준의 lactate를 생산함을 확인 할 수 있었다. 배양 48시간의 lactate의 함량이 증가한 균주는 Lactobacillus plantarum GB-LP2 및 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 균주로 각 2.02, 1.48g/L로 확인되었다(표 9). TMR 및 silage에서 변이 방지를 위해서는 발효 초기에 빠르게 pH를 낮추는 조건이 유리하므로 발효 24시간째에 높은 lactate 함량이 확인된 Lactobacillus paracasei GB-TS5 균주가 TMR/silage starter로서의 활용가능성이 높을 것으로 판단된다.

배양 시간별 lactate 함량

Strains	0h (g/L)	24h (g/L)	48h (g/L)
Lactobacillus plantarum GB-LP2	0.43	0.41	2.02
Lactobacillus paracasei GB-TS5		2.13	2.00
Lactobacillus acidophilus GB-LC2		0.53	1.48

선발 균주들의 당 이용성은 배양 배지내의 glucose함량 변화로 확인하였다. 선발 균주를 MRS액체 배지에 접종 하여 30℃ 진탕배양기에서 180rpm으로 배양을 하면서 24시간, 48시간에 샘플을 취하여 0.45㎛ filter를 이용하여 제균 후 제균액 1㎖을 취해 YSI 2900 series Biochemistry Analyzer를 이용하여 glucose 함량을 분석 하였다. Lactobacillus plantarum GB-LP2 및 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 균주는 다른 균주에 비하여 소실된 glucose 량이 크지 않아 상대적으로 당 이용성이 낮음을 알 수 있었다(표 10). Lactate 분석 결과와 마찬가지로 Lactobacillus paracasei GB-TS5 균주는 당 이용능과 lactate 합성이 우수함을 확인 하였다. 이는 상기 균들이 대사과정 중 glucose에서 lactate로의 전환이 다른 균에 비해 높기 때문인 것으로 판단된다.

선발균주의 glucose 이용성 조사

Strains	0h (g/L)	24h (g/L)	48h (g/L)
Lactobacillus plantarum GB-LP2	14.93	12.50	5.26
Lactobacillus paracasei GB-TS5		4.16	0.05
Lactobacillus acidophilus GB-LC2		13.37	8.80

선발 균주들의 질소 이용능을 확인하기 위하여 선발 균주를 MRS 액체배지에 접종 한 후 30℃ 진탕배양기에서 180rpm으로 배양을 진행 하였다. 배양 24시간, 48시간에 배양액을 취하여 0.45㎛ filter를 이용하여 제균한 제균액 200㎕ 취하여 Dumas법을 이용하여 총 질소를 분석 하였다(표 11).

선발 균주의 nitrogen 이용성 조사

Strains	24h (%)	48h (%)
Lactobacillus plantarum GB-LP2	1.89	1.85
Lactobacillus paracasei GB-TS5	1.84	1.80
Lactobacillus acidophilus GB-LC2	2.25	2.21
MRS (대조구)	2.10

선발균주 3종 단독과 이를 혼합한 것(1 : 1 : 1 의 균수비율)의 저온, 실온, 고온조건에서의 7일간 발효실험을 통해 발효특성을 확인하였다. 일반적인 발효조건을 항온항습 챔버를 활용하여 저온조건을 10℃, 실온조건을 25℃, 고온조건을 45℃로 각각 설정하고 발효일자별로 샘플링을 통해 유산균 성장 및 pH변화를 조사하였다. TMR 원료는 공주소재 업체로부터 재공 받은 배합원료를 다른 변수를 배제하기 위해 121℃, 30분간 멸균하여 배지 내 미생물을 모두 사멸시킨 후 초기 수분함량은 38%로 조정하고 최종 선발균주를 각각 1% 수준으로 접종하여 발효를 진행하였으며, 혼합종균은 각 균주를 동일한양으로 혼합하여 최종 1%를 접종 하였다. 대조구는 멸균되지 않은 원료에 유산균 종균 대신 물을 추가하여 처리구와 동일한 조건으로 발효를 진행하였다.

저온발효실험결과 3종의 균주를 모두 혼합한 처리구(1 : 1 : 1 의 균수비율)에서는 유산균수의 성장이 양호하여 동절기 안정적인 발효품질 확보에 기여할 것으로 판단되었다.

선발균주 단독 및 조합(1 : 1 : 1 의 균수비율)을 통한 저온조건에서의 TMR 발효 품질 평가

처리구	0일차		1일차		3일차		5일차		7일차
처리구	균수 (cfu/g)	pH	균수 (cfu/g)	pH	균수 (cfu/g)	pH	균수 (cfu/g)	pH	균수 (cfu/g)	pH
Negative control	3.50E+06	5.22	2.10E+06	5.18	2.50E+06	5.19	1.30E+06	5.22	8.30E+05	5.34
Lactobacillus paracasei GB-TS5	1.17E+06	5.03	2.40E+06	4.99	2.80E+06	4.95	5.10E+06	4.87	7.10E+06	4.89
Lactobacillus plantarum GB-LP2	1.10E+06	5.11	1.40E+06	5.03	1.45E+06	4.95	1.92E+06	4.95	2.11E+06	5.01
Lactobacillus acidophilus GB-LC2	2.00E+06	5.1	1.40E+06	4.99	2.00E+06	5.02	1.80E+06	5.12	3.90E+06	5.05
3 종 MIX	3.30E+06	5.12	2.60E+06	4.96	2.80E+06	4.97	4.49E+06	4.93	1.10E+07	4.95

실온 발효실험에서는 3종 균주를 1 : 1 : 1 의 균수비율로 혼합한 처리구에서 발효 5일차에 10⁸ cfu/g 수준까지 유산균 수가 증가하여 발효품질측면에서는 3종균주를 혼합하는 것이 유리한 것으로 확인되었다.

선발균주 단독 및 조합(1 : 1 : 1 의 균수비율)을 통한 실온조건에서의 TMR 발효 품질 평가

처리구	0일차		1일차		3일차		5일차		7일차
처리구	균수 (cfu/g)	pH	균수 (cfu/g)	pH	균수 (cfu/g)	pH	균수 (cfu/g)	pH	균수 (cfu/g)	pH
Negative control	3.10E+06	5.19	3.20E+06	5.21	8.40E+06	5.04	3.30E+07	5.05	3.25E+07	4.97
Lactobacillus paracasei GB-TS5	1.17E+06	5.03	3.20E+06	4.97	4.91E+06	4.88	3.36E+07	4.59	4.26E+07	4.43
Lactobacillus plantarum GB-LP2	1.10E+06	5.11	2.50E+06	5.13	6.70E+06	5.1	2.47E+07	5.01	3.56E+07	4.86
Lactobacillus acidophilus GB-LC2	2.00E+06	5.1	2.30E+06	5.1	3.90E+06	5.03	3.27E+07	4.86	1.85E+07	4.78
3 종 MIX	3.30E+06	5.12	3.60E+06	5.02	2.85E+07	4.91	1.10E+08	4.67	9.10E+07	4.75

고온발효실험결과 대조구에서는 유산균 균수가 감소하여 발효 5일차 이후 10⁴ cfu/g 수준까지 균수가 감소하였으나, 3종 혼합 처리구(1 : 1 : 1 의 균수 비율)에서는 초기 접종 수준에 비해 균수가 약간 증가하는 경향을 확인하였으며, 실제 TMR 공장 및 농가 등에서 45℃이상의 고온조건이 계속 유지되지는 않을 것이므로, 내열성이 있는 균주가 같이 포함되어 있어 안정적인 품질 유지에 도움이 될 것으로 판단된다.

선발균주 단독 및 조합(1 : 1 : 1 의 균수비율)을 통한 고온조건에서의 TMR 발효 품질 평가

처리구	0일차		1일차		3일차		5일차		7일차
처리구	균수 (cfu/g)	pH	균수 (cfu/g)	pH	균수 (cfu/g)	pH	균수 (cfu/g)	pH	균수 (cfu/g)	pH
Negative control	3.00E+06	5.2	1.30E+05	5.31	3.10E+05	5.24	7.60E+04	5.36	1.20E+04	5.41
Lactobacillus paracasei GB-TS5	1.17E+06	5.0	2.40E+06	5.17	1.90E+06	5.18	9.10E+05	5.21	6.50E+05	5.31
Lactobacillus plantarum GB-LP2	1.10E+06	5.1	1.10E+06	5.01	1.50E+06	5.05	4.96E+06	5.02	5.82E+06	4.97
Lactobacillus acidophilus GB-LC2	2.00E+06	5.1	8.00E+05	4.97	5.50E+05	5.15	2.10E+05	5.21	5.80E+04	5.16
3 종 MIX	3.30E+06	5.1	1.60E+06	4.92	2.20E+06	4.95	5.20E+06	4.94	5.30E+06	5.01

3종의 본 발명에 따른 균주와 시판 starter에 대한 silage 발효실험을 진행하였다. Silage 제조는 하계작물인 옥수수, 추계작물인 볏짚 및 이탈리안 라이그라스를 이용해 제작하여, 완전한 발효가 이루어져 안정기에 도달하는 40일 까지 보관 후 발효 과정 중의 품질 특성과 유기산, 미생물 균수를 지표로 하여 발효 품질을 평가하였다. 평가 결과 본 발명에 따른 균주는 스타터로서 모든 사일리지에서 우수한 효과를 나타냈으며, 이하에서는 옥수수 silage 에 대한 결과를 대표로 소개한다.

