CN109563472A - 芽孢杆菌属组合物及用于反刍动物的方法 - Google Patents

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Abstract

公开了用于减少饲料中微生物生长的芽孢杆菌属菌株、组合物和方法。公开了用于为动物提供有益效果，包括但不限于提高动物性能的芽孢杆菌属菌株、组合物及方法。

Description

芽孢杆菌属组合物及用于反刍动物的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年5月25日申请的美国临时专利申请号62/341,332的优先权，将其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及芽孢杆菌属菌株的组合物及方法。在一个实施方案中，本公开涉及用于控制微生物生长(例如，于饲料或饲喂料中)的芽孢杆菌属菌株、组合物及方法。在一个实施方案中，本公开涉及用于改善动物性能的芽孢杆菌属菌株、组合物及方法；并且更具体地涉及一种用于改善反刍动物性能的基于芽孢杆菌属菌株的直接喂饲型微生物。
背景技术
梭菌属的生物体是革兰氏阳性(gram-positive)、厌氧、形成内生孢子的细菌。梭菌属是土壤及动物(包括奶牛和小牛)肠道的常驻菌。许多物种在奶牛场普遍存在，通常被发现于半干青贮(haylage)、玉米青贮(corn silage)、秸秆、粪肥、初乳和牛垫料中。发酵饲养料中因pH降低到小于5.0而使得梭菌属的生长受到限制，但生物体即使在良好发酵的饲养料中仍可存活较长的一段时间。
存在超过100个经过鉴别的梭菌属物种，已知其中一些会引起肠道疾病，而其他对于广泛的酶功能及工业用途并不致病。经过鉴别会引起动物中肠道疾病的物种包括产气荚膜梭菌(C.perfringens)、败毒梭菌(C.septicum)、索氏梭菌(C.sordelli)和肉毒梭菌(C.botulinum)。由这些生物体引起的疾病的例子包括坏死性肠炎(necrotic enteritis)、肠道出血综合征(HBS)、恶性水肿、皱胃疾病和肉毒杆菌中毒。
由产气荚膜梭菌介导的疾病是对畜牧业造成经济损伤的一个重要原因。在乳品生产中，HBS是消化系统死亡的主要原因，且据报道于2000年在美国实施的调查中造成乳畜死亡中的至少2％(Baker2002)。最近，认为HBS的发病率是在逐渐增加的，但对发病率的另外的评估尚不可得，因为所述疾病具显著季节性，症状与常见反刍动物消化道疾病相似且一大部分患病牛并未进行尸检。
最先于1991年报导HBS，是在爱达荷州一个牛奶场(dairy)的五头高产奶荷斯坦牛观察到的(Sockett，2004)。症状包括点源粘膜下血肿，每头累及10-20cm空肠。这五头牛每头均展示血肿破裂且放血进入至空肠的肠腔中。HBS的常见症状包括产奶量突然降低、由于肠阻塞引起的腹痛和贫血(Anderson，2002)。所述疾病的临床体征是减少饲料摄入、抑郁、产奶量降低、脱水、腹胀和粪便中带暗血凝块(Dennison等人，2002)。在阻塞性血凝块栓发作的48小时内死亡。
虽然已知烟曲霉和产气荚膜梭菌与HBS的病因有关(Ceci等人，2006；Dennison等人，2005)，但该综合征本质上最好描述为是多微生物和多因素的。增加高能量饮食的消耗似乎是已经描述的所有危险因素的最合理的共同途径(Berghaus等人，2005)。
除了引起肠道疾病的梭菌属物种外，分离自奶牛的瘤胃液和粪便样品的其他梭菌属物种是产生高水平的丙酮、丁醇、1,3-丙二醇和丁酸(已知作为它们代谢终产物)的物种。已知这些代谢终产物可抑制瘤胃细菌和胃肠道细菌且可影响瘤胃和消化功能并降低效率。如果存在于青贮中，则这些生物体可降低作物的营养价值。
由于肠梭菌感染的偶发急性病因，已知治疗处理不是很有效。因此，预防策略，如使用益生菌来控制胃肠道中梭菌增殖是疾病控制的优选的方向。还可使用益生菌来控制非产毒梭菌激发。依照本发明的一个方面，诸位发明人已针对能够抑制广泛致病性和非致病性梭菌物种的有效益生菌进行研究。万古年来，土壤生态系统中芽孢杆菌与梭菌相互竞争。在这一过程中，芽孢杆菌属的某些菌株已发展出抑制梭菌物种的有效机制。依照本发明的一个方面，诸位发明人已分离并鉴定出能够抑制影响反刍动物生产能力的广泛梭菌的几个芽孢杆菌属菌株。由芽孢杆菌产生的主要细菌素是许多功能及结构不同的肽。它们通常是疏水的且是环状的，具有非天然氨基酸，并对肽酶和蛋白酶具有抗性。它们可通过多酶复合物以核糖体或非核糖体方式合成，通常会接着进行翻译后修饰。芽孢杆菌属菌株通常产生以非核糖体方式合成的脂肽，即附接至小环肽的脂肪酸。这些以非核糖体方式合成的肽是结构多样化的(Luo等人，2015a)，因为它们是从一组异源前体组装而成；但它们通过多载体硫代模板机制来合成这一点是不变的(Luo等人，2015b)。
青贮是反刍动物生产系统中梭菌生物体的主要来源。青贮和饲养料可支持造成营养价值降级的多种腐败微生物(如梭菌、芽孢杆菌、酵母和霉菌)的生长。因为许多变量会妨碍用于保存青贮的理想条件，所以乳酸菌通常用作青贮接种物以促进适当的发酵和青贮的最佳保存。乳酸菌在厌氧条件中快速地生长且变成存在于作物中的优势微生物，且通过产生乳酸使得pH降低。虽然大肠菌群和霉菌是通过降低pH到小于pH 5而被抑制，但梭菌很难利用低pH来控制，这是因为它们在甚至小于5.0的pH下仍可存活。因此，传统的乳酸菌青贮接种物在控制青贮中的梭菌方面不是完全有效的。
控制青贮中的梭菌生物体对于防止这些细菌对青贮质量和反刍动物性能产生有害作用是非常重要的。由于当存在梭菌活性时观察到牛摄食减少且因由梭菌发酵引起青贮营养质量下降，青贮中的梭菌活性是不希望的。乳酸通过产丁酸梭菌发酵为丁酸会导致干物质损失约50％且来自青贮饲料原料的总能损失18％(McDonald等人，1991)。另外，梭菌腐败生物体对牛的健康具有有害作用，此点通过当向牛喂饲梭菌青贮时出现较高的酸中毒发生率得以证实(Seglar，2003)。
虽然芽孢杆菌被视作青贮腐败生物体，但已知芽孢杆菌属的一些成员可产生能够控制梭菌生长及存活的抗微生物化合物(Hong等人，2005)。在暴露于氧后芽孢杆菌可导致青贮的加速腐败，但在筒仓厌氧条件下不太会影响作物的发酵(Muck，2010)。因此，可以在制作青贮饲料之时使用芽孢杆菌属生物体来控制梭菌腐败生物体的生长。在本发明一个实施方案中鉴定出的芽孢杆菌属菌株产生针对多种梭菌具有抑制活性的多种化合物。
芽孢杆菌属菌株通过抑制可产生非营养性终产物(如丙酮和丁醇)(其可负面地影响瘤胃功能)的梭菌而影响瘤胃和肠道的整体生态。芽孢杆菌属菌株的活性不但降低产气荚膜梭菌和非产毒梭菌的水平，而且降低它们的总体多样性。
归因于用作益生菌的芽孢杆菌属菌株的免疫调节活性是它们促成整体健康和安好的主要方式之一(由Hong等人综述，2005)。据报导芽孢杆菌属孢子在口服给予后进入肠派尔斑(intestinal Peyer’s patches)和肠膜淋巴结中，继而于体外研究中被巨噬细胞所吞噬(Duc等人，2003，2004)。口服给予枯草芽孢杆菌诱导单核细胞产生细胞因子干扰素-λ于血液中(Kosaka等人，1998)，表明芽孢杆菌发挥全身性作用以及肠层级的局部作用。另外，在给予肉用仔鸡以及下游TLR信号传导通路成员后观察到肠道空肠和回肠中toll样受体(TLR)-2和TLR-4的信使RNA表达增加。MyD88、TRAF6和NF-κB(Rajput等人，2017)。
芽孢杆菌属菌株具有使得它们有效成为直接喂饲型微生物的许多活性，包括细胞外酶、抗微生物剂和免疫调节分子的产生。此外，芽孢杆菌属形成使得它们稳定于饲料和其他饲料组分中的内生孢子。这些孢子是耐热的且因此将在正常的饲料造粒工艺中存活。所述孢子抗干燥且矿物盐使得它们稳定于维生素和微量矿物质预混料中。
体外数据和体内试验均指示这些芽孢杆菌属菌株在抑制梭菌(如产气荚膜梭菌)中的有效性，从而减小商业乳制品操作中的疾病负担。这些相同的试验已证实芽孢杆菌属菌株可有效抑制能够产生抑制性代谢产物的非产毒梭菌。这些菌株现可用作益生菌，以便提高乳制品生产力且减少牛消化道疾病。
发明内容
诸位发明人已开发出一种包含分离的芽孢杆菌属菌株的直接喂饲型微生物组合物，所述微生物组合物用于减少在已摄入有效量的所述直接喂饲型微生物组合物的反刍动物的消化系统中的梭菌属，其中所述分离的芽孢杆菌属菌株选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌1104、枯草芽孢杆菌1781、枯草芽孢杆菌747、枯草芽孢杆菌1541、枯草芽孢杆菌1999和枯草芽孢杆菌2018。
在本发明的一个方面，一种直接喂饲型微生物组合物可抑制选自由以下组成的组的梭菌：产气荚膜梭菌、双酶梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、第三梭菌和索氏梭菌。
在本发明的一个方面，其中所述梭菌是双酶梭菌，所述分离的芽孢杆菌属菌株可抑制在已摄入有效量的所述直接喂饲型微生物组合物的所述反刍动物的消化系统中产生1,3-丙二醇。
在本发明的一个方面，其中所述梭菌是拜氏梭菌，所述分离的芽孢杆菌属菌株可抑制在已摄入有效量的所述直接喂饲型微生物组合物的所述反刍动物的消化系统中产生丁醇。
在本发明的一个方面，其中所述梭菌是拜氏梭菌，所述分离的芽孢杆菌属菌株可抑制在已摄入有效量的所述直接喂饲型微生物组合物的所述反刍动物的消化系统中产生丙酮。
在本发明的一个方面，其中所述梭菌是丁酸梭菌，所述分离的芽孢杆菌属菌株可抑制在已摄入有效量的所述直接喂饲型微生物组合物的所述反刍动物的消化系统中产生丁酸盐。
在本发明的一个方面，其中所述梭菌是产气荚膜梭菌，所述分离的芽孢杆菌属菌株可减少在已摄入有效量的所述直接喂饲型微生物组合物的所述反刍动物中消化障碍如肠道出血综合征的发生。
在本发明的一个方面，所述直接喂饲型微生物组合物还可以包含布置在所述分离的芽孢杆菌属菌株周围的冷冻保护剂，并且其中所述分离的芽孢杆菌属菌株是生物纯粉状冻干菌株。
在本发明的一个方面，所述直接喂饲型微生物组合物可以是包含芽孢杆菌属孢子的生物纯粉状冻干芽孢杆菌属菌株。
在本发明的一个方面，所述直接喂饲型微生物组合物还可以包含载体。
在本发明的一个方面，由所述反刍动物每天所摄入的所述直接喂饲型微生物组合物的所述有效量可包括以下浓度：在约2x108CFU所述分离的芽孢杆菌属菌株/反刍动物与约2.0x1010CFU所述分离的芽孢杆菌属菌株/反刍动物之间。
在本发明的一个方面，由所述反刍动物每天所摄入的所述直接喂饲型微生物组合物的所述有效量可包括以下浓度：约2x109CFU所述分离的芽孢杆菌属菌株/反刍动物。
在本发明的另一方面，提供了一种改善反刍动物性能的方法，其包括以下步骤：将有效量的根据权利要求1所述的直接喂饲型微生物组合物引入一种或多种反刍动物的消化系统中，并且提供选自以下的至少一个益处：(1)抑制在所述一种或多种反刍动物中选自产气荚膜梭菌、双酶梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、第三梭菌和索氏梭菌中的至少一种的病原体；(2)降低所述一种或多种反刍动物的死亡率；(3)改善所述一种或多种反刍动物的饲料效率；(4)减少所述一种或多种反刍动物中肠道出血综合征的发生；(5)改善所述一种或多种反刍动物中的瘤胃发酵；(6)提高所述一种或多种反刍动物的产奶量；以及(7)调节所述一种或多种反刍动物的全身免疫细胞和肠免疫细胞中炎性细胞因子的免疫应答。
在本发明的另一方面，给予所述直接喂饲型微生物组合物的方法可提供降低所述一种或多种反刍动物中的产气荚膜梭菌菌株多样性的益处。
在本发明的另一方面，给予所述直接喂饲型微生物组合物的方法可提供降低所述一种或多种反刍动物中的非产毒梭菌菌株多样性的益处。
在本发明的另一方面，在所述一种或多种反刍动物是奶牛时，给予所述直接喂饲型微生物组合物的方法可提供增加所述一种或多种反刍动物中平均能量校正牛奶产量的益处。
在本发明的另一方面，给予所述直接喂饲型微生物组合物的方法可提供在直接喂饲型微生物给予期间降低所述一种或多种反刍动物的与消化系统有关的死亡率的益处。
在本发明的另一方面，给予所述直接喂饲型微生物组合物的方法可包括将所述直接喂饲型微生物组合物添加至反刍动物饲料中。
在本发明的另一方面，诸位发明人已开发出布置在具有孢子的粉状冻干分离芽孢杆菌属菌株周围的冷冻保护剂，所述具有孢子的粉状冻干分离芽孢杆菌属菌株选自以下中的至少一种：枯草芽孢杆菌1104、枯草芽孢杆菌1781、枯草芽孢杆菌747、枯草芽孢杆菌1541、枯草芽孢杆菌1999和枯草芽孢杆菌2018；和载体，其中所述组合物可抑制在已摄入有效量的所述直接喂饲型微生物组合物的反刍动物的消化系统中的选自以下的至少一种病原体：产气荚膜梭菌、双酶梭菌、拜氏梭菌和丁酸梭菌，并且其中所述直接喂饲型微生物组合物的所述有效量可包括以下浓度：在约2x108CFU所述分离的芽孢杆菌属菌株/反刍动物/天与约2.0x1010CFU所述分离的芽孢杆菌属菌株/反刍动物/天之间。
在本发明的另一方面，诸位发明人已开发出一种用于减少梭菌的组合物，该组合物包含芽孢杆菌属菌株的有效量的生物纯培养物，该芽孢杆菌属菌株选自下组，所述组由芽孢杆菌1104、芽孢杆菌1781、芽孢杆菌747、芽孢杆菌1541、芽孢杆菌1999和芽孢杆菌2018组成。
在本发明的另一方面，抑制的所述梭菌选自下组，所述组由产气荚膜梭菌、双酶梭菌、拜氏梭菌、和丁酸梭菌、第三梭菌和索氏梭菌组成。
在本发明的另一方面，所述组合物还包含布置在所述分离的芽孢杆菌属菌株周围的冷冻保护剂，并且所述分离的芽孢杆菌属菌株是粉状冻干菌株。
在本发明的另一方面，所述组合物包含呈芽孢杆菌属孢子形式的生物纯粉状冻干芽孢杆菌属菌株。
在本发明的另一方面，所述组合物可作为直接喂饲型微生物用于控制已摄入有效量的所述直接喂饲型微生物的反刍动物的消化系统中的梭菌。
在本发明的另一方面，由所述反刍动物每天所摄入的所述直接喂饲型微生物的所述有效量包括以下浓度：在约2x108CFU所述分离的芽孢杆菌属菌株/反刍动物与约2.0x1010CFU所述分离的芽孢杆菌属菌株/反刍动物之间。
在本发明的另一方面，由所述反刍动物每天所摄入的所述直接喂饲型微生物的所述有效量包括以下浓度：约2x109CFU所述分离的芽孢杆菌属菌株/反刍动物。
在本发明的另一方面，所述组合物可作为青贮控制微生物以一个体积的包含有效量的所述组合物的青贮与一个体积的产生所述青贮的饲喂料(fodder)混合的方式用于抑制梭菌属的生长。
在本发明的另一方面，芽孢杆菌属菌株的生物纯培养物抑制选自下组的致病微生物的生长，所述组由以下组成：大肠杆菌(E.coli)、产气荚膜梭菌、双酶梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、第三梭菌、索氏梭菌、大肠菌群、酵母和霉菌。
在本发明的另一方面，所述芽孢杆菌属菌株的生物纯培养物增加了青贮中乳酸和乙酸的浓度。
在本发明的另一方面，所述芽孢杆菌属菌株的生物纯培养物减少了青贮的腐败。
在本发明的另一方面，提供了一种用于减少青贮中致病微生物生长的方法，该方法包括将一个体积的饲喂料与有效量的所述组合物混合以减少所述致病微生物的生长。
在本发明的另一方面，芽孢杆菌属菌株选自下组，所述组由以下组成：芽孢杆菌1104、芽孢杆菌1781、芽孢杆菌747、芽孢杆菌1541、芽孢杆菌1999和芽孢杆菌2018，所述芽孢杆菌属菌株用于在直接喂饲型微生物中使用以控制反刍动物消化系统中的梭菌。
在本发明的另一方面，芽孢杆菌属菌株选自下组，所述组由以下组成：芽孢杆菌1104、芽孢杆菌1781、芽孢杆菌747、芽孢杆菌1541、芽孢杆菌1999和芽孢杆菌2018，所述芽孢杆菌属菌株用于在制造用以控制反刍动物消化系统中的梭菌的直接喂饲型微生物中使用。
在本发明的另一方面，芽孢杆菌属菌株选自下组，所述组由以下组成：芽孢杆菌1104、芽孢杆菌1781、芽孢杆菌747、芽孢杆菌1541、芽孢杆菌1999和芽孢杆菌2018，所述芽孢杆菌属菌株用于在青贮控制微生物中使用以抑制青贮中梭菌的生长。
在本发明的另一方面，芽孢杆菌属菌株选自下组，所述组由以下组成：芽孢杆菌1104、芽孢杆菌1781、芽孢杆菌747、芽孢杆菌1541、芽孢杆菌1999和芽孢杆菌2018，所述芽孢杆菌属菌株用于在制造用以抑制青贮中梭菌的生长的青贮控制微生物中使用。
在查看本说明书、权利要求书和附图后本发明的其他目标、特征及优点将变得清楚。
附图说明
图1是示出依照实施例1根据本发明一个实施方案的从饲料样品分离的产气荚膜梭菌和非产毒梭菌的比例的饼状图表；
图2是示出依照实施例1根据本发明一个实施方案的在饲料样品(n＝345)中鉴定出的主要非产毒梭菌的饼状图表；
图3是显示依照实施例1根据本发明一个实施方案的以通过RAPD PCR产生的基因指纹为基础的饲料梭菌分离株间差异的系统树图；
图4是示出依照实施例2根据本发明一个实施方案的六种迷你筒仓型(mini-silo)接种物处理的pH测量值相对时间的线图。
图5是示出依照实施例2根据本发明一个实施方案的六种迷你筒仓型接种物处理的芽孢杆菌计数随时间变化的线图；
图6是示出依照实施例2根据本发明一个实施方案的六种迷你筒仓型接种物处理的乳酸菌(LAB)群体随时间变化的线图；
图7是示出依照实施例2根据本发明一个实施方案的六种迷你筒仓型接种物处理的酵母群体随时间变化的线图；
图8是示出依照实施例2根据本发明一个实施方案的六种青贮接种物处理的霉菌群体随时间变化的线图；
图9是示出依照实施例2根据本发明一个实施方案的六种青贮接种物处理的梭菌群体随时间变化的线图；
图10是示出依照实施例2根据本发明一个实施方案的六种青贮接种物处理(以已采样的为基础)的乳酸浓度随时间变化的线图；
图11为是示出依照实施例2根据本发明一个实施方案的六种青贮接种物处理(以已采样的为基础)的乙酸浓度随时间变化的线图；
图12是示出依照实施例3根据本发明一个实施方案的四种青贮接种物处理(以已采样的为基础)的pH测量值随时间的线图；
图13是示出依照实施例3根据本发明一个实施方案的四种青贮接种物处理(以已采样的为基础)的大肠杆菌群体随时间变化的线图；
图14是示出依照实施例3根据本发明一个实施方案的四种青贮接种物处理(以已采样的为基础)的大肠菌群群体随时间变化的线图；
图15是示出依照实施例3根据本发明一个实施方案的四种青贮接种物处理(以已采样的为基础)的芽孢杆菌属群体随时间变化的线图；
图16是示出依照实施例3根据本发明一个实施方案的四种青贮接种物处理(以已采样的为基础)的乳酸菌(LAB)群体随时间变化的线图；
图17是示出依照实施例3根据本发明一个实施方案的四种青贮接种物处理(以已采样的为基础)的酵母群体随时间变化的线图；
图18是示出依照实施例3根据本发明一个实施方案的四种青贮接种物处理(以已采样的为基础)的霉菌群体随时间变化的线图；
图19是示出依照实施例3根据本发明一个实施方案的四种青贮接种物处理(以已采样的为基础)的梭菌群体随时间变化的线图；
图20是示出依照实施例3根据本发明一个实施方案的四种青贮接种物处理(以已采样的为基础)的乳酸水平随时间的线图；
图21是示出依照实施例3根据本发明一个实施方案的四种青贮接种物处理(以已采样的为基础)的乙酸水平随时间变化的线图；
图22是示出依照实施例4根据本发明一个实施方案的pH测量值随时间(在包含芽孢杆菌属的青贮接种物的农场应用与未经处理的对照之间比较)的线图；
图23是示出依照实施例4根据本发明一个实施方案的大肠杆菌计数(CFU/g)随时间(在包含芽孢杆菌属的青贮接种物的农场应用与未经处理的对照之间比较)的线图；
图24是示出依照实施例4根据本发明一个实施方案的大肠菌群计数(CFU/g)随时间(在包含芽孢杆菌属的青贮接种物的农场应用与未经处理的对照之间比较)的线图；
图25是示出依照实施例4根据本发明一个实施方案的芽孢杆菌属计数(CFU/g)随时间(在包含芽孢杆菌属的青贮接种物的农场应用与未经处理的对照之间比较)的线图；
图26是示出依照实施例4根据本发明一个实施方案的乳酸菌(LAB)计数(CFU/g)随时间(在包含芽孢杆菌属的青贮接种物的农场应用与未经处理的对照之间比较)的线图；
图27是示出依照实施例4根据本发明一个实施方案的酵母计数(CFU/g)随时间(在包含芽孢杆菌属的青贮接种物的农场应用与未经处理的对照之间比较)的线图；
图28是示出依照实施例4根据本发明一个实施方案的霉菌计数(CFU/g)随时间(在包含芽孢杆菌属的青贮接种物的农场应用与未经处理的对照之间比较)的线图；
图29是示出依照实施例4根据本发明一个实施方案的梭菌计数(CFU/g)随时间(在包含芽孢杆菌属的青贮接种物的农场应用与未经处理的对照之间比较)的线图；
图30是示出依照实施例4根据本发明一个实施方案的乳酸浓度随时间(在包含芽孢杆菌属的青贮接种物的农场应用与未经处理的对照之间比较)的线图；
图31是示出依照实施例4根据本发明一个实施方案的乙酸浓度随时间(在包含芽孢杆菌属的青贮接种物的农场应用与未经处理的对照之间比较)的线图；
图32是示出依照实施例5根据本发明一个实施方案的威斯康辛州(Wisconsin)母牛和小牛的各个粪便样品的所有梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图33是示出依照实施例5根据本发明一个实施方案的在威斯康辛州所采集的每一农场的各个农场小牛粪便样品的总梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图34是示出依照实施例5根据本发明一个实施方案的在从威斯康辛州所采集的每一农场的各个农场母牛粪便样品的总梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图35是示出来自在威斯康辛州所采集的粪便样品的粪便样品产气荚膜梭菌计数计算值的图表。依照实施例5，根据本发明的一个实施方案，通过将各样品的总梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图36是示出来自威斯康辛州的各个小牛粪便样品的产气荚膜梭菌计数计算值的图表。通过将各样品的梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数。依照实施例5，根据本发明的一个实施方案，针对各农场报告结果；
图37是示出从威斯康辛州采集的各个母牛粪便样品的产气荚膜梭菌计数计算值的图表。通过将各样品的梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数。依照实施例5，根据本发明的一个实施方案，针对各农场报告结果；
图38是示出依照实施例5根据本发明一个实施方案的从威斯康辛州分离的产气荚膜梭菌(n＝1,522)的系统树图，聚类截止值是在75％相似度，其中与每一分离株(n＝1,522)有关的信息于右边列出：农场，ID号，α、β、ε和ι毒素结果，毒素类型，来源和所在州；并且基于系统树图聚类来选择代表者以用于在细菌素抑制测定中进行筛选；
图39是依照实施例5根据本发明一个实施方案的非产毒梭菌(n＝183)的系统树图，该系统树图显示出来自威斯康辛州每一分离株的16S DNA序列之间的相似性；其中，与每一分离株有关的信息从左到右列出，包括：农场、ID号或模式菌株鉴定、鉴定、分离株的来源；
图40是示出依照实施例5根据本发明一个实施方案的主要非产毒梭菌(n＝183)物种与所有其他非产毒类型之间比较的饼图；
图41是示出依照实施例6根据本发明一个实施方案的德克萨斯州母牛和小牛的各个粪便样品的所有梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图42是示出依照实施例6根据本发明一个实施方案的在德克萨斯州所采集的每一农场的各个农场小牛粪便样品的总梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图43是示出依照实施例6根据本发明一个实施方案的在从德克萨斯州所采集的每一农场的各个农场母牛粪便样品的总梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图44是示出依照实施例6根据本发明一个实施方案的来自在德克萨斯州所采集的粪便样品的粪便样品产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的总梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图45是示出依照实施例6根据本发明一个实施方案的来自德克萨斯州的每一农场各个小牛粪便样品的产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图46是示出依照实施例6根据本发明一个实施方案的从德克萨斯州采集的每一农场各个母牛粪便样品的产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图47是示出依照实施例6根据本发明一个实施方案的从德克萨斯州样品分离的主要非产毒梭菌(n＝215)物种与所有其他非产毒类型之间比较的饼图；
图48是示出依照实施例7根据本发明一个实施方案的来自上中西部地区的母牛和小牛的各个粪便样品的所有梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图49是示出依照实施例7根据本发明一个实施方案的在从上中西部地区所采集的每一农场的各个农场小牛粪便样品的总梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图50是示出依照实施例7根据本发明一个实施方案的在从上中西部地区所采集的每一农场的各个农场母牛粪便样品的总梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图51是示出依照实施例7根据本发明一个实施方案的来自从上中西部地区所采集的粪便样品的粪便样品产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的总梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图52是示出依照实施例7根据本发明一个实施方案的来自上中西部地区的每一农场各个小牛粪便样品的产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图53是示出依照实施例7根据本发明一个实施方案的从上中西部地区采集的每一农场各个母牛粪便样品的产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图54是示出依照实施例7根据本发明一个实施方案的从上中西部地区分离的非产毒梭菌(n＝218)(示出两个主要鉴定类型(双酶梭菌组和拜氏梭菌组))与所有其他非产毒类型之间的比较的饼状图的饼图；
图55是示出依照实施例7根据本发明一个实施方案的来自大湖(Great Lakes)地区的母牛和小牛的各个粪便样品的所有梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图56是示出依照实施例8根据本发明一个实施方案的在从大湖地区所采集的每一农场的各个农场小牛粪便样品的总梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图57是示出依照实施例8根据本发明一个实施方案的在从大湖地区所采集的每一农场的各个农场母牛粪便样品的总梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图58是示出依照实施例8根据本发明一个实施方案的来自从大湖地区所采集的粪便样品的粪便样品产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的总梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图59是示出依照实施例8根据本发明一个实施方案的来自大湖地区的每一农场各个小牛粪便样品的产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图60是示出从大湖地区采集的每一农场各个母牛粪便样品的产气荚膜梭菌计数计算值的图表。依照实施例8，根据本发明的一个实施方案，通过将各样品的梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图61是示出依照实施例8根据本发明的一个实施方案，从大湖地区分离的非产毒梭菌(n＝190)(包括主要鉴定类型(双酶梭菌组))与所有其他非产毒类型之间比较的饼图；
