CN105567585A - 一种青贮用复合微生物菌剂及其在全株玉米青贮中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了<b>一种青贮用复合微生物菌剂及其在全株玉米青贮中的应用</b>，它是由乳酸片球菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌三种微生物菌剂按质量分数比为1：10-1：10-1混合组成，复合菌剂菌落总数为1.0-9.9×109CFU/ml。该复合微生物菌剂以50-200mL/t的剂量应用于全株玉米青贮中，提高了青贮玉米适口性，有效降低了干物质、蛋白和淀粉损失以及全株玉米青贮中中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量，提高了乳酸在总有机酸中所占的比例，降低了乙酸、丙酸和丁酸所占比例，在一定程度上改善了青贮发酵品质。本发明充分利用了微生物发酵的优势，具有绿色无污染、高效、成本低的特点，可降低青贮物料营养损失、改善其发酵品质，最终达到有效保存青贮物料的效果。
Description
技术领域
本发明公开了一种青贮用复合微生物菌剂及其在全株玉米青贮中的应用，属于家畜饲料中的青贮饲料加工技术领域。
背景技术
青贮是一种可以长期保存青绿饲草饲料作物的有效方法，近年来被应用于养殖领域尤指奶牛养殖领域，用来贮存全株玉米、玉米秸秆、高粱、苜蓿、黑麦草等饲草饲料作物。青贮饲料具有营养丰富、适口性好、易消化等特点，可提高奶牛产奶量、减少疾病发生，同时可实现一年四季均衡供应，以保障奶业健康快速可持续发展，是目前我国奶牛养殖重要的优质粗饲料来源。目前我国利用较多的主要是全株玉米、玉米秸秆和苜蓿青贮，其中全株玉米青贮技术较为成熟，但仍普遍存在水分含量高、养分流失严重等问题；玉米秸秆青贮水分含量合理但其营养成分相对较差且难以利用；苜蓿青贮因水溶性碳水化合物含量低缓冲度高，青贮难度较大，品质较差，尤其是蛋白损失严重。
研究表明，在青贮过程中加入青贮添加剂可以提高青贮发酵品质、降低青贮物料损失，同时有研究表明添加剂的使用对奶牛乳成分影响不大。微生物添加剂是青贮添加剂的一种，可有目的地调节青贮料内微生物区系，调控青贮发酵过程，以有效保存青贮物料的营养物质。近年来，绿色无污染的微生物添加剂因具有成本低、应用方便等特点，克服了其它青贮添加剂具有腐蚀性、家畜采食安全隐患、添加量大和成本高等缺陷，其研究和应用在世界各国受到高度重视。目前已有许多有关微生物青贮添加剂方面的报道，认为乳酸杆菌在青贮发酵全过程保持了高水平的乳酸杆菌数，可促进乳酸菌发酵、改善青贮饲料发酵品质，而乳酸球菌在发酵初期旺盛繁殖，可有效抑制杂菌生长。考虑到凝结芽孢杆菌也具有产酸抑制杂菌生长、消除臭味和降解粗纤维等功能，且有关乳酸片球菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌混合作为一种微生物青贮添加剂的研究未见报道，本发明人以上述三种微生物混合而成的复合微生物菌剂为研究对象，研究其作为青贮添加剂在全株玉米青贮中的应用效果。
发明内容
本发明人经过查阅相关文献以及开展一系列相关试验，发现凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌和乳酸片球菌组成的复合微生物菌剂在提高青贮发酵品质方面具有较好效果，可以应用于全株玉米青贮中。
本发明的技术方案如下：
一种用于青贮的复合微生物菌剂，其特征在于它是由乳酸片球菌（菌种保藏号：CGMCC1.4）、植物乳杆菌（菌种保藏号：ACCC11016）、凝结芽孢杆菌（菌种保藏号：ACCC10229）三种微生物菌剂按重量分数比为1：10-1：10-1混合组成，复合菌剂菌落总数为1.0-9.9×109CFU/ml。其中用于全株玉米青贮，添加剂量为50-200mL/t。各组成部分均具有产酸抑制杂菌生长，加快发酵的作用。
本发明进一步公开了复合微生物菌剂的制备方法：乳酸片球菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌三个菌种分别活化后培养于MRS液体培养基上，10%接种量37℃培养48h按比例（1：10-1：10-1）于MRS培养基混合，菌剂菌落总数为1.0-9.9×109CFU/ml。所述的微生物菌剂和MRS培养基均为市售。
