CN107653203A - 一种鼠李糖乳杆菌及其在制备饲料添加剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鼠李糖乳杆菌及其在制备饲料添加剂中的应用。本发明提供的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017，其保藏编号为CGMCC No.14463。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017可作为苜蓿青贮添加剂，该苜蓿青贮添加剂可以在苜蓿高水分状态下提高苜蓿青贮品质，有效地解决了高水分苜蓿的青贮难题，并提高了青贮品质。
Description
技术领域
本发明涉及青贮饲料质量安全领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌及其在制备饲料添加剂中的应用。
背景技术
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上最主要的豆科饲用作物，含有丰富的蛋白质、维生素等营养物质，适时收获利用，适口性好，营养价值高，含有动物生长发育必需的氨基酸、常量和微量矿物质元素、各种维生素以及未知生长于繁殖因子，能够显著的提升草食动物消化效率，提高畜产品产量和品质，对奶牛产业具有十分重要的作用，因此苜蓿还被成为“牛奶生产的第一车间”。
苜蓿中具有较高的蛋白质，具有牧草之王的美誉。现蕾末期至开花期刈割的苜蓿干草的蛋白质含量在16％以上，刈割较晚的苜蓿干草的蛋白质含量能达到12％-15％，蛋白质消化率达70％以上。苜蓿也是单位草地面积蛋白质产量最高的苜蓿之一，以每公顷产干草12.35t计算，每公顷可产蛋白质2017kg，相当于每公顷产4.942t大豆。除了具有很高的经济功能，苜蓿还具有生物固氮、恢复植被、保持水土及培肥地力等生态功能，种植苜蓿具有良好的生态效益和经济效益，还可以增加地表覆盖度，同时也帮助解决家畜饲草问题，减轻畜牧业生产给环境带来的生态压力。
我国是世界上苜蓿种植的主要国家之一，地理纬度处在北纬30-45°之间，是世界上最适宜种植苜蓿的地区。与小麦和玉米相比，种植苜蓿的纯收益与收益率最高且不断增加，种植和利用苜蓿可以为畜牧业带来很大的经济效益。苜蓿具有很大的研究和开发价值，亟需加大对苜蓿的研究和开发。
苜蓿草产品主要包括干草产品和青贮饲料两大类。然而在调制干草时，常常会因为雨淋、落叶、霉变等因素的影响，造成苜蓿干草营养价值的降低，损失率为20-30％。尤其是华北和东北等主产区，因为降雨和高温同期，在苜蓿收获季节因雨淋造成的损失率更高。相比之下，调制青贮可以减少气候条件引起的养分损失，而且青贮便于机械化操作。青贮饲料是指青贮容器中厌氧条件下，经发酵处理的饲料产品。其基本原理是青贮饲料中的乳酸菌等微生物在厌氧条件下，将可溶性碳水化合物(WSC)转化成有机酸，使pH值下降，从而达到保存青绿饲料的目的。青贮是保存苜蓿青绿多汁性能和营养成分，提高适口性、消化率和利用率的简易方法。苜蓿青贮饲料可以有效地解决草食畜饲料的来源，节约粮食资源和大量的饲料，对于苜蓿草的种植和奶牛业的发展具有极大的推动作用。
苜蓿含水量极高，可达到80％-90％，通常青贮原料的含水量在60％-70％之间时较易获得优质青贮饲料，水分过大会造成青贮加工过程中大量汁液流出，导致营养物质损失严重。而且苜蓿含糖量较低，缓冲能值较高，单位面积附着的乳酸菌数也较少，综合以上因素，苜蓿属于难于常规青贮的苜蓿原料。所以要获得优质苜蓿青贮饲料，通常采用田间凋蔫、使用必要的添加剂等手段来解决。另外，苜蓿单独青贮较难成功，通常会在生产中使用发酵促进剂、有害菌抑制剂、营养性添加剂等提供其青贮品质。
我国种植苜蓿的地区多为西北、华北、东北等地区，受我国季风性气候影响，东北华北黄淮海地区降雨量集中，苜蓿的收获时期为夏季，并伴随着雨季同期，苜蓿在调制干草的晾晒过程中雨淋会导致其发霉腐败并降低营养成分、并且在晾晒过程中落叶等因素会造成苜蓿营养物质的大量损失。在实际生产中，苜蓿但凡要经过晾晒都有被雨淋的风险，且在晾晒过程中的人工翻动会导致苜蓿叶片和茎秆的分离，同时翻晒作业时会带入土壤，使青贮原料收到污染，解决苜蓿雨季苜蓿的调制和安全贮藏仍是一个难题问题。苜蓿主要种植地区地区7、8月份天气变化无常，调制干草有一定的困难，当苜蓿收获后在田间来不及晾晒而又恰好雨天时，此时如何处理苜蓿能带来最大的经济效益减少农户的经济损失是一个值得探讨的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种鼠李糖乳杆菌及其在制备饲料添加剂中的应用。
本发明提供的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017，已于2017年07月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCCNo.14463。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017简称为鼠李糖乳杆菌YLGG2017。