图62是示出依照实施例9根据本发明一个实施方案的来自东北地区的母牛和小牛的各个粪便样品的所有梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图63是示出依照实施例9根据本发明一个实施方案的在从东北地区所采集的每一农场的各个农场小牛粪便样品的总梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图64是示出依照实施例9根据本发明一个实施方案的在从东北地区所采集的每一农场的各个农场母牛粪便样品的总梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图65是示出依照实施例9根据本发明一个实施方案的来自从东北地区所采集的粪便样品的粪便样品产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的总梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图66是示出依照实施例9根据本发明一个实施方案的来自东北地区的每一农场各个小牛粪便样品的产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图67是示出依照实施例9根据本发明一个实施方案的从东北地区采集的每一农场各个母牛粪便样品的产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图68是示出依照实施例9根据本发明一个实施方案的从东北地区分离的非产毒梭菌(n＝181)(包括两个主要鉴定类型(双酶梭菌组和拜氏梭菌组))与所有其他非产毒类型之间比较的饼图；
图69是示出依照实施例10根据本发明一个实施方案的来自大西洋中部地区的母牛和小牛的各个粪便样品的所有梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图70是示出依照实施例10根据本发明一个实施方案的在从大西洋中部地区所采集的每一农场的各个农场小牛粪便样品的总梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图71是示出依照实施例10根据本发明一个实施方案的在从大西洋中部地区所采集的每一农场的各个农场母牛粪便样品的总梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图72是示出依照实施例10根据本发明一个实施方案的来自从大西洋中部地区所采集的粪便样品的粪便样品产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的总梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图73是示出依照实施例10根据本发明一个实施方案的来自大西洋中部地区的每一农场各个小牛粪便样品的产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图74是示出依照实施例10根据本发明一个实施方案的从大西洋中部地区采集的每一农场各个母牛粪便样品的产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图75是示出依照实施例10根据本发明的一个实施方案，从大西洋中部地区分离的非产毒梭菌(n＝151)(包括主要鉴定类型-双酶梭菌组)与所有其他非产毒类型之间比较的饼图；
图76是示出依照实施例11根据本发明一个实施方案的来自I-29走廊地区的母牛和小牛的各个粪便样品的所有梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图77是示出依照实施例11根据本发明一个实施方案的在从I-29走廊地区所采集的每一农场的各个农场小牛粪便样品的总梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图78是示出依照实施例11根据本发明一个实施方案的在从I-29走廊地区所采集的每一农场的各个农场母牛粪便样品的总梭菌(梭菌属物种未区分)的枚举结果的图表；
图79是示出依照实施例11根据本发明一个实施方案的来自从I-29走廊地区所采集的粪便样品的粪便样品产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的总梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图80是示出依照实施例11根据本发明一个实施方案的来自I-29走廊地区的每一农场各个小牛粪便样品的产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图81是示出依照实施例11根据本发明一个实施方案的从I-29走廊地区采集的每一农场各个母牛粪便样品的产气荚膜梭菌计数计算值的图表，其中通过将各样品的梭菌计数乘以百分比(证实为产气荚膜梭菌)来估计产气荚膜梭菌计数；
图82是示出依照实施例11根据本发明一个实施方案的从I-29走廊地区分离的非产毒梭菌(n＝399)(包括两个主要鉴定类型(双酶梭菌组和拜氏梭菌组))与所有其他非产毒类型之间比较的饼图；
图83是示出依照实施例12根据本发明一个实施方案的各个粪便样品在所有时间点的总梭菌的枚举结果(包括实施例6的那些)的图表，其中显著不同于处理前样品的时间点由平均误差棒上的星号表示；
图84是示出依照实施例12根据本发明一个实施方案在所有时间点的各个粪便样品的产气荚膜梭菌的计数计算值(包括实施例6的那些)的图表；
图85是示出依照实施例12根据本发明一个实施方案的德克萨斯州农场ALJ非产毒梭菌属物种比例随时间变化的条形图；
图86是示出依照实施例13根据本发明一个实施方案的威斯康辛州农场E所有采样点的各个粪便样品的总梭菌的枚举结果的图表；
图87是示出依照实施例13根据本发明一个实施方案的来自威斯康辛州农场E的各个粪便样品的产气荚膜梭菌计数计算值随时间的图表；
图88是示出依照实施例13根据本发明一个实施方案的来自威斯康辛州农场E的非产毒梭菌属物种比例随时间的图；
图89是示出依照实施例14根据本发明一个实施方案的来自农场BS的各个粪便样品在所有时间点的总梭菌的枚举结果(包括实施例6的那些)的图表，其中显著不同于处理前样品的时间点由平均误差棒上的星号表示；
图90是示出依照实施例14根据本发明一个实施方案的来自农场BS的各个粪便样品在所有时间点的产气荚膜梭菌的计数计算值(包括实施例6的那些)的图表；
图91是示出依照实施例14根据本发明一个实施方案的来自德克萨斯州农场BS的来自处理前的与经107天处理的采样点的非产毒梭菌属物种比例之间比较的图；
图92是示出依照实施例15根据本发明一个实施方案的由芽孢杆菌属菌株747(含及不含LPS)引起的炎性细胞因子(MIP-2和TNF-α)基因表达的倍数变化的图；
图93是示出依照实施例15根据本发明一个实施方案的由芽孢杆菌属菌株1781(含及不含LPS)引起的炎性细胞因子(MIP-2和TNF-α)基因表达的倍数变化的图；
图94是示出依照实施例15根据本发明一个实施方案的由芽孢杆菌属菌株1104(含及不含LPS)引起的炎性细胞因子(MIP-2和TNF-α)基因表达的倍数变化的图；
图95是示出依照实施例15根据本发明一个实施方案的由芽孢杆菌属菌株1541(含及不含LPS)引起的炎性细胞因子(MIP-2和TNF-α)基因表达的倍数变化的图；
图96是示出依照实施例15根据本发明一个实施方案的由芽孢杆菌属菌株2018(含及不含LPS)引起的炎性细胞因子(MIP-2和TNF-α)基因表达的倍数变化的图；
图97是示出依照实施例15根据本发明一个实施方案的由芽孢杆菌属菌株747和1781(含及不含LPS)引起的炎性细胞因子(MIP-2和TNF-α)基因表达的倍数变化的图；
图98是示出依照实施例16根据本发明一个实施方案的在开始代乳品处理后14天小牛血浆触珠蛋白(haptoglobin)浓度的图；
图99是示出依照实施例18根据本发明一个实施方案的来自威斯康辛州农场WB的各个粪便样品在所有时间点的总梭菌的枚举结果(包括实施例5的那些)的图表，其中显著不同于处理前样品的时间点由平均误差棒上的星号表示；
图100是示出依照实施例18根据本发明一个实施方案的来自威斯康辛州农场WB的各个粪便样品在所有时间点的产气荚膜梭菌的计数计算值(包括实施例5的那些)的图表；以及
图101是示出依照实施例18根据本发明一个实施方案的来自威斯康辛州农场WB的非产毒梭菌属物种比例随时间的图表。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
本公开并不受限于本文中公开的示例性方法和材料，且类似或等效于本文中描述的那些的任何方法和材料可用于本公开实施方案的实践或测试中。数字范围包含界定范围的数字在内。
应该指出，如在本说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个(a)/一种(an)”和“该(the)”包括复数对象，除非上下文另外清楚地指出。
本公开中的数值范围是近似的，且因此除非另有指明否则可包括在范围外的值。数值范围包括从下限值以一个单位的增量到上限值的并包括所述下限值和上限值的所有值，条件是任一下限值与任一更高值间隔至少两个单位。对于包含小于一或包含大于一的分数(例如，1.1、1.5等)的值的范围来说，视需要，一个单位被认为是0.0001、0.001、0.01或0.1。对于包含小于十的个位数的范围(例如，1至5)来说，一个单位通常被视为是0.1。这些仅是具体地预期的例子，并且在所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能组合被认为在本公开中明确指出。本公开中尤其对于混合物中各种组分的相对量、及方法中所列举的各种温度及其他参数范围提供数值范围。
如本文所用，“给予”是指将菌株或组合物引入环境的动作。
如本文所用，术语“动物”包括但不限于人、哺乳动物、两栖动物、鸟、爬行动物、猪、母牛、牛、山羊、马、绵羊、家禽和关在或饲养在农场或牧场的其他动物、绵羊、大角羊、野牛(buffalo)、羚羊、公牛、驴、骡、鹿、麋鹿、驯鹿、水牛(water buffalo)、骆驼、美洲驼、羊驼、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、雪貂、狗、猫和其他宠物、灵长类动物、猴、猿和大猩猩。在一些实施方案中，所述动物是反刍动物，包括但不限于牛、绵羊、山羊等。
如本文所用，“动物性能”可由饲料效率和/或动物体重增加且/或由饲料转化率和/或由饲料中养分消化性(例如氨基酸消化性)和/或饲料中的可消化能量或可代谢能量和/或由氮存留和/或由动物避免坏死性肠炎负面影响的能力和/或由受试者的免疫应答决定。
“至少一种菌株”指单一菌株，但还指包括至少两种细菌菌株的菌株混合物。“至少两种菌株的混合物”指两种、三种、四种、五种、六种或甚至更多种菌株的混合物。在菌株混合物的一些实施方案中，比例可从1％到99％变化。当混合物包括超过两种菌株时，所述菌株可以按大致相等的比例或按不同比例存在于混合物中。
如本文所用，“生物纯菌株”指代不包含如下量的其他细菌菌株的菌株，所述量足以干扰所指菌株复制或通过正常细菌学技术可检测到。“分离的”在与本文所述的生物体和培养物连用时不仅包括生物纯菌株，而且包括以除了其在自然界中发现的那样外生长或保持的生物体的任何培养物。
如本文所用，产气荚膜梭菌(旧称为魏氏梭菌(C.welchii)或魏氏芽孢杆菌(Bacillus welchii))是梭菌属的革兰氏阳性、棒状、厌氧、形成孢子的致病细菌。
如本文所用，术语“接触”指代间接或直接施用菌株、青贮控制微生物(“SCM”)或公开于本文中的组合物于产品(包括但不限于饲料)。可使用的施用方法的实施例包括(但不限于)处理在包含细菌菌株、SCM或组合物的材料中处理产品，通过将细菌菌株、SCM或组合物与产品混合而直接施用，将细菌菌株、SCM或组合物喷洒到产品表面或将产品浸入到细菌菌株、SCM或组合物的制剂中。
如本文所用，术语“复合饲料”指代呈膳食、丸粒、坚果、饼状或碎屑(crumble)形式的商用饲料。复合饲料可由各种粗料和添加剂共混而得。根据靶动物的具体要求来配制这些共混物。
在一个实施方案中，“有效量”指代用以减少饲料(包括但不限于青贮和饲喂料)中梭菌生长的SCM的量。
在另一实施方案中，“有效量”指用以改善动物性能的DFM的量。如本文中所述或通过本领域中已知的其他方法来测量性能的改善。可以通过提供对包含DFM和外源酶的饲料的随意可及性而向动物给予有效量。还可以按一个或多个剂量来给予DFM和外源酶。
如本文所用，“能量消化性”指所消耗的饲料的总能量减去粪便的总能量，或所消耗的饲料的总能量减去在动物胃肠道的某一指定部分(例如回肠)上残留的消化物的总能量。如本文所用的可代谢能量指代表观代谢能量并且指所消耗饲料的总能量减去在粪便、尿液和消化的气体产物中所包含的总能量。能量消化性和可代谢能量可以按摄取的总能量与排泄于粪便中或在胃肠道指定部分中存在的消化物的总能量之差来测量，采用相同方法来测量养分的消化性，且适当地针对氮排泄来校正以计算饲料的可代谢能量。
如本文所用，术语“饲料(feed)”于本文中与“饲料原料(feedstuff)”是同义使用的。
如本文所用，“饲料原料”可包括饲料材料，其包括玉蜀黍或玉米、小麦、大麦、黑小麦、黑麦、稻米、树薯粉、高粱和/或任何副产品、以及富含蛋白质的组分(如豆粉、油菜籽粉、卡诺拉菜籽粕(canola meal)、棉籽粉、葵花籽粉、动物副产品粉)及其混合物。更优选地，饲料原料可包括动物脂肪和/或植物油。饲料原料还可包含另外的矿物质(如例如钙)和/或另外的维生素。
如本文所用，术语“饲料效率”指代当在一段时间中向动物随意喂饲或喂饲某一指定量的食物时发生的动物体重增加的量。
如本文所用，术语“饲料转化率”指代向动物喂饲的饲料使得动物体重增加某一指定量的量。
“降低的饲料转化率”或“提高的饲料转化率”指与当饲料不包含DFM或复合物时使动物体重增加某一指定量所需要的饲料的量相比，在饲料中使用DFM或复合物导致喂饲给动物以使动物体重增加相同量所需要的饲料的量更少。
如本文所用，术语“饲喂料”指代提供给动物(而不是需要动物自己寻觅饲养料)的任何食物。饲喂料包含已割取的植物。术语饲喂料包括干草、秸秆、青贮、压缩和颗粒饲料、油和混合日粮、以及发芽谷物和豆类。
如本文所用，“改善的动物性能”指与未喂饲细菌菌株、DMF、SCM或组合物的受试者相比，在本文公开的细菌菌株、DFM、SCM或组合物导致在受试者中存在增加的饲料效率、和/或增加的体重增加和/或减少的饲料转化率和/或饲料中养分或能量的提高的消化性和/或提高的氮存留和/或改善的用以避免坏死性肠炎负面影响的能力和/或改善的免疫应答。
如本文所用，“免疫应答”指本文公开的细菌菌株、SCM、DFM或组合物调节动物免疫应答的多种方式(包括抗体生产的增加、由细胞介导的免疫力上调、促炎性细胞因子上调及toll样受体信号传导增强)的一种。应理解，由本文公开的细菌菌株、SCM、DFM或组合物对胃肠道的免疫刺激可有利于保护宿主免遭疾病侵袭，且胃肠道的免疫抑制可有利于宿主，因为用于支持免疫功能的养分和能量很少。
如本文所用，术语“家畜”指代任何养殖动物。在一个实施方案中，家畜为如下中的一种或多种：反刍动物(如牛，例如母牛或公牛(包括小牛))、单胃动物(如家禽(包括肉鸡、小鸡和火鸡)、猪(包括小猪))、鸟、水产动物(如鱼、无胃鱼、胃鱼、淡水鱼(如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼(如锦鲤))、海水鱼(如海鲈鱼)、和甲壳类(如虾、蚌和扇贝))、马(包括赛马)、绵羊(包括羔羊)。
如本文所用，术语“微生物(microbial)”可与微生物(microorganism)互换使用。
如本文所用，“氮存留”指受试者从饮食保留氮作为身体质量的能力。当氮排泄超过每日摄入时出现负氮平衡且通常在肌肉损失时看出来。通常，尤其在生长期动物中，正氮平衡与肌肉生长相关。可以通过收集一段时间中的全部排泄物和尿液，将氮存留测量为摄入氮与排泄氮之差。应理解，排泄氮包括来自饲料的未消化的蛋白质、内源性蛋白质分泌物、微生物蛋白质和尿氮。
如本文所用，“养分消化性”意指养分从胃肠道或胃肠道的指定部分(例如小肠)处消失的部分。养分消化性可以作为对受试者所给予量与从受试者粪便所出量之差或对受试者所给予量与胃肠道(例如回肠)的指定部分上消化物中所残留量之差来测量。可以通过收集一段时间中的全部排泄物；或利用不为动物所吸收的惰性标记物，然后让研究人员计算在整个胃肠道或胃肠道的某一部分中消失的养分的量，由摄入养分与排泄养分之差来测量养分消化性。这种惰性标记物可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶灰分。消化性可表示为饲料中养分的百分比，或表示为饲料中每质量单位养分中可消化养分的质量单位。
如本文所用，“减少微生物生长”包括但不限于使微生物的生长减少至少大于1％的百分比或百分比范围。
如本文所用，“青贮”指代可喂饲给牛、绵羊和其他此类反刍动物(反刍咀嚼动物)或用作用于厌氧消化器的生物燃料原料的经发酵高湿存储饲喂料。它以称为饲料青贮法(ensilage)、制作青贮饲料(ensiling)或放入青贮窖(silaging)的工艺发酵并存储，且通常是使用整株绿色植物(不仅仅是谷物)由饲料作物(包括玉米、高粱或其他谷物)制成。青贮可由许多农作物制成，且可根据类型使用专用术语(燕麦是燕麦青贮、苜蓿是半干青贮-但下文可看到英国对术语半干青贮用法不同)。
如本文所用，利用随机扩增动态性DNA聚合酶链反应(RAPD-PCR)分析，“变体”的基因序列与所公开的菌株具有至少80％的同一性。基因序列的同一性程度可改变。在一些实施方案中，利用RAPD-PCR分析，变体的基因序列与所公开的菌株具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。可用于RAPD-PCR分析的六个引物包括如下：引物1(5'-GGTGCGGGAA-3')(SEQ ID No.1)、引物2(5'-GTTTCGCTCC-3')(SEQ ID No.2)、引物3(5'-GTAGACCCGT-3')(SEQ ID No.3)、引物4(5'-AAGAGCCCGT-3')(SEQ ID No.4)、引物5(5'-AACGCGCAAC-3')(SEQ ID No.5)、引物6(5'-CCCGTCAGCA-3')(SEQ ID No.6)。可利用Ready-to-GoTM RAPD分析珠(Amersham Biosciences，瑞典)(它被设计为预-混合、预分布型反应以进行RAPD分析)来进行RAPD分析。
如本文所用，术语“活微生物”是指具有新陈代谢活性或能够区别开的微生物。
在一个实施方案中，本公开涉及用于控制饲料原料中梭菌生长的细菌菌株、SCM、组合物及方法。在另一实施方案中，本公开涉及用于控制青贮中梭菌生长的细菌菌株、SCM、组合物及方法。
在一个实施方案中，本公开涉及用于改善动物性能的细菌菌株、DFM、组合物及方法。某些芽孢杆菌属菌株及其组合和组合物可用于提高动物的性能度量。
I.微生物
在一个实施方案中，本公开涉及一种或多种细菌菌株。在又另一个实施方案中，本公开涉及组合物，所述组合物包含一种或多种细菌菌株或由其组成或基本上由其组成。在一个实施方案中，组合物可以是异质混合物、均质混合物、粉末(冻干、冷冻干燥型)、或其任何组合。
A.青贮控制微生物
青贮控制微生物(SCM)是减少基质(包括但不限于饲料、青贮和饲喂料)腐败的微生物。在一个实施方案中，SCM包括活微生物。在另一个实施方案中，SCM包括活细菌。
在一个实施方案中，SCM可以是形成孢子的细菌，并且因此术语SCM可由孢子构成或包含孢子，所述孢子例如细菌孢子。因此，在一个实施方案中，如本文所用，术语“活微生物”可包括微生物孢子(如内生孢子)。
在另一个实施方案中，本公开涉及不包括或不包含微生物孢子(如内生孢子)的组合物。
在一个实施方案中，SCM为包含两种或更多种细菌菌株的组合。
在一个实施方案中，一个或多个细菌是分离的。在另一个实施方案中，SCM是细菌的生物纯培养物。在再另一个实施方案中，SCM是包括至少两种细菌菌株(不包含其他微生物)的组合物。在再另一个实施方案中，SCM是包括至少两种细菌菌株(不包含在自然环境中发现的其他微生物)的组合物。
在一个实施方案中，SCM可以是以分离或半分离形式使用的活微生物或不成活微生物。SCM与培养其的生长培养基组合或不组合使用。
在一个实施方案中，SCM在生长于合适的培养基时能够产生菌落形成单位。合适的培养基可包含饲料或饲料成分(或由其组成)。
在一个实施方案中，SCM在生长于合适的培养基时不能产生菌落形成单位。不论SCM在生长于合适的培养基时能够还是不能够产生菌落形成单位，细胞仍可以有代谢活性(例如，即使它们无法分裂)。
在一个实施方案中，SCM可作为不成活细胞给予。在一个实施方案中，SCM可作为活微生物给予。
在一个实施方案中，SCM可选自如下芽孢杆菌属物种：枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌。在一个实施方案中，SCM可以是芽孢杆菌属菌株。
在一个实施方案中，SCM可以是枯草芽孢杆菌。在一个实施方案中，SCM可选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌1104。
在另一个实施方案中，SCM可以是枯草芽孢杆菌。在再另一个实施方案中，SCM可以是枯草芽孢杆菌1781。在再另一个实施方案中，SCM可以是枯草芽孢杆菌747。
在另一个实施方案中，SCM是包括枯草芽孢杆菌747、1104、1541、1781、1999和2018的多株SCM。
a.SCM的配制
在一个实施方案中，SCM配制品包含各占50％的菌株1104和1781的芽孢杆菌属接种物。
在另一个实施方案中，SCM是包括枯草芽孢杆菌1104和1781及LAB菌株的多株SCM。LAB组合物包含30％Lp 115(植物乳杆菌)、30％Pj300(乳酸片球菌)、30％P751(戊糖片球菌)和10％屎肠球菌。
在另一个实施方案中，每克青贮的芽孢杆菌接种物的目标施用率的范围是从约5,000CFU/g到约5,000,000CFU/g。LAB接种物可以按约150,000CFU/g施用。
b.配量
在一个实施方案中，本文公开的SCM及组合物可设计为一次性施用的。在一个实施方案中，可将本文公开的SCM及组合物与基质(如青贮或饲喂料)混合以防止梭菌腐败。
有待组合使用的组合物(和其中的各组分)的最佳用量可取决于有待处理的产品和/或使产品与组合物接触的方法和/或所述组合物的预期用途。SCM的量应是用以有效且维持充分有效于减少基质腐败的充分量。
B.直接喂饲型微生物
直接喂饲型微生物(DFM)是改善动物性能的微生物。在一个实施方案中，DFM包括活微生物。在另一个实施方案中，DFM包括活细菌。
在一个实施方案中，DFM可以是形成孢子的细菌，并且因此术语DFM可由孢子构成或包含孢子，所述孢子例如细菌孢子。因此，在一个实施方案中，如本文所用，术语“活微生物”可包括微生物孢子(如内生孢子或分生孢子)。
在另一个实施方案中，本公开涉及不包括或不包含微生物孢子(如内生孢子)的组合物。
在一个实施方案中，DFM为包含两种或更多种细菌菌株的组合。
在一个实施方案中，一个或多个细菌是分离的。在另一个实施方案中，DFM是细菌的生物纯培养物。在再另一个实施方案中，DFM是包括至少两种细菌菌株(不包含其他微生物)的组合物。在再另一个实施方案中，DFM是包括至少两种细菌菌株(不包含在自然环境中发现的其他微生物)的组合物。
在一个实施方案中，DFM可以是以分离或半分离形式使用的活微生物或不成活微生物。DFM与培养其的生长培养基组合或不组合使用。
在一个实施方案中，DFM在生长于合适的培养基时能够产生菌落形成单位。合适的培养基可包含饲料或饲料成分(或由其组成)。
在一个实施方案中，DFM在生长于合适的培养基时不能产生菌落形成单位。不论DFM在生长于合适的培养基时能够还是不能够产生菌落形成单位，细胞仍可以有代谢活性(例如，即使它们无法分裂)。
在一个实施方案中，DFM可作为不成活细胞给予。
在一个实施方案中，DFM可以是枯草芽孢杆菌。在一个实施方案中，DFM可选自由以下组成的组：枯草芽孢杆菌747、1104、1541、1781、1999、2018。
在一个实施方案中，DFM是包括枯草芽孢杆菌747、1104、1541、1781、1999、2018的多株DFM。
a.DFM的配制
在一个实施方案中，可将一种或多种载体或其他成分添加至DFM。DFM可以按各种物理形式呈现，例如，作为外包衣(top dress)，作为用作浸液或用于添加至代乳品的水溶性浓缩物，明胶胶囊或凝胶。
在外包衣形式的一个实施方案中，将冷冻干燥的发酵产品添加至载体(如乳清、麦芽糖糊精、蔗糖、右旋糖、石灰石(碳酸钙)、稻壳、酵母培养物、干淀粉和/或硅铝酸钠)中。
在用于浸液或代乳品补充剂的水溶性浓缩物的一个实施方案中，将冷冻干燥的发酵产品添加至水溶性载体(如乳清、麦芽糖糊精、蔗糖、右旋糖、干淀粉、硅铝酸钠)，并且添加液体以形成浸液或将补充剂添加至乳或代乳粉。
在明胶胶囊形式的一个实施方案中，将冷冻干燥的发酵产品添加至载体(如乳清、麦芽糖糊精、糖、石灰石(碳酸钙)、稻壳、酵母培养物、干淀粉和/或硅铝酸钠)中。
在一个实施方案中，细菌和载体被封装于可降解性明胶胶囊中。在凝胶形式的一个实施方案中，将冷冻干燥的发酵产品添加至载体(如植物油、蔗糖、二氧化硅、聚山梨醇酯80、丙二醇、丁基化羟基茴香醚、柠檬酸、乙氧基喹和/或人工着色剂)以形成凝胶。
可视情况将一种或多种DFM与添加剂(包括但不限于生长基质、酶、糖、碳水化合物、提取物和促进生长的微量成分)的无水配制品混合。糖可包括如下：乳糖；麦芽糖；右旋糖；麦芽糊精；葡萄糖；果糖；甘露糖；塔格糖(tagatose)；山梨糖；棉子糖；和半乳糖。糖在50％-95％范围内(单独或呈组合形式)。提取物可包括在5％-50％范围内的酵母或干酵母发酵可溶物。生长基质可包括：在5％-25％范围内的胰酪胨(trypticase)；在5％-30％范围内的乳酸钠；和在1％-5％范围内的吐温80。碳水化合物可包括甘露醇、山梨醇、核糖醇和阿拉伯醇。碳水化合物在5％-50％范围内(单独地或呈组合形式)。微量成分可包括如下：在0.5％-5.0％范围内的碳酸钙；在0.5％-5.0％范围内的氯化钙；在0.5％-5.0％范围内的磷酸氢二钾；在0.5％-5.0％范围内的磷酸钙；在0.25％-1.00％范围内的锰蛋白盐；和在0.25％-1.0％范围内的锰。
为制备本文所述的DFM，可将一种或多种培养物和一种或多种载体(使用时)添加至带式或桨叶式混合机且混合约15分钟，但可延长或缩短定时。将所述组分共混，使得得到培养物和载体的均匀混合物。终产物优选是可流动的干粉。然后可将一种或多种DFM或包含它的组合物添加至动物饲料或饲料预混物，添加至动物的水，或以本领域已知的其他方式给予(优选是与本发明的酶同时给予)。动物用饲料可以补充本文所述的一种或多种DFM或本文所述的组合物。