[본 발명에 따른 균주를 이용한 옥수수 silage 발효특성]

수확된 옥수수는 전동절단기를 이용해 절단하였다. 절단된 옥수수는 무게를 측정한 후에 처리구에 따라서 서로 다른 미생물을 첨가하였다. 미생물의 첨가는 분무기를 사용하였다. 실험설계는 표 12 와 같이 총 5개의 시험구를 설정하여 진행하였다.

서로 다른 발효 균주의 사용이 옥수수 사일리지 발효특성에 미치는 영향에 관한 실험설계

	Control		Treatments
	Negative control	Positive control	Lactobacillus acidophilus GB-LC2	Lactobacillus plantarum GB-LP2	Lactobacillus paracasei GB-TS5
첨가물질	Saline	commercial silage additives	○	○	○

준비가 완료된 옥수수는 무게가 측정되어 있는 플라스틱 용기(5 kg)에 투입하였다. 옥수수의 투입은 진압기를 이용하여 수행하였다.

옥수수 사일리지 충진이 완료된 용기는 실내로 옮기어 상온 조건에서 40 일간 발효를 진행하였다. 발효 기간별 시료는 0 일, 3 일, 7 일, 20 일 및 40 일의 간격으로 채취하였고, 시료 채취는 용기 비워 내용물을 전량 취하는 방식으로 진행하였다.

샘플 분석은 먼저 발효시킨 플라스틱의 통의 무게를 먼저 측정한 후 뚜껑을 개봉한 뒤 비닐을 깔아 놓은 바닥에 모두 덜어 주었다. 이 후 4분법을 이용하여 시료를 임의적으로 취하였다. 채취된 시료의 일부를 다시 무게가 측정된 양파망에 넣고 예건용 시료로 사용하였다. 나머지 시료들은 다시 6등분 하여 지퍼백에 넣어준 후 -20℃냉동고에서 보관하였다. 양파망에 옮겨 놓은 시료들은 65℃ 열풍 건조기에 약 3일간 건조시켰다.

예건이 완료된 시료는 일반 분쇄기(cutter miller)를 이용해 1차 분쇄하였다.

이후 4~5 mm의 스크린이 장착된 사이클론밀을 이용하여 분쇄하였고, 분석용 시료로 사용하였다.

사일리지 시료는 많은 수분을 포함하고 있기 때문에 2단계로 나누어 건물을 측정하였다. 1차 건물을 측정하기 위해 미리 무게를 구한 알루미늄 박스에 사일리지 시료를 약 100 g 칭량하였다. 칭량한 시료를 경북대 부속목장에 위치한 건조기를 이용하여 60℃ 상태에서 3일간 건조하였다. 건조 후 데시케이터에서 30분간 방냉한 다음 무게를 측정하여 건물을 산출하였다. 이후 각 시료를 0.1 mm grinder 를 이용하여 분쇄하고 1 g 칭량하여 위의 105℃ 상태에서 16시간 건조 후 무게를 측정하여 2차 건물을 측정하였다.

조단백질은 시료 0.5 g을 켈텍 플라스크에 취하고 분해촉진제 2정을 첨가한 후 황산 12 mL을 서서히 가해서 잘 혼합하였다. 이를 digestor 에서 420℃로 가열하여 1시간 동안 분해 시킨 후 식혀서 켈텍장치를 이용하어 증류하였다. 증류 후 0.1N 염산 용액으로 자동 적정하여 산출된 값을 사용하였다.

조지방은 Ankom nyron filter bag 에 0.5 g 시료를 칭량한 후 입구를 봉하고, diether ether로 충진된 soxhlet 장치를 이용하여 12시간 이상 맑은 diether ether가 나올 때까지 지용성 물질을 추출하고 남은 건조 중량을 구하여 산출하였다.

유기물은 2차 건물을 측정한 시료를 이미 무게를 측정한 crucible에 담아 550℃ 회화로에서 3시간 회화시켰다. 이 후 데시케이터에서 40분간 방냉 후 회분의 무게를 측정하였다. 최초 무게를 측정한 시료의 무게에서 회분의 무게를 감하여 유기물함량을 산출하였다.

NDF(Neutral detergent fiber)는 Ankom nyron filter bag 에 0.5 g 시료를 칭량한 후 입구를 봉하고, 중성세제가 들어있는 Ankom 섬유소 분해 장비를 이용하여 중성세제에 용해되는 부분(Neutral detergent solubles, NDS)을 제거하였다. NDS가 제거된 시료를 건조 후 무게를 측정하여 산출하였다.

ADF(Acid detergent fiber) NDF를 구하고 남은 시료를 다시 산성세제가 들어있는 Ankom 섬유소 분해 장비를 이용하여 산성세제에 용해되는 부분(Acid detergent solubles, ADS)을 제거하였다. ADS가 제거된 시료를 건조 후 무게를 측정하여 산출하였다.

pH는 각 사일리지 시료 100 g을 칭량하여 지퍼백에 넣고 900 mL의 증류수를 첨가하였다. 입구를 봉하고 stomacher를 이용하여 8 stroke/sec의 속도로 4분 동안 stomaching을 실시하였다. 추출액을 50 mL 비이커로 옮겨 pH meter를 이용해 pH를 측정하였다.

유기산은 Stomacher를 이용하여 추출한 추출액을 10,000rpm으로 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액에 H₂SO₄ 을 첨가하여 최종 50 mM의 농도로 산화시킨 후, 0.45 μm syringe filter를 이용하여 정제한 후 HPLC(A 300 × 7.80 mm Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) column, mobile phage : 0.005 N H₂SO₄, flow rate : 0.5 mL/min, UV detector : 210 nm)를 이용하여 분석하였다.

반추위액의 준비는 실험당일 공시축(홀스타인)으로부터 반추위 내용물을 채취하였다. 반추위 내용물은 현장에서 바로 4 겹의 cheese cloth로 여과 후 2 L 보온병에 head space가 없도록 담아 bottle 내 산소의 침입을 차단한 상태로 1 시간 이내에 실험실로 운반 하였다. Rumen inoculum의 준비는 운반된 반추위액은 2 겹의 거즈를 이용하여 여과 후에 사용하였다. 인공타액은 McDougall's 완충용액을 이용하여 제조하였고, 인공타액의 pH는 이산화탄소를 주입하여 7.0으로 조정하였다. 이후 반추위액과 인공타액을 1:9의 비율로 혼합하여 rumen inoculum을 제조하였다.

in vitro 반추위 발효는 150 mL의 배양병에 1 g의 분쇄된 사일리지 시료를 칭량하여 투입하였다. 준비된 rumen inoculum 100 mL를 사일리지 시료가 들어있는 배양병에 주입하였다. 이때 외부 공기의 유입을 방지하기 위하여 이산화탄소를 주입하면서 모든 과정들을 수행하였다. Rumen inoculum의 주입이 완료된 후에 알루미늄뚜껑과 실리콘 마개를 이용하여 배양병을 밀봉하였고, 배양을 개시하였다. 배양은 39℃ 항온기에서 진행하였다. 배양 개시 후 0, 3, 6, 12, 24시간이 지난 후에 각 배양 시간에 할당된 배양병을 개봉하였다.

측정항목은 각 시간대 별로 배양 종료 시 배양병에 glass syringe를 연결하여 가스발생으로 인하여 형성된 압력에 의하여 나타난 부피를 측정하는 방법으로 가스 발생량을 평가하였다.

배양병 개봉 후에 미리 무게를 측정한 나일론백(Nylon bag, Ankom, USA)에 배양액 전량을 여과하였다. 여과되지 않고 나일론백에 잔류하는 사일리지 시료는 105℃ 건조기에서 24시간 동안 건조하여 무게를 측정하였고, 건물 소화율 분석 자료로 사용하였다. 여과액은 별도의 용기에 수거하였고 pH, 암모니아태 질소, 휘발성 지방산의 분석용 시료로 사용하였다.

암모니아태 질소 함량은 Chaney와 Marbach (1962)의 방법에 따라 분석하였다. 여과된 배양액을 15 분 동안 원심분리(10,000 rpm, 5 분)하였고, 얻어진 상층액을 분석에 사용하였다. 분석방법은 배양 상등액 20 μL를 시험관에 넣고 phenol 50 g과 sodium nitroferricyanide 0.25 g를 증류수 1 L에 혼합 제조한 phenol color reagent를 1 mL를 첨가하여 반응시켰다. 이후 다시 NaOH 25 g과 sodium hypochloride 16.8 mL를 멸균 증류수 1 L를 넣어서 제조한 alkali reagent를 1 mL를 첨가하였다. 이 후 37℃ 항온 수조에서 15 분 간 반응시켜 발색을 유도 시킨 후에 분광광도계(Optizen UV2120, Mecasis, Korea)를 이용하여 630 nm의 파장에서 그 흡광도를 측정하였다.

통계분석은 모든 실험은 3반복으로 수행되었다. 각 시험구들간의 효과는 일원배치 분산분석을 이용하여 분석하였다. 통계분석은 SPSS 프로그램의 일반선형모형(general linear model)을 이용한 분산분석을 이용하였고, Duncan 다중비교 분석을 이용하여 시험구간 유의성을 검증하였다. 유의수준은 95%로 하였다. 통계분석은 SPSS (version 20.0, IBM, USA) 소프트웨어를 사용하였다.

옥수수 silage 제조 후 3, 7, 20, 40일 째에 샘플을 취하여 미생물 분석을 진행 하였다. 비교를 위하여 시판 Starter는 유산균 합제로만 되어 있는 제품을 사용하였으며, 최초 접종 수준은 10⁵ CFU/g 으로 설정하였다.

