CN102286394B - 耐高温乳酸菌株ht1及其在调制青贮饲料方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株耐高温乳酸菌及其调制青贮饲料的方法，属于微生物应用和饲料调制加工技术领域。所用菌株为HT1，经鉴定为乳杆菌属鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosussp.），菌种保藏号为CGMCC4483，该菌株的16SrDNA的Genbank登录号为JF414107。主要生物学特性为为革兰氏染色阳性杆菌，葡萄糖同型发酵，耐酸，生长速度快，生育温域宽，尤为耐高温。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用和饲料调制加工技术领域，具体涉及乳酸菌在改善青贮饲料发酵品质中的应用。
背景技术
青贮饲料是在厌氧和酸性环境下长期贮存的新鲜牧草、饲料作物等多水分饲料。近年来，随着我国奶牛业的快速发展，青贮饲料的生产量在迅速增长，2003年全国青贮饲料的生产量就已经超过了2亿吨（中国奶业协会，2003）。可见青贮饲料的生产、利用对畜牧业生产，特别是高产奶牛来说具有非常重要的意义。它既能保证奶、肉产品的数量与品质，又可节约饲用粮食，另外通过青贮还可使粗糙或带异味而不易直接饲用的植物材料，以及不易干燥的高水分饮料、食品加工副产物等得到充分利用，提高生物资源的利用、转化效率（内田，1999；曹致中，2005）。但青贮饲料的发酵品质受多种因素的影响，其中乳酸菌在调制青贮饲料中起主要作用。
乳酸菌为革兰氏阳性菌，抗过氧化氢酶，厌氧，无孢子，无运动性。在青贮过程中，促进乳酸发酵，可提高青贮发酵品质，减少营养损失。当青贮窖密封后，厌氧微生物可以快速繁殖，如果条件适宜，乳酸菌将快速酸化环境，当pH下降到一定程度时，与其竞争的有害微生物将不能生存，这样便得到稳定的青贮饲料。反之，不良微生物快速生长，导致青贮饲料腐败或品质下降。乳酸发酵的关键是乳酸菌，如果材料本身附着的乳酸菌数量较少，或乳酸菌数量虽多，但缺乏耐特殊环境（如高温）的乳酸菌，在相应条件下就难于获得优质青贮饲料。高温青贮环境无论在南方还是北方都存在，如装窖时间长或密封不充分时，由于植物和微生物的呼吸产热，青贮窖内的温度很快就会超过40℃。在我国南方，全年温度较高，特别是夏季，青贮窖内更易发生高温。在以上条件下很难调制优质青贮饲料（张建国，2000；Ashbell G.et al, 1992）。
青贮时添加甲酸等酸类化学物质，可以直接降低pH，改善青贮料的发酵品质，但因成本高、腐蚀性强、作业不安全等因素，在生产中难以利用。改善青贮饲料发酵品质的乳酸菌添加剂在市场上也比较多，但一般没有考虑到高温条件，在高温环境下改善效果不明显。
本发明针对生产中青贮高温环境存在的问题，对耐高温并能改善青贮发酵品质的乳酸菌进行了分离、筛选。结果发现1株鼠李糖乳杆菌，它在高温条件下，可显著提高饲草青贮的发酵品质，在生产上具有较大的应用价值。
发明内容
本发明针对生产中青贮高温环境存在的问题，提供了一种耐高温乳酸菌株及利用该菌株调制优质青贮饲料的方法。此菌株在高温条件下可显著提高饲草青贮的发酵品质，在生产上具有较大的应用价值。
本发明提供了耐高温乳酸菌HT1在调制青贮饲料方面的应用。
发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明提供一种耐高温乳酸菌HT1，经鉴定为乳杆菌属鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus），于2010年12月17日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏号为CGMCC 4483，该菌株的16S rDNA 的Genbank 登录号为JF414107；其主要生物学特性为革兰氏染色阳性杆菌，葡萄糖同型发酵，耐酸性强（在pH3.75～9条件下可以正常生长），生长速度快（MRS培养基培养1天pH可降到3.9以下），生育温域宽（10-50℃可正常生长），耐50℃的高温。
鼠李糖乳杆菌菌株HT1在调制青贮饲料方面的应用。
一种利用上述乳酸菌菌株HT1调制青贮饲料的方法，其特征在包括以下步骤：①将待发酵饲料切断混合均匀；②每kg新鲜饲料加入菌株HT1 1.0×108个或以上；③添加菌株HT1后的饲料密封后贮藏。
菌株的生长温度优选为45℃。
步骤①所述的待发酵饲料切断至1 cm～2 cm。
耐高温乳酸菌菌株HT1的16S rDNA序列如下所示：