在一个实施方案中，本文公开的DFM和组合物可呈浓缩物形式。通常，这些浓缩物包含相当高浓度的DFM。
可将呈浓缩物形式的粉末、颗粒和液体组合物用水稀释或重悬浮于水或其他合适的稀释剂(例如，合适的生长培养基，如乳或矿物油或植物油)中以得到即用型组合物。
可根据本领域中已知的方法制备呈浓缩物形式的本文公开的DFM和组合物。
b.配量
在一个实施方案中，本文公开的DFM和组合物提供在约108CFU/头/天到约5x109CFU/头/天的所选范围内的活细胞含量(菌落形成单位，CFU)。
在一个实施方案中，呈浓缩物形式的DFM可具有在至少109CFU/g到约1012CFU/g、或至少1011CFU/g到约1012CFU/g范围内的活细胞含量。
在一个实施方案中，本文公开的DFM和/或饲料添加剂组合物可设计为一次性给予或可设计为每天喂饲。有待组合使用的组合物(和其中的各组分)的最佳用量将取决于有待处理的产品和/或使产品与组合物接触的方法和/或所述组合物的预期用途。用于组合物中的DFM的量应是有效并且维持充分有效于改善喂饲包含所述组合物的饲料产品的动物的性能的充分量。这个有效性时间长度应长达至少使用产品(如饲料添加剂组合物或包含它的饲料)之时。
C.根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的保存物
芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018于2016年5月24日保存在农业研究服务培养物保藏所(Agricultural Research Service Culture Collection)(NRRL)(NorthUniversity Street 1815号，Peoria，Ill.，61604)且菌株747指定为登录号NRRL B-67257，菌株1104指定为NRRL B-67258，菌株1541指定为NRRL B-67260，菌株1781指定为NRRL B-67259及菌株2018指定为NRRL B-67261。菌株1999于2016年9月15日保存且指定为登录号NRRL B-67318。所有保存物都是依据用于专利程序目的的微生物保存的国际认可，在布达佩斯条约规定下制作的。
D.培养菌株的方法
可通过发酵细菌菌株生产芽孢杆菌属菌株。可通过扩大种子培养规模来开始发酵。这涉及重复且无菌地转移培养物达到越来越大的体积以充当发酵接种物，发酵是在大不锈钢发酵槽中于包含为达最佳生长所需要的蛋白质、碳水化合物和矿物质的培养基中进行。一种非限制性示例性培养基为胰酪胨大豆肉汤培养基(TSB)。将接种物添加至发酵容器后，控制温度及搅拌以使生长最大化。一旦培养物达到最大种群密度，就通过从发酵培养基中分离细胞来收获培养物。这通常通过离心来完成。
然后可确定培养物的计数。菌落形成单位(CFU)是从标准微生物接种平板方法得到的样品的活细胞计数。该术语是从单一细胞在接种于合适的培养基平板中时将会在琼脂培养基中生长且变为活群落的事实衍生的。因为多个细胞可产生一个活群落，故术语菌落形成单位是比细胞数更有用的单位测量。
在一个实施方案中，本文公开的芽孢杆菌属菌株可以在5x108CFU/ml与约5x1011CFU/ml之间发酵。
在至少一个实施方案中，使用2x109CFU/ml水平。通过离心收获细菌，然后去除上清液。上清液可用于本文描述的方法中。在至少一些实施方案中，将细菌沉淀。在至少一些实施方案中，将细菌冷冻干燥。在至少一些实施方案中，将细菌与载体混合。然而，没有必要在使用它们前冷冻干燥芽孢杆菌属。菌株还可与或不与防腐剂一起并且以浓缩、不浓缩或稀释形式来使用。
在一个实施方案中，本公开涉及一种生物纯培养物，该生物纯培养物包含浓度为约5x102CFU/ml到约5x109CFU/ml的本文公开的一种或多种芽孢杆菌属菌株，由其组成或基本上由其组成。
在一个实施方案中，本公开涉及一种培养物，该培养物包含浓度为选自由5x1011CFU/ml、5x1012CFU/ml、和5x1013CFU/ml组成的组的本文公开的一种或多种芽孢杆菌属菌株，由其组成或基本上由其组成。
在一个实施方案中，本公开涉及一种培养物，其包含浓度为5x1010CFU/ml到1012CFU/ml或5x1011CFU/ml到1012CFU/ml的本文公开的一种或多种芽孢杆菌属菌株，由其组成或基本上由其组成。
II.组合物
在一个实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含本文公开的一种或多种芽孢杆菌属菌株。在又另一个实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含一种或多种SCM。在又另一个实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含一种或多种DFM。
在一个实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含选自由枯草芽孢杆菌781和枯草芽孢杆菌747组成的组的一种或多种芽孢杆菌属菌株，其中该组合物不含其他微生物。
在一个实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含选自由枯草芽孢杆菌747、1781、1104、1541、1999及2018组成的组的一种或多种芽孢杆菌属菌株，其中所述芽孢杆菌属菌株在形成组合物之前是生物纯的。
在一个实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含选自由枯草芽孢杆菌1781和枯草芽孢杆菌747组成的组的一种或多种芽孢杆菌属菌株；(b)载体和(c)防腐剂。在另一个实施方案中，所述芽孢杆菌属菌株中的一种或多种的浓度为至少109CFU/ml。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含(a)选自由枯草芽孢杆菌1781、枯草芽孢杆菌747组成的组的一种或多种芽孢杆菌属菌株，和(b)饲料。在又另一个实施方案中，本公开涉及一种饲料，其包含(a)选自由枯草芽孢杆菌1104、1781和2018组成的组的一种或多种芽孢杆菌属菌株(b)青贮或饲喂料，其中所述饲料相较于不含芽孢杆菌属菌株的饲料具有更低的梭菌浓度。
III.饲料/饲料原料
在一个实施方案中，本文公开的菌株、SCM、DFM和组合物可用作饲料，或可用于制备饲料。在一个实施方案中，饲料为饲喂料。在另一个实施方案中，饲料为青贮。
已经长成同时仍是绿色的青贮、和养分可以经由自然“酸洗”方法保存。当青贮植物中的糖在无空气的密封容器(“筒仓”)中被细菌发酵时产生乳酸。依此方式保存的青贮称为“窖存的青贮”或“青贮”，且将保存长达三年而不会变质。青贮对于家畜来说是非常可口的且可在任何时间喂饲。
饲料可以呈溶液形式或呈固体形式-这取决于用途和/或施用模式和/或给予模式。当用作饲料(如功能性饲料)或用于制备饲料(如功能性饲料)时，本发明的组合物可结合如下中的一者或多者使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的佐剂、营养活性成分。
在一个实施方案中，将本文公开的菌株、SCM、DFM和组合物与饲料组分混合以形成饲料原料。在一个实施方案中，饲料可以是饲喂料或其预混物、或复合饲料或其预混物。在一个实施方案中，可将本文公开的菌株、SCM、DFM和组合物与复合饲料、复合饲料组分混合，或混合到复合饲料的预混物中或混合到饲喂料、饲喂料组分、或饲喂料的预混物中。
在再另一个实施方案中，可将本文公开的菌株、SCM、DFM和组合物与青贮、压缩粒化饲料、油和混合日粮以及发芽谷物和豆荚混合。可以从选自如下的植物中的一种或多种获得饲喂料：大麦、油菜(卡诺拉)、玉米(玉蜀黍)、粟、燕麦、高粱、大豆、小麦和豆类。
本文公开的任何饲料原料可包括选自下组的一种或多种饲料材料，所述组包括：a)谷类，如小粒谷物(如小麦、大麦、黑麦、燕麦和其组合)和/或大粒谷物(如玉米或高粱)；b)谷类副产品，如玉米谷蛋白粉(corn gluten meal)、湿饼(特别是基于玉米的湿饼)、酒糟(DDG)(特别是基于玉米的酒糟(cDDG))、酒糟可溶物(DDGS)(特别是基于玉米的酒糟可溶物(cDDGS))、麦麸、小麦粗粉(wheat middlings)、小麦次粉(wheat shorts)、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)从来源(如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉骨粉、马铃薯蛋白、乳清、椰子核、芝麻)获得的蛋白质；d)从植物和动物来源获得的油和脂肪；e)矿物质和维生素。
按重量计，饲料原料可包含至少10％、至少20％、至少30％或至少50％玉米粉和豆粕、或玉米和全脂大豆、或粗麦粉或葵花籽粕。
饲料原料可包含在约0与约40％之间的玉米DDGS。若饲料原料包含任何玉米DDGS，那么它可包含在约5％与约40％之间的玉米DDGS。对于家禽(玉米DDGS存在于饲料原料的情况)可包含平均在约7％至15％之间的玉米DDGS。对于猪(玉米DDGS存在于饲料原料的情况)可包含平均5％至40％的玉米DDGS。
饲料原料可包含呈单一谷物的玉米，在这种情形中所述饲料原料可包含在约35％至约80％之间的玉米。
在一个实施方案中，饲料可以是如下中的一种或多种：复合饲料及预混物，其包括丸粒、坚果或(牛)饼；作物或作物残渣：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、椰子核、糠(chaff)、甜菜渣；鱼粉；肉骨粉；糖蜜；油饼和压滤饼；寡醣；保存的饲养料植物：青贮；海草；种子和谷物(完整或通过粉碎、研磨等制备的)；发芽谷物和豆荚；酵母提取物。
在一个实施方案中，将本文公开的细菌菌株、SCM、DFM或组合物与产品(例如饲料原料)混合。在另一个实施方案中，细菌菌株、SCM、DFM或组合物可包含于饲料原料的乳液或原成分中。对于一些应用，使组合物可用于将要受到影响/将要被处理的产品的表面是很重要的。这使得组合物赋予以下有利特征中的一种或多种：性能益处。
在一个实施方案中，可应用本文公开的细菌菌株、SCM、DFM或组合物散布、涂布和/或浸渍产品(如饲料原料或饲料原料的原成分)。
在一个实施方案中，可以按合适的浓度添加本文公开的细菌菌株、SCM、DFM或组合物，如例如以最终饲料产品中提供如下日剂量的浓度：从约2X105CFU至约2X1011CFU、合适地从约2X106至约1X1010、或在约3.75X107CFU至约1X1010CFU之间。
在又另一个实施方案中，细菌菌株、SCM、DFM或组合物对高达约70℃、高达约85℃、或高达约95℃的热处理将是热稳定的。可进行所述热处理长达约1分钟、长达约5分钟、长达约10分钟、长达约30分钟、长达约60分钟。术语热稳定指在加热到指定温度前在添加剂中存在/有活性的细菌菌株或SCM的至少约75％在它冷却至室温后仍旧存在/有活性。在一个实施方案中，在加热到指定温度前在添加剂中存在且有活性的细菌菌株或SCM的至少约80％在它冷却到室温后仍旧存在且有活性。
在一个实施方案中，将本文公开的细菌菌株、SCM、DFM或组合物进行均质化以产生粉末。
IV.形式
在一个实施方案中，细菌菌株、SCM、DFM、或组合物及其他组分、和/或包含它们的饲料原料可按任何合适的形式使用。本文公开的细菌菌株、SCM、DFM或组合物可按固体或液体制剂或其替代品形式使用。固体制剂的例子包括粉末，糊剂，大丸(bolus)，胶囊，球粒，片剂，尘剂(dust)，和可以润湿、喷雾干燥或冷冻干燥的颗粒。液体制剂的例子包括但不限于水溶液、有机溶液或有机水溶液、悬浮液和乳液。
在一些应用中，可将本文公开的细菌菌株、SCM、DFM或组合物与饲料混合或在饮用水中给予。在一个实施方案中，用于包含于水中的剂量范围是约1X108CFU/动物/天到约1X1010CFU/动物/天，且更优选约1X109CFU/动物/天。
形式的适合的例子包括如下中的一种或多种：粉末、糊剂、大丸、球粒、片剂、丸剂、胶囊、卵状物(ovule)、溶液或悬浮液，可包含调味剂或着色剂；用于速释、迟释、修饰释放、缓释、脉冲释放或控释应用。
举例来说，如果本文公开的细菌菌株、SCM、DFM或组合物是以固体(如球粒化形式)使用，那么它还可包含如下中的一种或多种：赋形剂，如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，如淀粉(优选玉米、马铃薯或树薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲纤维素钠和某些复杂的硅酸盐：造粒粘合剂，如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。
用于制备所述形式的营养上可接受的载体的例子包括例如水、盐溶液、醇、有机硅、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸单甘油酯和脂肪酸二甘油酯、石油醚脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
在一个实施方案中，用于所述形式的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳汁糖或高分子量聚乙二醇。
对于水性悬浮液和/或酏剂，可将本文公开的细菌菌株、SCM、DFM或组合物与各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料、与乳化剂和/或助悬剂及与稀释剂(如水、丙二醇和甘油)及其组合进行组合。
在一个实施方案中，非吸湿性乳清可用作用于本文公开的细菌菌株、SCM、DFM或组合物(特别是细菌DFM)的载体，且是引发生长的很好的培养基。包含本文公开的细菌菌株、SCM、DFM或组合物的糊剂可用植物油和惰性胶凝成分配制。
在一个实施方案中，真菌产品可用作为载体的谷物副产品配制。
通过本领域技术人员已知的手段，诸如在顶喷式流化床涂布机中、在底喷式Wurster中或通过转鼓造粒(如高剪切造粒)、挤压、盘式涂布或在微量成分混合机中，可制备干粉或干粒。
在另一个实施方案中，可以包覆(例如囊封)本文公开的细菌菌株、SCM、DFM或组合物。在一些实施方案中，如在细菌菌株能够产生内生孢子的情况下，本文公开的细菌菌株、SCM、DFM或组合物可在没有任何包衣下提供。
V.用DFM处理饲料的方法
在一个实施方案中，本公开涉及减少饲料腐败的方法，其包括将本文公开的SCM或组合物以相较于未与SCM或组合物混合的饲料可有效减少青贮腐败的量与饲料混合。在一个实施方案中，饲料为青贮或饲喂料。
在一个实施方案中，与未用SCM或组合物处理的饲料相比，饲料的腐败减少了选自由以下组成的组的百分比：至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少、至少95％和至少99％。
在一个实施方案中，与未用SCM或组合物处理的饲料相比，饲料的腐败减少了2％到5％、或5％到10％、或10％到15％、或15％到20％、或20％到25％、或25％到30％、或30％到35％、或35％到40％、或40％到45％、或45％到50％、或50％到55％、或55％到60％、或60％到65％、或65％到70％、或70％到75％、或75％到80％、或80％到85％、或85％到90％、或90％到95％、或95％到99％。
在另一个实施方案中，本公开涉及控制饲料中微生物的生长的方法，其包括将本文公开的SCM或组合物以可有效控制饲料中微生物生长的量与饲料混合。
在另一个实施方案中，本公开涉及减少饲料中梭菌的生长的方法，其包括将本文公开的SCM或组合物以可有效控制饲料中梭菌生长的量与饲料混合。
在另一个实施方案中，本公开涉及减少饲喂料中梭菌的生长的方法，其包括：(a)将本文公开的SCM或组合物在液体中混合；(b)将液体与饲喂料混合；并且(c)将饲喂料放入密封容器中。
在另一个实施方案中，本公开涉及减少饲喂料中梭菌的生长的方法，其包括：(a)将本文公开的呈干燥形式的SCM或组合物与饲喂料混合；并且(b)将饲喂料放入密封容器中。
在另一个实施方案中，本公开涉及减少饲喂料中梭菌的生长的方法，其包括：(a)将本文公开的SCM或组合物喷洒于饲喂料上；并且(b)将饲喂料放入密封容器中。
在一个实施方案中，本公开涉及生产青贮的方法，其包括：(a)将本文公开的SCM或组合物在液体中混合；(b)将液体与饲喂料混合；(c)将饲喂料放入密封容器中持续一段合适的时间；并且(d)从容器获得青贮。
在另一个实施方案中，本公开涉及生产青贮的方法，其包括：(a)将本文公开的呈干燥形式的SCM或组合物与饲喂料混合；(b)将饲喂料放入密封容器中；并且(c)从容器获得或收获青贮。
在另一个实施方案中，本公开涉及生产青贮的方法，其包括：(a)将本文公开的SCM或组合物喷洒于饲喂料上；(b)将饲喂料放入密封容器中；并且(c)从容器获得或收获青贮。
在一个实施方案中，SCM或组合物是以选自由以下组成的组的饲喂料百分比混合或喷洒：5％-10％、10％-220％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-95％、以及95％-99％和100％饲喂料。
在一个实施方案中，SCM或组合物是以至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％和100％混合或喷洒。
在一个实施方案中，密封容器是筒仓。在另一个实施方案中，密封容器为塑料袋。
在一个实施方案中，所述青贮与从饲喂料获得的未用芽孢杆菌属菌株处理的青贮相比，具有更低的致病微生物(如梭菌)浓度。
在一个实施方案中，与未用SCM或组合物处理的饲料相比，梭菌的生长减少了选自由以下组成的组的百分比：至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少、至少95％和至少99％。
在一个实施方案中，与未用SCM或组合物处理的饲料相比，梭菌的生长减少了2％到5％、或5％到10％、或10％到15％、或15％到20％、或20％到25％、或25％到30％、或30％到35％、或35％到40％、或40％到45％、或45％到50％、或50％到55％、或55％到60％、或60％到65％、或65％到70％、或70％到75％、或75％到80％、或80％到85％、或85％到90％、或90％到95％、或95％到99％。
在一个实施方案中，梭菌是破伤风梭菌(Clostridium tetani)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、诺氏梭菌(Clostridium novyi)。
在一个实施方案中，梭菌是产气荚膜梭菌。
在另一个实施方案中，本公开涉及增加饲料保质期或保存期的方法，其包括将SCM或组合物以相较于未与SCM或组合物混合的饲料可有效增加饲料的保质期或储存期的量与饲料混合。
在一个实施方案中，SCM包括一种或多种芽孢杆菌属菌株。在一个实施方案中，芽孢杆菌属菌株处于选自由以下组成的组的浓度：5,000CFU/g、10,000CFU/g、15,000CFU/g、20,000CFU/g、25,000CFU/g、30,000CFU/g、35,000CFU/g、40,000CFU/g、45,000CFU/g、50,000CFU/g、55,000CFU/g、60,000CFU/g、65,000CFU/g、70,000CFU/g、75,000CFU/g、80,000CFU/g、85,000CFU/g、90,000CFU/g、95,000CFU/g和100,000CFU/g。在一个实施方案中，SCM是解淀粉芽孢杆菌1104和枯草芽孢杆菌1781的组合物。
在又另一个实施方案中，芽孢杆菌属菌株处于选自由以下组成的组的浓度：5,000CFU/g到10,000CFU/g。
在又另一个实施方案中，芽孢杆菌属菌株处于选自由以下组成的组的浓度：10,000CFU/g到75,000CFU/g。
在又另一个实施方案中，芽孢杆菌属菌株处于选自由以下组成的组的浓度：103CFU/g、104CFU/g、105CFU/g、106CFU/g、107CFU/g、108CFU/g、109CFU/g和1010CFU/g。
在另一个实施方案中，组合物还包含防腐剂。
在一个实施方案中，SCM是乳酸菌和芽孢杆菌属的组合物。在一个实施方案中，乳酸菌的CFU是组合物中芽孢杆菌属菌株的CFU的2倍。在又另一个实施方案中，乳酸菌的CFU是组合物中芽孢杆菌属菌株的CFU的3倍。
在一个实施方案中，乳酸菌的浓度选自由以下组成的组：50,000CFU/g、75,000CFU/g、100,000CFU/g、125,000CFU/g、150,000CFU/g、200,000CFU/g、250,000CFU/g、275,000CFU/g、300,000CFU/g、325,000CFU/g、350,000CFU/g、375,000CFU/g和400,000CFU/g。
在再另一个实施方案中，芽孢杆菌属菌株的浓度选自由以下组成的组：25,000CFU/g、50,000CFU/g、75,000CFU/g、100,000CFU/g、125,000CFU/g、150,000CFU/g和200,000CFU/g。
在又另一个实施方案中，SCM是包含解淀粉芽孢杆菌1104和枯草芽孢杆菌1781及一种或多种以下菌株的组合物：屎肠球菌、植物乳杆菌LP 115、乳酸片球菌PJ300和戊糖片球菌P751的组合物。在一个实施方案中，组合物中芽孢杆菌属菌株的浓度是从约25,000CFU/g到约75,000CFU/g。在另一个实施方案中，乳酸菌的浓度是从约75,000CFU/g到约225,000CFU/g。
VI.将DFM给予动物的方法
在一个实施方案中，本公开涉及提高动物性能度量的方法。在另一个实施方案中，本公开涉及提高反刍动物性能度量的方法。
在又另一个实施方案中，本公开涉及一种方法，其包括向动物给予包含DFM的组合物。在再另一个实施方案中，本公开涉及一种方法，其包括向动物给予有效量的包含DFM的组合物以提高动物的性能。可以将此有效量以一个或多个剂量给予动物。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物给予有效量的包含DFM的组合物以增加平均日采食量。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种方法，其包括向动物给予有效量的包含DFM的组合物以增加平均日增重。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种方法，其包括向动物给予有效量的包含DFM的组合物以增加总增重。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种方法，其包括向动物给予有效量的包含DFM的组合物以增加饲料转化，所述饲料转化可通过饲料:增量或增量:饲料来测量。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种方法，其包括向动物给予有效量的包含DFM的组合物以增加饲料效率。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种方法，其包括向动物给予有效量的包含DFM和外源饲料酶的组合物以降低死亡率。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种方法，其包括向动物给予有效量的包含DFM的组合物以降低实际生产成本。
在再另一个实施方案中，DFM是枯草芽孢杆菌1104或具有枯草芽孢杆菌1104的所有鉴定特征的菌株。在再另一个实施方案中，DFM是枯草芽孢杆菌1781或具有枯草芽孢杆菌1781的所有鉴定特征的菌株。在再另一个实施方案中，DFM是枯草芽孢杆菌747或具有枯草芽孢杆菌747的所有鉴定特征的菌株。在再另一个实施方案中，DFM是枯草芽孢杆菌1541或具有枯草芽孢杆菌1541的所有鉴定特征的菌株。在再另一个实施方案中，DFM是枯草芽孢杆菌1999或具有枯草芽孢杆菌1999的所有鉴定特征的菌株。在再另一个实施方案中，DFM是枯草芽孢杆菌2018或具有枯草芽孢杆菌2018的所有鉴定特征的菌株。
在又另一个实施方案中，DFM是包含枯草芽孢杆菌747和枯草芽孢杆菌1781的多菌株。
在一些实施方案中，将一种或多种芽孢杆菌属菌株以至少1x109CFU/动物/天的比率添加至动物的饲料中。在一些实施方案中，将一种或多种芽孢杆菌属菌株以约1x109CFU/g饲料至约1x1010CFU/g饲料喂饲。
本文所提供的DFM可例如作为包含菌株的培养物溶液、包含菌株的上清液或培养物溶液的细菌产品给予。
将本文公开的DFM或组合物给予动物可提高动物的性能。在一个实施方案中，将本文提供的DFM给予动物可增加平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)或饲料效率(增重:饲料；G:F)(统称为“性能度量”)。可改善一种或多于一种这些性能度量。
可以按许多方法中的一种将包含DFM的组合物给予动物。例如，组合物可呈固体形式作为兽医用药品给予，可分布于赋形剂(优选水)中且直接喂饲给动物，可与呈干燥形式的饲料材料物理混合，或组合物可形成于溶液中且此后喷洒到饲料材料上。向动物给予本文公开的组合物的方法被认为是在技术人员的技术范围内。
当与饲料材料组合使用时，用于反刍动物的饲料材料可以是谷物或干草或青贮或青草、或其组合。此类饲料材料包括玉米、干谷物、苜蓿、任何饲料成分、和食物或饲料工业副产品以及生物燃料工业副产品和玉米粉及其混合物。对于单胃动物饮食，饲料材料可包括玉米、豆粕、副产品(如具有可溶物的干酒糟(DDGS))和维生素/矿物质补充剂。还可使用其他饲料材料。
给予可能是在任何时间与或不与饲料一起的。然而，细菌优选地是与饲料一起给予或在紧接于饲料前给予。
因此，在至少一些实施方案中，通过补充旨在用于动物的饲料将有效量的包含DFM的组合物给予动物。如本文所用，“补充”指代将有效量的本文所提供的细菌直接掺入旨在用于动物的饲料中的行为。因此，在喂饲时动物摄入本文所提供的细菌。在一个实施方案中，本公开涉及芽孢杆菌属菌株。在一个实施方案中，芽孢杆菌属菌株是枯草芽孢杆菌1104。在再另一个实施方案中，芽孢杆菌属菌株是枯草芽孢杆菌1781。在再另一个实施方案中，芽孢杆菌属菌株是枯草芽孢杆菌747。在再另一个实施方案中，芽孢杆菌属菌株是枯草芽孢杆菌1541。在再另一个实施方案中，芽孢杆菌属菌株是枯草芽孢杆菌2018。
在一个实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含以下芽孢杆菌属菌株中的两种或更多种：枯草芽孢杆菌1104、枯草芽孢杆菌1781、枯草芽孢杆菌747、枯草芽孢杆菌1541、枯草芽孢杆菌1999和枯草芽孢杆菌2018。
在再另一个实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含枯草芽孢杆菌747和以下芽孢杆菌属菌株中的一种或多种：枯草芽孢杆菌1104、枯草芽孢杆菌1781、枯草芽孢杆菌1541、枯草芽孢杆菌1999和枯草芽孢杆菌2018。
在再另一个实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含枯草芽孢杆菌1781和以下芽孢杆菌属菌株中的一种或多种：枯草芽孢杆菌1104、枯草芽孢杆菌747、枯草芽孢杆菌1541、枯草芽孢杆菌1999和枯草芽孢杆菌2018。
在又另一个实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含枯草芽孢杆菌747和枯草芽孢杆菌1781。
