CN107354115A - 用于青贮饲料发酵的植物乳杆菌 - Google Patents

用于青贮饲料发酵的植物乳杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物应用技术领域，具体而言，涉及一种用于青贮饲料发酵的植物乳杆菌。该植物乳杆菌Bn‑20，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.13657，保藏日期：2017年02月10日。该植物乳杆菌Bn‑20制成的微生物菌剂可很好地用于青贮发酵饲料的制备。

Description

用于青贮饲料发酵的植物乳杆菌
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体而言，涉及一种用于青贮饲料发酵的植物乳杆菌。
背景技术
青贮饲料是将青绿饲料经切碎后，在密闭缺氧的条件下，通过厌氧乳酸菌的发酵作用，抑制各种杂菌的繁殖，而得到的一种粗饲料。青贮饲料气味酸香、柔软多汁、适口性好、营养丰富、利于长期保存是家畜优良饲料来源。
随着我国奶牛养殖业的迅速发展，在青贮中使用发酵添加剂越来越普遍。最初在青贮中使用添加剂的目的，在于保证乳酸菌繁殖条件，促进青贮发酵，从而使青贮饲料保存良好。而添加微生物让青贮发酵从自然发酵发展到定向发酵,从不可控制走向可控制起到了关键作用。目前，从青贮添加剂的应用进展来看,控制青贮发酵仍是重要目的之一，但选用适宜的添加剂以改善青贮饲料的营养价值,也越来越受到重视。2015年中央1号文件提出“支持青贮玉米和苜蓿等饲草料种植”。
2016年中央财政在农业结构调整方面，将加大支持力度，将“粮改饲”试点范围扩大，试点县从30个增加到100个，到2020年，青贮玉米面积预计将达到2500万亩。
我国年产各种农作物秸秆近6亿吨，相当于天然草地生产野干草的几十倍。但秸秆饲料质地粗硬，木质化的粗纤维素含量高，适口性差，营养价值低，利用效果不佳。而玉米秸秆经过本农青贮发酵剂处理后，每吨秸秆饲料相当于270千克粮食饲料的营养价值，从而扩大饲料来源，节约粮食饲料，其经济和社会效益可观。
青贮饲料就是乳酸菌发酵饲料，自然青贮就是利用自然界植物上存在的乳酸菌进行发酵，由于自然界植物上的乳酸菌含量少，仅占细菌总数的0.01～1％。所以在发酵过程中，乳酸菌很难迅速的形成优势菌群，不能在短时间内降低pH值。其结果：一是各种细菌都在生长繁殖使温度迅速上升，造成预备发酵期延长。二是预备发酵过程中，青贮料因发热造成大量的营养成分和能量的损失，还造成气味刺鼻、适口性差的状况。三是在发酵过程中霉菌和腐败菌的大量繁殖，造成青贮料局部发霉和腐烂，特别是顶部、底部和边沿霉变、腐烂情况严重。四是由于有大量的杂菌存在，在青贮料开窖时，很容易形成二次发酵，在取食截面上新发生霉斑或者成片发霉，情况不好时会造成彻底霉变、腐烂。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植物乳杆菌，以及包含该菌株的微生物菌剂和该菌剂的使用方法，以解决上述问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一株细菌菌株，所述菌株为植物乳杆菌Bn-20，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.13657，保藏日期：2017年02月10日。
该菌株的拉丁学名为Lactobacillus plantarum，中文学名为植物乳杆菌，菌株名为Bn-20。
该菌株具有高效的青绿作物降解功能。
上述的经过分离纯化的植物乳杆菌，其菌落特征为表面菌落直径约3mm，凸起，呈圆形，表面光滑，细密，色白，偶尔呈浅黄或深黄色。