该菌是采用富集培养，稀释平板法筛选获得：将装有500 mL蒸馏水的锥形瓶、装有9 mL蒸馏水的试管、MRS固体培养基及平板灭菌，灭菌后再将MRS培养基倒入平板内。无菌条件下，取10 g青贮40天的玉米样于塑料袋内，再加入90 mL灭菌蒸馏水振荡均匀，使其终浓度为100 g·L-1，然后再取稀释后样品1 mL加入含有9 mL灭菌蒸馏水的试管振荡均匀，使其终浓度为10 g·L-1，此时取该液体0.03 mL反复进行平板划线分离，直至得到单菌落，将单菌落用接种针插入含有MRS固体培养基的试管中心，于4℃冰箱内保存。其中MRS培养基为：蛋白胨（Proteose peptone NO.3）10.0 g；牛肉膏（Beef extract）10.0 g；酵母提取物（Yeast extract）5.0 g；葡萄糖（Dextrose）20.0 g；吐温（Polysorbate 80）1 mL；柠檬酸铵（Ammonium citrate）2.0 g；醋酸钠（NaAc）5.0 g；硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.1 g；硫酸锰（MnSO4·4H2O）0.05 g；磷酸氢二钾（K2HPO4）2.0 g；蒸馏水（H2O）1000 mL，固体培养基再加15 g/L琼脂（Agar），121℃，灭菌20 min。
本发明从90株乳酸菌中，用生理生化方法筛选出耐高温、耐酸及生长速度快的乳酸菌HT1。提取乳酸菌HT1全长基因，然后运用PCR 扩增引物 25f (5`-AAC TGA AGA GTT TGA TCC TGG CTC-3`) 和1492r (5`-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT-3`) (Hurek et al, 1997)，扩增出16S rDNA基因，在NCBI上对比相关序列，确定其相似菌种。最后，将筛选出的菌株及对照菌分别添加到不同饲草中，并将其放于高温环境中青贮，开封后分析青贮发酵品质并进行对比，确认HT1可以显著提高高温环境下青贮饲料的发酵品质。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
⑴利用微生物改善青贮饲料的发酵品质，成本低，安全，可靠，易于利用。
⑵该菌株可在我国各地使用，特别是高温环境下效果独特，克服了因乳酸菌数量不足或耐高温乳酸菌较少造成青贮饲料发酵不佳的问题。
⑶本发明使用的鼠李糖乳杆菌菌株HT1在高温环境下比现有乳酸菌添加剂效更佳。
具体实施方式
实施例1：筛选耐高温优良乳酸菌
从王草、柱花草、玉米、野生稻等材料上分离乳酸菌菌株90株，进行革兰氏染色和细胞形状观察，并根据生育温度（10、15、20、25、30、35、40、45、50℃）和生育pH（3.5、3.75、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）等实验筛选出耐高温、耐酸及生长速度快的乳酸菌HT1。结果表明，HT1菌株为革兰氏阳性，同型发酵的杆菌，在50℃和pH3.75条件下皆可生长，具有较强的耐高温、耐酸性，可发酵大多数糖类（表1）。
表1菌株HT1的特性
-：不生长； ±：生长弱；+：生长； ++：生长好。
乳酸菌HT1的生理生化试验、培养基及其配制的方法如下所述：
1）革兰氏染色、发酵类型及形状观察参照东秀珠主编的《常见细菌系统鉴定手册》。
2）乳酸菌生长pH调节使用4 mol/L NaOH和4 mol/L HCl。
3）糖发酵采用API 50 CHL（bioMérieux, l’Etoile, France）分析。
4）培养基
1. MRS培养基（用于乳酸菌的培养）：
蛋白胨（Proteose peptone NO.3）10.0 g；牛肉膏（Beef extract）10.0 g；酵母提取物（Yeast extract）5.0 g；葡萄糖（Dextrose）20.0 g；吐温（Polysorbate 80）1 mL；柠檬酸铵（Ammonium citrate）2.0 g；醋酸钠（NaAc）5.0 g；硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.1 g；硫酸锰 （MnSO4·4H2O）0.05 g；磷酸氢二钾（K2HPO4）2.0 g。将上述试剂溶解，用蒸馏水定容至1000 mL，固体培养基再加15 g/L琼脂（Agar），121℃灭菌20 min。
2．API 50 CHL培养基：