复合微生物菌剂在全株玉米青贮过程中的使用方法：在青贮物料装窖的过程中，分层按50-200mL/t的添加剂量将复合微生物菌剂均匀喷洒于粉碎好的适时收获的全株玉米上，同时均匀添加麸皮（10kg/t）和食盐（9kg/t），压实、密封，15天后即可开窖使用，使用过程中应上下垂直取料，以避免暴露于空气中的面积太大，尽可能减少有氧损失。
本发明更进一步公开了复合微生物菌剂在提高青贮物料适口性、降低青贮物料营养损失并改善其发酵品质以达到有效保存青贮物料方面的应用，特别是在全株玉米青贮过程中的应用。
实验结果显示：
（1）复合微生物菌剂处理全株玉米青贮在感官评价上具有较强的芳香味或酸香味，可以使茎叶结构保持良好，而不添加复合微生物菌剂的对照组酸香味较弱，有的甚至有较强的氨味且有轻度霉菌污染，即复合微生物菌剂在一定程度上提高了全株玉米青贮的适口性；
（2）复合微生物菌剂处理全株玉米青贮降低了干物质、蛋白和淀粉损失以及中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量，与不添加复合微生物菌剂的对照组相比，减少了全株玉米青贮的营养损失提高其可消化性；
（3）与不添加复合微生物菌剂的对照组相比，复合微生物菌剂处理全株玉米青贮在一定程度上增加了乳酸在总有机酸中所占比例而减少了乙酸、丙酸和丁酸所占比例，即改善了全株玉米青贮的发酵品质。
本发明所述的复合微生物菌剂在全株玉米青贮中的应用实验方法如下：
材料和方法：
单独制备乳酸片球菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌稀释液，以1:1:1的比例混合成菌落总数为1.0×109CFU/ml的复合菌剂。
通过联合收割机对全株玉米进行收获并切碎，准备1.5L发酵罐，按每罐1.5kg粉碎全株玉米制作青贮，处理组为复合菌剂150μL（即添加剂量为100mL/t）+15g麸皮（10kg/t）+13.5g食盐（9kg/t），对照组添加150μL蒸馏水替换复合菌剂，将添加物与全株玉米混匀后置于发酵罐中，压实密封，15d后对青贮样品进行感官评定（气味、质地和色泽，评分标准详见表1）和青贮发酵品质指标测定，主要包括pH值、黄曲霉毒素、干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、淀粉、氨态氮、乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量。数据结果以“均值±标准差”表示，并通过SPSS20.0进行方差分析。
表1.青贮物料感官评分标准
结果：根据感官（气味、质地和色泽）评价，复合微生物菌剂处理全株玉米青贮在感官评价上具有较强的芳香味或酸香味，可以使茎叶结构保持良好，而不添加复合微生物菌剂的对照组酸香味较弱，有的甚至有较强的氨味且有轻度霉菌污染，二者总评分平均值分别为12分和4分，根据青贮评分标准，微生物组属于2级尚好，而对照组属于4级腐败说明复合微生物菌剂在一定程度上提高了全株玉米青贮的适口性；黄曲霉毒素分析结果表明，无论是微生物组还是对照组均未超出国家标准（10ppb）。
全株玉米青贮发酵品质结果分析详见表2，微生物组干物质、粗蛋白和淀粉含量分别高于对照组10.127%（p<0.01）、6.573%（p<0.05）和13.418%（p<0.05），而中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量则分别低于对照组15.933%（p<0.05）和18.508%（p<0.01）；pH值、黄曲霉毒素、氨态氮以及乙酸、丙酸和丁酸占总有机酸的比例均表现为微生物组低于对照组，而乳酸占总有机酸的比例则是微生物组高于对照组，但差异均未达显著水平。
根据隶属函数法对上述指标进行综合分析，全株玉米青贮效果复合微生物组显著优于对照组，而变异系数（8.502%）远低于对照组（59.772%），说明复合微生物处理全株玉米青贮的发酵品质整体表现较为稳定。
表2.对照组和复合微生物组全株玉米青贮发酵品质相关指标方差分析表