옥수수 silage 제조 후 3, 7, 20, 40일차에 대한 샘플 분석 결과 발효 7일차의 미생물 분포는 무처리구와 처리구에서 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 하지만 발효 20일 경과 후부터 무처리구, 시판 Starter 를 접종한 처리구에서 바실러스 종이 확인 되었는데 바실러스의 성장은 유산균 발효에 의하여 낮아진 pH를 올리면서 silage의 품질 변이를 야기 할 수 있는 원인이 될 수 있다. 그리고 균주 조성에 있어서 시판 Starter는 유산균 외의 균수가 발효 과정 중 12~16% 까지 증가를 하였지만 선발균주인 Lactobacillus paracasei GB-TS5 및 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 처리구에서는 4% 미만으로 확인 되었다.

옥수수 silage의 경우 pH의 변화는 크지 않았지만 미생물 균총의 변화가 나타난 것으로 보아 유산균이 생성하는 유기산의 휘발로 인하여 유산균 이외의 다른 오염균의 성장을 억제하지 못하는 것으로 판단된다. 추가적인 사항으로 유기산의 함량 분석을 진행 한다면 보다 객관적인 이유를 확인 할 수 있을 것으로 예상되며, 본 발명에 따른 균주의 silage용 starter로서의 사용 가능성을 확인 할 수 있었다.

수거된 옥수수를 선발균주인 Lactobacillus plantarum GB-LP2, Lactobacillus paracasei GB-TS5 및 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 와 상용 사일리지 발효조정제를 이용하여 사일리지를 제작하고, 발효 기간별 건물함량의 변화를 조사하였다. 아무런 균주도 첨가하지 않고 숙성시킨 시험구를 대조구로 설정하였다.

선발 균주를 접종하여 제작한 옥수수 사일리지의 pH는 발효 3일차에 평균 4.0에서 40일째 평균 3.9가 측정되었다. 발효시작 후 7일째과 20일째 대조구(NC), Lactobacillus plantarum GB-LP2 처리구(LPL) 와 Lactobacillus paracasei GB-TS5 처리구(LPA)의 pH가 다른 처리구에 비해 더 낮은 값을 보였으며(P<0.05), 40일째에는 전체 처리구가 4.0 이하의 값으로 측정되었다.

발효 기간별 옥수수 사일리지의 pH 변화

Days of ensiling	Treatment					SEM	Sig.
Days of ensiling	NC	PC	LPL	LPA	LA	SEM	Sig.
3	4.00	4.05	3.95	3.97	4.03	0.014	NS
7	3.88^a	3.98^b	3.88^a	3.86^a	3.96^b	0.040	*
20	3.86^a	3.93^b	3.85^a	3.83^a	3.96^b	0.005	*
40	3.85	3.91	3.83	3.88	3.90	0.011	NS

NC = 음성 대조군 (첨가제를 첨가하지 않은 옥수수 silage); PC = 양성 대조군 (상용 사일리지 발효조정제를 이용하여 제작한 silage); LPL = Lactobacillus plantarum GB-LP2 처리구 silage; LPA = Lactobacillus paracasei GB-TS5 처리구 silage; LA = Lactobacillus acidophilus GB-LC2 처리구 silage. SEM = 평균의 표준오차, Sig. = 유의성. S = 유의하지 않음, * = 유의하게 상이함 (P<0.05) ^a,b 상이한 위 첨자는 유의하게 다름 (P<0.05), 이하 표에서도 동일함

발효 3일차의 건물변화는 모든 시험구에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다(p>0.05). 발효 7일차에는 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 시험구에서 유의적으로 높게 나타났다. 발효 20일차에서는 시험구들간의 유의적인 차이가 발견되지 않았다(p>0.05). 발효 40일차의 경우 양성대조군(PC), Lactobacillus plantarum GB-LP2 처리구 및 Lactobacillus paracasei GB-TS5 처리구에서 유의적으로 높은 건물함량을 나타내었다(p<0.05).

숙성 기간별 옥수수 사일리지의 건물 변화 (%)

Days	Treatments¹					SEM	Sig.
Days	NC	PC	LPL	LPA	LA	SEM	Sig.
3	31.58	32.54	31.74	31.64	31.76	0.41	NS
7	31.01^a	31.40^a	31.92^ab	32.01^ab	34.59^b	0.47	*
20	30.77	27.72	30.61	30.27	28.89	0.62	NS
40	31.28^a	32.61^ab	33.51^b	31.09^a	33.42^b	0.36	*

아무런 접종균을 사용하지 않은 음성대조군(NC) 을 제외하고 모든 시험구들에서 건물함량이 감소하다가 다시 회복되는 형태의 패턴을 나타내었다.

발효 3일차에는 모든 영양성분들 분석결과가 시험구별 유의적 차이를 나타내지 않았다(p>0.05). 발효 7일차의 경우, 유기물함량과 ADF 함량에서만 시험구들 간의 유의적 차이가 관찰되었다(p<0.05). 유기물함량은 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 를 사용한 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 시험구에서 가장 높았다. 반면 ADF함량은 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 시험구에서 가장 낮게 나타났다. 발효 20일차의 유기물함량은 T1과 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 시험구에서 가장 높게 관찰되었다. 조단백질 함량은 시험구간의 유의적인 차이가 나타나지 않았다(p>0.05). NDF와 ADF 함량의 경우 Lactobacillus plantarum GB-LP2 을 접종한 시험구에서 가장 낮게 관찰되었다. 발효 40일 차의 영양소함량을 보면, 가장 높은 유기물 함량은 Lactobacillus plantarum GB-LP2 시험구에서 관찰되었고, 조단백질함량은 음성대조구(NC) 및 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 시험구에서 낮게 나타났다. NDF와 ADF 함량은 음성대조구(NC)에서 가장 높게 관찰되었다.

숙성 기간별 옥수수 사일리지의 영양 성분 변화(% DM basis)

Days	Treatment¹	OM	CP	NDF	ADF
3	NC	93.28	8.71	58.24	35.95
	PC	94.19	8.45	53.22	31.26
	LPL	93.48	8.58	59.67	33.17
	LPA	93.55	8.92	54.51	34.24
	LA	93.47	8.74	55.35	36.53
	SEM	0.41	0.10	0.96	0.80
	Significance	NS	NS	NS	NS
7	NC	93.35^a	8.25	58.18	36.76^b
	PC	93.99^ab	8.23	54.43	32.45^ab
	LPL	93.27^a	8.24	57.31	36.32^ab
	LPA	93.67^ab	8.33	56.86	35.68^ab
	LA	94.68^b	8.54	51.97	30.05^a
	SEM	0.20	0.11	1.02	1.00
	Significance	*	NS	NS	*
20	NC	92.67^a	8.63	59.14^b	37.82^b
	PC	93.25^ab	8.68	54.76^ab	33.13^ab
	LPL	93.98^b	8.72	52.71^b	31.73^a
	LPA	93.35^ab	8.75	56.73^ab	35.69^ab
	LA	93.27^b	8.58	57.27^ab	35.54^ab
	SEM	0.17	0.04	0.86	0.78
	Significance	*	NS	*	*
40	NC	93.39^a	8.42^a	58.19^b	36.29^b
	PC	93.99^ab	8.28^a	52.90^ab	32.15^ab
	LPL	94.44^b	8.80^b	54.13^ab	33.35^ab
	LPA	93.19^a	8.48^ab	57.15^b	37.06^b
	LA	94.57^b	8.40^a	50.68^a	30.94^a
	SEM	0.18	0.06	1.01	0.86
	Significance	*	*	*	*

유기물함량은 발효 과정 중 모든 시험구에서 다소 감소하는 경향을 나타내었으나 큰 차이는 관찰되지 않았다.

NDF와 ADF함량 변화는 다른 영양성분들에 비하여 다소 큰 차이를 나타내었다. 모든 시험구에서 발효 기간에 따라 NDF와 ADF 함량이 감소하는 경향을 나타내었다. 전 발효기간 동안 NDF와 ADF함량이 가장 높게 유지된 시험구는 음성대조구(NC)인 것으로 나타났다.

발효 기간별 옥수수 사일리지의 암모니아 생성량은 선발균주 접종 후 7일째, Lactobacillus paracasei GB-TS5 처리구(LPA)가 0.46 g/kg DM 으로 가장 낮았으며(P<0.05) 다른 처리구는 평균 0.60 g/kg DM으로 차이가 없었다. 발효 20일 째는 대조구(NC)가 0.969 g/kg DM 으로 가장 높았으며(P<0.05), Lactobacillus plantarum GB-LP2 처리구가 0.437 g/kg DM 으로 가장 낮았다(P<0.05). 발효 40일째 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 처리구가 1.399 g/kg DM 으로 암모니아 생성량이 가장 높았고(P<0.05), 대조구(NC)가 0.591 g/kg DM으로 가장 낮았다(P<0.05). 대조구(NC)의 경우 발효 20일 까지 암모니아 생성량이 증가하다가 40일째 다시 감소하였으며, 그 외의 모든 처리구에서는 발효 기간이 경과할수록 암모니아 생성량이 증가하였다.