含有所述植物乳杆菌Bn-20的微生物菌剂也属于本发明要求保护的范围。对于该菌株而言，考虑到应用时的秸秆降解效率及其可能需要运输等原因，有必要将其扩大培养制成微生物菌剂的形式以扩大其应用范围。
优选的，如上所述的微生物菌剂，所述微生物菌剂为液体菌剂，且在该液体菌剂中，植物乳杆菌Bn-20的活菌的数量≥2×109CFU/ml；更优选的植物乳杆菌Bn-20的活菌的数量为2×1010CFU/ml～1×1012CFU/ml；或1×1011CFU/ml，或3×1010CFU/ml～9×1010CFU/ml，或5×1010CFU/ml～7×1010CFU/ml。
本发明还涉及所述的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将所述微生物菌剂接种于液体培养基中进行培养得到发酵液；
可选的，将所述发酵液pH值调整为6.5～7.5,冷冻干燥即得。
优选的，如上所述的微生物菌剂的制备方法，所述液体培养基为MRS培养基；
优选的，所述培养的条件为35℃～40℃培养6h～12h。
本发明还涉及一种青贮饲料的制备方法，向青绿作物中添加如上所述的微生物菌剂进行厌氧发酵。
优选的，如上所述的制备方法，所述青绿作物在添加所述微生物菌剂前经过粉碎处理，粉碎大小为1～2厘米。
优选的，如上所述的制备方法，所述微生物菌剂的添加量为1吨所述青绿作物中添加0.8～1.2g所述微生物菌剂。
优选的，如上所述的制备方法，所述厌氧发酵的发酵条件为：
水分60％～75％，环境温度≥15℃，优选25℃～40℃；
优选的，发酵时间：夏季3～5天，春秋7～10天，冬季20天以上。
优选的，如上所述的制备方法，所述青绿作物包括农作物产品、副产品以及牧草；
更优选的，所述农作物产品包括饲用玉米；
更优选的，所述副产品包括玉米秸、麦秸以及地瓜秧；
更优选的，所述牧草包括豆科(如苜蓿等)或禾本科牧草。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、本发明提供的植物乳杆菌分离自不含有任何添加剂的青贮饲料。秸秆类植物青贮过程中，其表面带有的乳酸菌起到不可替代的作用，在青贮饲料中可能存在优良的青贮用乳酸菌，且由于其附生于植物表面，更能适应青贮环境。
2)、本发明提供的植物乳杆菌可利用青贮中的碳水化合物迅速发酵，繁殖快，成酸作用强，具有很好的抗腐败防霉能力。青贮经乳酸菌发酵后，能够形成大量的有机酸，这些有机酸具有很强的杀菌抑菌能力，故发酵的青贮饲料不易发生霉变，可以长期保存。
3)、秸秆经乳酸菌发酵后，质地变得柔软，并具有酸香气味，适口性明显提高，增强了家畜的食欲，与未经过处理的秸秆相比，一般采食速度可提高43％，采食量可增加20％以上。
4)、本发明提供的植物乳杆菌在青贮开始时即可大量繁殖，迅速成为优势菌群，接种4h后，酸度就下降到4.0以下，从而抑制其他各种微生物的活动，当pH值下降至3.8时，乳酸菌本身的生长也受到抑制，青贮饲料中的生物化学过程也会停止，即青贮完成。
5)、本发明提供的植物乳杆菌可以产生乳酸、乙酸、甲酸等一些具有抑菌或杀菌作用的物质，这些物质对金黄色葡萄球菌、蜡状芽胞杆菌、大肠杆菌、酵母菌等病原菌均有很强的抑制作用。
6)、使用本发明提供的植物乳杆菌后。乳酸菌大量的繁殖，可以迅速加快青贮发酵的速度，确保青贮的质量和品质。最关键的一点就是大量的乳酸菌，为奶牛提供了最佳的菌体蛋白。提高了奶产量，增加了牛奶中乳蛋白的含量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为添加植物乳杆菌Bn-20菌剂后青贮中微生物检测结果；
图2为添加植物乳杆菌Bn-20菌剂后青贮中有机酸检测结果。