蛋白胨（Proteose peptone NO.3）10.0 g；酵母提取物（Yeast extract）5.0 g；吐温（Polysorbate 80）1 mL；醋酸钠（NaAc）5.0 g；柠檬酸铵（Ammonium citrate）2.0 g；硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.2 g；磷酸氢二钾（K2HPO4）2.0 g；硫酸锰（MnSO4·4H2O ）0.05 g；溴甲酚紫（Bromcresol purple）0.17 g。将上述试剂溶解，用蒸馏水定容至1000 mL，分装在15 mL的试管中，每试管10 mL，121℃灭菌20 min。
实施例2：乳酸菌的鉴定
菌株在5 mL的MRS培养基中37℃培养过夜，菌液移入1.5 mL的离心管中，10000 rpm/min离心3 min～5 min收集菌，用TE0.1（10 mmol/L Tris–HCl, 0.1 mmol/L EDTA, pH 8.0）清洗两次，再用TIANamp Bacteria DNA Kit（TIANGEN BIOTECH CO., LTD, Beijing, China）试剂盒提取DNA，在OD600 nm处检测其吸光值。然后，进行PCR扩增，16S rDNA的扩增引物为25f （5`-AAC TGA AGA GTT TGA TCC TGG CTC-3`）和 1492r （5`-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT-3`），RCR反应为95℃（5 min）- 94℃（30 s）- 55℃（1 min）-72℃（1.5 min）-72℃（10 min），其中94℃（30 s）- 55℃（1 min）-72℃（1.5 min）反应循环30次。扩增产物送博尚生物科技有限公司（中国）测序，结果在NCBI 的基因库上比对，找出与此菌亲缘相近的标准菌株玉米乳杆菌（Lactobacillus zeae RIA-482）；干酪乳杆菌（Lactobacillus casei NM 108-1）；副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei subsp）；鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus NM 94-5），并用DNAman软件分析，将筛选菌株的16S rDNA的部分序列（约1400 bp～1500 bp）与标准菌进行相似度分析，HT1与鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）相似度超过99%，应为同一种。
实施例3：添加到青贮饲料中的效果
以轻度预干（预干是指晾晒，以降低水分含量）和未预干的黑麦草为材料进行了青贮添加试验。黑麦草切断至1 cm～2 cm，混合均匀，每kg新鲜材料加入菌株HT1约1.0×108 个。添加菌株HT1后的黑麦草饲料装入30 cm×20 cm的聚乙烯青贮袋，每个处理装6袋，3袋45℃保存，3袋15℃保存，每袋约200 g，用真空密封机（SINBO Vacuum Sealer, Hong Tai Home Electrical Appliance Co. Ltd.）抽气、密封，置于45℃贮藏30 d。
表2 青贮前饲草的化学及微生物成分
| 项目 | 未预干黑麦草 | 预干黑麦草 | 水稻 |
| 干物质（%） | 16.37 | 30.03 | 50.73 |
| 粗灰分（% DM） | 9.86 | 10.28 | 10.04 |
| 可溶性碳水化合物（% DM） | 13.7 | 12.39 | 11.16 |
| 粗蛋白（% DM） | 14.36 | 14.87 | 6.19 |
| 粗脂肪（% DM） | 4.13 | 3.12 | 2.11 |
| 粗纤维（% DM） | — | — | — |
| 中性洗涤纤纤维（% DM） | 53.98 | 50.35 | 59.80 |
| 酸性洗涤纤维（% DM） | 32.14 | 29.95 | 34.22 |
| pH值 | 6.13 | 6.02 | 5.88 |
| 缓冲能（mE/kg DM） | 233.6 | 213.9 | 118.2 |
| 氨态氮（% TN） | 2.7 | 4.9 | 1.60 |
| 乳酸菌（lg cfu/g FM） | 4.4 | 4.2 | 7.34 |
| 好气性细菌（lg cfu/g FM） | 7.5 | 7.9 | 7.99 |
| 酵母菌（lg cfu/g FM） | 5.4 | 5.6 | 6.32 |