本发明保护鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017在制备苜蓿青贮饲料中的的应用。
本发明还保护一种菌剂，是将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017与益生菌保护剂混合得到的。
所述菌剂具体可为将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017与益生菌保护剂混合冻干得到的。
每克所述菌剂中含1×1010-6×1010CFU鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)YLGG2017。
每克所述菌剂中含2.3×1010CFU鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017。
本发明还保护一种菌剂的制备方法，包括如下步骤：将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017与益生菌保护剂混合。
所述方法具体可为：将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017菌体与益生菌保护剂混合后冻干，得到所述菌剂。
所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017菌体的制备方法具体可为：将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017接种至MRS液体培养基中培养，培养结束时将培养体系离心，收集沉淀(鼠李糖乳杆菌YLGG2017菌体)。
所述方法中，培养结束时培养体系的OD600nm＝2.2。
所述方法中，接种后培养体系的初始OD600nm＝0.02。
所述方法中，培养条件为37℃、静置培养。
每克所述菌剂中含1×1010-6×1010CFU鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)YLGG2017。
每克所述菌剂中含2.3×1010CFU/g鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017。
以上任一所述益生菌保护剂具体可为脱脂奶。
所述脱脂奶具体可为将固态奶粉按10％质量体积比(w/v)溶解于水得到的。
所述固态奶粉具体可为高蛋白脱脂高钙奶粉，更具体可为购自内蒙古伊利实业集团股份有限公司，货号为6907992440071的高蛋白脱脂高钙奶粉。
本发明还保护所述菌剂在制备苜蓿青贮饲料中的的应用。
本发明还保护一种苜蓿青贮饲料的制备方法(方法甲)，包括如下步骤：将所述菌剂施加到苜蓿上，进行青贮，得到苜蓿青贮饲料。
所述方法甲中，所述苜蓿具体可为初花期紫花苜蓿。
所述方法甲中，所述苜蓿的含水量具体可为80.1％。
所述方法甲中，所述苜蓿经过预处理；所述预处理方法为：将苜蓿切碎至2-3cm。
所述方法甲中，将所述菌剂施加到苜蓿上前，包括如下步骤：将菌剂采用水溶解，室温活化25min。所述水为蒸馏水。
所述方法甲中，所述菌剂施加量为每克苜蓿接种8×105CFU的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017。
所述方法甲中，所述青贮的温度为30℃。所述青贮的时间为30天。
本发明还保护一种苜蓿青贮饲料的制备方法(方法乙)，包括如下步骤：将所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017施加到苜蓿上，进行青贮，得到苜蓿青贮饲料。
所述方法乙中，所述苜蓿具体可为初花期紫花苜蓿。
所述方法乙中，所述苜蓿的含水量具体可为80.1％。
所述方法乙中，所述苜蓿经过预处理；所述预处理方法为：将苜蓿切碎至2-3cm。
所述方法乙中，所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017的施加量为每克苜蓿接种8×105CFU的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017。
所述方法乙中，所述青贮的温度为30℃。所述青贮的时间为30天。
本发明还保护所述方法甲或所述方法乙制备得到的苜蓿青贮饲料。
本发明提供了一种鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017可作为苜蓿青贮添加剂，该苜蓿青贮添加剂可以在苜蓿高水分状态下提高苜蓿青贮品质，有效地解决了高水分苜蓿的青贮难题，并提高了青贮品质。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