注：**表示p<0.01，*表示p<0.05。
结论：与对照组相比，复合微生物组全株玉米青贮发酵品质极显著优于对照组，可显著降低干物质、蛋白和淀粉损失以及中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量，并在一定程度上增加了乳酸在总有机酸中所占比例而减少了乙酸、丙酸和丁酸所占比例。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用到的试剂均有市售,其中包括乳酸片球菌（菌种保藏号：CGMCC1.4）、植物乳杆菌（菌种保藏号：ACCC11016）、凝结芽孢杆菌（菌种保藏号：ACCC10229）以及MRS液体培养基。
实施例1：
材料和方法：
单独制备乳酸片球菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌稀释液，分别以质量分数1:1:1、1:1:10和1:10:10的比例混合成菌落总数为1.0×109CFU/ml的复合菌剂，分别标记为复合菌剂I组、II组和III组。
通过联合收割机对乳熟末期玉米收获并切碎，准备1.5L发酵罐，按每罐1.5kg粉碎全株玉米制作青贮，处理组分别为复合菌剂I组、II组和III组各150μL（100mL/t）+15g麸皮（10kg/t）+13.5g食盐（10kg/t），对照组添加150μL蒸馏水替换复合菌剂，将添加物与全株玉米混匀后置于发酵罐中，压实密封，15d后对青贮样品进行感官（气味、质地和色泽）评定和青贮发酵品质各指标测定，主要包括pH值、黄曲霉毒素、干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、淀粉、乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量。数据结果以“均值±标准差”表示，并通过SPSS20.0进行多重比较。
结果：
根据感官（气味、质地和色泽）评价，复合微生物菌剂处理全株玉米青贮在感官评价上具有较强的芳香味或酸香味，可以使茎叶结构保持良好，而不添加复合微生物菌剂的对照组酸香味较弱，有的甚至有较强的氨味且有轻度霉菌污染，复合微生物I组、II组、III组和对照组总评分平均值分别为12分、17分、15分和4分，根据青贮评分标准，微生物I组、II组和III组均属于2级尚好或1级优良，而对照组属于4级腐败，说明复合微生物菌剂在一定程度上提高了全株玉米青贮的适口性；黄曲霉毒素分析结果表明，无论是微生物组还是对照组均未超出国家标准（10ppb）。
全株玉米青贮发酵品质多重比较结果分析详见表3，与对照组相比，复合微生物I组、II组和III组干物质含量比对照组增加了10.127%（p<0.01）、10.127%（p<0.01）和4.219%（p>0.05）；粗蛋白含量分别增加了6.573%（p<0.05）、2.381%（p>0.05）和4.494%（p<0.05）；酸性洗涤纤维分别降低了18.508%（p<0.05）、9.730%（p>0.05）和17.842（p<0.05）；淀粉含量分别提高了13.418%（p<0.05）、9.541%（p<0.05）和10.301%（p<0.05）。而中性洗涤纤维在复合微生物I组比II组、III组和对照组分别降低了18.066%（p<0.05）、12.389%（p>0.05）和15.933%（p<0.05），复合微生物II组、III组与对照组无显著差异；pH值、黄曲霉毒素、乳酸和丁酸含量在各组之间差异均未达显著水平，故数据未在表中列出。
根据上述指标的综合隶属函数比较全株玉米青贮发酵品质结果为：微生物I组>微生物II组>微生物III组>对照组，其中微生物组与对照组差异均达到显著水平，各自的变异系数依次为4.247%、37.971%、33.179%和73.773%，说明全株玉米青贮发酵品质整体表现的稳定性微生物I组最高而对照组最低。
表3.对照组和复合微生物组全株玉米青贮发酵品质相关指标多重比较表
注：不同的小写字母表示处理间在p<0.05范围内存在显著差异。
结论：