在又另一个实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含选自由以下组成的组的一种或多种芽孢杆菌属菌株：枯草芽孢杆菌1104、枯草芽孢杆菌1781、及枯草芽孢杆菌747、枯草芽孢杆菌1541、枯草芽孢杆菌1999、枯草芽孢杆菌2018和防腐剂。
在又另一个实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含选自由以下组成的组的一种或多种芽孢杆菌属菌株：枯草芽孢杆菌1104、枯草芽孢杆菌1781、及枯草芽孢杆菌747、枯草芽孢杆菌1541、枯草芽孢杆菌1999、枯草芽孢杆菌2018和植物乳杆菌。
在另一个实施方案中，本公开涉及用于控制或减少饲料(包括但不限于饲喂料和青贮)腐败的芽孢杆菌属菌株、组合物和方法。
在另一个实施方案中，本公开涉及用于控制或减少微生物生长的芽孢杆菌属菌株、组合物和方法。在另一个实施方案中，公开用于控制或减少饲料(包括但不限于青贮和/或饲喂料)中微生物的生长的组合物和方法。
在再另一个实施方案中，公开了用于控制或减少梭菌的生长的芽孢杆菌属菌株、组合物和方法。在再另一个实施方案中，公开了用于控制或减少饲料(包括但不限于青贮和/或饲喂料)中梭菌的生长的芽孢杆菌属菌株、组合物和方法。
在一个实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含一种或多种控制腐败的微生物。在另一个实施方案中，本公开涉及一种组合物，其包含一种或多种控制腐败的微生物和一种或多种另外的组分。
在另一个实施方案中，本公开涉及用于改善动物性能的芽孢杆菌属菌株、组合物和方法。在另一个实施方案中，本公开涉及用于改善动物性能的一种或多种直接喂饲型微生物。
在另一个实施方案中，本公开涉及用于增加青贮或饲喂料的保质期的方法，其包括：将有效量的至少一种芽孢杆菌属菌株与青贮混合以增加青贮或饲喂料的保质期。在再另一个实施方案中，本公开涉及用于增加青贮或饲喂料的保质期的方法，其包括：将包含至少一种控制腐败的微生物的组合物与青贮混合以增加青贮或饲喂料的保质期。在再另一个实施方案中，本公开涉及用于增加青贮或饲喂料的保质期的方法，其包括：将包含至少两种控制腐败的微生物的组合物与青贮混合以增加青贮或饲喂料的保质期。
在又另一个实施方案中，本公开涉及一种控制青贮或饲喂料中微生物的生长的方法，其包括将有效量的至少一种芽孢杆菌属菌株与青贮或饲喂料混合。在一个实施方案中，制作青贮饲料之时将芽孢杆菌属菌株与青贮混合。
在再另一个实施方案中，本公开涉及一种控制青贮或饲喂料中微生物的生长的方法，其包括：将包含至少一种控制腐败的微生物的组合物与青贮或饲喂料混合以控制青贮或饲喂料中微生物的生长。在再另一个实施方案中，本公开涉及一种控制青贮或饲喂料中微生物的生长的方法，其包括：将包含至少两种控制腐败的微生物的组合物与青贮或饲喂料混合。
在又另一个实施方案中，本公开涉及用于改善动物性能的方法，其包括：向动物给予一种或多种芽孢杆菌属菌株、一种或多种直接喂饲型微生物或一种组合物以改善所述动物的性能(与未喂饲所述芽孢杆菌属菌株、直接喂饲型微生物或组合物的动物相比)。
在一个实施方案中，本公开涉及一种控制、或处理或防止动物中病原体的生长的方法，其包括：向动物给予一种或多种芽孢杆菌属菌株、一种或多种直接喂饲型微生物或一种组合物以控制、处理或防止病原体的生长(与未喂饲所述芽孢杆菌属菌株、直接喂饲型微生物或组合物的动物相比)。在一个实施方案中，病原体是产气荚膜梭菌。
在再另一个实施方案中，本公开涉及一种用于动物的饲料，其包含一种或多种芽孢杆菌属菌株、一种或多种DFM或一种或多种组合物。
优选实施方案的描述
实施例
实施例1：选择芽孢杆菌属菌株以抑制从饲料样品分离的产气荚膜梭菌和非产毒梭菌。
引言：制作青贮饲料工艺是通过促进存在于作物中的糖的厌氧发酵且将它们转化为保存材料的乳酸和其他有益酸性化合物来保存潮湿作物的营养价值的手段(Muck，2010)。尤其在未维持厌氧条件时或在厌氧发酵的乳酸终产物不足以充分减小pH时，潮湿作物可支持多种腐败微生物(如梭菌、芽孢杆菌、酵母和霉菌)的生长，所述腐败微生物造成养分价值下降(Driehuis和Oude Elferink，2000)。因此，制成青贮饲料的工艺允许在新鲜饲养料不可用时长期储存用于反刍家畜的喂饲材料。
因为许多变量会妨碍用于保存青贮的理想条件，所以乳酸菌通常用作青贮接种物以促进适当的发酵和青贮的最佳保存。乳酸菌在厌氧条件中快速地生长且变成存在于作物中的优势微生物，且通过产生乳酸(它们的发酵终产物)使得pH降低。通过减小pH到小于5来控制肠杆菌和芽孢杆菌，然而梭菌的抑制更难些，因为一些可以在更低的pH下生长(Driehuis，2013)。因此，在条件不太利于乳酸菌发酵时(如在高湿条件中)保存作物且防止梭菌腐败生物体的生长可能需要更低的pH(Driehuis和Oude Elferink，2000)。这些腐败梭菌在乳酸菌已经停止生长后易于负面影响青贮质量。
控制青贮中的梭菌生物体对于防止这些细菌有害地影响青贮质量非常重要。一般来说，梭菌腐败生物体分为三个组，包括使氨基酸发酵且产生氨、胺和二氧化碳的解蛋白梭菌，使碳水化合物发酵的丁酸梭菌组别，和使糖和乳酸发酵的酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)组别；后两个组别产生作为终产物的丁酸、乙酸、氢和二氧化碳(Muck，2010)。由于当存在梭菌活性时观察到牛摄食减少且因由梭菌发酵引起青贮营养质量下降，青贮中的梭菌活性是不希望的。乳酸通过产丁酸梭菌发酵为丁酸会导致干物质损失约50％且来自青贮饲料原料的总能损失18％(McDonald等人，1991)。另外，梭菌腐败生物体对牛的健康具有有害作用，此点通过当向牛喂饲梭菌青贮时出现较高的酸中毒发生率得以证实(Seglar，2003)。
使用乳酸菌作为青贮接种物以支持作物的保存且通过确保在低湿条件下收获作物并将作物制作青贮饲料来控制青贮中的梭菌发酵。然而，管理在收获时将会影响作物含湿量的农场条件(如天气)并不总是实用的或可行的，且制作青贮饲料常常在次优条件下进行。虽然芽孢杆菌被视为青贮腐败生物体，但已知芽孢杆菌属的成员可产生能够抑制周围环境中竞争细菌的抗微生物化合物，且已证实在控制梭菌生长中的效力。芽孢杆菌通常会在暴露于氧气后使得青贮的腐败加速，但很少会影响作物在筒仓的厌氧条件下的发酵(Muck，2010)。因此，需要可以在制作青贮饲料时添加的芽孢杆菌属菌株以控制在高湿条件下所收获的青贮中梭菌腐败生物体的生长。
材料和方法：从111种不同牛奶场收集饲养料样品。用无菌蛋白胨1:10稀释样品，在50℃下热休克10分钟，于无菌蛋白胨中计数继而倾注于具有D-环丝氨酸(400mg/L)的胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸(TSC)琼脂板上以选择梭菌。在37℃下厌氧孵育琼脂板24小时以使梭菌生长。若存在，那么将所分离的亚硫酸盐还原菌落挑入强化梭菌培养基(RCM)(Oxoid，CM0149)中且在37℃下厌氧孵育24小时。在孵育24小时后，将培养物转移(10％)到脑心浸液(BHI)肉汤培养基(BD，211059)且在37℃下厌氧孵育24小时。
在每孔含500μl假定梭菌培养物的96孔块中进行培养物DNA的提取。通过以4,700rpm离心10分钟且丢弃上清液来收获细胞。将细胞重悬浮于500μl的50mM EDTA-2Na(pH＝8.0)中。将300μl悬浮细胞的等分试样转移到新的96孔块并与来自鸡蛋白(西格马(Sigma)，L6876)溶液(100mg/ml，在50mM EDTA中)的20μl溶菌酶组合以裂解细菌细胞。在37℃下孵育96孔块1小时以裂解细菌细胞。在孵育后添加220μl裂解缓冲液(6M胍、20％Triton-X 100、10mM Tris-HCL，pH 7.5)，混合然后在室温下孵育15分钟。在孵育后向每孔添加20μl蛋白酶K(NEB，800U/mL)，混合并且在55℃下孵育30分钟以降解蛋白质。然后将细胞裂解物转移到96孔结合板(Promega，A2278)并且以4,700rpm离心5分钟。丢弃流通物，通过以4700rpms离心750μl柱洗涤溶液(Promega，A1318)持续1分钟30秒、并丢弃在每次旋转结束时的流通物来执行结合板柱的三次洗涤。将结合板以4,700rpm再离心10分钟以去除任何残留的乙醇。然后将干净的洗脱板置于结合板之下，并且用预热到55℃的200μl无核酸酶水(Promega，P1195)洗脱DNA。
利用聚合酶链式反应(PCR)，针对对产气荚膜梭菌具有特异性的毒素基因(α、β、ε及ι)筛选DNA。利用包含四个引物组的多重PCR(Yoo等人，1997)执行毒素基因的扩增(表1)。PCR混合物包含2.5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、0.5μM各引物、0.1μl InvitrogenTMPlatinumTM Taq DNA聚合酶、2.5μl DNA和无菌水，以达到总反应体积25μl。所述混合物经历94℃5分钟；接着30个循环：94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟；最后以72℃最终延伸3分钟来结束。使用片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)观察PCR产物以确定是否实现扩增。
表1.用于从所采集的梭菌分离株扩增产气荚膜梭菌毒素基因、产生来自产气荚膜梭菌阳性分离株的RAPD图谱、并且扩增来自非产毒梭菌代表菌的16S rRNA基因以用于DNA测序的引物。
利用随机扩增多态性DNA(RAPD)分析产生独特的菌株特异性遗传指纹以确定青贮梭菌分离株中的多样性。PCR包含5μl DNA、2.5μl RAPD引物2(10μM；表4)和添加至Ready-To-Go RAPD分析珠(Life Sciences，27-9500-01)的17.5μl无菌水。所述混合物经历95℃5分钟；接着45个循环：95℃1分钟、36℃1分钟、72℃2分钟；并且最后以72℃最终延伸5分钟来结束。在片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)上观察PCR产物以确定扩增模式且导入到BioNumerics生物信息学软件以用于分析。将RAPD模式与基于带的Dice相关分析法比较以确定RAPD模式间的相似性。
为鉴定非产毒梭菌分离株，使用引物27F-YM和1492R-Y(表1)，对青贮样品进行PCR反应以扩增rDNA的16S区。PCR混合物包含5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、1μl 50mMdNTP、0.4μM各引物(表3)、0.2μl InvitrogenTM PlatinumTM Taq DNA聚合酶、5μl DNA，并且添加无菌水以达到总反应体积50μl。所述混合物经历95℃4分钟；接着35个循环：95℃30秒、50℃30秒、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸7分钟来结束。对于扩增进行质量检查且将PCR产物送到MWG operon(http://www.operon.com/)以获得16S基因的序列。将序列与从EZbiocloud在线电子数据库(http://www.ezbiocloud.net/)获得的已知类型的细菌菌株进行比较。基于这些序列的比较，细菌鉴定指定给分离株。
对从饲料样品获得的产气荚膜梭菌分离株和非产毒梭菌分离株进行抗微生物筛选，以量测由发明人的经鉴定的芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018所产生的抗微生物细菌素的有效性。针对非产毒梭菌分离株测试菌株1999。通过使各菌株在32℃下于摇床中以150rpm于脑心浸液(BHI)肉汤培养基中生长24小时来收获细菌素。在孵育后执行将24小时培养物中的1％转移到新制的BHI肉汤培养基。然后，在32℃摇床中以150rpm孵育芽孢杆菌36-48小时。然后以14,000xg离心培养物20分钟，接着用0.2μm过滤器过滤上清液以去除任何残留细胞。
通过使从青贮样品分离的梭菌菌株在37℃下厌氧生长于强化梭菌培养基(RCM)中24小时执行细菌素浊度测定。将过夜培养物转移(1％)到无菌RCM且立刻用于测定。将每一梭菌分离株的四个重复样品铺板于无菌48孔反应板中。每一梭菌分离株的测试如下：600μl经孵育的梭菌培养物(阳性对照)、600μl RCM+70μl来自芽孢杆菌2018的细菌素、600μl RCM+70μl来自芽孢杆菌1104的细菌素、600μl RCM+70μl来自芽孢杆菌1541的细菌素、600μlRCM+70μl来自芽孢杆菌1781的细菌素、600μl RCM+70μl来自芽孢杆菌747的细菌素、和670RCM(阴性对照)。在37℃下厌氧孵育板24小时，然后使用BioTek Epoch微板分光光度计读取，其中在600nm波长下得到读数。在读取前，将70μl无菌水添加至阳性对照以确保每孔体积相等。从所有OD读数减去阴性对照的光密度读数，且使用每一细菌素处理来计算相对阳性对照的抑制百分比。
结果：来自111个不同地点的1,169个所测试饲料样品的梭菌枚举结果指示跨所有样品的平均梭菌水平(CFU/g)为4.2E+03CFU/g。个别样品是在<10到4.1E+06CFU/g范围内(表2)。
对总共3,958个假定梭菌分离株已针对指定的产气荚膜梭菌毒素基因进行了测试。从收集自>100个不同农业地点的青贮样品收获所测试的分离株。在筛选的3,958个分离株中，756个分离株(19.1％)针对毒素基因中的至少1个测试为阳性(图1)。756个毒素基因阳性分离株中有635个(84％)经鉴定为A型(仅α毒素)，然而，还在梭菌青贮分离株中检测到β、ε和ι毒素。
在经过成功扩增的590个饲料分离株中，遗传RAPD指纹图谱呈现多样性。从70个不同农场样品获得这些分离株，并且根据Dice相关方法基于75％相似性形成133个簇群。最大的簇群为40个分离株(9.7％)(图3)。
在3,958个分离株中，发现所采集的3,202个分离株(80.9％)为非产毒梭菌。来自非产毒梭菌的测序代表物(n＝345)显示两个主要梭菌组：双酶梭菌组(双酶副梭菌和解苯副梭菌(P.benzoelyticum))和拜氏梭菌组(二醇梭菌(C.diolis)、拜氏梭菌、还原铬梭菌(C.chromiireducens)、糖乙酸多丁醇梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)、橙色梭菌(C.puniceum)和糖丁基梭菌(C.saccharobutylicum))。拜氏梭菌物种是丙酮和丁醇的已知生产者。双酶梭菌物种是可产生1,3-丙二醇的罕见的机会性病原体。非产毒梭菌组的这两种主要鉴定类型占非产毒分离株的44％(图2)。
从每一单独农场的RAPD系统树图中选择代表(n＝196)以获得产气荚膜梭菌群体的多样性且进行抑制测定。单独地点的组合数据是由41个不同位点组成(表3)。利用细菌素浊度测定进行的抗微生物测试显示大多数饲料产气荚膜梭菌分离株使用从747、1104、1541、1781和2018收获得的细菌素被很好地抑制。来自菌株747、1104、1541、1781和2018中至少一种的细菌素能够抑制>60％的生长-所测试的196个分离株中126个(64.3％)的生长。至少一种细菌素菌株能够抑制所测试的196个分离株中97个(49.5％)的生长(大于79％)。菌株747跨所测试的所有产气荚膜梭菌青贮分离株具有54.9％的最高总体抑制。
从德克萨斯州的两个不同奶牛场收集得的非产毒梭菌分离株(n＝14)也进行了抑制检测。所测试的分离株是由双酶梭菌组、丁酸梭菌、拜氏梭菌组、戈氏梭菌(C.ghonii)、第三梭菌组和索氏梭菌组成(表4)。来自菌株747、1104、1541、1781、1999和2018中至少一种的细菌素能够抑制所测试的14个分离株中11个(78.6％)的生长(>60％)。至少一种细菌素菌株能够抑制所测试的14个分离株中9个(64.3％)的生长(大于79％)。菌株747跨所测试的所有非产毒梭菌青贮分离株具有77.2％的最高总体抑制。
表2.以地点计的样品数量及平均梭菌计数结果
表3.针对收获自芽孢杆菌属分离株的细菌素测试的每一青贮产气荚膜梭菌分离株的抑制百分比。
表4.针对从芽孢杆菌属分离株收获的细菌素从德克萨斯州饲料样品采集的非产毒梭菌分离株的抑制百分比。
结论：从111个不同地点采集饲料样品(1,169个)且测试其梭菌水平。这些水平在<10到4.1E+06CFU/g范围内，跨所有样品的平均枚举计数为4.2E+03CFU/g。所有地点(除了一个位点外，在此处仅采集到一个样品)具有可检测的梭菌水平。
从100个不同位置采集的3,958个假定梭菌分离株中，针对至少一种产气荚膜梭菌毒素基因测试有756个为阳性。这些阳性分离株中的大多数(84％)经过鉴定为A型。通过RAPD PCR对这些产毒梭菌分离株中590个进行遗传分析显示多样化群体由133个簇群组成。在极大程度上，分离株看起来不是基于地点分组的，但几个小簇群例外。有38个分离株没有与任何其他分离株集簇。
非产毒分离株(3202个)中的代表性分离株(345个)是通过16S rRNA基因的测序鉴定的。以拜氏梭菌组(23％)和双酶梭菌组(21％)为主。鉴定出的其他非产毒物种包括第三梭菌组、丁酸梭菌、索氏梭菌组、产气荚膜梭菌、泰瑞孢子菌(Terrisporobacter)物种、撒丁岛梭菌(C.sardiniense)组和Romboutsia lituserburensis。
针对产毒和非产毒梭菌二者的抗微生物筛选显示受到发明人鉴定的芽孢杆菌属菌株的抑制。芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018中的一种或多种抑制196个产气荚膜梭菌分离株中的126个。对于非产毒分离株，14个中的11个受到芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781、1999和2018中的一种或多种抑制。
实施例2：芽孢杆菌属菌株的组合对在迷你筒仓中将苜蓿制作青贮饲料的影响
引言：使用乳酸菌作为青贮接种物以支持作物的保存且通过确保在低湿条件下收获作物并将作物制作青贮饲料来控制青贮中的梭菌发酵。然而，管理在收获时将会影响作物含湿量的农场条件(如天气)并不总是实用的或可行的，且制作青贮饲料常常在次优条件下进行。虽然芽孢杆菌被视作青贮腐败生物体，然而已知芽孢杆菌属的成员可产生能够抑制周围环境中的竞争性细菌的抗微生物化合物，且已证实在控制梭菌生长中的效力。本研究的目的是确定根据本发明此实施方案的芽孢杆菌属菌株在控制在迷你筒仓中制成青贮饲料的苜蓿中梭菌腐败生物体的生长方面的效力。
材料和方法：将根据本发明此实施方案的芽孢杆菌属菌株中的两种即芽孢杆菌1104和1781以等比例组合为青贮接种物，且应用于饲养料以测试基于芽孢杆菌属的青贮接种物对饲养料材料的物理和化学性特性的影响以及其抑制与梭菌生长有关的二级发酵的能力。
利用如下青贮接种物处理来处理新鲜切割的苜蓿半干青贮：
1)不含青贮接种物的对照；
2)低剂量芽孢杆菌属接种物；
3)高剂量芽孢杆菌属接种物
4)乳酸菌(LAB)接种物
5)高剂量芽孢杆菌属接种物+LAB接种物
6)大剂量芽孢杆菌属接种物+LAB接种物
芽孢杆菌属接种物包含50％菌株(1104、1781)。LAB接种物包含30％Lp115(植物乳杆菌)、30％Pj300(乳酸片球菌)、30％P751(戊糖片球菌)和10％屎肠球菌。每克青贮的接种物目标施用率为：低剂量芽孢杆菌属为5,000CFU/g，高剂量芽孢杆菌属为50,000CFU/g，LAB为150,000CFU/g，高剂量芽孢杆菌属+LAB为对应芽孢杆菌属和LAB处理率的组合，大剂量芽孢杆菌属+LAB为5,000,000CFU/g芽孢杆菌属，和对应LAB率(表5)。
表5.应用于苜蓿饲养料材料的六个处理的接种物剂量
将各处理应用于1,000g饲养料材料且以39lb/ft3的密度包入具有密封盖的8盎司的玻璃球瓶中。将瓶储存于室温且在第7天、第30天、第78天、第90天和第182天将感兴趣的细菌和微生物(芽孢杆菌属、LAB、大肠杆菌和大肠菌群、梭菌、酵母和霉菌)进行枚举。在第0天测试未处理的样品(对照)的pH和存在的初始背景细菌。在各时间点，还记录每个经处理的样品的pH读数，且以已采样的为基础分析挥发性脂肪酸(VFA)的存在和浓度。评价以下VFA：乳酸、乙酸、丁酸、异丁酸、丙酸、戊酸和异戊酸。最终VFA结果报告为重复值的平均值。
结果和讨论：所有六个处理的pH水从第0天的5.70降到第30天的4.19-4.33(图4)。从第30天到第182天，所有处理的pH值仍大多稳定，其中对照在这一时间内相较于用接种物处理的样品维持最高pH水平。这一数据表示将芽孢杆菌属添加至所应用的青贮接种物中可有助于快速地降低pH，更快地开始发酵工艺，且可有助于在制作青贮饲料工艺的稳定阶段(或储存阶段)期间维持更稳定的pH。较低的pH可有助于抑制腐败细菌，提高饲料的消化性，减少蛋白水解酶，抑制厌氧细菌，改变发酵终产物，并且增加半纤维素的水解。
对照和其他五个处理中的大肠杆菌群体从第0天的43CFU/g降到第78天的10CFU/g(表6)。从第78天到第182天，对照和所有处理的大肠杆菌水平一致维持在10CFU/g。从第78天到第182天两个对照样品和其他四个处理样品的大肠菌群计数维持在10CFU/g。在所应用的青贮接种物处理中添加芽孢杆菌属不会导致制作青贮饲料工艺期间大肠杆菌或大肠菌群群体水平随时间而增加。
表6.每一处理大肠杆菌和大肠菌群群体随时间的变化
如所期望，未添加芽孢杆菌属的处理(对照和LAB)相较于已添加芽孢杆菌属的处理在测量时间历程内具有最低的芽孢杆菌属计数(图5)。总体上，在所有时间点处对照和LAB处理中的芽孢杆菌属水平低于其他五个处理中的水平。在整个试验中大剂量芽孢杆菌属+LAB处理相较于所有其他处理具有最高芽孢杆菌属生长水平。到试验结束时，经过接种物处理的所有样品相比对照在它们中检测到具有最高芽孢杆菌水平，表明存在于青贮接种物中的芽孢杆菌属菌株维持稳定且在整个制作青贮饲料工艺中几乎没有经历死亡。所有处理在制作青贮饲料60天后LAB群体减少2-3个log，表明正常乳酸菌发酵可保存饲养料(图6)。
从第0天到第30天所有处理和对照的酵母计数减少(图7)。在第30天后，在第78天，所有处理(除了高剂量芽孢杆菌属+LAB处理之外)具有10CFU/g的一致酵母计数且在实验的剩余部分中维持在此浓度(除了对照之外)。到第180天试验结束时在所测试的处理中对照具有最高酵母生长水平。这一数据表明添加芽孢杆菌属不会负面影响乳酸菌接种物抑制青贮保存期间酵母腐败生物体生长的能力。
从第0天到第30天所有处理和对照的霉菌计数减少(图8)。第30天后，在所测试时间点的剩余时间点所有处理具有10CFU/g的一致霉菌计数，然而，从第30天到第90天对照处理具有10CFU/g的霉菌计数且然后在第182天的最后平板培养可增加到3.5CFU/g。这些数据表明添加芽孢杆菌属不会负面影响乳酸菌接种物减少并控制霉菌腐败生物体生长的能力。
到实验结束时所有接种物处理(除了高剂量芽孢杆菌属+LAB之外)相较于对照具有类似或更低的梭菌水平(图9)。在所有处理中所测试的最后两个时间点，低剂量芽孢杆菌属具有最低梭菌水平。这一数据表明芽孢杆菌属本身和/或与LAB的组合相比当在不给予处理时更有效地控制梭菌生长和二级发酵。
从第0天到第78天所有处理中乳酸浓度增加，并且然后从第78天到第90天减小(图10)。在各时间点，对照相较于经过微生物接种物处理的样品显示一致更低的乳酸水平。在所测试的各时间点，相较于所有其他处理，在高剂量芽孢杆菌属+LAB处理中观察到最高的乳酸水平。从第0天到第78天所有处理样品中乙酸浓度增加，并且然后从第78天到第90天减小(图11)。对于所测试的各时间点，高剂量芽孢杆菌属+LAB处理相较于所有其他处理具有最高的乙酸浓度。除了第30天之外(其中大剂量处理中略低)，在所有时间点，LAB处理具有最低乙酸浓度。在所测试的任何时间点，在任何处理样品中未检测到丁酸、异丁酸、丙酸、戊酸和异戊酸的浓度。
结论：在最初30天内pH从起始点5.7显著降低。从此点开始，直到试验结束，pH读数在此范围是稳定的。经过芽孢杆菌属青贮接种物处理的所有样品相较于对照具有更低的pH。在制作青贮饲料的最初几天内乳酸菌增加，并且然后在实验历程中总体上减少，同时所有经过处理的样品的芽孢杆菌属水平高于对照的水平。在制作青贮饲料的最初30天内，酵母和霉菌计数均显著减少，并且然后趋于平坦直到试验结束。经过处理的样品具有比对照的计数低十倍的计数。到试验结束时经过处理的样品(除了高剂量芽孢杆菌属+LAB处理之外)具有略低的梭菌水平。
这一数据表明通过添加这些芽孢杆菌属菌株作为青贮接种物不会负面影响青贮保存。事实上，芽孢杆菌属本身和/或与LAB的组合相比当不给予处理时更有效地控制梭菌生长和二级发酵以及酵母和霉菌生长。
实施例3：作为青贮接种物的芽孢杆菌属菌株的组合对农场和迷你筒仓中苜蓿青贮的影响
引言：使用乳酸菌作为青贮接种物以支持作物的保存且通过确保在低湿条件下收获作物并将作物制作青贮饲料来控制青贮中的梭菌发酵。然而，管理在收获时将会影响作物含湿量的农场条件(如天气)并不总是实用的或可行的，且制作青贮饲料常常在次优条件下进行。虽然芽孢杆菌被视作青贮腐败生物体，然而已知芽孢杆菌属的成员可产生能够抑制周围环境中的竞争性细菌的抗微生物化合物，且已证实在控制梭菌生长中的效力。本研究的目的是确定根据本发明此实施方案的芽孢杆菌属菌株在控制在农场和迷你筒仓中制成青贮饲料的苜蓿中梭菌腐败生物体的生长方面的效力。
材料和方法：将根据本发明此实施方案的芽孢杆菌属菌株中的两种即芽孢杆菌1104和1781以等比例组合为青贮接种物，且应用于饲养料以测试基于芽孢杆菌属的青贮接种物对饲养料材料的物理和化学性特性的影响以及其抑制与梭菌生长有关的二级发酵的能力。
本研究利用二次收割的苜蓿青贮和由对照、应用于农场的青贮接种物处理、以实验室1x剂量应用的青贮接种物处理和以实验室10x剂量应用的青贮接种物处理成的处理。农场和实验室青贮接种物处理均包含12.5％菌株1104和1781)、7％屎肠球菌、22.5％的各LP 115(植物乳杆菌)、Pj300(乳酸片球菌)和P751(戊糖片球菌)。
农场和实验室所应用的青贮接种物处理的接种物目标施用率为200,000CFU/克作物，由150,000CFU乳酸菌(LAB)和50,000CFU芽孢杆菌属组成。10x剂量包括2,000,000CFU/克作物，由1,500,000CFU LAB和500,000CFU芽孢杆菌属组成。将实验室接种物处理应用到1,000g饲养料材料，并且将所有处理以39lb/ft3密度包装于具有密封盖的8盎司玻璃球瓶中。将瓶储存于室温下且在第8天、第14天、第28天、第60天、第90天和第176天对于感兴趣细菌(芽孢杆菌属、LAB、大肠杆菌和大肠菌群、梭菌、酵母和霉菌)进行枚举。
在第0天记录所有处理的初始背景细菌和pH。在各时间点，获得每个经处理的样品的pH读数，且以已采样的为基础分析VFA的存在和浓度。重复处理挥发性脂肪酸(包括乳酸、乙酸、丁酸、异丁酸、丙酸、戊酸和异戊酸)且进行测量。最终VFA结果报告为重复值的平均值。
结果和讨论：在处理给予后的初始测量中所有处理的pH降低且在研究历程中维持(图12)。观察到pH降低表明饲养料材料的活性发酵并且将芽孢杆菌属菌株加入青贮接种物中不会负面影响长期青贮保存。
除了10x青贮接种物剂量，接种物处理样品中大肠杆菌计数初始以相较于对照更快的速率减少(图13)。在第30天后，在实验期剩余部分中所有处理维持低大肠杆菌水平(10CFU/g)。观察到接种物处理样品在测试最初30天期间的大肠菌群水平类似地减少(图14)。这些数据表明在发酵工艺历程中处理可控制腐败生物体生长。