本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，菌株名为Bn-20，保藏编号CGMCC No.13657；
该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间均为：2017年02月10日。经保藏中心于2017年02月10日检测为存活菌株。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例
本农青贮发酵剂中本农专有植物乳杆菌Bn-20，有效活菌数≥200亿CFU/ml(％)。
该菌分离自玉米秸秆，培养条件为MRS培养基，37℃培养10h后得到发酵液，将所述发酵液pH值调整为6.5～7.5，冷冻干燥即得青贮发酵剂粉剂。
发酵饲料方法如下：
粉碎：使用青贮加工设备，秸秆加工至1～2厘米。
添加本农青贮发酵剂：青饲料1吨需要加1g青贮发酵剂。
水分调节：发酵物料水分需控制在60％左右(青饲料可控制在70％左右)，即手抓起能成团，不滴水，放下能散即可。水分过大，可加入麸糠等干物料来调节；水分过小，可直接加水调节。
喷洒要求：稀释后均匀喷洒。
发酵要求：密封、压实。
发酵温度：环境温度在15度以上即可发酵。
发酵时间：夏季3～5天，春秋7～10天，冬季20天以上。
成功标准：有果香、清香、酒香、酸香味，手感松软，即发酵成功。
饲喂方法：可饲喂草食家畜。根据家畜的品种制定饲喂量。
经过本农青贮发酵剂的处理，增强了饲料的适口性，提高了采食量；显著增加饲料营养成份，能转化成动物所必需的多种营养全面的有效氨基酸成份；同时发酵剂里面的益生菌提高动物的免疫力。
发酵操作时需要注意：
(1)排除空气:乳酸菌是厌氧菌，只有在没有空气的条件下才能进行生长繁殖。因此在青贮过程中原料要切短(3cm以下)，踩实，密封严。
(2)创造适宜的温度:青贮原料在25～35℃时，乳酸菌会大量繁殖，很快便占主导优势，导致其他的一切杂菌都无法活动繁殖。因此要尽量踩实，排除空气外，还要尽可能缩短铡草装料过程，以减少氧化产热。
(3)掌握好水分:适于乳酸菌繁殖的含水量为70％左右，过干不易踩实，温度易升高；过湿则酸度大，牲畜不爱吃。
(4)原料的选择:乳酸菌发酵需要一定的糖分，含糖多的易贮。
(5)时间的确定:一看杆实成熟程度；二看青黄叶比例；一般中熟品种110天就基本成熟，就是说套播玉米在9月10日左右，麦后直播玉米在9月20日左右，就应收割青贮。
(6)装填及封窖:装填青贮饲料时要逐层装入，每层15～20cm,装一层踩实一层，边装边踏实，直至装满并超出窖口20～30cm为止。窖顶用厚塑料布封好，四周用泥土把塑料布压实，防止漏气和雨水流入。冬季为了保湿，顶部可以适当压些湿土或铺放一些玉米秸。
实验例1
本农青贮专用乳酸菌可以产生乳酸、乙酸、甲酸等一些具有抑菌或杀菌作用的物质，这些物质对金黄色葡萄球菌、蜡状芽胞杆菌、大肠杆菌、酵母菌等病原菌均有很强的抑制作用。
菌株 抑菌圈直径
金黄色葡萄球菌 11.18
蜡状芽孢杆菌 10.63
沙门氏菌 -
大肠杆菌 12.13
酵母菌 19.42
实验例2
本试验以北京本农科技发展有限公司研发的本农青贮发酵剂(即实施例1的植物乳杆菌Bn-20菌剂)为试验发酵剂，玉米秸秆为原料。将扩大培养的本农青贮发酵剂菌液均匀喷洒在青贮料上后进行封窖。开窖后进行三次青贮饲料样品采集。通过对样品进行乳酸菌活菌数检测、霉菌数量检测、有机酸含量检测、pH值等数据检测及分析，对本农青贮发酵剂产品的效果及青贮饲料的品质进行评定。
一、试验原理
青贮是以玉米秸秆作物为原料，利用乳酸菌的发酵作用长期保存青绿多汁饲料营养价值的饲草贮藏方式。