발효 기간별 옥수수 사일리지의 암모니아 생성량(g/kg DM) 변화

Days of Ensiling	Treatment					SEM	Sig.
Days of Ensiling	NC	PC	LPL	LPA	LA	SEM	Sig.
3	0.723	0.481	0.323	0.600	0.717	0.052	NS
7	0.602^b	0.657^b	0.602^b	0.460^a	0.606^b	0.014	*
20	0.969^b	0.720^ab	0.437^a	0.508^a	0.748^ab	0.047	*
40	0.591^a	1.072^abc	0.757^ab	1.187^bc	1.399^c	0.076	*

선발 균주를 처리한 후 40일동안 발효한 옥수수 사일리지의 젖산함량은 Lactobacillus paracasei GB-TS5 처리구가 20.84 g/kg DM으로 가장 높았으나(P<0.05), PC, Lactobacillus plantarum GB-LP2 그리고 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 처리구와는 유의적 차이가 없었고, 대조구(NC)는 11.91 g/kg DM으로 가장 낮았다(P<0.05). 초산은 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 처리구가 7.11 g/kg DM으로 가장 높았으며(P<0.05), 대조구(NC)sms 3.82 g/kg DM으로 가장 낮았다(P<0.05). 전체 처리구에서 젖산과 초산은 동일한 비율로 변화하는 경향을 보였으며, 유기산 총량은 Lactobacillus paracasei GB-TS5 처리구와 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 처리구가 가장 높았다.

40일차 발효 옥수수 사일리지의 유기산 함량

Organic acid, g/kg DM	NC	PC	LPA	LPL	LA	SEM	Sig.
Lactic acid	11.91^a	14.78^ab	20.84^b	14.65^ab	19.86^ab	1.32	*
Acetic acid	3.82^a	5.92^abc	6.51^bc	4.66^ab	7.11^c	0.41	*

반추위 발효 pH는 발효가스와 함께 중요한 발효 지표이다. 특히 반추동물의 주요 에너지원인 휘발성 지방산 생성량을 유추할 수 있는 지표가 되기도 한다.

본 시험에서는 발효시작 시점인 0시간에서 유의적인 pH 차이가 나타났다(p<0.05). 가장 낮은 pH는 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 처리구에서 나타났다. 이는 사일리지에 함유된 유기산에 의하여 반추위액의 pH 차이를 나타낸 것으로 판단된다.

반추위 발효 24시간에서도 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 처리구에서 가장 낮은 pH를 나타내었다.

서로 다른 접종 균주를 이용하여 제작한 옥수수 사일리지가 반추위 in vitro 발효 pH에 미치는 영향

	NC	PC	LPL	LPA	LA	SEM	p value
0	7.31^c	7.27^bc	7.32^d	7.25^ab	7.23^a	0.01	0.003
3	7.16^a	7.24^b	7.24^b	7.23^b	7.17^a	0.01	0.000
6	7.16	7.16	7.17	7.14	7.13	0.01	0.216
12	7.26^b	7.20^b	7.10^a	7.14^a	7.11^a	0.02	0.001
24	7.05^b	7.08^ab	7.04^b	7.01^b	6.94^a	0.02	0.052

일련의 발효 시간동안 모든 pH는 정상적인 반추위 미생물 활동 범위에 속하는 것으로 판단되었고, 모든 시험구들에서 정상적인 반추위 발효가 진행된 것으로 판단된다.

반추위 in vitro 건물소화율은 사료이용효율을 판단하는 중요한 기준이다.

발효시간에 따른 건물 소화율은 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 를 이용하여 제작한 옥수수 사일리지인 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 처리구에서 가장 높게 나타났다.

서로 다른 접종 균주를 이용하여 제작한 옥수수 사일리지가 반추위 in vitro 발효 건물소화율에 미치는 영향

	CON1	CON2	T1	T2	T3	SEM	p value
0	34.86^a	39.45^bc	37.17^ab	38.21^abc	40.92^c	0.69	0.027
3	40.73	40.56	40.11	41.51	43.91	0.76	0.596
6	41.54	46.36	44.20	46.60	47.72	0.98	0.308
12	48.11^a	52.26^ab	53.07^ab	49.33^a	56.37^b	1.10	0.112
24	57.72	60.50	58.35	63.04	65.13	1.43	0.479

반추위 발효 시간이 지남에 따라서 모든 시험구들의 건물 소화율이 증가하는 경향을 나타내었다. 아무런 균주도 사용하지 않은 대조구(negative control)에서 다른 시험구들에 비해 낮은 건물소화율을 나타내었고, 반대로 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 를 이용하여 제작한 옥수수 사일리지 시험구(Lactobacillus acidophilus GB-LC2)에서 가장 높은 건물 소화율 결과를 나타내었다.

발효 3시간까지는 시험구들간의 발효 가스 생산량 차이는 나타나지 않았다. 그러나 발효 6시간에서는 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 를 접종 균주로 제작된 옥수수 사일리지 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 처리구에서 음성대조구(NC)에 비해 유의적으로 높은 가스량이 나타났다(p<0.05).

이러한 경향은 발효 12시간까지 유지되었고, 이후 발효 24시간에서는 모든 시험구간에 유의적인 차이는 관찰되지 않았다(p>0.05).

서로 다른 접종 균주를 이용하여 제작한 옥수수 사일리지가 반추위 in vitro 발효 가스 생산량에 미치는 영향

	NC	PC	LPL	LPA	LA	SEM	p value
3	19.00	19.50	18.17	19.33	20.50	0.36	0.405
6	32.50^a	37.00^ab	34.50^ab	35.67^ab	37.17^b	0.69	0.161
12	60.50^a	65.67^ab	68.17^ab	61.33^a	71.33^b	1.45	0.060
24	100.83	110.33	102.83	111.17	101.67	3.90	0.899

반추위 발효에서 생산된 발효 가스는 발효효율을 평가하는 지표로 이용될 수 있다. 발효 시간이 지남에 따라서 모든 시험구들에서 발효가스가 지속적으로 증가하는 경향을 나타내었다. 시험구들간의 발효가스 생산량 차이는 발효시간 12시간에 두드러지게 나타났다.

40일차 발효 옥수수 사일리지의 in vitro 반추위 암모니아 생성량은 대조구를 포함한 전체 처리구에서 6시간까지 빠르게 증가하다가 발효 6시간에서 24시간 사이에는 Lactobacillus paracasei GB-TS5 처리구 를 제외하고는 암모니아 생성량의 변화가 크지 않았다(P<0.05). 전체 발효 시간에 걸쳐 Lactobacillus paracasei GB-TS5 처리구의 암모니아 발생량이 0시간 6.00, 6시간 8.97 그리고 24시간에 9.88 mg/100ml 로 가장 높았다(P<0.05).

40일차 발효 옥수수 사일리지가 in vitro 반추위액 암모니아 생성량 (mg/100 ml)에 미치는 영향

	Treatment					SEM	Sig.
	NC	PC	LPL	LPA	LA	SEM	Sig.
0 h	5.73^b	5.94^b	5.53^ab	6.00^b	5.22^a	0.065	*
6 h	8.33^bc	8.02^ab	8.05^ab	8.97^c	7.54^a	0.093	*
24h	7.55^a	8.25^a	8.02^a	9.88^b	8.17^a	0.151	*

[TMR / 사일리지 스타터 대량생산 조건]

균주의 제품화를 위해 확인되어야 할 것 중의 하나가 유통과정이나 저장 기간 동안 균의 안정성과 유통 및 사용의 편리성이 있어야 한다는 점이다. 이러한 사업화의 기본 요건을 충족시키기 위해 제품의 제형화에 대한 검토를 한 결과 보관이나 유통이 취약한 액상 형태보다는 보존성 및 사용 편의성을 높일 수 있는 고체 제형화 제품이 보다 효율적인 것으로 판단되어 액상 발효 후에 균주를 동결 건조하여 분말화 공정을 조사하였다. 또한 균주의 농축 및 건조 과정에서 발생할 수 있는 균주의 역가 소실을 최소화하기 위해 동결 보호제 및 동결 건조된 고농도 균체를 희석하는 제형화 실험을 같이 진행하였다.

일반적으로 사용되는 유산균 액상배양 배지는 MRS배지를 이용하지만, 대량생산을 하기 위해서는 비용적인 측면에서 경제성이 좋지 않다. 그 점을 보완하기 위하여 가격이 저렴하면서도 균의 성장이 우수한 배지조성에 대한 연구를 진행했다. 본 발명에 따른 균주의 액상배양을 위한 최적 배지조성을 확립하기 위하여 다음 표 25 의 조성과 같이 4 종류의 배지를 대상으로 시험을 진행하였다. 각각의 배지조성에서 배양하여 가장 높은 균수가 확인된 배지를 1차로 선정 한 후 750L 용량의 배양기를 이용하여 액상 발효를 진행했다.

각 배지조성에 따른 선발균주의 액상배양 결과 4.2×10⁸CFU/mL ~ 2.8×10¹⁰CFU/mL의 배양 결과를 확인 할 수 있었는데, 가장 높은 균수를 생산한 배지 4의 조성을 본 연구의 선발 균주의 최종 액상 배지로 확정하였다(표 25).

본 발명에 따른 균주의 종균 생산을 위해 750L 용량 액상배양기를 이용하여 온도 36℃, 100rpm의 조건에서 32시간 배양하여 최종 500L를 생산하였다. 생산된 종균의 균수는 표 27 에서와 같이 2.13×10¹⁰CFU/mL로 확인 되어 실험실 규모에서의 결과와 유사한 균수를 확보 할 수 있었다.