MRS液体培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述MRS液体培养基中的浓度为：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、柠檬酸氢二铵2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温-801.0g/L、乙酸钠5.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L；所述溶剂为水。
苜蓿鲜草提取液培养基：1kg苜蓿鲜草，切碎加5L水中，50℃水浴2h，得到提取液；将提取液先用四层纱布过滤，然后用定量滤纸(杭州特种纸业有限公司，新星201型)过滤，收集滤液；将滤液121℃高压灭菌15分钟，然后分装到已灭菌的试管中备用。
脱脂奶：固态奶粉按10％质量体积比(w/v)溶解于蒸馏水。
固态奶粉：高蛋白脱脂高钙奶粉，内蒙古伊利实业集团股份有限公司，货号：6907992440071。
实施例1、鼠李糖乳杆菌的分离筛选和鉴定
一、菌株的分离筛选
采集苜蓿青贮，将苜蓿青贮取20g加入180ml生理盐水，浸泡2h，将浸出液过滤后，用振荡器震荡30min，10-1-10-6梯度稀释，分别从各稀释梯度稀释液中取1mL接种至培养皿中，加入10-15ml灭菌后的MRS固体培养基，摇匀，待其冷却凝固，静置厌氧培养48h。挑取菌落形态、大小、颜色和光泽度有明显差别的单菌落，重复划线，并直至得到纯菌落。挑取单菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验。凡是革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性的菌株初步认定为乳酸菌，然后用苜蓿鲜草提取液培养基筛选出一株生长能力和产酸能力高的乳酸菌，命名为菌株YLGG2017，其生长能力和产酸能力如表1所示。
菌株生长能力和产酸能力的测定方法：将待测菌株接种到10mL的MRS液体培养基中，培养2代后按3％(体积比)的接种量接种到苜蓿鲜草提取液培养基中，37℃、250rpm振荡培养。每间隔12h取出一次培养的样品，取3次，最后一次为培养36h后取样，所有样品在波长620nm下测量样品的吸光度值，并测定发酵液的pH值。以未接种菌株的苜蓿提取液培养基为对照，比较不同菌株在苜蓿提取液培养基中振荡培养36h内在波长620nm下的吸光度值与对照之间的最大差值，以及发酵液的pH值与对照之间的最大差值，筛选出吸光度值升高最大，pH值下降最大的乳酸菌菌株。
表1菌株YLGG2017的生长能力和产酸能力
| \ | 生长能力a | 产酸能力b |
| 菌株YLGG2017 | 1.83 | 2.31 |
注：a，乳酸菌菌株在苜蓿提取液培养基中培养36h内在波长620nm下的吸光度值与对照之间的最大差值；b，乳酸菌菌株在苜蓿提取液培养基中培养36h内发酵液的pH值与对照之间的最大差值。
二、菌株YLGG2017的鉴定
菌株YLGG2017生物学特性：菌株YLGG2017在MRS固体培养基上培养24h，菌株生长良好，可形成边缘整齐的乳白色菌落；菌株革兰氏染色呈阳性，显微镜下的细胞形态为短杆状、无芽孢；氧化酶阴性，在苜蓿提取液培养基中具有较强的生长及产酸性能。
将菌株YLGG2017的16S rDNA序列进行扩增并测序，测序结果如序列表的序列1所示。16s rDNA鉴定结果显示菌株与NCBI数据库中的多株鼠李糖乳杆菌的相似性为99％。
经过以上鉴定，可以确定菌株YLGG2017属于鼠李糖乳杆菌，因此重新将其命名为鼠李糖乳杆菌YLGG2017。
三、鼠李糖乳杆菌YLGG2017的保藏
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017，已于2017年07月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.14463。鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017简称为鼠李糖乳杆菌YLGG2017。
实施例2、鼠李糖乳杆菌制备苜蓿青贮饲料
一、苜蓿青贮菌剂制备
1、将鼠李糖乳杆菌YLGG2017接种至15mlMRS液体培养基中，37℃静置培养48h，得到种子液(OD600nm＝1.864)。
2、将0.5μl步骤1得到的种子液接种至15mlMRS液体培养基(初始OD600nm＝0.02)，37℃静置培养24h，得到菌悬液(OD600nm＝2.2)。
3、将步骤2得到的菌悬液8000rpm离心15min收集菌体，将菌体采用生理盐水反复洗涤。