在研究期间，总芽孢杆菌属计数在6.7x103与4.7x105CFU/g之间的范围内，其中在10x青贮接种物剂量处理中观察到最高芽孢杆菌属计数。第60天后在经过处理的样品中建立芽孢杆菌属群落后，试验的剩余部分中芽孢杆菌属水平不会波动很多。这显示芽孢杆菌属在饲料样品中是稳定的并且在宽泛条件下维持活性(图15)。LAB计数从初始到第30天是增加的，并且然后在测试期的剩余部分逐渐减少(图16)。
在试验的最初30天期间，所有处理和对照的酵母群体减少，并且在实验期历程中维持在低水平(10CFU/g)(图17)。整个试验期中所有处理的霉菌计数类似地反应(图18)。这一数据表明发酵工艺控制青贮中的酵母和霉菌的腐败，并且青贮接种物在农场的实际应用导致与当在实验室的实验条件下应用接种物时相似的益处。
在试验的最初七天，所有处理的梭菌计数减少。(图19)。所有青贮接种物处理相较于未给予细菌接种物的对照处理具有相似或更低的梭菌计数。这一数据表明将青贮接种物添加至饲养料相比未给予处理时更有效地控制梭菌生长及二级发酵。
在来自所有处理的样品中在第14天和第90天相较于其他采样日观察到更高的乳酸浓度(图20)。在试验期结束时10x青贮接种物剂量相较于其他处理具有最高乳酸水平，表明此处理导致良好保存的饲养料。对于乙酸浓度观察到相似的趋势，其中乙酸水平从第0天到第90天增加了1-3倍(图21)。在实验室给予的10x青贮接种物剂量和在农场给予的青贮接种物相较于未处理的对照在试验期结束时均具有更大的乙酸浓度，表明这些处理提供更稳定的青贮保存发酵工艺。
结论：在处理给予后的初始测量中所有处理中的pH减小且在研究历程中维持。接种物处理样品中大肠杆菌和大肠菌群计数以相较于对照更快的速率减少(除了10x青贮接种物剂量)。经处理的样品相较于它们的未处理的对照具有略低的霉菌水平。
这一数据表明通过将这些芽孢杆菌属菌株添加至青贮接种物不会负面影响青贮保存。事实上，与LAB组合的芽孢杆菌属相比当未给予处理时更有效地促进大肠菌群的减少且防止霉菌生长。在处理给予后的初始测量中所有处理的pH降低且在研究历程中维持(图12)。观察到的pH的降低表明饲养料材料的活性发酵，并且将芽孢杆菌属菌株加入青贮接种物中不会负面影响长期青贮保存。
实施例4：农场应用包含芽孢杆菌属菌株的青贮接种物作为青贮中梭菌的生物控制剂
引言：使用乳酸菌作为青贮接种物以支持作物的保存且通过确保在低湿条件下收获作物并将作物制作青贮饲料来控制青贮中的梭菌发酵。然而，管理在收获时将会影响作物含湿量的农场条件(如天气)并不总是实用的或可行的，且制作青贮饲料常常在次优条件下进行。虽然芽孢杆菌被视作青贮腐败生物体，然而已知芽孢杆菌属的成员可产生能够抑制周围环境中的竞争性细菌的抗微生物化合物，且已证实在控制梭菌生长中的效力。本研究的目的是确定根据本发明此实施方案的芽孢杆菌属菌株在控制在农场和迷你筒仓中制成青贮饲料的苜蓿中梭菌腐败生物体的生长方面的效力。
材料和方法：研究包含芽孢杆菌属菌株的青贮接种物用于控制所保存饲养料中的梭菌腐败生物体的用途以证实接种物在农场应用时的效力。在本研究中使用二次收割的苜蓿半干青贮，并且处理由未处理的对照和收割时应用于农场饲养料的青贮接种物组成。青贮接种物包含12.5％芽孢杆菌1104和12.5％芽孢杆菌1781，7％屎肠球菌，LP 115(植物乳杆菌)、PJ 300(乳酸片球菌)和P 751(戊糖片球菌)各22.5％。青贮接种物的目标施用率为200,000CFU/克，由150,000CFU乳酸菌(LAB)和50,000CFU芽孢杆菌组成。将各处理应用于1,000g饲养料材料且以39lb/ft3的密度包入具有密封盖的8盎司的玻璃球瓶中。将瓶储存于室温下且在第0天、第7天、第14天、第28天、第58天、第91天和第175天对于感兴趣细菌(芽孢杆菌属、LAB、大肠杆菌和大肠菌群、梭菌、酵母和霉菌)进行枚举。在第0天测试经过处理的样品和未处理的样品的pH和存在于样品中的初始背景细菌。在各时间点，还记录各样品的pH读数且以已采样的为基础分析VFA(包括乳酸、乙酸、丁酸、异丁酸、丙酸、戊酸和异戊酸)的存在和浓度。VFA结果报告为重复值的平均值。
结果和讨论：在制作青贮饲料工艺期间，从第0天到第14天两种处理的饲养料样品的pH降低(图22)。实验期历程中维持此降低的pH水平。这一数据表示将芽孢杆菌属添加至所应用的青贮接种物中可有助于快速地降低pH，更快地开始发酵工艺，且可有助于在制作青贮饲料工艺的稳定阶段(或储存阶段)期间维持更稳定的pH。较低的pH可有助于抑制腐败细菌，提高饲料的消化性，减少蛋白水解酶，抑制厌氧细菌，改变发酵终产物，并且增加半纤维素的水解。
从第0天到第14天来自两种处理的样品中大肠杆菌和大肠菌群群体减少(图23；图24)。在第14天后，在剩余的测量中大肠杆菌和大肠菌群计数维持在不可检测的限度。相较于未处理的对照样品，第7天给予细菌处理的样品中大肠杆菌和大肠菌群水平更低，表明细菌处理相比未处理的样品更有效地控制这些腐败微生物。
芽孢杆菌属生物体以两种处理第0天在初始测量时的背景计数存在(图25)。到试验结束时，当饲养料经细菌青贮接种物处理时相较于第0天芽孢杆菌计数变高。另外，给予以细菌接种物呈现的芽孢杆菌不会导致芽孢杆菌计数在实验期历程中相较于未处理的对照差别很大，表明以接种物给予的芽孢杆菌属没有过度生长也没有充当腐败生物体。未处理的对照与在给予细菌青贮接种物时的LAB计数相似(图26)。
在制作青贮饲料后的最初7天内酵母和霉菌计数减少约5个log，且在实验期的剩余部分中两种处理维持很低(<1.0E+02CFU/g)(图27和图28)，表明有效的发酵工艺可保存饲养料。
在整个试验中经过接种物处理的样品的梭菌计数相似于或少于对照的梭菌计数(图29)。这一数据表明将青贮接种物添加至饲养料相比未给予处理时更有效地控制梭菌生长及二级发酵。
在整个研究过程中两种处理间的乳酸和乙酸水平相似(图30；图31)。在第90天观察到这些VFA水平有些波动，但在最后一个采样时间点在两种处理间再次观察到相似的值。
结论：在处理给予后的初始测量中所有处理中的pH减小且在研究历程中维持。接种物处理样品中大肠杆菌和大肠菌群计数以相较于对照更快的速率减少。经处理的样品相较于它们的未处理的对照具有略低的霉菌水平。在整个试验中经过接种物处理的样品的梭菌计数相似于或少于对照的梭菌计数。这一数据表明将青贮接种物添加至饲养料相比未给予处理时更有效地控制梭菌生长及二级发酵。
这一数据表明通过将这些芽孢杆菌属菌株添加至青贮接种物不会负面影响青贮保存。事实上，与LAB组合的芽孢杆菌属相比当未给予处理时更有效地促进大肠菌群的减少且防止霉菌生长。与当未给予处理时相比更有效地控制梭菌生长和二级发酵。
实施例5：选择芽孢杆菌属菌株以抑制从反刍动物粪便样品分离的产气荚膜梭菌和非产毒梭菌。(威斯康辛州)
引言：梭菌属是革兰氏阳性、形成孢子的细菌的属，它是胃肠道的常驻者。许多梭菌属物种与反刍动物中的肠道疾病(包括肠道出血综合征(HBS)，一种通常与产气荚膜梭菌A型水平的增加有关的疾病)相关(Dennison等人，2005)。虽然由梭菌引起的大多数肠道疾病是急性的且在畜群中偶发，但总体来说，预后不良且疾病的第一征象可能是死亡。基于最新结果，亚急性肠道梭菌疾病激发可能是比急性激发更广泛的问题。由于急性疾病激发的治疗的成功率低，需要更普遍地将重点放在预防措施上。
本研究的目的是表征反刍动物中梭菌的分布及多样性并使用新颖芽孢杆菌属菌株作为控制梭菌群体的方法来确保对这些分离株的抑制。
材料和方法：用无菌蛋白胨1:10稀释来自从威斯康辛州的24个农场收集的母牛、小母牛和小牛的粪便样品(228)，在60℃下热休克30分钟，于无菌蛋白胨中计数继而倾注于具有D-环丝氨酸(400mg/L)的胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸(TSC)琼脂板上以选择梭菌物种。在37℃下厌氧孵育琼脂板24小时。若存在，那么将分离的亚硫酸盐还原菌落经过计数得到总梭菌计数(CFU/g)，并且将代表性分离株挑入强化梭菌培养基(RCM)(Oxoid，CM0149)中且在37℃下厌氧孵育24小时。在孵育24小时后，将培养物转移(10％)到脑心浸液(BHI)肉汤培养基(BD，211059)且在37℃下厌氧孵育24小时。
在每孔含500μl假定梭菌培养物的96孔块中进行DNA的提取。通过以4,700rpm离心10分钟、去除上清液来收获细胞。将细胞重悬浮于500μl的50mM EDTA-2Na(pH＝8.0)中。将300μl悬浮细胞的等分试样转移到新的96孔块并与来自鸡蛋白(西格马(Sigma)，L6876)溶液(100mg/ml，在50mM EDTA中)的20μl溶菌酶组合以裂解细菌细胞。在37℃下孵育96孔块1小时以裂解细菌细胞。在孵育后添加220μl裂解缓冲液(6M胍、20％Triton-X 100、10mMTris-HCL，pH 7.5)，混合然后在室温下孵育15分钟。在孵育后向每孔添加20μl蛋白酶K(NEB，800U/mL)，混合并且在55℃下孵育30分钟以降解蛋白质。然后将细胞裂解物转移到96孔结合板(Promega，A2278)并且以4,700rpm离心5分钟。丢弃流通物，通过以4700rpms离心750μl柱洗涤溶液(Promega，A1318)持续1分钟30秒、丢弃在每次旋转结束时的流通物来执行结合板柱的三次洗涤。将结合板以4,700rpm再离心10分钟以去除任何残留的乙醇。然后将干净的洗脱板置于结合板之下，并且用200μl预热(55℃)的无核酸酶水(Promega，P1195)洗脱DNA。
利用聚合酶链式反应(PCR)，针对对产气荚膜梭菌具有特异性的毒素基因(α、β、ε及ι)筛选DNA。利用包含四个引物组的多重PCR(Yoo等人，1997)执行毒素基因的扩增(表1.)。PCR混合物包含2.5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、0.5μM各引物(表1.)、0.1μlInvitrogenTM PlatinumTM Taq DNA聚合酶、2.5μl DNA，添加无菌水以达到总反应体积25μl。所述混合物经历94℃5分钟；接着30个循环：94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟；最后以72℃最终延伸3分钟来结束。使用片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)观察PCR产物以确定是否实现扩增。若观察到一个或多个毒素基因，那么根据它们的毒素基因谱对各分离株进行毒素类型鉴定(Songer，1996)。利用阳性产气荚膜梭菌与总梭菌分离株的比率以基于总梭菌计数计算估计的产气荚膜梭菌计数。
利用对所选分离株进行的随机扩增多态性DNA(RAPD)分析产生独特的菌株特异性遗传指纹以确定产气荚膜梭菌分离株中的多样性。PCR包含5μl DNA、2.5μl RAPD引物2(10μM)(表1.)和添加至Ready-To-Go RAPD分析珠(Life Sciences，27-9500-01)的17.5μl无菌水。所述混合物经历95℃5分钟；接着45个循环：95℃1分钟、36℃1分钟、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸5分钟来结束。在片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)上观察PCR产物以确定扩增模式且导入到BioNumerics生物信息学软件以用于分析。将RAPD模式与基于带的Dice相关分析法比较以确定RAPD模式之间的相似性(作为监测分离株之间的多样性的方式)。
对从反刍动物样品获得的产气荚膜梭菌分离株进行抗微生物筛选以量测由发明人鉴定的芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018所产生的抗微生物细菌素的有效性。通过使各菌株在32℃下于摇床中以150rpm于脑心浸液(BHI)肉汤培养基中生长24小时来收获细菌素。在孵育后执行将24小时培养物中的1％转移到新制的BHI肉汤培养基。然后，在32℃摇床中以150rpm孵育芽孢杆菌36-48小时。然后以14,000xg离心培养物20分钟，接着用0.2μm过滤器过滤上清液以去除任何残留细胞。
通过使从反刍动物粪便样品分离的产气荚膜梭菌菌株在37℃下厌氧生长于RCM中24小时执行细菌素浊度测定。将过夜培养物转移(1％)到无菌RCM且立刻用于测定。对于各产气荚膜梭菌分离株，在无菌48孔反应板中运行至少六个孔，即600μl经接种的培养物(阳性对照)、600μl经接种的RCM+70μl细菌素(747、1104、1541、1781和2018)和670RCM(未接种的，阴性对照)。在37℃下厌氧孵育板24小时，然后使用BioTek Epoch微板分光光度计读取，在600nm波长下得到读数。从所有OD读数减去阴性对照的光密度读数，且使用阳性对照和每一细菌素处理来计算抑制百分比。
为鉴定不具有对产气荚膜梭菌具特异性的至少一种毒素基因的梭菌，对分离株DNA使用引物27F-YM和1492R-Y(表1)进行PCR反应来扩增rDNA的16S区。在不含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因的分离株的20％进行此举。PCR混合物包含5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、1μl 50mM dNTP、0.4μM各引物(表1.)、0.2μl InvitrogenTM PlatinumTM TaqDNA聚合酶、5μl DNA，并且添加无菌水以达到总反应体积50μl。所述混合物经历95℃4分钟；接着35个循环：95℃30秒、50℃30秒、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸7分钟来结束。对于扩增进行质量检查且将PCR产物送到gene wiz(https://www.genewiz.com)以获得16S基因的序列。将序列与从EZbiocloud在线电子数据库(http://www.ezbiocloud.net/)获得的已知类型的细菌菌株进行比较。基于这些序列的比较，细菌鉴定指定给分离株。
通过使从反刍动物粪便和饲料样品分离的非产毒的非产气荚膜梭菌的梭菌菌株在37℃下厌氧生长于RCM中24小时执行细菌素浊度测定。将过夜培养物转移(1％)到无菌RCM且立刻用于测定。对于各产气荚膜梭菌分离株，在无菌48孔反应板中运行至少六个孔，即600μl经接种的培养物(阳性对照)、600μl经接种的RCM+70μl细菌素(747、1104、1541、1781、1999和2018)和670RCM(未接种的，阴性对照)。在37℃下厌氧孵育板24小时，然后使用BioTek Epoch微板分光光度计读取，在600nm波长下得到读数。从所有OD读数减去阴性对照的光密度读数，且使用阳性对照和每一细菌素处理来计算抑制百分比。
结果：从24个威斯康辛州奶牛场(从此处分离得2914个假定的梭菌菌株作为威斯康辛州牛奶场梭菌多样性的代表)采集到粪便样品(228个)(表7.)。
梭菌枚举结果表明跨所有小牛粪便样品的平均梭菌水平CFU/g为1,240,000CFU/g，其中单独粪便样品是在<10CFU/g到28,900,000CFU/g范围内。然而，跨所有母牛粪便样品的平均梭菌水平CFU/g为59,200CFU/g，其中单独的粪便样品是在10CFU/g到6,700,000CFU/g范围内(图32.)。小牛(图33.)和母牛(图34.)的样品看起来均是在梭菌水平范围内。
产气荚膜梭菌枚举结果显示跨所有小牛粪便样品的平均产气荚膜梭菌水平CFU/g为495,000CFU/g，其中单独样品是在<10CFU/g到14,500,000CFU/g范围内。然而，跨所有母牛粪便样品的平均产气荚膜梭菌水平CFU/g为36,200CFU/g，其中单独样品是在<10CFU/g到3,690,000CFU/g范围内(图35.)。小牛(图36.)和母牛(图37.)的样品看起来均是在梭菌水平范围内。
对毒素多重PCR结果的分析显示哪些分离株包含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因。对来自母牛粪便样品的总共1,737个假定梭菌分离株已针对指定的产气荚膜梭菌毒素基因进行了测试。在筛选的1,737个母牛梭菌分离株中，1,219个分离株(70.2％)针对毒素基因中的至少1个测试为阳性。1,219个毒素基因阳性分离株中有1,203个(98.5％)经鉴定为A型(仅α毒素)，然而，还在母牛粪便梭菌分离株中检测到β、ε和ι毒素。对来自小牛粪便样品的总共1,177个假定梭菌分离株已针对指定的产气荚膜梭菌毒素基因进行了测试。在筛选的1,177个小牛梭菌分离株中，482个分离株(41.0％)针对毒素基因中的至少1个测试为阳性。482个毒素基因阳性分离株中有438个(90.9％)经鉴定为A型(仅α毒素)，然而，还在小牛粪便梭菌分离株中检测到β、ε和ι毒素。
在经过成功扩增的1,522个分离株中，遗传RAPD指纹图谱呈现多样性。从小牛粪便、母牛粪便和饲料收获所测试的分离株且并不基于样品类型或农场严格聚类。基于75％相似性，分离株依Dice相关方法形成170个簇群。最大簇群为148个分离株(9.7％)，并且由来自11个不同农场的分离株构成，所有(除了两个之外)的分离株为产气荚膜梭菌A型(图38.)。
从RAPD系统树图中选择代表以获得来自此地区的产气荚膜梭菌群体的多样性且进行抑制测定。利用细菌素浊度测定进行的抗微生物测试显示使用从747、1104、1541、1781和2018收获得的细菌素很好地抑制了大多数反刍动物粪便产气荚膜梭菌分离株。来自菌株747、1104、1541、1781和2018中至少一种的细菌素能够抑制所测试的271个分离株中244个(>60％)生长，代表产气荚膜梭菌群体(基于系统树图)总计93.4％的抑制(表8)。
在2,914个分离株中，发现所采集的1,207个分离株(41％)为非产毒梭菌。来自非产毒梭菌的测序代表(n＝183)显示三个主要梭菌组(图39.)。双酶梭菌组(双酶副梭菌和解苯副梭菌)、丁酸梭菌和拜氏梭菌组(二醇梭菌、拜氏梭菌、还原铬梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、橙色梭菌和糖丁基梭菌)，非产毒梭菌组的这三个主要组占非产毒分离株的47.5％(图40.)。
利用细菌素浊度测定选择来自威斯康辛州的具有已知16S鉴定的六个分离株以用于抗微生物测试。结果显示使用从747、1104、1541、1781、1999和2018收获的细菌素很好地抑制了所测试的大多数反刍动物非产毒分离株。来自菌株747、1104、1541、1781、1999和2018中至少一种的细菌素能够抑制所测试的6个分离株中6个(>60％)的生长(表9)。
讨论：粪便样品用作最容易得到的样品类型，以估计水平并且在反刍动物的消化系统中获得梭菌和产气荚膜梭菌的分离株。在从整个威斯康辛州采集的228个粪便样品中，所有(除了两个之外)包含可检测的梭菌水平。调查结果表明梭菌是以各种水平存在于几乎所有粪便样品中。从反刍动物样品收获得的大多数分离株(59％)包含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因。在92％的母牛粪便样品和77％的小牛粪便样品中检测到产气荚膜梭菌。梭菌和产气荚膜梭菌的大量存在表明整个威斯康辛州大多数反刍动物中具有亚急性肠道梭菌疾病激发的风险。根据RAPD遗传指纹，产气荚膜梭菌分离株是多样化的，但对样品类型或农场无特异性。产气荚膜梭菌的不同代表中大多数受到来自以下菌株747、1104、1541、1781或2018的至少一种细菌素抑制(>60％)。所述菌株中的至少一种抑制在所测试的271个分离株中的244个分离株(高于60％)，表示基于簇群在RAPD系统树图上的表示抑制总产气荚膜梭菌群体的93.4％。这表明芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018可抑制广泛多种产气荚膜梭菌分离株。芽孢杆菌属菌株并不限于特定的一种或多种梭菌菌株(如疫苗)，基于在RAPD系统树图中所观察到的遗传多样性，所述特定的一种或多种梭菌菌株可能缺失大批梭菌群体。非产毒梭菌的DNA测序揭示三个主要梭菌物种的鉴定。已知可产生1,3-丙二醇的双酶梭菌组(Leja等人，2014；Myszka等人，2012)，已知可产生丁醇和丙酮的拜氏梭菌组(Hou等人，2017)，和作为丁酸盐的生产者的丁酸梭菌(Weng等人，2015)。这些物种的代谢终产物的产生可在反刍动物中具有影响，降低奶牛性能参数，如产奶量。所测试的非产毒梭菌均受到来自以下菌株747、1104、1541、1781、1999或2018中至少一种的细菌素抑制(>60％)。非产毒梭菌的抑制还可以是芽孢杆菌属菌株用于提高性能参数的潜在作用模式。针对体外梭菌分离株的高抑制水平表明芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781、1999和2018的潜在的作用模式。
芽孢杆菌属菌株对梭菌群体提供预防作用，其可不但提高反刍动物效率而导致产奶量增加，而且防止产气荚膜梭菌急性水平从而减少消化系统性死亡的发生。所采集粪便样品中的梭菌和产气荚膜梭菌的高盛行率表明整个威斯康辛州中许多反刍动物中的效率改善的机会。本实施例显示从采集自威斯康辛州的反刍动物粪便样品和饲料样品得到的梭菌分离株的多样性。所测试的芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781、1999和2018可抑制威斯康辛州中所观察到的大多数梭菌多样性。根据本发明的此实施方案的产品可抑制从威斯康辛州反刍动物分离的产毒和非产毒梭菌二者，表明若呈直接喂饲型微生物(DFM)喂饲给奶牛那么具有反刍动物效率益处。
表7.从威斯康辛州奶牛场按照农场(24)和年龄(母牛或小牛)为分层采集粪便样品228个，对这些样品针对梭菌而枚举，测试产气荚膜梭菌，对分离株进行基因分型并测试抑制。
农场名称 母牛粪便 小牛粪便
农场WB 54 4
农场CR 6 4
农场G 8 2
农场S 4 4
农场DE 8 2
农场ME 3 6
农场MC 3 8
农场BE 6 2
农场GR 4 4
农场LP 4 4
农场AL 3 4
农场Z 4 5
农场HN 4 4
农场MV 4 4
农场HA 3 0
农场WO 0 7
农场AD 2 2
农场MI 4 4
农场BA 4 4
农场R 0 1
农场OO 0 9
农场GO 0 8
农场CW 5 0
农场CH 0 3
总计 133 95
表8：显示从威斯康辛州粪便样品分离的所测试的每种分离株的细菌素测定结果和该分离株的来源。基于每种处理的与阳性对照充分相比的生长百分比来计算抑制。
表9：显示来自威斯康辛州的所测试的每种分离株的细菌素测定结果。基于每种处理的与阳性对照充分相比的生长百分比来计算抑制。
实施例6：选择芽孢杆菌属菌株以抑制从反刍动物粪便样品分离的产气荚膜梭菌和非产毒梭菌。(德克萨斯州)
引言：梭菌属是革兰氏阳性、形成孢子的细菌的属，它是胃肠道的常驻者。许多梭菌属物种与反刍动物中的肠道疾病(包括肠道出血综合征(HBS)，一种通常与产气荚膜梭菌A型水平的增加有关的疾病)相关。虽然由梭菌引起的大多数肠道疾病是急性的且在畜群中偶发，但总体来说，预后不良且疾病的第一征象可能是死亡。基于最新结果，亚急性肠道梭菌疾病激发可能是比急性激发更广泛的问题。由于急性疾病激发的治疗的成功率低，需要更普遍地将重点放在预防措施上。
本研究的目的是表征反刍动物中梭菌的分布及多样性并使用新颖芽孢杆菌属菌株作为控制梭菌群体的方法来确保对这些分离株的抑制。
目标是确定母牛粪便样品和饲料样品中梭菌和产气荚膜梭菌的水平。确定非产毒梭菌群体的基因型。确定产气荚膜梭菌的基因型和测试代表性分离株对本发明人鉴定出的芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018的敏感性。本研究的目的是表征反刍动物中梭菌的分布及多样性并使用新颖芽孢杆菌属菌株作为控制梭菌群体的方法来确保对这些分离株的抑制。
材料和方法：用无菌蛋白胨1:10稀释来自从德克萨斯州的12个农场收集的母牛、小母牛和小牛的粪便样品(827)，在60℃下热休克30分钟，于无菌蛋白胨中计数继而倾注于具有D-环丝氨酸(400mg/L)的胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸(TSC)琼脂板上以选择梭菌物种。在37℃下厌氧孵育琼脂板24小时。若存在，那么将分离的亚硫酸盐还原菌落经过计数得到总梭菌计数(CFU/g)，并且将代表性分离株挑入强化梭菌培养基(RCM)(Oxoid，CM0149)中且在37℃下厌氧孵育24小时。在孵育24小时后，将培养物转移(10％)到脑心浸液(BHI)肉汤培养基(BD，211059)且在37℃下厌氧孵育24小时。
在每孔含500μl假定梭菌培养物的96孔块中进行DNA的提取。通过以4,700rpm离心10分钟、去除上清液来收获细胞。将细胞重悬浮于500μl的50mM EDTA-2Na(pH＝8.0)中。将300μl悬浮细胞的等分试样转移到新的96孔块并与来自鸡蛋白(西格马(Sigma)，L6876)溶液(100mg/ml，在50mM EDTA中)的20μl溶菌酶组合以裂解细菌细胞。在37℃下孵育96孔块1小时以裂解细菌细胞。在孵育后添加220μl裂解缓冲液(6M胍、20％Triton-X 100、10mMTris-HCL，pH 7.5)，混合然后在室温下孵育15分钟。在孵育后向每孔添加20μl蛋白酶K(NEB，800U/mL)，混合并且在55℃下孵育30分钟以降解蛋白质。然后将细胞裂解物转移到96孔结合板(Promega，A2278)并且以4,700rpm离心5分钟。丢弃流通物，通过以4700rpms离心750μl柱洗涤溶液(Promega，A1318)持续1分钟30秒、丢弃在每次旋转结束时的流通物来执行结合板柱的三次洗涤。将结合板以4,700rpm再离心10分钟以去除任何残留的乙醇。然后将干净的洗脱板置于结合板之下，并且用200μl预热(55℃)的无核酸酶水(Promega，P1195)洗脱DNA。
利用聚合酶链式反应(PCR)，针对对产气荚膜梭菌具有特异性的毒素基因(α、β、ε及ι)筛选DNA。利用包含四个引物组的多重PCR(Yoo等人，1997)执行毒素基因的扩增(表1.)。PCR混合物包含2.5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、0.5μM各引物(表1.)、0.1μlInvitrogenTM PlatinumTM Taq DNA聚合酶、2.5μl DNA，添加无菌水以达到总反应体积25μl。所述混合物经历94℃5分钟；接着30个循环：94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟；最后以72℃最终延伸3分钟来结束。使用片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)观察PCR产物以确定是否实现扩增。若观察到一个或多个毒素基因，那么根据它们的毒素基因谱对各分离株进行毒素类型鉴定(Songer，1996)。利用阳性产气荚膜梭菌与总梭菌分离株的比率以基于总梭菌计数计算估计的产气荚膜梭菌计数。