선발균주의 최적 액상배양 조건을 확인하기 위한 배지조성 (단위:%)

Composition	Medium 1	Medium 2	Medium 3	Medium 4
Glucose	0.2	0.2	0.15	4
Yeast extract	0.15	0.1	0.05	1
Peptone				2
C₂H₃NaO₂				0.5
KH₂PO₄		0.05	0.05	0.2
NaCl	0.05			0.5
MnCl₂				0.005
MgSO₄		0.0075	0.0075	0.01
Tween80				0.1
Molasses			0.05

배지조성에 따른 선발균주 액상발효 균수

Medium	CFU/mL
Medium	Lactobacillus paracasei GB-TS5	Lactobacillus acidophilus GB-LC2	Lactobacillus plantarum GB-LP2
Medium 1	1.10×10⁹	1.70×10⁹	3.20×10⁹
Medium 2	1.54×10⁹	2.12×10⁹	1.32×10⁹
Medium 3	9.80×10⁸	3.60×10⁹	4.20×10⁹
Medium 4	6.30×10⁹	1.10×10¹⁰	6.20×10⁹

본 발명에 따른 균주의 액상종균 생산 결과

균 주	Lactobacillus paracasei GB-TS5	Lactobacillus acidophilus GB-LC2	Lactobacillus plantarum GB-LP2
배양액(L)	500	500	500
균수(CFU/mL)	8.90×10⁹	7.20×10⁹	9.30×10⁹

액상발효액의 경우 장시간 보존 시 낮은 pH와 영양분 부족 등에 의하여 균수가 저감되어 보관 저장성이 떨어지게 되는데 이 점을 보완하기 위한 방안으로 동결건조를 사용하여 저장 안정성을 높이고 있다. 하지만 동결건조 과정 중 낮은 온도와 고압 등에 의하여 대부분의 균이 사멸하기 때문에 균의 사멸을 최소화하기 위해 동결건조 보호제를 첨가한다. 하지만 동결건조 보호제는 균주별로 보호력의 차이가 있어, 본 발명에 따른 균주에 최적화된 동결건조 보호제 조성을 결정하기 위하여 선발균의 배양액에서 균체만을 회수 (15,400rpm의 연속 원심분리)하여 표 28 과 같은 동결 보호제의 조성으로 시험을 실시했다.

동결 건조 보호제 조성 조사

동결건조 보호제 조성(%)
원 료	조성 1	조성 2	조성 3	조성 4
Skim milk	5	10	20	10
Glycine	1.5
Glutamic acid	2.94
Sodium alginate				1
Chitosan				1
CMC		5	5	5
비용(원/L)	21,156.6	15,414.4	29,814.4	27,383.4

4 종류의 서로 다른 조성을 갖는 보호제와 보호제를 첨가하지 않은 처리구를 동일 조건에서 동결건조를 진행 하였다. 동결건조가 완료된 후 파쇄하여 0.85% NaCl이 첨가된 멸균 생리식염수에 단계별로 희석한 후 희석액 100㎕를 MRS 한천 배지에 도말, 30℃ 항온 배양기에서 48시간 배양을 한 후 생균수를 확인 하였다. 각 동결건조 보호제의 보호력이 차이가 있는 것을 확인할 수 있었는데, 선발 균주 모두 조성 2, 3, 4에서 동결건조 후 높은 균수를 보였으며, 보호제를 첨가 하지 않은 처리구 및 조성 1 에서는 균수가 감소하는 경향을 확인 할 수 있었다. 최종적으로 각 동결보호제의 조성에 따른 원가 (표 29 내지 31) 및 동결건조 전 후 의 균수 변화를 확인한 결과 동결보호제 조성을 Skim milk 10%, CMC 5%이 가장 경제적인 동결보호제 조성인 것을 확인할 수 있었다.

Lactobacillus paracasei GB-TS5 균주의 동결 보호제 조성에 따른 동결건조 전후의 균수 변화 (3반복 분석)

처 리 구	동결건조 전 균수 (CFU/g)	동결건조 후 균수 (CFU/g)	증감 (%)
무처리	1.90(±0.9)×10¹¹	6.20(±1.0)×10⁹	-96.56
보호제조성2	2.50(±1.1)×10¹¹	1.30(±0.5)×10¹²	520.00
보호제조성3	2.10(±0.7)×10¹¹	1.41(±0.4)×10¹²	671.43
보호제조성4	1.83(±0.4)×10¹¹	7.50(±0.5)×10¹¹	409.84

Lactobacillus acidophilus GB-LC2 균주의 동결 보호제 조성에 따른 동결건조 전후의 균수 변화 (3반복 분석)

처 리 구	동결건조 전 균수 (CFU/g)	동결건조 후 균수 (CFU/g)	증감 (%)
무처리	2.02(±0.9)×10¹¹	3.80(±1.5)×10¹⁰	-81.19
보호제조성2	1.86(±1.1)×10¹¹	1.15(±0.5)×10¹²	618.28
보호제조성3	1.81(±0.7)×10¹¹	9.20(±0.4)×10¹¹	508.29
보호제조성4	1.95(±0.4)×10¹¹	9.85(±0.5)×10¹¹	505.13

Lactobacillus plantarum GB-LP2 균주의 동결 보호제 조성에 따른 동결건조 전후의 균수 변화 (3반복 분석)

처 리 구	동결건조 전 균수 (CFU/g)	동결건조 후 균수 (CFU/g)	증감 (%)
무처리	2.30(±0.9)×10¹¹	4.86(±1.5)×10¹⁰	-77.91
보호제조성2	2.31(±1.1)×10¹¹	1.15(±0.5)×10¹²	497.84
보호제조성3	2.25(±0.7)×10¹¹	1.03(±0.4)×10¹²	457.78
보호제조성4	2.30(±0.4)×10¹¹	8.20(±0.5)×10¹¹	356.52

가장 경제적인 동결보호제 조성으로 결정된 조성 2를 포함하여 실제 저장조건에서의 저장성 평가를 통해 최종 제품화에 적용할 동결보호제 조성을 결정하였다. 저장성 평가는 Lactobacillus plantarum GB-LP2 균주 동결건조물을 200g씩 진공포장하여 이용하였으며, 저장성 평가 조건은 가속조건 (온도 40℃, 습도 70%)의 항온항습 챔버를 활용하여 60일간 저장성 평가를 실시하였다. 그 결과 동결건조 효율이 우수한 조성 2 보다 저장성에서 조성 4 (조성 2 + sodium alginate + chitosan)가 가장 우수한 것으로 확인되었다. 조성 4의 경우 sodium alginate 및 chitosan을 추가로 혼합하는 과정에서 혼합 균일도를 높이기 위한 혼합시간은 추가로 더 소요되고 그로인한 동결건조 후 균수가 조성 2에 비해 낮은 경향이 모든 균주에서 나타났으나, 저장성에서는 가장 안정적인 조성인 것을 확인하고 최종 제품화를 위한 동결보호제 조성을 조성 4로 결정하였다.

동결건조 된 분말 상태의 생균은 수분이 1% 이하의 저수분 상태이다. 그렇기 때문에 실온 보관 시 주위 환경의 수분을 흡수 하여 균수 저감 등 품질 변이가 일어날 수 있다. 이 점 때문에 동결건조 분말의 보관은 주로 냉장 밀봉 상태를 요구하게 되는데 이런 문제는 제품의 대량 유통을 위한 제한 요인으로 작용하게 되어 본 연구에서는 동결건조 생균 분말의 효과적인 보관 및 유통을 위한 방안으로 흡습성이 낮은 부형제를 혼합하여 제품 품질을 안정화시키기 위한 방안을 조사하였다. 본 시험에 사용한 부형제 및 조성은 표 32 과 같다.

동결 건조 주의 균질화를 위한 부형제 조성 (%)

성 분	조성 1	조성 2	조성 3	조성 4	조성 5
Sucrose	5
Molasses	10
Whey	82	82
Silicon	2	2
Glucose		15	99
Dextrose				99
Lactose					99

최적의 부형제를 선택하기 위해 6.9X10¹² CFU/g의 동결건조 생균 분말을 2.00X10¹⁰CFU/g이 되게끔 부형제로 희석 및 혼합 단계에서 혼합 시간을 1, 3, 5, 10분으로 달리하며 혼합 균일도를 조사했다. 이론상 계산된 희석 균수와 혼합 시험 후 균수를 비교하여 균일도가 가장 좋은 혼합 시간을 결정 하였다(표 33).

혼합 시간 및 부형제 조성별 균주 혼합 균일도 조사

부형제 조성	혼합 시간
부형제 조성	1분	3분	5분	10분
목표균수	2.00X10¹⁰	2.00X10¹⁰	2.00X10¹⁰	2.00X10¹⁰
조성 1	5.50E+09	1.80E+10	7.30E+10	2.03E+09
조성 2	5.00E+09	1.67E+10	5.80E+10	1.74E+09
조성 3	1.80E+09	3.00E+10	1.90E+10	7.00E+09
조성 4	3.28E+09	3.82E+10	2.20E+10	1.10E+10
조성 5	7.00E+09	1.80E+10	4.10E+10	7.00E+10
평균	4.52E+09	2.42E+10	4.26E+10	1.84E+10

혼합 시간에 따른 균질화 실험 결과 혼합 1분은 전체적으로 균수가 예상치인 2X10¹⁰CFU/g에 비하여 낮았으며 (4.52X10⁹ CFU/g), 5분과 10분의 혼합 시간에서도 기대치와 차이가 있었다. 하지만 3분의 혼합시간에서는 기대치와 비슷한 수준의 균수인 2.42X10¹⁰ CFU/g으로 최적의 혼합 균일도를 확인 할 수 있었다. 5분 이상의 혼합은 각 부형제의 입자에 따라서 분리 현상이 일어나서 균수의 변이가 나타나는 것으로 판단된다. 본 결과를 바탕으로 동결건조 분말의 부형제와의 혼합 시간은 3분이 적정한 수준인 것으로 판단된다.