4、将步骤3处理后的菌体沉淀与10ml灭菌后的脱脂奶混匀后冻干，得到苜蓿青贮菌剂(菌剂中包含2.3×1010CFU/g的鼠李糖乳杆菌YLGG2017)。
二、苜蓿青贮饲料的制备
1、紫花苜蓿在初花期进行刈割和切短，切短长度为2-3cm。不经任何萎焉处理，含水量为80.1％。
2、取步骤一当日制备的苜蓿青贮菌剂，按每克苜蓿草接种8×105CFU的鼠李糖乳杆菌YLGG2017，加5ml蒸馏水于室温下溶解活化25min，全部均匀喷洒到苜蓿上，对照组(CK)使用相同量的无菌水处理，采用聚乙烯袋(180×260mm)抽真空密封制作苜蓿青贮，每袋约250g，然后贮藏在30℃的恒温箱中，青贮30天。
实施例3、苜蓿青贮饲料的检测
取实施例2得到的苜蓿青贮饲料进行如下检测：
1、取苜蓿青贮饲料样品，65℃烘箱中干燥48h，根据失重计算苜蓿青贮饲料含水量。
2、取苜蓿青贮饲料样品，65℃烘箱中干燥48h，检测水溶性碳水化合物含量、粗蛋白含量、还原性糖含量、游离氨基酸含量、中性洗涤纤维(NDF)含量和酸性洗涤纤维(NDF)含量。
水溶性碳水化合物采用蒽酮一硫酸比色法测定。
粗蛋白采用凯氏定氮法测定(F0SS公司全自动凯氏定氮仪)。
还原性糖采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定。
游离氨基酸采用茚三酮比色法测定。
中性洗涤纤维(NDF)含量和酸性洗涤纤维(NDF)含量采用Van Soest法测定。
3、准确称取20g苜蓿青贮饲料样品，加入180mL蒸馏水，搅拌均匀，先后用4层纱布和定性滤纸(杭州特种纸业有限公司，新星102)过滤，收集滤液。两次过滤，得到浸提液。
4、测量步骤3得到的浸提液的pH值和和氨态氮(NH3-N)。
pH值使用雷磁PHS-25型pH仪测定。
氨态氮含量采用苯酚-次氯酸钠比色法测定。
5、取苜蓿青贮饲料样品，参照文献(Licitra,G,T M Hernandez,P J VanSoest.Standardization of procedures for nitrogenfractionation of ruminantfeeds.Animal Feed Science and Technology,1996,57:347～358)中的方法检测非蛋白氮占粗蛋白的百分比，参照文献(Sniffen C J,O'connor J D,Van Soest P J,et al.Anet carbohydrate and protein system for evaluating cattle diets:II.Carbohydrate and protein availability[J].Journal of Animal Science.1992,70(11):3562～3577)中的方法检测快速降解蛋白、中速降解蛋白、慢速降解蛋白和结合蛋白质占粗蛋白的百分比。
结果如表2和表3所示。
表2鼠李糖乳杆菌YLGG2017对青贮苜蓿饲料发酵青贮品质的影响
表3鼠李糖乳杆菌YLGG2017对青贮苜蓿饲料康奈尔净碳水化合物蛋白质体系
的影响
| 指标 | 对照 | 鼠李糖乳杆菌 |
| 非蛋白氮(占粗蛋白的百分比) | 65.80 | 60.58 |
| 快速降解蛋白(占粗蛋白的百分比) | 3.49 | 3.77 |
| 中速降解蛋白(占粗蛋白的百分比) | 20.40 | 24.81 |
| 慢速降解蛋白(占粗蛋白的百分比) | 3.46 | 5.69 |
| 结合蛋白质(占粗蛋白的百分比) | 6.39 | 5.15 |
上述结果表明，添加鼠李糖乳杆菌YLGG2017可以降低苜蓿青贮的pH值。添加鼠李糖乳杆菌YLGG2017的苜蓿青贮非蛋白氮和不可利用蛋白的含量与对照组相比降低，中速降解蛋白含量与对照组相比提高，说明鼠李糖乳杆菌YLGG2017可以提高苜蓿蛋白组分在反刍动物瘤胃中的利用率。
<110> 中国农业大学
<120> 一种鼠李糖乳杆菌及其在制备饲料添加剂中的应用
<160> 1
<210> 1
<211> 1460
<212> DNA
<213> 鼠李糖乳杆菌
<400> 1
cgctgctatg atgcagtcga cgagttctga ttattgaaag gtgcttgcat cttgatttaa 60
ttttgaacga gtggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgccctta agtgggggat 120
aacatttgga aacagatgct aataccgcat aaatccaaga accgcatggt tcttggctga 180
aagatggcgt aagctatcgc ttttggatgg acccgcggcg tattagctag ttggtgaggt 240
aacggctcac caaggcaatg atacgtagcc gaactgagag gttgatcggc cacattggga 300
ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacgc 360
aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggcttt cgggtcgtaa aactctgttg 420
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cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tatccggatt 540
tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cctcggctta 600
accgaggaag tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca 660
tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg 720
gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga acaggattag ataccctggt 780
agtccatgcc gtaaacgatg aatgctaggt gttggagggt ttccgccctt cagtgccgca 840
gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat 900
tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc 960
ttaccaggtc ttgacatctt ttgatcacct gagagatcag gtttcccctt cgggggcaaa 1020
atgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc 1080
aacgagcgca acccttatga ctagttgcca gcatttagtt gggcactcta gtaagactgc 1140
cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg 1200
gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga gaccgcgagg tcaagctaat 1260
ctcttaaagc cattctcagt tcggactgta ggctgcaact cgcctacacg aagtcggaat 1320
cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg 1380
cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc gaagccggtg gcgtaaccct tttagggagc 1440
gagccgtcta agtgacaaat 1460
Claims (9)
1.鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017，其保藏编号为CGMCCNo.14463。
2.鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017在制备苜蓿青贮饲料中的的应用。
3.一种菌剂，是将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017与益生菌保护剂混合得到的。
4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于：每克所述菌剂中含1×1010-6×1010CFU鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017。
5.一种菌剂的制备方法，包括如下步骤：将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)YLGG2017与益生菌保护剂混合。
6.权利要求3或4所述的菌剂在制备苜蓿青贮饲料中的的应用。
7.一种苜蓿青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：将权利要求3或4所述的菌剂施加到苜蓿上，进行青贮，得到苜蓿青贮饲料。
8.一种苜蓿青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)YLGG2017施加到苜蓿上，进行青贮，得到苜蓿青贮饲料。
9.权利要求7或8所述的方法制备得到的苜蓿青贮饲料。
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