利用对所选分离株进行的随机扩增多态性DNA(RAPD)分析产生独特的菌株特异性遗传指纹以确定产气荚膜梭菌分离株中的多样性。PCR包含5μl DNA、2.5μl RAPD引物2(10μM)(表1.)和添加至Ready-To-Go RAPD分析珠(Life Sciences，27-9500-01)的17.5μl无菌水。所述混合物经历95℃5分钟；接着45个循环：95℃1分钟、36℃1分钟、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸5分钟来结束。在片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)上观察PCR产物以确定扩增模式且导入到BioNumerics生物信息学软件以用于分析。将RAPD模式与基于带的Dice相关分析法比较以确定RAPD模式之间的相似性(作为监测分离株之间的多样性的方式)。
对从反刍动物样品获得的产气荚膜梭菌分离株进行抗微生物筛选以量测由发明人鉴定的芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018所产生的抗微生物细菌素的有效性。通过使各菌株在32℃下于摇床中以150rpm于脑心浸液(BHI)肉汤培养基中生长24小时来收获细菌素。在孵育后执行将24小时培养物中的1％转移到新制的BHI肉汤培养基。然后，在32℃摇床中以150rpm孵育芽孢杆菌36-48小时。然后以14,000xg离心培养物20分钟，接着用0.2μm过滤器过滤上清液以去除任何残留细胞。
通过使从反刍动物粪便样品分离的产气荚膜梭菌菌株在37℃下厌氧生长于RCM中24小时执行细菌素浊度测定。将过夜培养物转移(1％)到无菌RCM且立刻用于测定。对于各产气荚膜梭菌分离株，在无菌48孔反应板中运行至少六个孔，即600μl经接种的培养物(阳性对照)、600μl经接种的RCM+70μl细菌素(747、1104、1541、1781和2018)和670RCM(未接种的，阴性对照)。在37℃下厌氧孵育板24小时，然后使用BioTek Epoch微板分光光度计读取，在600nm波长下得到读数。从所有OD读数减去阴性对照的光密度读数，且使用阳性对照和每一细菌素处理来计算抑制百分比。
为鉴定不具有对产气荚膜梭菌具特异性的至少一种毒素基因的梭菌物种，对分离株DNA使用引物27F-YM和1492R-Y(表1)进行PCR反应来扩增rDNA的16S区。在不含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因的分离株的20％进行此举。PCR混合物包含5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、1μl 50mM dNTP、0.4μM各引物(表1.)、0.2μl InvitrogenTM PlatinumTMTaq DNA聚合酶、5μl DNA，并且添加无菌水以达到总反应体积50μl。所述混合物经历95℃4分钟；接着35个循环：95℃30秒、50℃30秒、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸7分钟来结束。对于扩增进行质量检查且将PCR产物送到gene wiz(https://www.genewiz.com)以获得16S基因的序列。将序列与从EZbiocloud在线电子数据库(http://www.ezbiocloud.net/)获得的已知类型的细菌菌株进行比较。基于这些序列的比较，细菌鉴定指定给分离株。
通过使从反刍动物粪便和饲料样品分离的非产毒梭菌菌株在37℃下厌氧生长于RCM中24小时执行细菌素浊度测定。将过夜培养物转移(1％)到无菌RCM且立刻用于测定。对于各产气荚膜梭菌分离株，在无菌48孔反应板中运行至少六个孔，即600μl经接种的培养物(阳性对照)、600μl经接种的RCM+70μl细菌素(747、1104、1541、1781、1999和2018)和670RCM(未接种的，阴性对照)。在37℃下厌氧孵育板24小时，然后使用BioTek Epoch微板分光光度计读取，在600nm波长下得到读数。从所有OD读数减去阴性对照的光密度读数，且使用阳性对照和每一细菌素处理来计算抑制百分比。
结果：从12个德克萨斯州农场(从此处分离得7,046个假定的梭菌菌株作为德克萨斯州梭菌多样性的代表)采集到粪便样品(827个)(表10.)。
梭菌枚举结果表明跨所有小牛粪便样品的平均梭菌水平CFU/g为1,110,000CFU/g，其中单独粪便样品是在10CFU/g到17,300,000CFU/g范围内。然而，跨所有母牛粪便样品的平均梭菌水平CFU/g为59,700CFU/g，其中单独的粪便样品是在<10CFU/g到35,500,000CFU/g范围内(图41.)。小牛(图42.)和母牛(图43.)的样品看起来均是在梭菌水平范围内。
产气荚膜梭菌枚举结果显示跨所有小牛粪便样品的平均产气荚膜梭菌水平CFU/g为353,000CFU/g，其中单独样品是在<10CFU/g到4,020,000CFU/g范围内。然而，跨所有母牛粪便样品的平均产气荚膜梭菌水平CFU/g为56,100CFU/g，其中单独样品是在<10CFU/g到35,500,000CFU/g范围内(图44.)。小牛(图45.)和母牛(图46.)的样品看起来均是在梭菌水平范围内。
对毒素多重PCR结果的分析显示哪些分离株包含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因。对来自粪便样品的总共7,046个假定梭菌分离株已针对指定的产气荚膜梭菌毒素基因进行了测试。在筛选的7,046个梭菌分离株中，3,697个分离株(52.5％)针对毒素基因中的至少1个测试为阳性。3,697个毒素基因阳性分离株中有3,588个(97％)经鉴定为A型(仅α毒素)，然而，还在粪便梭菌分离株中检测到β、ε和ι毒素。
在经过成功扩增的3,460个分离株中，遗传RAPD指纹图谱呈现多样性。从小牛粪便、母牛粪便和饲料收获所测试的分离株且并不基于样品类型或农场严格聚类。基于75％相似性，分离株依Dice相关方法形成513个簇群。
从RAPD系统树图中选择代表以获得来自此地区的产气荚膜梭菌群体的多样性且进行抑制测定。利用细菌素浊度测定进行的抗微生物测试显示使用从747、1104、1541、1781和2018收获得的细菌素很好地抑制了大多数反刍动物粪便产气荚膜梭菌分离株。来自菌株747、1104、1541、1781和2018中至少一种的细菌素能够抑制所测试的983个分离株中877个(大于60％)生长，代表产气荚膜梭菌群体(基于系统树图)总计92.7％的抑制(表11.)。
在7,046个分离株中，发现所采集的3,349个分离株(47.5％)为非产毒梭菌。来自非产毒梭菌的测序代表(n＝215)显示两个主要梭菌组。双酶梭菌组(双酶副梭菌和解苯副梭菌)和拜氏梭菌组(二醇梭菌、拜氏梭菌、还原铬梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、橙色梭菌和糖丁基梭菌)，非产毒梭菌组的这两个主要组占非产毒分离株的52.1％(图47.)。
利用细菌素浊度测定选择来自德克萨斯州的具有已知16S鉴定的非产毒分离株(n＝105)以用于抗微生物测试。选择分离株以涵盖非产毒分离株的多样性表示。结果显示使用从747、1104、1541、1781、1999和2018收获的细菌素很好地抑制了所测试的大多数反刍动物非产毒分离株。来自菌株747、1104、1541、1781、1999和2018中至少一种的细菌素能够抑制所测试的105个分离株中71个(>60％)的生长(表12.)。
讨论：粪便样品用作最容易得到的样品类型，以估计水平并且在反刍动物的消化系统中获得梭菌和产气荚膜梭菌的分离株。在从整个德克萨斯州采集的827个粪便样品中，所有(除了一个之外)包含可检测的梭菌水平。调查结果表明梭菌是以各种水平存在于几乎所有粪便样品中。从反刍动物样品收获得的大多数分离株(52.5％)包含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因。在86％的母牛粪便样品和60％的小牛粪便样品中检测到产气荚膜梭菌。梭菌和产气荚膜梭菌的大量存在表明整个德克萨斯州大多数反刍动物中具有亚急性肠道梭菌疾病激发的风险。根据RAPD遗传指纹，产气荚膜梭菌分离株是多样化的，但对样品类型或农场无特异性。产气荚膜梭菌的不同代表中大多数受到来自以下菌株747、1104、1541、1781或2018的至少一种细菌素抑制(>60％)。所述菌株中的至少一种抑制在所测试的983个分离株中的877个分离株(高于60％)，表示基于簇群在RAPD系统树图上的表示抑制产气荚膜梭菌群体的92.7％。这表明芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018可抑制广泛多种产气荚膜梭菌分离株。芽孢杆菌属菌株并不限于特定的一种或多种梭菌菌株(如疫苗)，基于在RAPD系统树图中所观察到的遗传多样性，所述特定的一种或多种梭菌菌株可能缺失大批梭菌群体。非产毒梭菌的DNA测序揭示两个主要梭菌物种的鉴定。已知可产生1,3-丙二醇的双酶梭菌组(Leja等人，2014；Myszka等人，2012)和已知可产生丁醇和丙酮的拜氏梭菌组(Hou等人，2017)。这些物种的代谢终产物的产生可在反刍动物中具有影响，降低奶牛性能参数，如产奶量。所测试的非产毒梭菌分离株大多数(71/105)受到来自以下菌株747、1104、1541、1781、1999或2018中至少一种的细菌素抑制(大于60％)。非产毒梭菌的抑制还可以是芽孢杆菌属菌株用于提高性能参数的潜在作用模式。针对体外梭菌分离株的高抑制水平表明芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781、1999和2018的潜在的作用模式。
芽孢杆菌属菌株对梭菌群体提供预防作用，其可不但提高反刍动物效率而导致产奶量增加，而且防止产气荚膜梭菌急性水平从而减少消化系统性死亡的发生。所采集粪便样品中的梭菌和产气荚膜梭菌的高盛行率表明整个德克萨斯州中许多反刍动物中的效率改善的机会。本实施例显示从采集自德克萨斯州的反刍动物粪便样品和饲料样品得到的梭菌分离株的多样性。所测试的芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781、1999和2018可抑制德克萨斯州中所观察到的大多数梭菌多样性。根据本发明的此实施方案的产品可抑制从德克萨斯州反刍动物分离的产毒和非产毒梭菌二者，表明若呈直接喂饲型微生物(DFM)喂饲给奶牛那么具有反刍动物效率益处。
表10.从德克萨斯州农场按照农场(12)和年龄(母牛或小牛)为分层采集粪便样品827个，对这些样品针对梭菌而枚举，测试产气荚膜梭菌，对分离株进行基因分型并测试抑制。
表11：显示从德克萨斯州粪便样品分离的所测试的每种分离株的细菌素测定结果和该分离株的来源。基于每种处理的与阳性对照充分相比的生长百分比来计算抑制。
表12：显示来自德克萨斯州的所测试的每种分离株的细菌素测定结果。基于每种处理的与阳性对照充分相比的生长百分比来计算抑制。
实施例7：选择芽孢杆菌属菌株以抑制从反刍动物粪便样品分离的产气荚膜梭菌和非产毒梭菌。(上中西部)。
引言：梭菌属是革兰氏阳性、形成孢子的细菌的属，它是胃肠道的常驻者。许多梭菌属物种与反刍动物中的肠道疾病(包括肠道出血综合征(HBS)，一种通常与产气荚膜梭菌A型水平的增加有关的疾病)相关。虽然由梭菌引起的大多数肠道疾病是急性的且在畜群中偶发，但总体来说，预后不良且疾病的第一征象可能是死亡。基于最新结果，亚急性肠道梭菌疾病激发可能是比急性激发更广泛的问题。由于急性疾病激发的治疗的成功率低，需要更普遍地将重点放在预防措施上。
本研究的目的是表征反刍动物中梭菌的分布及多样性并使用新颖芽孢杆菌属菌株作为控制梭菌群体的方法来确保对这些分离株的抑制。
材料和方法：用无菌蛋白胨1:10稀释来自从上中西部地区的4个农场收集的母牛、小母牛和小牛的粪便样品(248)，在60℃下热休克30分钟，于无菌蛋白胨中计数继而倾注于具有D-环丝氨酸(400mg/L)的胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸(TSC)琼脂板上以选择梭菌物种。在37℃下厌氧孵育琼脂板24小时。若存在，那么将分离的亚硫酸盐还原菌落经过计数得到总梭菌计数(CFU/g)，并且将代表性分离株挑入强化梭菌培养基(RCM)(Oxoid，CM0149)中且在37℃下厌氧孵育24小时。在孵育24小时后，将培养物转移(10％)到脑心浸液(BHI)肉汤培养基(BD，211059)且在37℃下厌氧孵育24小时。
在每孔含500μl假定梭菌培养物的96孔块中进行DNA的提取。通过以4,700rpm离心10分钟、去除上清液来收获细胞。将细胞重悬浮于500μl的50mM EDTA-2Na(pH＝8.0)中。将300μl悬浮细胞的等分试样转移到新的96孔块并与来自鸡蛋白(西格马(Sigma)，L6876)溶液(100mg/ml，在50mM EDTA中)的20μl溶菌酶组合以裂解细菌细胞。在37℃下孵育96孔块1小时以裂解细菌细胞。在孵育后添加220μl裂解缓冲液(6M胍、20％Triton-X 100、10mMTris-HCL，pH 7.5)，混合然后在室温下孵育15分钟。在孵育后向每孔添加20μl蛋白酶K(NEB，800U/mL)，混合并且在55℃下孵育30分钟以降解蛋白质。然后将细胞裂解物转移到96孔结合板(Promega，A2278)并且以4,700rpm离心5分钟。丢弃流通物，通过以4700rpms离心750μl柱洗涤溶液(Promega，A1318)持续1分钟30秒、丢弃在每次旋转结束时的流通物来执行结合板柱的三次洗涤。将结合板以4,700rpm再离心10分钟以去除任何残留的乙醇。然后将干净的洗脱板置于结合板之下，并且用200μl预热(55℃)的无核酸酶水(Promega，P1195)洗脱DNA。
利用聚合酶链式反应(PCR)，针对对产气荚膜梭菌具有特异性的毒素基因(α、β、ε及ι)筛选DNA。利用包含四个引物组的多重PCR(Yoo等人，1997)执行毒素基因的扩增(表1.)。PCR混合物包含2.5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、0.5μM各引物(表1.)、0.1μlInvitrogenTM PlatinumTM Taq DNA聚合酶、2.5μl DNA，添加无菌水以达到总反应体积25μl。所述混合物经历94℃5分钟；接着30个循环：94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟；最后以72℃最终延伸3分钟来结束。使用片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)观察PCR产物以确定是否实现扩增。若观察到一个或多个毒素基因，那么根据它们的毒素基因谱对各分离株进行毒素类型鉴定(Songer，1996)。利用阳性产气荚膜梭菌与总梭菌分离株的比率以基于总梭菌计数计算估计的产气荚膜梭菌计数。
利用对所选分离株进行的随机扩增多态性DNA(RAPD)分析产生独特的菌株特异性遗传指纹以确定产气荚膜梭菌分离株中的多样性。PCR包含5μl DNA、2.5μl RAPD引物2(10μM)(表1.)和添加至Ready-To-Go RAPD分析珠(Life Sciences，27-9500-01)的17.5μl无菌水。所述混合物经历95℃5分钟；接着45个循环：95℃1分钟、36℃℃1分钟、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸5分钟来结束。在片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)上观察PCR产物以确定扩增模式且导入到BioNumerics生物信息学软件以用于分析。将RAPD模式与基于带的Dice相关分析法比较以确定RAPD模式之间的相似性(作为监测分离株之间的多样性的方式)。
对从反刍动物样品获得的产气荚膜梭菌分离株进行抗微生物筛选以量测由发明人鉴定的芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018所产生的抗微生物细菌素的有效性。通过使各菌株在32℃下于摇床中以150rpm于脑心浸液(BHI)肉汤培养基中生长24小时来收获细菌素。在孵育后执行将24小时培养物中的1％转移到新制的BHI肉汤培养基。然后，在32℃摇床中以150rpm孵育芽孢杆菌36-48小时。然后以14,000xg离心培养物20分钟，接着用0.2μm过滤器过滤上清液以去除任何残留细胞。
通过使从反刍动物粪便样品分离的产气荚膜梭菌菌株在37℃下厌氧生长于RCM中24小时执行细菌素浊度测定。将过夜培养物转移(1％)到无菌RCM且立刻用于测定。对于各产气荚膜梭菌分离株，在无菌48孔反应板中运行至少六个孔，即600μl经接种的培养物(阳性对照)、600μl经接种的RCM+70μl细菌素(747、1104、1541、1781和2018)和670RCM(未接种的，阴性对照)。在37℃下厌氧孵育板24小时，然后使用BioTek Epoch微板分光光度计读取，在600nm波长下得到读数。从所有OD读数减去阴性对照的光密度读数，且使用阳性对照和每一细菌素处理来计算抑制百分比。
为鉴定不具有对产气荚膜梭菌具特异性的至少一种毒素基因的梭菌，对分离株DNA使用引物27F-YM和1492R-Y(表1)进行PCR反应来扩增rDNA的16S区。在不含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因的分离株的20％进行此举。PCR混合物包含5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、1μl 50mM dNTP、0.4μM各引物(表1)、0.2μl InvitrogenTM PlatinumTM TaqDNA聚合酶、5μl DNA，并且添加无菌水以达到总反应体积50μl。所述混合物经历95℃4分钟；接着35个循环：95℃30秒、50℃30秒、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸7分钟来结束。对于扩增进行质量检查且将PCR产物送到gene wiz(https://www.genewiz.com)以获得16S基因的序列。将序列与从EZbiocloud在线电子数据库(http://www.ezbiocloud.net/)获得的已知类型的细菌菌株进行比较。基于这些序列的比较，细菌鉴定指定给分离株。
结果：从4个上中西部地区农场(明尼苏达州(Minnesota)和南达科他州(SouthDakota))(从此处分离得2,419个假定的梭菌菌株作为上中西部地区梭菌多样性的代表)采集到248个粪便样品(表13.)。
梭菌枚举结果表明跨所有小牛粪便样品的平均梭菌水平CFU/g为505,000CFU/g，其中单独粪便样品是在15CFU/g到1,160,000CFU/g范围内。然而，跨所有母牛粪便样品的平均梭菌水平CFU/g为8,480CFU/g，其中单独的粪便样品是在5CFU/g到785,000CFU/g范围内(图48.)。小牛(图49.)和母牛(图50.)的样品看起来均是在梭菌水平范围内。
产气荚膜梭菌枚举结果显示跨所有小牛粪便样品的平均产气荚膜梭菌水平CFU/g为81,800CFU/g，其中单独样品是在<10CFU/g到1,160,000CFU/g范围内。然而，跨所有母牛粪便样品的平均产气荚膜梭菌水平CFU/g为5,490CFU/g，其中单独样品是在<10CFU/g到314,000CFU/g范围内(图51.)。小牛(图52.)和母牛(图53.)的样品看起来均是在梭菌水平范围内。
对毒素多重PCR结果的分析显示哪些分离株包含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因。对来自粪便样品的总共2,419个假定梭菌分离株已针对指定的产气荚膜梭菌毒素基因进行了测试。在筛选的2,419个梭菌分离株中，629个分离株(26.0％)针对毒素基因中的至少1个测试为阳性。629个毒素基因阳性分离株中有583个(92.7％)经鉴定为A型(仅α毒素)，然而，还在粪便梭菌分离株中检测到β、ε和ι毒素。
在经过成功扩增的551个分离株中，遗传RAPD指纹图谱呈现多样性。从小牛粪便、母牛粪便和饲料收获所测试的分离株且并不基于样品类型或农场严格聚类。基于75％相似性，分离株依Dice相关方法形成106个簇群。最大的群簇为37个分离株，占系统树图的6.7％。
从RAPD系统树图中选择代表以获得来自此地区的产气荚膜梭菌群体的多样性且进行抑制测定。利用细菌素浊度测定进行的抗微生物测试显示使用从747、1104、1541、1781和2018收获得的细菌素很好地抑制了大多数反刍动物粪便产气荚膜梭菌分离株。来自菌株747、1104、1541、1781和2018中至少一种的细菌素能够抑制所测试的135个分离株中123个(>60％)生长，代表产气荚膜梭菌群体(基于系统树图)总计95.2％的抑制(表14.)。
在2,419个分离株中，发现所采集的1,790个分离株(74.0％)为非产毒梭菌。来自非产毒梭菌的测序代表(n＝218)显示两个主要梭菌组，双酶梭菌组(双酶副梭菌和解苯副梭菌)和拜氏梭菌组(二醇梭菌、拜氏梭菌、还原铬梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、橙色梭菌和糖丁基梭菌)，非产毒梭菌组的这两个主要组占非产毒分离株的50.5％(图54.)。
讨论：粪便样品用作最容易得到的样品类型，以估计水平并且在反刍动物的消化系统中获得梭菌和产气荚膜梭菌的分离株。在从整个上中西部采集的248个粪便样品中，所有样品具有可检测的梭菌水平。从反刍动物样品收获的许多分离株(629个分离株)包含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因。在74％的母牛粪便样品和50％的小牛粪便样品中检测到产气荚膜梭菌。梭菌和产气荚膜梭菌的大量存在表明整个上中西部大多数反刍动物中具有亚急性肠道梭菌疾病激发的风险。根据RAPD遗传指纹，产气荚膜梭菌分离株是多样化的，但对样品类型或农场无特异性。产气荚膜梭菌的不同代表中大多数受到来自以下菌株747、1104、1541、1781或2018的至少一种细菌素抑制(>60％)。所述菌株中的至少一种抑制在所测试的135个分离株中的123个分离株(高于60％)，表示基于簇群在RAPD系统树图上的表示抑制总产气荚膜梭菌群体的95.2％。这表明芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018可抑制广泛多种产气荚膜梭菌分离株。芽孢杆菌属菌株并不限于特定的一种或多种梭菌菌株(如疫苗)，基于在RAPD系统树图中所观察到的遗传多样性，所述特定的一种或多种梭菌菌株可能缺失大批梭菌群体。非产毒梭菌的DNA测序揭示两个主要梭菌物种的鉴定。已知可产生1,3-丙二醇的双酶梭菌组(Leja等人，2014；Myszka等人，2012)和已知可产生丁醇和丙酮的拜氏梭菌组(Hou等人，2017)。这些物种的代谢终产物的产生可在反刍动物中具有影响，降低奶牛性能参数，如产奶量。针对体外梭菌分离株的高抑制水平表明芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018的潜在的作用模式。
芽孢杆菌属菌株对梭菌群体提供预防作用，其可不但提高反刍动物效率而导致产奶量增加，而且防止产气荚膜梭菌急性水平从而减少消化系统性死亡的发生。所采集粪便样品中的梭菌和产气荚膜梭菌的高盛行率表明整个上中西部中许多反刍动物中的效率改善的机会。本实施例显示从采集自上中西部的反刍动物粪便样品和饲料样品得到的梭菌分离株的多样性。所测试的芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018可抑制上中西部所观察到的大多数梭菌多样性。根据本发明的此实施方案的产品可抑制从上中西部反刍动物分离的产毒梭菌，表明若呈直接喂饲型微生物(DFM)喂饲给奶牛那么具有反刍动物效率益处。
表13.从上中西部地区奶牛场按照农场(4)和年龄(母牛或小牛)为分层采集粪便样品248个，对这些样品针对梭菌而枚举，测试产气荚膜梭菌，对分离株进行基因分型并测试抑制。
农场名称 母牛粪便样品 小牛粪便样品
农场BR 50 6
农场E 45 9
农场W 61 9
农场Y 64 4
总计 220 28
表14：显示从上中西部地区粪便样品或饲料样品分离的所测试的每种分离株的细菌素测定结果和该分离株的来源。基于每种处理的与阳性对照充分相比的生长百分比来计算抑制。
实施例8：选择芽孢杆菌属菌株以抑制从反刍动物粪便样品分离的产气荚膜梭菌和非产毒梭菌。(大湖)
引言：梭菌属是革兰氏阳性、形成孢子的细菌的属，它是胃肠道的常驻者。许多梭菌属物种与反刍动物中的肠道疾病(包括肠道出血综合征(HBS)，一种通常与产气荚膜梭菌A型水平的增加有关的疾病)相关。虽然由梭菌引起的大多数肠道疾病是急性的且在畜群中偶发，但总体来说，预后不良且疾病的第一征象可能是死亡。基于最新结果，亚急性肠道梭菌疾病激发可能是比急性激发更广泛的问题。由于急性疾病激发的治疗的成功率低，需要更普遍地将重点放在预防措施上。
本研究的目的是表征反刍动物中梭菌的分布及多样性并使用新颖芽孢杆菌属菌株作为控制梭菌群体的方法来确保对这些分离株的抑制。
材料和方法：用无菌蛋白胨1:10稀释来自从大湖地区的6个农场收集的母牛、小母牛和小牛的粪便样品(265)，在60℃下热休克30分钟，于无菌蛋白胨中计数继而倾注于具有D-环丝氨酸(400mg/L)的胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸(TSC)琼脂板上以选择梭菌物种。在37℃下厌氧孵育琼脂板24小时。若存在，那么将分离的亚硫酸盐还原菌落经过计数得到总梭菌计数(CFU/g)，并且将代表性分离株挑入强化梭菌培养基(RCM)(Oxoid，CM0149)中且在37℃下厌氧孵育24小时。在孵育24小时后，将培养物转移(10％)到脑心浸液(BHI)肉汤培养基(BD，211059)且在37℃下厌氧孵育24小时。
在每孔含500μl假定梭菌培养物的96孔块中进行DNA的提取。通过以4,700rpm离心10分钟、去除上清液来收获细胞。将细胞重悬浮于500μl的50mM EDTA-2Na(pH＝8.0)中。将300μl悬浮细胞的等分试样转移到新的96孔块并与来自鸡蛋白(西格马(Sigma)，L6876)溶液(100mg/ml，在50mM EDTA中)的20μl溶菌酶组合以裂解细菌细胞。在37℃下孵育96孔块1小时以裂解细菌细胞。在孵育后添加220μl裂解缓冲液(6M胍、20％Triton-X 100、10mMTris-HCL，pH 7.5)，混合然后在室温下孵育15分钟。在孵育后向每孔添加20μl蛋白酶K(NEB，800U/mL)，混合并且在55℃下孵育30分钟以降解蛋白质。然后将细胞裂解物转移到96孔结合板(Promega，A2278)并且以4,700rpm离心5分钟。丢弃流通物，通过以4700rpms离心750μl柱洗涤溶液(Promega，A1318)持续1分钟30秒、丢弃在每次旋转结束时的流通物来执行结合板柱的三次洗涤。将结合板以4,700rpm再离心10分钟以去除任何残留的乙醇。然后将干净的洗脱板置于结合板之下，并且用200μl预热(55℃)的无核酸酶水(Promega，P1195)洗脱DNA。