본 발명에 따른 균주 동결 건조물을 대상으로 부형제 조성별로 저장안정성을 조사 하였다. 저장성 평가는 동결건조물과 각 조성별 부형제를 혼합 후 150g씩 (각 처리구별 150g * 21개)을 알루미늄 포장지로 소포장 한 후 가속조건인 40℃, 수분 70%의 환경에서 30일간 보관 하면서 생균수의 변화를 조사하였다.

부형제 조성에 따른 저장안정성 시험 결과 조성 4, 5에서 가속조건에서 30일 경과 후 7.1X10⁸ CFU/g, 7.6X10⁸ CFU/g의 균수를 보유하고 있어 다른 부형제 조성 대비 10배이상의 저장안정성이 우수한 것으로 확인되었다. 상기 결과를 토대로 조성 4를 선발하고 조성 4에 slicon dioxide 2%를 추가 혼합하여 최종 부형제로 설정하고 선발균주인 Lactobacillus paracasei GB-TS5, Lactobacillus acidophilus GB-LC2, Lactobacillus plantarum GB-LP2 균주 동결건조 생균의 부형제 혼합 후 저장 안정성 평가를 실시하였다. 그 결과 기존 조성 4 대비 200% 이상 개선되는 효과를 확인하였다.

확립된 대량생산 조건에서 각 선발균주별로 500L/batch 규모로 28~30시간 배양 후 원심분리 및 동결건조를 통해 생산공정 확립을 완료하였다. 3batch이상의 대량생산을 통한 생산공정 확립을 완료하였으며, 동결건조 후 Lactobacillus paracasei GB-TS5 균주는 1.0×10¹² cfu/g, Lactobacillus acidophilus GB-LC2 균주는 9.5×10¹¹ cfu/g, Lactobacillus plantarum GB-LP2 균주는 8.7×10¹¹ cfu/g의 평균균수를 확보하였으며, 최종제품으로 1.50×10¹⁰ cfu/g 이상의 균수를 기준으로 500~600kg의 제품을 제조 할 수 있어 제품화 단계에서도 문제 없이 제품생산 및 공급이 가능할 것으로 확인되었다.

선발균주의 대량생산 결과 (액상발효 공정)

균주	동결건조 생균 균수 (cfu/g)				총 생산량 (kg)	평균 생산량 (kg/batch)	최종제품 생산량 (1.50×10¹⁰ cfu/g 기준)
균주	1차	2차	3차	평균	총 생산량 (kg)	평균 생산량 (kg/batch)	최종제품 생산량 (1.50×10¹⁰ cfu/g 기준)
Lactobacillus paracasei GB-TS5	1.89E+11	2.15E+12	6.73E+11	1.00E+12	8.13	2.71	544.17
Lactobacillus acidophilus GB-LC2	1.10E+12	8.50E+11	9.00E+11	9.50E+11	10.02	3.34	634.60
Lactobacillus plantarum GB-LP2	1.01E+12	7.50E+11	8.50E+11	8.70E+11	11.04	3.68	640.32

동결건조 공정은 고상발효에 비하여 복잡한 단계를 거쳐서 생산되며 1회 생산량도 고상발효에 비하여 많지 않다는 단점을 가지고 있다. 이는 최종 제품에 대한 회수율, 경제성에서 상대적으로 고체발효보다 낮음을 의미한다. 이 점을 보완하기 위하여 본 연구에서는 곡물원료를 이용하여 선발균주에 대한 고상발효의 가능성을 조사했다. 고상발효에 사용된 균주는 1차 시험에서 유기산 생성이 우수하고, 섬유소 분해능을 보유한 Lactobacillus paracasei GB-TS5 균주를 이용하였다. 고상발효에 사용된 곡물원료는 가축 사료에 많이 사용되는 원료 중에 사전 연구 과정 중에 선택되었던 대두박과 소맥피를 이용하였다.

고상발효의 배지 원료 조성을 결정하기 위하여 대두박과 소맥피만을 단독으로 사용한 곡물 배지와 대두박과 소맥피를 동량 혼합한 복합 곡물 배지를 준비하였다. 고상발효용 종균은 MRS 액체배지에 Lactobacillus paracasei GB-TS5 및 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 균주를 각 접종 한 후 30℃ 진탕배양기에서 180rpm으로 48시간 배양을 한 것을 사용하였다. 고상발효를 하기 위해 준비된 원료들은 수분이 50% 되도록 보정한 이후 다른 균들을 제거하기 위해 121℃에서 15분간 멸균을 진행하였다. 증자 후 상온에서 충분히 식힌 후 종균용 배양액을 배지 원료 질량의 1%가 되도록 접종 (초기 균수: 1.0X10⁶CFU/g)하여 36℃ 항온 배양기에서 48시간 발효하였다. 발효가 종료된 발효물 샘플을 취하여 0.85% NaCl이 함유된 멸균 생리식염수에 적당량 희석 한 후 MRS 한천배지에 도말 하여 생균수를 확인 하였다.

단독 곡물 배지와 혼합 곡물 배지의 고상발효 결과 대두박 배지에서 4종 균주 모두 1.0×10⁹CFU/g이상의 높은 균수를 확인할 수 있었으며, 대두박 소맥피 혼합 배지도 1.0×10⁹CFU/g이상의 균수를 확보하여 경제성 측면에서는 대두박, 소맥피 혼합배지가 가장 우수한 고상발효용 배지인 것으로 확인되었다.

고상발효 조건 확립을 위해 초기 접종균수 수준을 1.0×10⁷ cfu/g수준으로 접종하고 초기 수분함량과 발효온도를 달리하여 최적 발효조건을 조사하였다. 가수 조건은 40%, 50%, 60%로, 발효 온도는 30℃, 35℃, 40℃로 발효 시간은 48시간으로 하여 고상발효를 진행하였다. 그 결과 선발균주의 최적 고상발효를 위한 발효온도는 액상발효에서의 온도와 비슷한 35℃, 초기 수분 함량에서는 60%에서 가장 높은 균수 확인 할 수 있었다. 하지만 초기 수분함량 50% 처리구에서도 비슷한 결과를 보여 50% 이상에서는 균 성장에 큰 문제가 되지 않는 것으로 판단되었다. 이상의 결과들을 바탕으로 고상발효 조건은 대두박을 배지로 하여 초기 수분은 50%, 발효 온도는 35~36℃로 설정 하였다.

발효온도 및 수분함량에 따른 균수 변화

발효온도	30℃			35℃			40℃
수분함량	40%	50%	60%	40%	50%	60%	40%	50%	60%
Lactobacillus paracasei GB-TS5	1.40E+09	2.50E+09	3.80E+09	1.70E+09	3.30E+09	5.00E+09	9.10E+08	2.30E+09	3.50E+09
Lactobacillus acidophilus GB-LC2	8.50E+08	9.10E+08	1.50E+09	1.23E+09	2.14E+09	3.50E+09	8.20E+08	9.50E+08	1.33E+09

선발균주 3종을 활용한 5톤 규모의 대량생산 공정은 pilot scale 실험의 조건과 동일하게 대두박 및 소맥피 혼합원료 배지에 초기 접종균수를 2.0×10⁷ cfu/g으로 접종하고 초기 수분함량을 50%, 배양온도를 35~36℃로 설정하여 발효를 진행하였다. 발효공정 중 균수 변화를 확인하면서 최적 발효시간을 설정하였다. Lactobacillus paracasei GB-TS5 균주의 5톤 발효결과 발효시간 18시간부터 균수가 10⁹ cfu/g 에 도달하였으며, 발효 30시간 이후부터는 발효시간이 길어질수록 균수가 감소하는 것으로 확인되었으며 pH는 초기 6.3~6.5에서 발효 18시간 이후부터는 5이하로 내려가 발효 42시간째 4.0수준까지 내려가 유산균외 타 균주의 오염은 없는 것으로 확인되었다.

Lactobacillus paracasei GB-TS5 균주의 고상발효결과를 기준으로 Lactobacillus acidophilus GB-LC2 및 Lactobacillus plantarum GB-LP2 균주 최적 발효시간을 30시간을 발효 시간으로 설정하고 대량생산 시험을 진행하였다. 초기 종균을 2.0×10⁷ cfu/g으로 접종하고 초기 수분함량을 50%, 배양온도를 35~36℃로 동일하게 설정하고 대량생산 시험을 진행하였다. Lactobacillus acidophilus GB-LC2 의 경우 균수는 16시간 이후부터 10⁹ cfu/g 이상으로 유지되었으며, pH는 24시간 이후부터 5.0이하로 유지되었다. Lactobacillus plantarum GB-LP2 균주의 경우 발효 20시간부터 균수가 10⁹ cfu/g에 도달하였으며, pH도 5.0이하로 유지되었다. 특히 Lactobacillus plantarum GB-LP2 균주의 경우 발효온도를 35℃로 설정하였으나, 실제온도는 38도 이상 유지되었으며 그로 인해 발효과정 중 수분함량도 감소한 것으로 확인되었다.

최종 선발균주의 최적 고상발효공정을 활용하여 5~6톤/batch의 고상발효실험을 3회 이상실시하여 최종 균수를 목표균수인 10⁹ cfu/g 이상의 균수를 확보함으로써 최종 생산공정 확립을 완료하였다.