青贮原理主要是利用牧草表面所附带的乳酸菌，在厌氧条件下，通过微生物(乳酸菌)厌氧发酵，将饲料中糖转变成乳酸，pH下降到4.2以下，抑制其他有害微生物的生长，从而达到保存青饲料营养价值，延长保存时间。
二、试验时间及地点
试验单位：黑龙江博誉农业发展有限公司
试验时间：2016年9月——2017年3月
三、试验设计
1.黑龙江发酵工程研究中心青贮发酵剂菌液扩大培养
1.1先行将发酵用菌种、培养基、承装菌液的容器等先行寄往黑龙江发酵工程研究中心。
1.2发酵条件：37℃、接种量3％、自来水、发酵时间15h、发酵总量300L。
1.3发酵结束后，测定发酵液活菌数：2×109CFU/ml，pH约为4。
2.黑龙江博誉农业发展有限公司牧场青贮作业
将在黑龙江发酵工程研究中心发酵得到的发酵液300L分装成每桶50L，运往黑龙江博誉农业发展有限公司联系的牧场。此牧场用于喷洒菌液的设备为喷壶，喷壶容量为20L,根据之前的计算，本次青贮按照3000吨的青贮原料喷洒75L菌液的量进行喷洒。
运输青贮料的自卸翻斗车一次可运输青贮料16T左右，平均8车青贮料需喷洒一壶稀释后的菌剂，喷洒的过程中采用分层喷洒的原则，尽量做到铺一层、喷洒一次，尽可能的使菌剂和青贮料混合均匀。
在场的工程车辆充足，工程现场24小时不间断作业，因此，做到了平均2天即可封一个3000T左右的青贮窖的速度。
由于正值秋季，工程现场除早晚外，其他时间有二级以上的风，这使得用手动喷壶喷洒的菌剂约20～30％的菌剂可能被风吹走，如果改用高压喷洒装置，效果可能会更好。
3.样品采集
分别与2016年12月份、2017年2月份及3月份进行三次采样，采样方法如下：
3.1以青贮料开窖截面中心点为基准点，向上下左右直线延伸，再取延伸线上的中间点，总计为九点，每个点采样深度大于15cm，小于25cm。上层采样点距离顶层30-50厘米，左右采样点距离窖壁30-60厘米，底层采样点距离窖底30-50厘米。
3.2对九点取出的样品进行混合搅拌均匀。
3.3利用四分法对样品进行分离。以对角线将样品切割，去掉对称的两部分，如果保留的样品还是较多，可再次四分法去除部分样品，直到样品在400～500克之间。
3.4剩余样品快速装填到采样袋中，并将采样袋抽真空处理。并对样品标号。标号内容包括采样日期时间、采样牧场、采样人。
3.5将抽真空后样品在0-4℃的环境中保存，以备检测。
四、数据分析及结论
1.数据分析
将采集回的样品部分留于北京本农生态环境技术研究院进行乳酸菌检测，部分送至农业部饲料工业中心进行霉菌与有机酸检测。数据结果如下表所示：
表1青贮成品质量现场评分结果
项目评分 本农组 对照组 自然发酵组
色泽 18 9 10
气味 20 10 3
结构 9 5 2
水分 16 15 16
pH值 23 18 21
总分 86 57 52
从表1可以看出在相同的时间下添加本农青贮发酵剂的贮料的pH下降的更快，说明加入本农青贮发酵剂能促进乳酸发酵，减少好氧发酵的时间。
表2添加本农发酵剂后青贮中微生物检测结果
从表2和图1中可以看出，本农组中乳酸菌约是对照组的300倍，是自然发酵组的400倍以上，而其他有害菌的含量都在饲料卫生标准范围内，对照组中的霉菌数是本农组的2倍，自然发酵组产生了更多的霉菌，并且有害菌的含量都在万级以上，严重超标。
表3添加本农发酵剂后青贮中有机酸检测结果
含量(mg/kg) 本农组 对照组 自然发酵组
乳酸 2.33×104 1.73×104 2.02×104
乙酸 6.21×103 6.17×103 1.34×104
丙酸 119 335 1.67×103
丁酸 25.7 213 129
从表3和图2中可以看出，相较于乳酸含量，本农组组含量在优质青贮含量范围内，并且是对照组1.5倍左右，乙酸在0.2％左右；由有害菌丁酸梭菌产生的丁酸对照组是本农组的9倍以上，说明本农组丁酸梭菌受到了抑制。