利用聚合酶链式反应(PCR)，针对对产气荚膜梭菌具有特异性的毒素基因(α、β、ε及ι)筛选DNA。利用包含四个引物组的多重PCR(Yoo等人，1997)执行毒素基因的扩增(表1)。PCR混合物包含2.5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、0.5μM各引物(表1.)、0.1μlInvitrogenTM PlatinumTM Taq DNA聚合酶、2.5μl DNA，添加无菌水以达到总反应体积25μl。所述混合物经历94℃5分钟；接着30个循环：94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟；最后以72℃最终延伸3分钟来结束。使用片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)观察PCR产物以确定是否实现扩增。若观察到一个或多个毒素基因，那么根据它们的毒素基因谱对各分离株进行毒素类型鉴定(Songer，1996)。利用阳性产气荚膜梭菌与总梭菌分离株的比率以基于总梭菌计数计算估计的产气荚膜梭菌计数。
利用对所选分离株进行的随机扩增多态性DNA(RAPD)分析产生独特的菌株特异性遗传指纹以确定产气荚膜梭菌分离株中的多样性。PCR包含5μl DNA、2.5μl RAPD引物2(10μM)(表1.)和添加至Ready-To-Go RAPD分析珠(Life Sciences，27-9500-01)的17.5μl无菌水。所述混合物经历95℃5分钟；接着45个循环：95℃1分钟、36℃1分钟、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸5分钟来结束。在片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)上观察PCR产物以确定扩增模式且导入到BioNumerics生物信息学软件以用于分析。将RAPD模式与基于带的Dice相关分析法比较以确定RAPD模式之间的相似性(作为监测分离株之间的多样性的方式)。
对从反刍动物样品获得的产气荚膜梭菌分离株进行抗微生物筛选以量测由发明人鉴定的芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018所产生的抗微生物细菌素的有效性。通过使各菌株在32℃下于摇床中以150rpm于脑心浸液(BHI)肉汤培养基中生长24小时来收获细菌素。在孵育后执行将24小时培养物中的1％转移到新制的BHI肉汤培养基。然后，在32℃摇床中以150rpm孵育芽孢杆菌36-48小时。然后以14,000xg离心培养物20分钟，接着用0.2μm过滤器过滤上清液以去除任何残留细胞。
通过使从反刍动物粪便样品分离的产气荚膜梭菌菌株在37℃下厌氧生长于RCM中24小时执行细菌素浊度测定。将过夜培养物转移(1％)到无菌RCM且立刻用于测定。对于各产气荚膜梭菌分离株，在无菌48孔反应板中运行至少六个孔，即600μl经接种的培养物(阳性对照)、600μl经接种的RCM+70μl细菌素(747、1104、1541、1781和2018)和670RCM(未接种的，阴性对照)。在37℃下厌氧孵育板24小时，然后使用BioTek Epoch微板分光光度计读取，在600nm波长下得到读数。从所有OD读数减去阴性对照的光密度读数，且使用阳性对照和每一细菌素处理来计算抑制百分比。
为鉴定不具有对产气荚膜梭菌具特异性的至少一种毒素基因的梭菌，对分离株DNA使用引物27F-YM和1492R-Y(表1)进行PCR反应来扩增rDNA的16S区。在不含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因的分离株的20％进行此举。PCR混合物包含5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、1μl 50mM dNTP、0.4μM各引物(表1.)、0.2μl InvitrogenTM PlatinumTM TaqDNA聚合酶、5μl DNA，并且添加无菌水以达到总反应体积50μl。所述混合物经历95℃4分钟；接着35个循环：95℃30秒、50℃30秒、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸7分钟来结束。对于扩增进行质量检查且将PCR产物送到gene wiz(https://www.genewiz.com)以获得16S基因的序列。将序列与从EZbiocloud在线电子数据库(http://www.ezbiocloud.net/)获得的已知类型的细菌菌株进行比较。基于这些序列的比较，细菌鉴定指定给分离株。
结果：从6个大湖地区农场(密西根州(Michigan)、印第安纳州(Indiana)、俄亥俄州(Ohio)、纽约州(New York))(从此处分离得2,715个假定的梭菌分离株作为大湖地区梭菌多样性的代表)采集到粪便样品(265个)(表15.)。
梭菌枚举结果表明跨所有小牛粪便样品的平均梭菌水平CFU/g为180,000CFU/g，其中单独粪便样品是在50CFU/g到2,910,000CFU/g范围内。然而，跨所有母牛粪便样品的平均梭菌水平CFU/g为69,800CFU/g，其中单独的粪便样品是在10CFU/g到125,000CFU/g范围内(图55.)。小牛(图56.)和母牛(图57.)的样品看起来均是在梭菌水平范围内。
产气荚膜梭菌枚举结果显示跨所有小牛粪便样品的平均产气荚膜梭菌水平CFU/g为1,620CFU/g，其中单独样品是在<10CFU/g到1,450,000CFU/g范围内。然而，跨所有母牛粪便样品的平均产气荚膜梭菌水平CFU/g为1,250CFU/g，其中单独样品是在<10CFU/g到125,000CFU/g范围内(图58.)。小牛(图59.)和母牛(图60.)的样品看起来均是在梭菌水平范围内。
对毒素多重PCR结果的分析显示哪些分离株包含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因。对来自粪便样品的总共2,715个假定梭菌分离株已针对指定的产气荚膜梭菌毒素基因进行了测试。在筛选的2,715个梭菌分离株中，1,456个分离株(53.6％)针对毒素基因中的至少1个测试为阳性。1,456个毒素基因阳性分离株中有1,427个(98％)经鉴定为A型(仅α毒素)，然而，还在粪便梭菌分离株中检测到β、ε和ι毒素。
在经过成功扩增的1,276个分离株中，遗传RAPD指纹图谱呈现多样性。从小牛粪便、母牛粪便和饲料收获所测试的分离株且并不基于样品类型或农场严格聚类。基于75％相似性，分离株依Dice相关方法形成162个簇群。最大群簇为102个分离株(8.0％)且由来自所有六个农场的分离株构成。
从RAPD系统树图中选择代表以获得来自此地区的产气荚膜梭菌群体的多样性且进行抑制测定。利用细菌素浊度测定进行的抗微生物测试显示使用从747、1104、1541、1781和2018收获得的细菌素很好地抑制了大多数反刍动物粪便产气荚膜梭菌分离株。来自菌株747、1104、1541、1781和2018中至少一种的细菌素能够抑制所测试的254个分离株中221个(>60％)生长，代表产气荚膜梭菌群体(基于系统树图b)总计89.0％的抑制(表16)。
在2,715个分离株中，发现所采集的1,259个分离株(46％)为非产毒梭菌。来自非产毒梭菌的测序代表(n＝190)显示一个主要梭菌组，双酶梭菌组(双酶副梭菌和解苯副梭菌)。双酶梭菌占非产毒分离株的50.0％(图61.)。
讨论：粪便样品用作最容易得到的样品类型，以估计水平并且在反刍动物的消化系统中获得梭菌和产气荚膜梭菌的分离株。在从整个大湖地区采集的265个粪便样品中，所有样品具有可检测的梭菌水平。从反刍动物样品收获得的大多数分离株(53.6％)包含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因。在86％的母牛粪便样品和63％的小牛粪便样品中检测到产气荚膜梭菌。梭菌和产气荚膜梭菌的大量存在表明整个大湖地区大多数反刍动物中具有亚急性肠道梭菌疾病激发的风险。根据RAPD遗传指纹，产气荚膜梭菌分离株是多样化的，但对样品类型或农场无特异性。产气荚膜梭菌的不同代表中大多数受到来自以下菌株747、1104、1541、1781或2018的至少一种细菌素抑制(>60％)。所述菌株中的至少一种抑制在所测试的254个分离株中的221个分离株(高于60％)，表示基于簇群在RAPD系统树图上的表示抑制总产气荚膜梭菌群体的89.0％。这表明芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018可抑制广泛多种产气荚膜梭菌分离株。芽孢杆菌属菌株并不限于特定的一种或多种梭菌菌株(如疫苗)，基于在RAPD系统树图中所观察到的遗传多样性，所述特定的一种或多种梭菌菌株可能缺失大批梭菌群体。非产毒梭菌的DNA测序揭示一个主要梭菌物种(双酶梭菌)的鉴定。针对体外梭菌分离株的高抑制水平表明芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018的潜在的作用模式。
芽孢杆菌属菌株对梭菌群体提供预防作用，其可不但提高反刍动物效率而导致产奶量增加，而且防止产气荚膜梭菌急性水平从而减少消化系统性死亡的发生。所采集粪便样品中的梭菌和产气荚膜梭菌的高盛行率表明整个大湖地区中许多反刍动物中的效率改善的机会。本实施例显示从采集自大湖地区的反刍动物粪便样品和饲料样品得到的梭菌分离株的多样性。所测试的芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018可抑制在大湖地区所观察到的大多数梭菌多样性。根据本发明的此实施方案的产品能够抑制从大湖地区反刍动物分离的产毒梭菌，表明若呈直接喂饲型微生物(DFM)喂饲给奶牛那么具有反刍动物效率益处。
表15.从大湖地区奶牛场按照农场(6)和年龄(母牛或小牛)为分层采集粪便样品265个，对这些样品针对梭菌而枚举，测试产气荚膜梭菌，对分离株进行基因分型并测试抑制。
农场名称 州 母牛粪便 小牛粪便
农场HG 密西根州 65 6
农场H 印第安纳州 55 9
农场M 俄亥俄州 40 5
农场U 俄亥俄州 10 4
农场C 纽约州 35 5
农场P 纽约州 25 6
总计 230 35
表16.显示从大湖地区粪便样品分离的所测试的每种分离株的细菌素测定结果和该分离株的来源。基于每种处理的与阳性对照充分相比的生长百分比来计算抑制。
实施例9：选择芽孢杆菌属菌株以抑制从反刍动物粪便样品分离的产气荚膜梭菌和非产毒梭菌。(东北)。
引言：梭菌属是革兰氏阳性、形成孢子的细菌的属，它是胃肠道的常驻者。许多梭菌属物种与反刍动物中的肠道疾病(包括肠道出血综合征(HBS)，一种通常与产气荚膜梭菌A型水平的增加有关的疾病)相关。虽然由梭菌引起的大多数肠道疾病是急性的且在畜群中偶发，但总体来说，预后不良且疾病的第一征象可能是死亡。基于最新结果，亚急性肠道梭菌疾病激发可能是比急性激发更广泛的问题。由于急性疾病激发的治疗的成功率低，需要更普遍地将重点放在预防措施上。
本研究的目的是表征反刍动物中梭菌的分布及多样性并使用新颖芽孢杆菌属菌株作为控制梭菌群体的方法来确保对这些分离株的抑制。
材料和方法：用无菌蛋白胨1:10稀释来自从东北地区的9个农场收集的母牛、小母牛和小牛的粪便样品(339)，在60℃下热休克30分钟，于无菌蛋白胨中计数继而倾注于具有D-环丝氨酸(400mg/L)的胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸(TSC)琼脂板上以选择梭菌物种。在37℃下厌氧孵育琼脂板24小时。若存在，那么将分离的亚硫酸盐还原菌落经过计数得到总梭菌计数(CFU/g)，并且将代表性分离株挑入强化梭菌培养基(RCM)(Oxoid，CM0149)中且在37℃下厌氧孵育24小时。在孵育24小时后，将培养物转移(10％)到脑心浸液(BHI)肉汤培养基(BD，211059)且在37℃下厌氧孵育24小时。
在每孔含500μl假定梭菌培养物的96孔块中进行DNA的提取。通过以4,700rpm离心10分钟、去除上清液来收获细胞。将细胞重悬浮于500μl的50mM EDTA-2Na(pH＝8.0)中。将300μl悬浮细胞的等分试样转移到新的96孔块并与来自鸡蛋白(西格马(Sigma)，L6876)溶液(100mg/ml，在50mM EDTA中)的20μl溶菌酶组合以裂解细菌细胞。在37℃下孵育96孔块1小时以裂解细菌细胞。在孵育后添加220μl裂解缓冲液(6M胍、20％Triton-X 100、10mMTris-HCL，pH 7.5)，混合然后在室温下孵育15分钟。在孵育后向每孔添加20μl蛋白酶K(NEB，800U/mL)，混合并且在55℃下孵育30分钟以降解蛋白质。然后将细胞裂解物转移到96孔结合板(Promega，A2278)并且以4,700rpm离心5分钟。丢弃流通物，通过以4700rpms离心750μl柱洗涤溶液(Promega，A1318)持续1分钟30秒、丢弃在每次旋转结束时的流通物来执行结合板柱的三次洗涤。将结合板以4,700rpm再离心10分钟以去除任何残留的乙醇。然后将干净的洗脱板置于结合板之下，并且用200μl预热(55℃)的无核酸酶水(Promega，P1195)洗脱DNA。
利用聚合酶链式反应(PCR)，针对对产气荚膜梭菌具有特异性的毒素基因(α、β、ε及ι)筛选DNA。利用包含四个引物组的多重PCR(Yoo等人，1997)执行毒素基因的扩增(表1)。PCR混合物包含2.5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、0.5μM各引物(表1.)、0.1μlInvitrogenTM PlatinumTM Taq DNA聚合酶、2.5μl DNA，添加无菌水以达到总反应体积25μl。所述混合物经历94℃5分钟；接着30个循环：94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟；最后以72℃最终延伸3分钟来结束。使用片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)观察PCR产物以确定是否实现扩增。若观察到一个或多个毒素基因，那么根据它们的毒素基因谱对各分离株进行毒素类型鉴定(Songer，1996)。利用阳性产气荚膜梭菌与总梭菌分离株的比率以基于总梭菌计数计算估计的产气荚膜梭菌计数。
利用对所选分离株进行的随机扩增多态性DNA(RAPD)分析产生独特的菌株特异性遗传指纹以确定产气荚膜梭菌分离株中的多样性。PCR包含5μl DNA、2.5μl RAPD引物2(10μM)(表1.)和添加至Ready-To-Go RAPD分析珠(Life Sciences，27-9500-01)的17.5μl无菌水。所述混合物经历95℃5分钟；接着45个循环：95℃1分钟、36℃1分钟、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸5分钟来结束。在片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)上观察PCR产物以确定扩增模式且导入到BioNumerics生物信息学软件以用于分析。将RAPD模式与基于带的Dice相关分析法比较以确定RAPD模式之间的相似性(作为监测分离株之间的多样性的方式)。
对从反刍动物样品获得的产气荚膜梭菌分离株进行抗微生物筛选以量测由发明人鉴定的芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018所产生的抗微生物细菌素的有效性。通过使各菌株在32℃下于摇床中以150rpm于脑心浸液(BHI)肉汤培养基中生长24小时来收获细菌素。在孵育后执行将24小时培养物中的1％转移到新制的BHI肉汤培养基。然后，在32℃摇床中以150rpm孵育芽孢杆菌36-48小时。然后以14,000xg离心培养物20分钟，接着用0.2μm过滤器过滤上清液以去除任何残留细胞。
通过使从反刍动物粪便样品分离的产气荚膜梭菌菌株在37℃下厌氧生长于RCM中24小时执行细菌素浊度测定。将过夜培养物转移(1％)到无菌RCM且立刻用于测定。对于各产气荚膜梭菌分离株，在无菌48孔反应板中运行至少六个孔，即600μl经接种的培养物(阳性对照)、600μl经接种的RCM+70μl细菌素(747、1104、1541、1781和2018)和670RCM(未接种的，阴性对照)。在37℃下厌氧孵育板24小时，然后使用BioTek Epoch微板分光光度计读取，在600nm波长下得到读数。从所有OD读数减去阴性对照的光密度读数，且使用阳性对照和每一细菌素处理来计算抑制百分比。
为鉴定不具有对产气荚膜梭菌具特异性的至少一种毒素基因的梭菌，对分离株DNA使用引物27F-YM和1492R-Y(表1)进行PCR反应来扩增rDNA的16S区。在不含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因的分离株的20％进行此举。PCR混合物包含5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、1μl 50mM dNTP、0.4μM各引物(表1.)、0.2μl InvitrogenTM PlatinumTM TaqDNA聚合酶、5μl DNA，并且添加无菌水以达到总反应体积50μl。所述混合物经历95℃4分钟；接着35个循环：95℃30秒、50℃30秒、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸7分钟来结束。对于扩增进行质量检查且将PCR产物送到gene wiz(https://www.genewiz.com)以获得16S基因的序列。将序列与从EZbiocloud在线电子数据库(http://www.ezbiocloud.net/)获得的已知类型的细菌菌株进行比较。基于这些序列的比较，细菌鉴定指定给分离株。
结果：从9个东北地区农场(缅因州(Maine)、佛蒙特州(Vermont)和纽约州)(从此处分离得3,252个假定的梭菌分离株作为东北地区梭菌多样性的代表)采集到粪便样品(339个)(表17.)。
梭菌枚举结果表明跨所有小牛粪便样品的平均梭菌水平CFU/g为466,000CFU/g，其中单独粪便样品是在25CFU/g到1,250,000CFU/g范围内。然而，跨所有母牛粪便样品的平均梭菌水平CFU/g为18,200CFU/g，其中单独的粪便样品是在5CFU/g到3,540,000CFU/g范围内(图62.)。小牛(图63.)和母牛(图64.)的样品看起来均是在梭菌水平范围内。
产气荚膜梭菌枚举结果显示跨所有小牛粪便样品的平均产气荚膜梭菌水平CFU/g为311,000CFU/g，其中单独样品是在<10CFU/g到3,540,000CFU/g范围内。然而，跨所有母牛粪便样品的平均产气荚膜梭菌水平CFU/g为16,700CFU/g，其中单独样品是在<10CFU/g到3,540,000CFU/g范围内(图65.)。小牛(图66.)和母牛(图67.)的样品看起来均是在梭菌水平范围内。
对毒素多重PCR结果的分析显示哪些分离株包含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因。对来自粪便样品的总共3,252个假定梭菌分离株已针对指定的产气荚膜梭菌毒素基因进行了测试。在筛选的3,252个梭菌分离株中，1,795个分离株(55.2％)针对毒素基因中的至少1个测试为阳性。1,795个毒素基因阳性分离株中有1,687个(94％)经鉴定为A型(仅α毒素)，然而，还在粪便梭菌分离株中检测到β、ε和ι毒素。
在经过成功扩增的1,619个分离株中，遗传RAPD指纹图谱呈现多样性。从小牛粪便、母牛粪便和饲料收获所测试的分离株且并不基于样品类型或农场严格聚类。基于75％相似性，分离株依Dice相关方法形成361个簇群。最大群簇为82个分离株(5.1％)且由来自若干个农场的分离株构成。
从RAPD系统树图中选择代表以获得来自此地区的产气荚膜梭菌群体的多样性且进行抑制测定。利用细菌素浊度测定进行的抗微生物测试显示使用从747、1104、1541、1781和2018收获得的细菌素很好地抑制了大多数反刍动物粪便产气荚膜梭菌分离株。来自菌株747、1104、1541、1781和2018中至少一种的细菌素能够抑制所测试的412个分离株中342个(>60％)生长，代表产气荚膜梭菌群体(基于系统树图)总计84.6％的抑制(表18.)。
在3,252个分离株中，发现所采集的1,457个分离株(44.8％)为非产毒梭菌。来自非产毒梭菌的测序代表(n＝181)显示两个主要梭菌组，双酶梭菌组(双酶副梭菌和解苯副梭菌)和拜氏梭菌组(二醇梭菌、拜氏梭菌、还原铬梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、橙色梭菌和糖丁基梭菌)，非产毒梭菌组的这两个主要组占非产毒分离株的53.6％(图68.)。
讨论：粪便样品用作最容易得到的样品类型，以估计水平并且在反刍动物的消化系统中获得梭菌和产气荚膜梭菌的分离株。在从整个东北地区采集的339个粪便样品中，所有样品具有可检测的梭菌水平。从反刍动物样品收获得的大多数分离株(55.2％)包含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因。在90％的母牛粪便样品和70％的小牛粪便样品中检测到产气荚膜梭菌。梭菌和产气荚膜梭菌的大量存在表明整个东北地区大多数反刍动物中具有亚急性肠道梭菌疾病激发的风险。根据RAPD遗传指纹，产气荚膜梭菌分离株是多样化的，但对样品类型或农场无特异性。产气荚膜梭菌的不同代表中大多数受到来自以下菌株747、1104、1541、1781或2018的至少一种细菌素抑制(>60％)。所述菌株中的至少一种抑制在所测试的412个分离株中的342个分离株(高于60％)，表示基于簇群在RAPD系统树图上的表示抑制总产气荚膜梭菌群体的84.6％。这表明芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018可抑制广泛多种产气荚膜梭菌分离株。芽孢杆菌属菌株并不限于特定的一种或多种梭菌菌株(如疫苗)，基于在RAPD系统树图中所观察到的遗传多样性，所述特定的一种或多种梭菌菌株可能缺失大批梭菌群体。非产毒梭菌的DNA测序揭示两个主要梭菌物种的鉴定。已知可产生1,3-丙二醇的双酶梭菌组(Leja等人，2014；Myszka等人，2012)和已知可产生丁醇和丙酮的拜氏梭菌组(Hou等人，2017)。这些物种的代谢终产物的产生可在反刍动物中具有影响，降低奶牛性能参数，如产奶量。针对体外产气荚膜梭菌分离株的高抑制水平表明芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018的潜在的作用模式。
芽孢杆菌属菌株对梭菌群体提供预防作用，其可不但提高反刍动物效率而导致产奶量增加，而且防止产气荚膜梭菌急性水平从而减少消化系统性死亡的发生。所采集粪便样品中的梭菌和产气荚膜梭菌的高盛行率表明整个东北地区中许多反刍动物中的效率改善的机会。本实施例显示从采集自东北地区的反刍动物粪便样品和饲料样品得到的梭菌分离株的多样性。所测试的芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018可抑制东北地区所观察到的大多数梭菌多样性。根据本发明的此实施方案的产品可抑制从东北反刍动物分离的产毒梭菌，表明若呈直接喂饲型微生物(DFM)喂饲给奶牛那么具有反刍动物效率益处。
表17.从东北地区奶牛场按照农场(9)和年龄(母牛或小牛)为分层采集粪便样品339个，对这些样品针对梭菌而枚举，测试产气荚膜梭菌，对分离株进行基因分型并测试抑制。
表18：显示从东北地区粪便样品分离的所测试的每种分离株的细菌素测定结果和该分离株的来源。基于每种处理的与阳性对照充分相比的生长百分比来计算抑制。
实施例10：选择芽孢杆菌属菌株以抑制从反刍动物粪便样品分离的产气荚膜梭菌和非产毒梭菌。(大西洋中部)
引言：梭菌属是革兰氏阳性、形成孢子的细菌的属，它是胃肠道的常驻者。许多梭菌属物种与反刍动物中的肠道疾病(包括肠道出血综合征(HBS)，一种通常与产气荚膜梭菌A型水平的增加有关的疾病)相关。虽然由梭菌引起的大多数肠道疾病是急性的且在畜群中偶发，但总体来说，预后不良且疾病的第一征象可能是死亡。基于最新结果，亚急性肠道梭菌疾病激发可能是比急性激发更广泛的问题。由于急性疾病激发的治疗的成功率低，需要更普遍地将重点放在预防措施上。
本研究的目的是表征反刍动物中梭菌的分布及多样性并使用新颖芽孢杆菌属菌株作为控制梭菌群体的方法来确保对这些分离株的抑制。
材料和方法：用无菌蛋白胨1:10稀释来自从大西洋中部地区的6个农场收集的母牛、小母牛和小牛的粪便样品(186)，在60℃下热休克30分钟，于无菌蛋白胨中计数继而倾注于具有D-环丝氨酸(400mg/L)的胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸(TSC)琼脂板上以选择梭菌物种。在37℃下厌氧孵育琼脂板24小时。若存在，那么将分离的亚硫酸盐还原菌落经过计数得到总梭菌计数(CFU/g)，并且将代表性分离株挑入强化梭菌培养基(RCM)(Oxoid，CM0149)中且在37℃下厌氧孵育24小时。在孵育24小时后，将培养物转移(10％)到脑心浸液(BHI)肉汤培养基(BD，211059)且在37℃下厌氧孵育24小时。
在每孔含500μl假定梭菌培养物的96孔块中进行DNA的提取。通过以4,700rpm离心10分钟、去除上清液来收获细胞。将细胞重悬浮于500μl的50mM EDTA-2Na(pH＝8.0)中。将300μl悬浮细胞的等分试样转移到新的96孔块并与来自鸡蛋白(西格马(Sigma)，L6876)溶液(100mg/ml，在50mM EDTA中)的20μl溶菌酶组合以裂解细菌细胞。在37℃下孵育96孔块1小时以裂解细菌细胞。在孵育后添加220μl裂解缓冲液(6M胍、20％Triton-X 100、10mMTris-HCL，pH 7.5)，混合然后在室温下孵育15分钟。在孵育后向每孔添加20μl蛋白酶K(NEB，800U/mL)，混合并且在55℃下孵育30分钟以降解蛋白质。然后将细胞裂解物转移到96孔结合板(Promega，A2278)并且以4,700rpm离心5分钟。丢弃流通物，通过以4700rpms离心750μl柱洗涤溶液(Promega，A1318)持续1分钟30秒、丢弃在每次旋转结束时的流通物来执行结合板柱的三次洗涤。将结合板以4,700rpm再离心10分钟以去除任何残留的乙醇。然后将干净的洗脱板置于结合板之下，并且用200μl预热(55℃)的无核酸酶水(Promega，P1195)洗脱DNA。
利用聚合酶链式反应(PCR)，针对对产气荚膜梭菌具有特异性的毒素基因(α、β、ε及ι)筛选DNA。利用包含四个引物组的多重PCR(Yoo等人，1997)执行毒素基因的扩增(表1)。PCR混合物包含2.5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、0.5μM各引物(表1)、0.1μlInvitrogenTM PlatinumTM Taq DNA聚合酶、2.5μl DNA，添加无菌水以达到总反应体积25μl。所述混合物经历94℃5分钟；接着30个循环：94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟；最后以72℃最终延伸3分钟来结束。使用片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)观察PCR产物以确定是否实现扩增。若观察到一个或多个毒素基因，那么根据它们的毒素基因谱对各分离株进行毒素类型鉴定(Songer，1996)。利用阳性产气荚膜梭菌与总梭菌分离株的比率以基于总梭菌计数计算估计的产气荚膜梭菌计数。