최종 선발균주 3종의 고상발효 공정 확립 결과

균주명	최종 건조 후 균수 (CFU/g)
균주명	1차	2차	3차	평균
Lactobacillus paracasei GB-TS5	2.70E+09	3.70E+09	9.70E+08	2.46.E+09
Lactobacillus acidophilus GB-LC2	1.89E+09	3.83E+09	3.00E+09	2.91.E+09
Lactobacillus plantarum GB-LP2	8.61E+08	9.90E+08	1.04E+09	9.64.E+08

TMR/silage starter로서 최종제품의 균수 측면에서는 고상발효 공정을 통해 생산된 종균은 최종 제품으로서 최종 균수를 10⁹ cfu/g 이상의 균수를 확보할 수 없어 현장에서 요구되는 종균의 품질 확보에 문제가 있을 것으로 판단되었다. 반면 액상발효 공정을 통해 생산된 제품이 10¹⁰ cfu/g 이상의 균수를 가진 제품을 제조할 수가 있어, 일반적으로 시중에 유통중인 TMR/silage starter와 유사한 형태의 제품 제조가 가능할 것으로 판단되어 액상발효 공정을 통해 생산된 종균을 최종 TMR/ silage starter 제품으로 결정하였다.

[본 발명에 따른 TMS 제품의 안전성 및 안정성]

액상발효 공정을 통해 생산된 개발제품(본 발명에 따른 균주를 1 : 1 : 1 의 균수 비율로 혼합한 제품)의 저장 안정성 평가를 위해 다양한 포장재료 및 보관온도에 대한 평가를 실시하였으며, 실제 동결건조 원말의 경우는 진공포장을 실시하고 저온 조건 (4℃) 및 실온 (25℃)조건에서 6개월간 저장성 평가를 실시하였으며, 원말의 경우는 진공포장 후 저온저장 조건에서는 6개월간 균수 감소 없이 안정적인 균수가 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 그렇지만, 진공포장 후 실온저장조건에서는 보관 2개월 이후부터 균수가 감소하였으며, 3개월까지는 균수가 10¹² cfu/g을 유지하여 최대 보관기간인 것으로 확인되었다.

액상발효 공정을 통해 생산된 원말의 부형제 희석 제품(TMR/Silage starter, 부형제: dextrin + silicon dixoide)의 경우도 원말과 동일하게 진공포장 후 저온 조건에 보관할 경우 균수의 감소가 없는 것을 확인하였으나(98%), 실온조건에서는 최대 4개월까지는 균수가 유지 되는 것을 확인할 수 있었으며, 최종 6개월 이후에서는 log 값 기준 93%수준의 균수가 유지되었다. 또한, 알루미늄 포장의 경우도 저온저장 조건에서는 진공포장 후 실온저장 방법과 유사하게 최대 4개월까지는 안정적으로 균수가 유지됨을 확인할 수 있으며, 최종 6개월 이후에서는 log 값 기준 87% 수준의 균수를 확인하였다. 반면 알루미늄 포장 후 실온저장 조건에서는 6개월 이후 log 값 기준 81% 수준의 저장안정성을 확인하였다

반면, 고상발효공정을 통해 생산된 TMR/silage starter 제품의 경우 6개월간 실온 저장에서도 균수변화는 전혀 확인되지 않았으며, 6개월 이후에도 안정적인 균수가 유지됨을 확인할 수 있었다 (log 값 기준 96%).

개발제품의 급성 독성양상 및 독성강도를 알고자 암수 SD 랫드에 개발제품을 강제경구투여하고 14일간 관찰하면서 독성 유무에 대해 확인하였다. 독성 평가에 사용된 제품은 액상발효 공정을 통해 제조된 제품을 사용하였으며, 급이를 용이하게 하기 위해 멸균 식염수로 희석 후 독성평가에 사용하였다. 독성 평가 결과 개발제품의 단회 경구 투여 후 14일간 관찰 시 사망동물과 특이한 임상증상, 체중 변화, 사료 섭취량 및 부검소견이 관찰되지 않았다. 비록 음수 섭취량에 있어 20 mL/kg bw 투여군 암컷 랫드에서는 투여 후 1일째에 통계학적으로 유의하게 대조군에 비하여 높았으나, 일시적이며 투여 후 4일째부터는 회복하였다. 20 mL/kg bw 암컷 랫드 투여군을 제외한 다른 투여군에서 음수 섭취량은 대조군과 비교 시 차이가 없었다. 결론적으로 개발제품의 급이를 통한 임상증상, 체중 및 사료 섭취량의 변화 등이 관찰되지 않았고, 관찰기간 종료 후 실시한 육안적 병리검사에서 이상이 관찰되지 않았으며, 관찰종료일까지 사망동물이 관찰되지 않았다. 이를 근거로 경구 투여 시 반수치사량(LD₅₀)은 20 mL/kg bw (9×10⁹CFU/kgbw)보다 높은 양으로 제품의 경구노출에 의한 독성이 거의 없는 안전한 물질로 판단되었다.

개발제품 급여 농도에 따른 폐사율

Dose group (mL/kg bw, cfu/kg bw)	Sex	No. of Animals	Number of death
Dose group (mL/kg bw, cfu/kg bw)	Sex	No. of Animals	1	2	3	4	5	6	7	8	9~15 day	Mortality (%)
VC	Male	5	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0/5 (0)
VC	Female	5	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0/5 (0)
개발제품 (5, 2.25x10⁹)	Male	5	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0/5 (0)
개발제품 (5, 2.25x10⁹)	Female	5	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0/5 (0)
개발제품 (10, 4.5x10⁹)	Male	5	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0/5 (0)
개발제품 (10, 4.5x10⁹)	Female	5	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0/5 (0)
개발제품 (20, 9x10⁹)	Male	5	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0/5 (0)
개발제품 (20, 9x10⁹)	Female	5	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0/5 (0)

VC: Vehicle control (0.9% saline solution)

처리구간의 임상증상 발현 정도

Dose group (mL/kg bw, cfu/kg bw)	Sex	Day 0	Day 1	Day 2	Day 3~14
VC	Male	NCS	NCS	NCS	NCS
VC	Female	NCS	NCS	NCS	NCS
개발제품 (5, 2.25x10⁹)	Male	NCS	NCS	NCS	NCS
개발제품 (5, 2.25x10⁹)	Female	NCS	NCS	NCS	NCS
개발제품 (10, 4.5x10⁹)	Male	NCS	NCS	NCS	NCS
개발제품 (10, 4.5x10⁹)	Female	NCS	NCS	NCS	NCS
개발제품 (20, 9x10⁹)	Male	NCS	NCS	NCS	NCS
개발제품 (20, 9x10⁹)	Female	NCS	NCS	NCS	NCS

VC: Vehicle control (0.9% saline solution)

NCS: No clinical signs

처리구간 체중 변화

Dose group (mL/kg bw, cfu/kg bw)		Body weights (g)
Dose group (mL/kg bw, cfu/kg bw)		Day 0^a)	Day 1	Day 4	Day 7	Day 10	Day 14
VC	Mean	236.3	249.9	265.4	279.0	299.7	321.3
	SD	11.9	11.1	9.8	11.3	9.9	9.6
	n	5	5	5	5	5	5
개발제품 (5, 2.25x10⁹)	Mean	234.9	250.7	264.5	277.8	302.2	321.1
	SD	14.3	13.9	13.8	15.0	16.9	18.7
	n	5	5	5	5	5	5
개발제품 (10, 4.5x10⁹)	Mean	231.3	245.1	260.2	276.6	300.4	318.4
	SD	10.2	9.3	8.8	12.1	12.4	18.6
	n	5	5	5	5	5	5
개발제품 (20, 9x10⁹)	Mean	236.9	250.9	267.7	281.1	304.8	325.3
	SD	14.7	15.2	15.3	16.3	15.4	13.2
	n	5	5	5	5	5	5

VC: Vehicle control (0.9% saline solution)

a): Data after fasting for 14 hrs

[기타 본 발명에 따른 TMR 제품의 특성]

공장에서 제조하는 제품을 대조구로하고 개발제품(혼합종균)을 처리구로 하여 TMR 발효사료를 제조하였다. 발효온도는 1.4 ~ 11.8℃, 상대습도는 49.4~88.1% 이었다. 발효시간은 동절기 TMR 평가일자와 동일하게 7일간 발효를 통해 발효사료를 제조하였다.

TMR 발효실험 원료 조성 및 첨가량

원료명	대조구	처리구
원료명	비율, %	비율, %
베이스	6	6
귀리피	4	4
단백피	4.5	4.5
옥수수F	7.5	7.5
호마박	7.6	7.6
비트펄프	2	2
귀리	2	2
건옥피	3.1	3.1
식빵	2	2
맥주박	24	24
장유박	5.5	5.5
효모	7	-
유산균	-	3
물	-	4
면실	4	4
비타민	0.4	0.4
중조	0.4	0.4
석회석	0.4	0.4
소금	0.1	0.1
티모시	2	2
연맥	9	9
라이그라스	1	1
혼합건초	7.5	7.5
계	100	100

TMR 발효결과 처리구에서는 동절기임에도 불구하고 발효 7일차 유산균 균수는 9.7×10⁷ cfu/g 수준까지 증가하였으며, 그로 인해 제품의 pH 또한 4.7수준까지 감소하였으며(도 1), 대장균군의 오염수준도 초기 10⁴ cfu/g 에서 발효 7일차 10² cfu/g 수준까지 감소하여 안정적인 품질을 확보할 수 있었다(도 2). 반면, 대조구 TMR의 경우 발효 7일차까지 pH가 5.0이상이었으며, 유산균 균수 또한 10⁶ cuf/g 수준으로 외기 온도가 낮은 동절기에는 발효가 잘 되지 않는 문제점을 가지고 있었다(도 3). 또한, 대장균군을 비롯한 오염균의 제어도 완벽하지 않아 장기 보관 시 TMR 품질뿐만 아니라 사양성적에도 좋지 않은 영향을 미칠 것으로 판단되었다.