总体而言，无论是复合微生物I组（乳酸片球菌：植物乳杆菌：凝结芽孢杆菌=1:1:1）、II组（乳酸片球菌：植物乳杆菌：凝结芽孢杆菌=1:1:10）还是III组（乳酸片球菌：植物乳杆菌：凝结芽孢杆菌=1:10:10）处理全株玉米青贮，均可不同程度提高其适口性、降低干物质、蛋白和淀粉损失以及中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量，整体效果显著优于对照组。
实施例2：
材料和方法：
单独制备乳酸片球菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌稀释液，以质量分数1:1:1的比例混合成菌落总数为5.0×109CFU/ml的复合菌剂。
通过联合收割机对乳熟末期玉米收获并切碎，准备1.5L发酵罐，按每罐1.5kg粉碎全株玉米制作青贮，处理组分别为复合菌剂剂量I（乳酸片球菌：植物乳杆菌：凝结芽孢杆菌=1：1：1）75μL（50mL/t）、复合菌剂剂量II150μL（100mL/t）和复合菌剂剂量III300μL（200mL/t）+15g麸皮（10kg/t）+13.5g食盐（9kg/t），对照组添加150μL蒸馏水替换复合菌剂，将添加物与全株玉米混匀后置于发酵罐中，压实密封，15d后对青贮样品进行感官（气味、质地和色泽）评定和青贮发酵品质各指标测定，主要包括pH值、黄曲霉毒素、干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、淀粉、乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量。数据结果以“均值±标准差”表示，并通过SPSS20.0进行多重比较。
结果：
根据感官（气味、质地和色泽）评价，复合微生物菌剂三个剂量处理全株玉米青贮在感官评价上具有较强的芳香味或酸香味，可以使茎叶结构保持良好，而不添加复合微生物菌剂的对照组酸香味较弱，有的甚至有较强的氨味且有轻度霉菌污染，复合微生物剂量I组、II组、III组和对照组总评分平均值分别为11分、12分、20分和4分，根据青贮评分标准，微生物组均属于1级优良或2级尚好，而对照组属于4级腐败，说明复合微生物菌剂三个剂量均在一定程度上提高了全株玉米青贮的适口性；黄曲霉毒素分析结果表明，无论是微生物组还是对照组均未超出国家标准（10ppb）。
全株玉米青贮发酵品质多重比较结果分析详见表4，与对照组相比，复合微生物III（300μL）组、II（150μL）组、I（75μL）组干物质含量分别增加了5.907%（p<0.05）、10.127%（p<0.01）和5.907%（p<0.05）；粗蛋白分别增加了1.708%（p>0.05）、6.573%（p<0.05）和4.712%（p>0.05）；中性洗涤纤维含量分别降低了7.926%（p>0.05）、18.066%（p<0.05）和2.022%（p>0.05）；酸性洗涤纤维分别降低了11.581%（p<0.05）、18.508%（p<0.05）和4.855%（p>0.05）。淀粉含量微生物III组和II组较对照组分别提高了6.717%（p>0.05）和13.418%（p<0.05），而微生物I组与对照组无显著差异；pH值、黄曲霉毒素、乳酸和丁酸含量在各组之间差异均未达显著水平，故数据未在表中列出。
根据上述指标的综合隶属函数比较全株玉米青贮发酵品质结果为：复合微生物III组>II组>I组>对照组，其中III组和II组显著高于后二者，后二者差异未达显著水平，各自的变异系数依次为14.061%、5.364%、25.316%和82.427%，说明全株玉米青贮发酵品质整体表现的稳定性微生物剂量II组（150μL）最高而对照组最低。
表4.对照组和复合微生物组全株玉米青贮发酵品质相关指标多重比较表
注：不同的小写字母表示处理间在p<0.05范围内存在显著差异。
结论：
复合微生物处理全株玉米青贮发酵品质存在剂量效应，与对照组相比，75μL组优于对照组，显著降低了干物质损失，其他指标虽也优于对照组，但未达显著水平；150μL组和300μL组处理效果显著优于对照组，显著降低了干物质、蛋白和淀粉损失以及中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量。