| 霉菌（lg cfu/g FM） | 4.2 | 4.4 | 5.75 |
DM: 干物质；FM: 鲜物质；lg: 数据以10为底取对数；cfu/g: 菌落形成单位。
在45℃高温条件下，无论是经过预干（水分含量70%）还是未预干的黑麦草（水分含量83.6%），添加菌株HT1的青贮料，其pH及氨态氮含量显著低于无添加的对照及在我国普遍使用的商品乳酸菌添加剂，而乳酸含量显著高于后两者，明显提高了两种水分含量黑麦草的发酵品质。
表3 45℃条件下添加乳酸菌HT1对黑麦草青贮发酵品质的影响
a-f表示同一列数据的差异（P < 0.05）； DM: 干重；cfu/g: 菌落形成单位；TN: 总氮；HT1 - L. rhamnosus HT1。
表4 15℃条件下添加乳酸菌HT1对黑麦草青贮发酵品质的影响
f表示同一列数据的差异（P < 0.05）； DM: 干重；cfu/g: 菌落形成单位；TN: 总氮；HT1 - L. rhamnosus HT1。
在15℃的低温条件下，同商品菌剂一样，HT1菌株也使新鲜黑麦草青贮料的pH、氨态氮含量、好气性细菌和酵母菌数量显著降低，乳酸含量显著增加，明显改善了低温条件下新鲜黑麦草的青贮发酵品质。在降低氨态氮含量方面，HT1菌株的效果还优于商品菌剂。但低温条件下，预干的黑麦草本身发酵品质较佳，无论是 HT1菌株还是商品菌剂，添加没有任何影响。
在水稻青贮中，添加HT1，除乙酸、氨态氮含量与对照无差异（P > 0.01）外，对全株水稻的其它青贮指标均有显著改善。与水稻用商品添加剂相比，添加HT1的青贮料具有较低的pH，其乳酸含量和乳酸乙酸比显著高于商品添加剂（P > 0.01）（表5）。可见，HT1对全株水稻的添加效果不仅优于对照，在某些指标上也比现有的水稻专用乳酸菌添加剂好。
表5添加乳酸菌对水稻青贮发酵品质的效果（30±6℃）
a-b表示同一列数据的差异（P < 0.05）；未检测到丙酸和丁酸；DM: 干重；cfu/g: 菌落形成单位；TN: 总氮；HT 1- L. rhamnosus。
以上结果表明，HT1菌株在高温条件下显著优于现有商品菌剂，即使在低温条件下，也具有与商品菌剂同样或以上的效果。
营养成分及青贮发酵指标测定方法如下：
1）新鲜材料营养成分及微生物分析：干物质（DM）含量采用70℃干燥法测定，粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定（定氮仪 KDN-103F，上海纤检仪器有限公司），粗纤维、中性洗涤纤维含量采用滤袋法测定，粗脂肪含量采用残余法测定（SLF-06，杭州托普仪器有限公司），粗灰分含量采用灼烧法测定（2003，张丽英）。可溶性碳水化合物（Water soluble-carbohydrates，WSC）含量采用蒽酮-硫酸法测定（1996，韩雅珊），氨态氮含量用凯氏定氮仪直接蒸馏测定，缓冲能采用盐酸、氢氧化钠滴定法测定，乳酸菌、细菌、酵母菌和霉菌数量分别采用MRS（de-Man Rogosa Sharpe）琼脂培养基、营养琼脂培养基（Nutrient ager，广东环凯微生物有限公司）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato-dextrose agar，广东环凯微生物有限公司）计数（1996，McDonald P.）。乳酸菌用厌氧箱37℃培养2 d～3 d；细菌、酵母菌、霉菌用生化培养箱30℃培养2 d～4 d。
2）发酵品质分析：青贮袋开封后，取20ｇ混匀的青贮料放入聚乙烯塑料封口袋中，加入80 mL 蒸馏水，在4℃下浸泡18 h后过滤，用pH计（PHS-3B，上海鹏顺科学仪器有限公司）测定浸提液pH值。乳酸菌、细菌、酵母菌和霉菌数量测定同鲜样相同，有机酸含量采用岛津LC-20AT型高效液相色谱仪测定：色谱条件：色谱柱（KC-811），流动相为3 mmol/L 的HClO4液，流速1 mL/min，柱温60℃，检测波长210 nm。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 耐高温乳酸菌株HT1及其在调制青贮饲料方面的应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 1435
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctaatacatg caagtcgaac gagttctgat tattgaaagg tgcttgcatc ttgatttaat 60