개발제품을 이용한 발효일자별 TMR 발효특징

발효일자	pH	수분	Salmonella	Coliform	Fungi	Yeast	BS	LAB
0일차	4.98	38.42	ND	3.80E+04	ND	7.80E+06	2.50E+06	1.06E+07
1일차	4.88	37.09	ND	2.40E+04	ND	6.31E+06	2.10E+06	1.75E+07
3일차	4.85	35.49	ND	2.10E+03	ND	6.51E+06	1.94E+06	1.54E+07
5일차	4.81	35.75	ND	2.50E+02	ND	1.71E+06	1.84E+06	6.40E+07
7일차	4.70	34.85	ND	1.40E+02	ND	8.15E+05	2.20E+06	9.70E+07

대조구 TMR의 발효일자별 발효특징

발효일자	pH	수분	Salmonella	Coliform	Fungi	Yeast	BS	LAB
0일차	5.20	36.27	ND	1.30E+05	ND	1.00E+06	5.00E+05	5.00E+06
1일차	5.21	35.88	ND	3.20E+05	2.00E+04	8.30E+06	9.00E+05	2.50E+06
3일차	5.18	34.19	ND	4.50E+05	1.10E+04	3.30E+06	2.10E+06	4.30E+06
5일차	5.14	34.21	ND	8.50E+04	ND	8.50E+05	2.30E+06	3.10E+06
7일차	5.25	34.18	ND	8.70E+04	ND	8.10E+05	1.10E+06	2.91E+06

본 사양시험은 선발된 유산균을 발효 starter 로 사용한 TMR이 육성기 육우의 성장에 미치는 영향을 평가하기 위해 진행하였다.

시험 설계는 대조구(Control)로는 관행 TMR에 기존 starter 가 첨가된 발효 TMR을 사용, 처리구(Treatment)로는 관행 TMR에 선발균주 starter 가 첨가된 발효 TMR을 사용하였다.

시험구 배치는 5 m X 10 m 우방에 육성기 육우 5두씩 3개 우방으로 배치하여 진행하였다. (각 실험구 당 총 15두)

시험 사료는 대조구(Control)의 경우, 안성 TMR 관행사료에 맥주박 효모를 관행수준으로 첨가하였다. 처리구(Treatment)는 안성 TMR 관행사료에 선발 균주를 TMR 중량 대비 1%로 첨가하였다. (Lactobacillus paracasei GB-TS5, Lactobacillus plantarum GB-LP2, Lactobacillus acidophilus GB-LC2: 각 균주는, 1.0 X 10⁷CFU/ g 수준으로 혼합하여 동일 수준으로 첨가) 시험사료의 수분함량은 안성 TMR 관행 수준인 38%로 처리하였다.

시험장소는 경기도 안성 소재 안성 TMR 부속 농장에서 실시하였다.

측정항목은 사료섭취량, 실험사료 일반성분분석 (DM, CP, EE, NDF, ADF, ash, OM), 일당증체량, 분 중 유산균과 유해미생물 균총 변화와 반추위 유래 미생물의 변화를 평가하였다.

시험사료의 일반성분분석은 실험개시, 개시 후 30일, 종료 시 총 3회 사료 샘플을 수거하여 분석하였으며, 분석방법은 위 사일리지 시험의 일반성분분석방법과 같다. 일당 증체량 분석은 시험개시와 종료 시 체중을 같은 시간에 측정하여 체중의 차이를 시험일수로 나누어 산출하였다.

선발 미생물을 접종한 처리구 사료가 반추위의 미생물 변화에 미치는 영향을 평가하기 위해 대조구와 시험구의 각 우방에서 3마리의 시험동물을 임의적으로 선발하여 체중측정 시 분을 채취하였다. 채취한 분은 곧바로 아이스박스에 저장하고 실험실로 이동 후 분석 전까지 -20℃ 냉동고에 보관하였다.

분중 반추위 유래 미생물의 변화 분석은 분 중 gDNA를 Global census of rumen microbial diversity, Project scope and protocol에 따라 추출하여, 341F-GC (CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG) 와 534R (ATT ACC GCG GCT GCT GG) primer를 사용하여 PCR 하였다. PCR 조건은 94℃ 5min, [94℃ 30sec, 62℃ 30sec, 72℃ 30sec]- 30cycle, 72℃ 7min 의 조건으로 실시하였고, DGGE(Biorad, USA)를 이용해 전기영동을 실시한 후 ETBR로 염색하여 Gel-doc(Biorad, USA)를 이용하여 사진을 촬영하였다. 이후 분석은 SYStat13 프로그램을 이용하였다.

in vivo 시험배합비(%)

원료명	대조구	처리구
베이스	6.0
귀리피	4.0
단백피	4.5
옥수수F	7.5
호마박	7.6
비트펄프	2.0
귀리	2.0
건옥피	3.1
식빵	2.0
맥주박	24.0
장유박	5.5
면실	4.0
비타민	0.4
중조	0.4
석회석	0.4
소금	0.1
티모시	2.0
연맥	9.0
라이그라스	1.0
혼합건초	7.5
효모	7.0	0
선발균주 3종	0	3.0
물	0	4.0

in vivo 시험사료 성분분석(%)

	DM	OM	CP	EE	NDF	ADF
Control	66.053	89.636	16.179	6.591	45.835	22.233
Treat	57.820	90.298	16.703	3.559	45.909	22.889

대조구와 처리구의 시험개시 평균체중은 각각 428,93kg과 435.93kg이었다. 관행 TMR과 개발제품이 처리된 시험사료를 2개월간 급여한 후 대조구는 평균 492.53kg, 처리구는 평균 499.87kg 이었다. 처음 한달 후 1차 체중 측정 결과 대조구가 처리구보다 체중 증가가 높았으나 (28.8kg vs 21.6kg) 이차 체중 측정을 한 2개월 후의 한달 간 증체는 처리구에서 대조구보다 높은 증체 경향을 보여(대조구 34.8kg vs 처리구 43.3kg) 결과적으로 2개월의 시험 종료 후 각각의 증체 성적은 대조구가 63.6kg, 처리구가 64.93kg으로 처리구가 약 1.3kg 증가한 것으로 나타났다. 일당 증체량 또한 대조구는 1.06kg/day, 처리구는 1.08kg/day로 통계적 유의성은 없었으나 개발제품을 접종하여 제조한 처리구 TMR이 높았다.

사양시험 종료 후 분내 미생물 균총 분석결과는 유의성은 없었으나, 처리구가 대장균, 살모넬라 균수 등에서의 대조구 대비 개선되는 경향을 확인할 수 있다. 이에 좀 더 명확하게 선발 미생물을 접종한 처리구 사료가 반추위의 미생물 변화에 미치는 영향을 평가하기 위해 대조구 9마리와 시험구 9마리에서 임의적으로 분을 채취하여 DGGE 분석을 실시하였다. 개발제품 접종한 TMR을 급여한 처리구와 관행사료를 급여한 대조구의 반추위 미생물의 군집간에는 시험 동물 개체간 다양성은 있었으나 유의적인 결과 차이는 없었다.

위의 결과에 따라, 본 발명에 따른 균주를 발효 starter로 이용하여 TMR을 제조하여 이용할 경우, 기존의 효모가 발효 starter로 사용된 TMR의 경우와 비교할 때 반추위내의 미생물 군집변화에 큰 영향을 미치지 않으면서 반추동물의 생산성을 소폭 증가 시킬 수 있을 것으로 판단된다.

본 발명에 따른 유산균을 발효 starter로 사용한 TMR이 육성기 육우의 성장에 미치는 영향

Items	Treatments		SEM	Sig.
Items	Control	Treatment	SEM	Sig.
Initial BW, kg	428.93	434.93	22.75	NS
1 Month BW, kg	457.7	456.5	27.80	NS
2 Month BW, kg	492.53	499.87	26.54	NS
First month BW gain, kg	29.8	21.6	2.90	NS
Second month BW gain, kg	34.8	43.3	3.01	NS
Total BW gain, kg	63.60	64.93	4.09	NS
Average daily gain (kg/ day)	1.06	1.08	0.07	NS

SEM = standard error of mean. Sig = significance, NS = not significant.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM11535P

수탁일자 : 20140429

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM11259P

수탁일자 : 20120220

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM10671P

수탁일자 : 20050816

Claims

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락토바실러스 파라카세이 GB-TS5(Lactobacillus paracasei GB-TS5, KCCM11535P), 락토바실러스 플란타럼 GB-LP2(Lactobacillus plantarum GB-LP2, KCCM11259P) 및 락토바실러스 아시도필러스 GB-LC2(Lactobacillus acidophilus GB-LC2, KCCM10671P) 를 각각 1 : 1 : 1 의 균 수의 비율로 혼합한 것을 함유하는 완전 배합 사료(Total Mixed Ration, TMR).