实施例3：
材料和方法：
复合微生物菌剂制备方法：乳酸片球菌（菌种保藏号：CGMCC1.4）、植物乳杆菌（菌种保藏号：ACCC11016）、凝结芽孢杆菌（菌种保藏号：ACCC10229）三个菌种分别活化培养于MRS液体培养基上，10%接种量37℃培养48h后混合于MRS培养基，以质量分数1:6:9的比例混合成复合微生物菌剂，其菌落总数为9.0×109CFU/ml。所有菌剂和MRS培养基均为市售。
使用方法：在青贮物料装窖的过程中，分层按150mL/t的添加剂量将复合微生物菌剂均匀喷洒于粉碎好的适时收获的全株玉米上，同时均匀添加麸皮（10kg/t）和食盐（9kg/t），压实、密封，15天后即可开窖使用，以未添加复合微生物菌剂为对照。
样品采集：开窖后以9点取样法进行青贮样品采集，除去上部料层50cm，在距离青贮窖两壁及青贮窖底各30cm处做四边形，再将各边中点相连，在各线相交点以各点为中心采样，用灭菌锐刀割取20cm*20cm*20cm饲料块，分装于自封袋中。
进行感官（气味、质地和色泽）评定和青贮发酵品质各指标测定，主要包括pH值、黄曲霉毒素、干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、淀粉、乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量。数据结果以“均值±标准差”表示。
结果：
根据感官（气味、质地和色泽）评价，全株玉米青贮在感官评价上具有较强的芳香味或酸香味，可以使茎叶结构保持良好，9个样品评分平均值分别为15.667分，根据青贮评分标准，属于1级优良，适口性佳；经分析，黄曲霉毒素未超出国家标准（10ppb）。
该应用中全株玉米青贮发酵品质相关指标详见表5，所采集的9个样品的变异系数除丙酸和丁酸占总有计算比例超过30%以外，其他指标变异系数均较低，说明青贮窖内全株玉米青贮均一度较高。依据表5中pH、干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、淀粉和乳酸占总有机酸比例可知，乳酸片球菌（菌种保藏号：CGMCC1.4）、植物乳杆菌（菌种保藏号：ACCC11016）、凝结芽孢杆菌（菌种保藏号：ACCC10229）三个菌种以质量分数1：6：9的比例按150mL/t的添加剂量制作全株玉米青贮，效果良好，青贮品质佳。
表5.全株玉米青贮发酵品质相关指标
Claims (6)
1.一种用于青贮的复合微生物菌剂，其特征在于它是由乳酸片球菌（菌种保藏号：CGMCC1.4）、植物乳杆菌（菌种保藏号：ACCC11016）、凝结芽孢杆菌（菌种保藏号：ACCC10229）三种微生物菌剂按重量分数比为1：10-1：10-1混合组成，复合菌剂菌落总数为1.0-9.9×109CFU/ml。
2.权利要求1所述复合微生物菌剂，其中用于全株玉米青贮，添加剂量为50-200mL/t。
3.权利要求1所述复合微生物菌剂的制备方法：它是将乳酸片球菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌三个菌种分别活化后培养于MRS液体培养基上，10%接种量37℃培养48h后按质量分数比为1：10-1：10-1混合于MRS培养基上，复合微生物菌剂菌落总数为1.0-9.9×109CFU/ml。
4.权利要求1所述复合微生物菌剂在全株玉米青贮过程中的使用方法：在青贮物料装窖的过程中，分层按50-200mL/t的添加剂量将复合微生物菌剂均匀喷洒于粉碎好的适时收获的全株玉米上，同时均匀添加麸皮（10kg/t）和食盐（9kg/t），压实、密封，15天后即可开窖使用，使用过程中应上下垂直取料，以避免暴露于空气中的面积太大，尽可能减少有氧损失。
5.权利要求1所述复合微生物菌剂在提高青贮物料适口性、降低青贮物料营养损失、改善发酵品质以达到有效保存青贮物料方面的应用。
6.权利要求1所述复合微生物菌剂在全株玉米青贮方面的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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