2.结论
黑龙江博誉农业发展有限公司联系的牧场使用北京本农科技发展有限公司研发的青贮发酵剂，制作了3000吨青贮。并于2016年10月开始饲喂这窖青贮。牧场场长根据使用本农青贮发酵剂做出的青贮做出几方面的反映：
(1)从外观来判定，不论颜色和味道都优于用其它方式制作的青贮。整体青贮切面，呈新鲜的黄绿色，具有诱人的酸香味。底层虽然有浸水的现象，但青贮从色泽、气味上都没有较大的变化。青贮没有粘手的感觉。
(2)从饲喂效果观察，首先在适口性上表现很好，牛群没有厌食现象。牛群会在较短的时间，能全部采食完设定的饲料量。故牛群的体况很好，体膘有点超标。故场长表示，要开始考虑减少青贮的添加。以保证牛只正常怀孕生理指标的要求，来满足今后产奶的需求。
(3)从经济效益方面来看，青贮表面基本没有腐败层，窖帮也是如此。场长反映，使用本农的青贮，牛体膘明显要好。由于本农的青贮乳酸菌有效活菌数要高于其它方式制作青贮的300倍至400倍，大量的活体乳酸菌就为奶牛提供了大量的菌体蛋白，牛只摄入了大量菌体蛋白，经过瘤胃小肠的吸收。对牛奶的增产及牛奶中乳蛋白成分的提高是个正相关。具体是多少还要做进一步的深度实验。
现有实验数据验证了青贮料在密封、压实较好的条件下，加入本农青贮发酵剂能快速降低青贮饲料pH值，抑制其他有害菌的生长繁殖，减少能量损失，从而提高青贮饲料品质。
对此次试验，该场场长认为：本农产品优于其它的产品，效果和印象极好。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一株细菌菌株，其特征在于，所述菌株为植物乳杆菌Bn-20，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.13657，保藏日期：2017年02月10日。
2.含有权利要求1所述菌株的微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为液体菌剂，且在该液体菌剂中，植物乳杆菌Bn-20的活菌的数量≥2×109CFU/ml。
4.权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述微生物菌剂接种于液体培养基中进行培养得到发酵液；
可选的，将所述发酵液pH值调整为6.5～7.5，冷冻干燥即得。
5.根据权利要求4所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述液体培养基为MRS培养基；
优选的，所述培养的条件为35℃～40℃培养6h～12h。
6.一种青贮饲料的制备方法，其特征在于，向青绿作物中添加权利要求2或3所述的微生物菌剂进行厌氧发酵。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述青绿作物在添加所述微生物菌剂前经过粉碎处理，粉碎大小为1～2厘米。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述微生物菌剂的添加量为1吨所述青绿作物中添加0.8～1.2g所述微生物菌剂。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述厌氧发酵的发酵条件为：
水分60％～75％，环境温度≥15℃，优选25℃～40℃。
10.根据权利要求6～9任一项所述的制备方法，其特征在于，所述青绿作物包括农作物产品、副产品以及牧草；
优选的，所述农作物产品包括饲用玉米；
优选的，所述副产品包括玉米秸、麦秸以及地瓜秧；
优选的，所述牧草包括豆科或禾本科牧草。
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