tttgaacgag tggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcccttaa gtgggggata 120
acatttggaa acagatgcta ataccgcata aatccaagaa ccgcatggtt cttggctgaa 180
agatggcgta agctatcgct tttggatgga cccgcggcgt attagctagt tggtgaggta 240
acggctcacc aaggcaatga tacgtagccg aactgagagg ttgatcggcc acattgggac 300
tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgca 360
agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggctttc gggtcgtaaa actctgttgt 420
tggagaagaa tggtcggcag agtaactgtt gtcggcgtga cggtatccaa ccagaaagcc 480
acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt atccggattt 540
attgggcgta aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc ctcggcttaa 600
ccgaggaagt gcatcggaaa ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat 660
gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg 720
tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga taccctggta 780
gtccatgccg taaacgatga atgctaggtg ttggagggtt tccgcccttc agtgccgcag 840
ctaacgcatt aagcattccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt 900
gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct 960
taccaggtct tgacatcttt tgatcacctg agagatcagg tttccccttc gggggcaaaa 1020
tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080
acgagcgcaa cccttatgac tagttgccag catttagttg ggcactctag taagactgcc 1140
ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg 1200
ctacacacgt gctacaatgg atggtacaac gagttgcgag accgcgaggt caagctaatc 1260
tcttaaagcc attctcagtt cggactgtag gctgcaactc gcctacacga agtcggaatc 1320
gctagtaatc gcggatcagc acgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380
ccgtcacacc atgagagttt gtaacacccg aagccggtgg cgtaaccctt ttagg 1435
Claims (2)
1.一种利用耐高温乳酸菌菌株HT1调制青贮饲料的方法，其特征包括以下步骤：①将待发酵饲料切断混合均匀；②每kg新鲜饲料加入菌株HT1 1.0×108 个或以上；③添加菌株HT1后的饲料密封后贮藏；
所述耐高温乳酸菌菌株HT1于2010年12月17日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO: 4483；
步骤③中所述菌株的生长温度为45℃；
所述待发酵饲料是未预干的黑麦草。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤①所述的待发酵饲料切断至1 cm～2 cm。
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