利用对所选分离株进行的随机扩增多态性DNA(RAPD)分析产生独特的菌株特异性遗传指纹以确定产气荚膜梭菌分离株中的多样性。PCR包含5μl DNA、2.5μl RAPD引物2(10μM)(表1)和添加至Ready-To-Go RAPD分析珠(Life Sciences，27-9500-01)的17.5μl无菌水。所述混合物经历95℃5分钟；接着45个循环：95℃1分钟、36℃1分钟、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸5分钟来结束。在片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)上观察PCR产物以确定扩增模式且导入到BioNumerics生物信息学软件以用于分析。将RAPD模式与基于带的Dice相关分析法比较以确定RAPD模式之间的相似性(作为监测分离株之间的多样性的方式)。
对从反刍动物样品获得的产气荚膜梭菌分离株进行抗微生物筛选以量测由发明人鉴定的芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018所产生的抗微生物细菌素的有效性。通过使各菌株在32℃下于摇床中以150rpm于脑心浸液(BHI)肉汤培养基中生长24小时来收获细菌素。在孵育后执行将24小时培养物中的1％转移到新制的BHI肉汤培养基。然后，在32℃摇床中以150rpm孵育芽孢杆菌36-48小时。然后以14,000xg离心培养物20分钟，接着用0.2μm过滤器过滤上清液以去除任何残留细胞。
通过使从反刍动物粪便样品分离的产气荚膜梭菌菌株在37℃下厌氧生长于RCM中24小时执行细菌素浊度测定。将过夜培养物转移(1％)到无菌RCM且立刻用于测定。对于各产气荚膜梭菌分离株，在无菌48孔反应板中运行至少六个孔，即600μl经接种的培养物(阳性对照)、600μl经接种的RCM+70μl细菌素(747、1104、1541、1781和2018)和670RCM(未接种的，阴性对照)。在37℃下厌氧孵育板24小时，然后使用BioTek Epoch微板分光光度计读取，在600nm波长下得到读数。从所有OD读数减去阴性对照的光密度读数，且使用阳性对照和每一细菌素处理来计算抑制百分比。
为鉴定不具有对产气荚膜梭菌具特异性的至少一种毒素基因的梭菌，对分离株DNA使用引物27F-YM和1492R-Y(表1)进行PCR反应来扩增rDNA的16S区。在不含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因的分离株的20％进行此举。PCR混合物包含5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、1μl 50mM dNTP、0.4μM各引物(表1)、0.2μl InvitrogenTM PlatinumTM TaqDNA聚合酶、5μl DNA，并且添加无菌水以达到总反应体积50μl。所述混合物经历95℃4分钟；接着35个循环：95℃30秒、50℃30秒、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸7分钟来结束。对于扩增进行质量检查且将PCR产物送到gene wiz(https://www.genewiz.com)以获得16S基因的序列。将序列与从EZbiocloud在线电子数据库(http://www.ezbiocloud.net/)获得的已知类型的细菌菌株进行比较。基于这些序列的比较，细菌鉴定指定给分离株。
结果：从6个大西洋中部地区(宾夕法尼亚州(Pennsylvania)和维吉尼亚州(Virginia))牛奶场(从此处分离得2,026个假定的梭菌分离株作为大西洋中部牛奶场梭菌多样性的代表)采集到粪便样品(186个)(表19)。
梭菌枚举结果表明跨所有小牛粪便样品的平均梭菌水平CFU/g为58,500CFU/g，其中单独粪便样品是在35CFU/g到615,000CFU/g范围内。然而，跨所有母牛粪便样品的平均梭菌水平CFU/g为2,570CFU/g，其中单独的粪便样品是在20CFU/g到147,000CFU/g范围内(图69)。小牛(图70)和母牛(图71)的样品看起来均是在梭菌水平范围内。
产气荚膜梭菌枚举结果显示跨所有小牛粪便样品的平均产气荚膜梭菌水平CFU/g为1,100CFU/g，其中单独样品是在<10CFU/g到5,640CFU/g范围内。然而，跨所有母牛粪便样品的平均产气荚膜梭菌水平CFU/g为1,430CFU/g，其中单独样品是在<10CFU/g到87,900CFU/g范围内(图72)。小牛(图73)和母牛(图74)的样品看起来均是在梭菌水平范围内。
对毒素多重PCR结果的分析显示哪些分离株包含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因。对来自大西洋中部粪便样品的总共2,026个假定梭菌分离株已针对指定的产气荚膜梭菌毒素基因进行了测试。在筛选的2,026个梭菌分离株中，649个分离株(32％)针对毒素基因中的至少1个测试为阳性。649个毒素基因阳性分离株中有630个(97.1％)经鉴定为A型(仅α毒素)，然而，还在梭菌分离株中检测到β、ε和ι毒素。
在经过成功扩增的582个分离株中，遗传RAPD指纹图谱呈现多样性。从小牛粪便、母牛粪便和饲料收获所测试的分离株且并不基于样品类型或农场严格聚类。基于75％相似性，分离株依Dice相关方法形成85个簇群。最大簇群为55个分离株(9.5％)且具有4.07的shannon多样性指数。
从RAPD系统树图中选择代表以获得来自此地区的产气荚膜梭菌群体的多样性且进行抑制测定。利用细菌素浊度测定进行的抗微生物测试显示使用从747、1104、1541、1781和2018收获得的细菌素很好地抑制了大多数反刍动物粪便产气荚膜梭菌分离株。来自菌株747、1104、1541、1781和2018中至少一种的细菌素能够抑制所测试的129个分离株中103个(>60％)生长，代表产气荚膜梭菌群体(基于系统树图)总计85.9％的抑制(表20)。
在2,026个分离株中，发现所采集的1,377个分离株(68％)为非产毒梭菌。来自非产毒梭菌的测序代表(n＝151)显示一个主要梭菌组双酶梭菌组(双酶副梭菌和解苯副梭菌)。双酶梭菌占非产毒分离株的51.5％(图75)。
讨论：粪便样品用作最容易得到的样品类型，以估计水平并且在反刍动物的消化系统中获得梭菌和产气荚膜梭菌的分离株。在从整个大西洋中部地区采集的186个粪便样品中，所有样品具有可检测的梭菌水平。从反刍动物样品收获的许多分离株(649个分离株)包含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因。在72％的母牛粪便样品和50％的小牛粪便样品中检测到产气荚膜梭菌。梭菌和产气荚膜梭菌的大量存在表明整个大西洋中部地区大多数反刍动物中具有亚急性肠道梭菌疾病激发的风险。根据RAPD遗传指纹，产气荚膜梭菌分离株是多样化的，但对样品类型或农场无特异性。产气荚膜梭菌的不同代表中大多数受到来自以下菌株747、1104、1541、1781或2018的至少一种细菌素抑制(>60％)。所述菌株中的至少一种抑制在所测试的129个分离株中的103个分离株(高于60％)，表示基于簇群在RAPD系统树图上的表示抑制总产气荚膜梭菌群体的85.9％。这表明芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018可抑制广泛多种产气荚膜梭菌分离株。芽孢杆菌属菌株并不限于特定的一种或多种梭菌菌株(如疫苗)，基于在RAPD系统树图中所观察到的遗传多样性，所述特定的一种或多种梭菌菌株可能缺失大批梭菌群体。非产毒梭菌的DNA测序揭示一个主要梭菌物种的鉴定。双酶梭菌组，已知其可产生1,3-丙二醇(Leja等人，2014；Myszka等人，2012)。针对体外产气荚膜梭菌分离株的高抑制水平表明芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018的潜在的作用模式。
芽孢杆菌属菌株对梭菌群体提供预防作用，其可不但提高反刍动物效率而导致产奶量增加，而且防止产气荚膜梭菌急性水平从而减少消化系统性死亡的发生。所采集粪便样品中的梭菌和产气荚膜梭菌的高盛行率表明整个大西洋中部地区中许多反刍动物中的效率改善的机会。本实施例显示从采集自大西洋中部地区的反刍动物粪便样品和饲料样品得到的梭菌分离株的多样性。所测试的芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018可抑制在大西洋中部地区所观察到的大多数梭菌多样性。根据本发明的此实施方案的产品能够抑制从大西洋中部地区反刍动物分离的产毒梭菌，表明若呈直接喂饲型微生物(DFM)喂饲给奶牛那么具有反刍动物效率益处。
表19从大西洋中部地区奶牛场按照农场(6)和年龄(母牛或小牛)为分层采集粪便样品186个，对这些样品针对梭菌而枚举，测试产气荚膜梭菌，对分离株进行基因分型并测试抑制。
农场名称 州 母牛粪便 小牛粪便
农场B PA 11 1
农场MD PA 68 7
农场RR PA 10 1
农场RG PA 17 1
农场RH VA 12 2
农场WH PA 56 0
总计 174 12
表20.显示从大西洋中部地区粪便样品分离的所测试的每种分离株的细菌素测定结果和该分离株的来源。基于每种处理的与阳性对照充分相比的生长百分比来计算抑制。
实施例11：选择芽孢杆菌属菌株以抑制从反刍动物粪便样品分离的产气荚膜梭菌和非产毒梭菌。(洲际-29走廊(Interstate-29 Corridor))
引言：梭菌属是革兰氏阳性、形成孢子的细菌的属，它是胃肠道的常驻者。许多梭菌属物种与反刍动物中的肠道疾病(包括肠道出血综合征(HBS)，一种通常与产气荚膜梭菌A型水平的增加有关的疾病)相关。虽然由梭菌引起的大多数肠道疾病是急性的且在畜群中偶发，但总体来说，预后不良且疾病的第一征象可能是死亡。基于最新结果，亚急性肠道梭菌疾病激发可能是比急性激发更广泛的问题。由于急性疾病激发的治疗的成功率低，需要更普遍地将重点放在预防措施上。
本研究的目的是表征反刍动物中梭菌的分布及多样性并使用新颖芽孢杆菌属菌株作为控制梭菌群体的方法来确保对这些分离株的抑制。
材料和方法：用无菌蛋白胨1:10稀释来自从I-29走廊地区的8个农场收集的母牛、小母牛和小牛的粪便样品(411)，在60℃下热休克30分钟，于无菌蛋白胨中计数继而倾注于具有D-环丝氨酸(400mg/L)的胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸(TSC)琼脂板上以选择梭菌物种。在37℃下厌氧孵育琼脂板24小时。若存在，那么将分离的亚硫酸盐还原菌落经过计数得到总梭菌计数(CFU/g)，并且将代表性分离株挑入强化梭菌培养基(RCM)(Oxoid，CM0149)中且在37℃下厌氧孵育24小时。在孵育24小时后，将培养物转移(10％)到脑心浸液(BHI)肉汤培养基(BD，211059)且在37℃下厌氧孵育24小时。
在每孔含500μl假定梭菌培养物的96孔块中进行DNA的提取。通过以4,700rpm离心10分钟、去除上清液来收获细胞。将细胞重悬浮于500μl的50mM EDTA-2Na(pH＝8.0)中。将300μl悬浮细胞的等分试样转移到新的96孔块并与来自鸡蛋白(西格马(Sigma)，L6876)溶液(100mg/ml，在50mM EDTA中)的20μl溶菌酶组合以裂解细菌细胞。在37℃下孵育96孔块1小时以裂解细菌细胞。在孵育后添加220μl裂解缓冲液(6M胍、20％Triton-X 100、10mMTris-HCL，pH 7.5)，混合然后在室温下孵育15分钟。在孵育后向每孔添加20μl蛋白酶K(NEB，800U/mL)，混合并且在55℃下孵育30分钟以降解蛋白质。然后将细胞裂解物转移到96孔结合板(Promega，A2278)并且以4,700rpm离心5分钟。丢弃流通物，通过以4700rpms离心750μl柱洗涤溶液(Promega，A1318)持续1分钟30秒、丢弃在每次旋转结束时的流通物来执行结合板柱的三次洗涤。将结合板以4,700rpm再离心10分钟以去除任何残留的乙醇。然后将干净的洗脱板置于结合板之下，并且用200μl预热(55℃)的无核酸酶水(Promega，P1195)洗脱DNA。
利用聚合酶链式反应(PCR)，针对对产气荚膜梭菌具有特异性的毒素基因(α、β、ε及ι)筛选DNA。利用包含四个引物组的多重PCR(Yoo等人，1997)执行毒素基因的扩增(表1)。PCR混合物包含2.5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、0.5μM各引物(表1)、0.1μlInvitrogenTM PlatinumTM Taq DNA聚合酶、2.5μl DNA，添加无菌水以达到总反应体积25μl。所述混合物经历94℃5分钟；接着30个循环：94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟；最后以72℃最终延伸3分钟来结束。使用片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)观察PCR产物以确定是否实现扩增。若观察到一个或多个毒素基因，那么根据它们的毒素基因谱对各分离株进行毒素类型鉴定(Songer，1996)。利用阳性产气荚膜梭菌与总梭菌分离株的比率以基于总梭菌计数计算估计的产气荚膜梭菌计数。
利用对所选分离株进行的随机扩增多态性DNA(RAPD)分析产生独特的菌株特异性遗传指纹以确定产气荚膜梭菌分离株中的多样性。PCR包含5μl DNA、2.5μl RAPD引物2(10μM)(表1)和添加至Ready-To-Go RAPD分析珠(Life Sciences，27-9500-01)的17.5μl无菌水。所述混合物经历95℃5分钟；接着45个循环：95℃1分钟、36℃1分钟、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸5分钟来结束。在片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)上观察PCR产物以确定扩增模式且导入到BioNumerics生物信息学软件以用于分析。将RAPD模式与基于带的Dice相关分析法比较以确定RAPD模式之间的相似性(作为监测分离株之间的多样性的方式)。
对从反刍动物样品获得的产气荚膜梭菌分离株进行抗微生物筛选以量测由发明人鉴定的芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018所产生的抗微生物细菌素的有效性。通过使各菌株在32℃下于摇床中以150rpm于脑心浸液(BHI)肉汤培养基中生长24小时来收获细菌素。在孵育后执行将24小时培养物中的1％转移到新制的BHI肉汤培养基。然后，在32℃摇床中以150rpm孵育芽孢杆菌36-48小时。然后以14,000xg离心培养物20分钟，接着用0.2μm过滤器过滤上清液以去除任何残留细胞。
通过使从反刍动物粪便样品分离的产气荚膜梭菌菌株在37℃下厌氧生长于RCM中24小时执行细菌素浊度测定。将过夜培养物转移(1％)到无菌RCM且立刻用于测定。对于各产气荚膜梭菌分离株，在无菌48孔反应板中运行至少六个孔，即600μl经接种的培养物(阳性对照)、600μl经接种的RCM+70μl细菌素(747、1104、1541、1781和2018)和670RCM(未接种的，阴性对照)。在37℃下厌氧孵育板24小时，然后使用BioTek Epoch微板分光光度计读取，在600nm波长下得到读数。从所有OD读数减去阴性对照的光密度读数，且使用阳性对照和每一细菌素处理来计算抑制百分比。
为鉴定不具有对产气荚膜梭菌具特异性的至少一种毒素基因的梭菌，对分离株DNA使用引物27F-YM和1492R-Y(表1)进行PCR反应来扩增rDNA的16S区。在不含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因的分离株的20％进行此举。PCR混合物包含5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、1μl 50mM dNTP、0.4μM各引物(表1)、0.2μl InvitrogenTM PlatinumTM TaqDNA聚合酶、5μl DNA，并且添加无菌水以达到总反应体积50μl。所述混合物经历95℃4分钟；接着35个循环：95℃30秒、50℃30秒、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸7分钟来结束。对于扩增进行质量检查且将PCR产物送到gene wiz(https://www.genewiz.com)以获得16S基因的序列。将序列与从EZbiocloud在线电子数据库(http://www.ezbiocloud.net/)获得的已知类型的细菌菌株进行比较。基于这些序列的比较，细菌鉴定指定给分离株。
结果：从八个I-29走廊地区农场(明尼苏达州、南达科他州和爱荷华州(Iowa))(从此处分离得3,471个假定的梭菌分离株作为I-29走廊地区梭菌多样性的代表)采集到粪便样品(411个)(表21)。
梭菌枚举结果表明跨所有小牛粪便样品的平均梭菌水平CFU/g为270,000CFU/g，其中单独粪便样品是在<10CFU/g到7,020,000CFU/g范围内。然而，跨所有母牛粪便样品的平均梭菌水平CFU/g为38,100CFU/g，其中单独的粪便样品是在5CFU/g到6,970,000CFU/g范围内(图76)。小牛(图77)和母牛(图78)的样品看起来均是在梭菌水平范围内。
产气荚膜梭菌枚举结果显示跨所有小牛粪便样品的平均产气荚膜梭菌水平CFU/g为54,800CFU/g，其中单独样品是在<10CFU/g到764,000CFU/g范围内。然而，跨所有母牛粪便样品的平均产气荚膜梭菌水平CFU/g为35,400CFU/g，其中单独样品是在<10CFU/g到6,970,000CFU/g范围内(图79)。小牛(图80)和母牛(图81)的样品看起来均是在梭菌水平范围内。
对毒素多重PCR结果的分析显示哪些分离株包含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因。对来自粪便样品的总共3,471个假定梭菌分离株已针对指定的产气荚膜梭菌毒素基因进行了测试。在筛选的3,471个梭菌分离株中，1,549个分离株(44.2％)针对毒素基因中的至少1个测试为阳性。1,549个毒素基因阳性分离株中有1,534个(99％)经鉴定为A型(仅α毒素)，然而，还在梭菌分离株中检测到β、ε和ι毒素。
在经过成功扩增的1,547个分离株中，遗传RAPD指纹图谱呈现多样性。从小牛粪便、母牛粪便和饲料收获所测试的分离株且并不基于样品类型或农场严格聚类。基于75％相似性，分离株依Dice相关方法形成72个簇群。最大的群簇为776个分离株，占系统树图的50.2％。
从RAPD系统树图中选择代表以获得来自此地区的产气荚膜梭菌群体的多样性且进行抑制测定。利用细菌素浊度测定进行的抗微生物测试显示使用从747、1104、1541、1781和2018收获得的细菌素很好地抑制了大多数反刍动物粪便产气荚膜梭菌分离株。来自菌株747、1104、1541、1781和2018中至少一种的细菌素能够抑制所测试的156个分离株中138个(>60％)生长，代表产气荚膜梭菌群体(基于系统树图)总计92.0％的抑制(表22)。
在3,443个分离株中，发现所采集的1,922个分离株(55.8％)为非产毒梭菌。来自非产毒梭菌的测序代表(n＝399)显示两个主要梭菌组，即双酶梭菌组(双酶副梭菌和解苯副梭菌)和拜氏梭菌组(二醇梭菌、拜氏梭菌、还原铬梭菌、糖乙酸多丁醇梭菌、橙色梭菌和糖丁基梭菌)，非产毒梭菌组的这两个主要组占非产毒分离株的61.7％(图82)。
讨论：粪便样品用作最容易得到的样品类型，以估计水平并且在反刍动物的消化系统中获得梭菌和产气荚膜梭菌的分离株。在从整个I-29走廊地区采集的411个粪便样品中，所有样品具有可检测的梭菌水平。从反刍动物样品收获的许多分离株(1,549个分离株)包含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因。在76％的母牛粪便样品和50％的小牛粪便样品中检测到产气荚膜梭菌。梭菌和产气荚膜梭菌的大量存在表明整个I-29走廊地区大多数反刍动物中具有亚急性肠道梭菌疾病激发的风险。根据RAPD遗传指纹，产气荚膜梭菌分离株是多样化的，但对样品类型或农场无特异性。产气荚膜梭菌的不同代表中大多数受到来自以下菌株747、1104、1541、1781或2018的至少一种细菌素抑制(>60％)。所述菌株中的至少一种抑制在所测试的156个分离株中的138个分离株(高于60％)，表示基于簇群在RAPD系统树图上的表示抑制产气荚膜梭菌群体的92.0％。这表明芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018可抑制广泛多种产气荚膜梭菌分离株。芽孢杆菌属菌株并不限于特定的一种或多种梭菌菌株(如疫苗)，基于在RAPD系统树图中所观察到的遗传多样性，所述特定的一种或多种梭菌菌株可能缺失大批梭菌群体。非产毒梭菌的DNA测序揭示两个主要梭菌物种的鉴定。已知可产生1,3-丙二醇的双酶梭菌组(Leja等人，2014；Myszka等人，2012)和已知可产生丁醇和丙酮的拜氏梭菌组(Hou等人，2017)。这些物种的代谢终产物的产生可在反刍动物中具有影响，降低奶牛性能参数，如产奶量。
芽孢杆菌属菌株对梭菌群体提供预防作用，其可不但提高反刍动物效率而导致产奶量增加，而且防止产气荚膜梭菌急性水平从而减少消化系统性死亡的发生。所采集粪便样品中的梭菌和产气荚膜梭菌的高盛行率表明整个I-29走廊中许多反刍动物中的效率改善的机会。本实施例显示从采集自I-29走廊的反刍动物粪便样品和饲料样品得到的梭菌分离株的多样性。所测试的芽孢杆菌属菌株747、1104、1541、1781和2018可抑制I-29走廊中所观察到的大多数梭菌多样性。根据本发明的此实施方案的产品可抑制从I-29走廊的反刍动物分离的产毒梭菌，表明若呈直接喂饲型微生物(DFM)喂饲给奶牛那么具有反刍动物效率益处。
表21.从I-29走廊地区奶牛场按照农场(8)和年龄(母牛或小牛)为分层采集粪便样品411个，对这些样品针对梭菌而枚举，测试产气荚膜梭菌，对分离株进行基因分型并测试抑制。
农场名称 州 母牛粪便 小牛粪便
农场B 明尼苏达州 36 7
农场P 明尼苏达州 48 5
农场K 明尼苏达州 13 4
农场R 爱荷华州 82 5
农场KC 南达科他州 60 0
农场N 明尼苏达州 71 10
农场S 明尼苏达州 46 0
农场C 明尼苏达州 22 2
总计 378 33
表22.显示从I-29走廊地区粪便样品或饲料样品分离的所测试的每种分离株的细菌素测定结果和该分离株的来源。基于每种处理的与阳性对照充分相比的生长百分比来计算抑制。
实施例12：芽孢杆菌属菌株的组合对德克萨斯州农场ALJ奶牛的梭菌群体的影响
引言：最先于1991年报导肠道出血综合征(HBS)，是在爱达荷州一个牛奶场(dairy)的五头高产奶荷斯坦牛观察到的(Sockett，2004)。症状包括点源粘膜下血肿，每头累及10-20cm空肠。这五头牛每头均展示血肿破裂且放血进入至空肠的肠腔中。虽然已知烟曲霉和产气荚膜梭菌与HBS的病因有关，但该综合征本质上最好描述为是多微生物和多因素的。增加高能量饮食的消耗似乎是已经描述的所有危险因素的最合理的共同途径(Berghaus等人，2005)。
HBS表征为产奶量突然降低、由于肠阻塞引起的腹痛和贫血(Anderson，2002)。所述疾病的临床体征是减少饲料摄入、抑郁、产奶量降低、脱水、腹胀和粪便中带暗血凝块。在阻塞性血凝块栓发作的48小时内死亡。因偶发性、急性病因的缘故，已知的有效治疗法很少。
除了引起肠道疾病的一些物种的梭菌属分离株外，其他梭菌属物种产生高水平的丙酮、丁醇、1,3-丙二醇和丁酸(已知作为它们代谢终产物)。若产生于瘤胃中，那么这些代谢终产物可能会影响瘤胃功能且减低效率。
由本发明人选择的可以抑制病原体的芽孢杆菌属菌株产生针对其他微生物具有抑制活性的多种化合物，其中包含超过十个操纵子的许多菌株产生抗真菌化合物和抗细菌化合物。多种细菌素在体外直接在芽孢杆菌属菌株作用的位点之处产生，因此细菌素的稳固共混物以低于所分离的细菌素直接加入饲料的情况下所需要的剂量的剂量存在。
本研究的目的是经110天测量经过根据本发明此实施方案的产品处理的(本文称为“经处理的”)农场ALJ奶牛中梭菌的水平和多样性。
材料和方法：选择德克萨斯州(农场ALJ)奶牛牛群来研究根据本发明此实施方案的芽孢杆菌属产品对梭菌水平和多样性的影响。所述牛群由圈养在沙特阿拉伯(Saudi)风格的畜棚中且睡在沙地上的2900头奶牛组成。
根据本发明此实施方案的产品是相等比例的两种芽孢杆菌属菌株的组合产品；芽孢杆菌747和芽孢杆菌1781，以每天二十亿CFU/头的剂量掺入全混合日粮(TMR)。
粪便样品是在两个时间段从处理前的90头母牛和处理110天后的63头母牛获得。
用无菌蛋白胨1:10稀释母牛粪便样品，在60℃下热休克30分钟，于无菌蛋白胨中计数继而倾注于具有D-环丝氨酸(400mg/L)的胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸(TSC)琼脂板上以选择梭菌物种。在37℃下厌氧孵育琼脂板24小时。若存在，那么将分离的亚硫酸盐还原菌落经过计数得到总梭菌计数(CFU/g)，并且将代表性分离株挑入强化梭菌培养基(RCM)(Oxoid，CM0149)中且在37℃下厌氧孵育24小时。在孵育24小时后，将培养物转移(10％)到脑心浸液(BHI)肉汤培养基(BD，211059)且在37℃下厌氧孵育24小时。
在每孔含500μl假定梭菌培养物的96孔块中进行DNA的提取。通过以4,700rpm离心10分钟、去除上清液来收获细胞。将细胞重悬浮于500μl的50mM EDTA-2Na(pH＝8.0)中。将300μl悬浮细胞的等分试样转移到新的96孔块并与来自鸡蛋白(西格马(Sigma)，L6876)溶液(100mg/ml，在50mM EDTA中)的20μl溶菌酶组合以裂解细菌细胞。在37℃下孵育96孔块1小时以裂解细菌细胞。在孵育后添加220μl裂解缓冲液(6M胍、20％Triton-X 100、10mMTris-HCL，pH 7.5)，混合然后在室温下孵育15分钟。在孵育后向每孔添加20μl蛋白酶K(NEB，800U/mL)，混合并且在55℃下孵育30分钟以降解蛋白质。然后将细胞裂解物转移到96孔结合板(Promega，A2278)并且以4,700rpm离心5分钟。丢弃流通物，通过以4700rpms离心750μl柱洗涤溶液(Promega，A1318)持续1分钟30秒、丢弃在每次旋转结束时的流通物来执行结合板柱的三次洗涤。将结合板以4,700rpm再离心10分钟以去除任何残留的乙醇。然后将干净的洗脱板置于结合板之下，并且用200μl预热(55℃)的无核酸酶水(Promega，P1195)洗脱DNA。
利用聚合酶链式反应(PCR)，针对对产气荚膜梭菌具有特异性的毒素基因(α、β、ε及ι)筛选DNA。利用包含四个引物组的多重PCR(Yoo等人，1997)执行毒素基因的扩增(表1)。PCR混合物包含2.5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、0.5μM各引物(表1)、0.1μlInvitrogenTM PlatinumTM Taq DNA聚合酶、2.5μl DNA，添加无菌水以达到总反应体积25μl。所述混合物经历94℃5分钟；接着30个循环：94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟；最后以72℃最终延伸3分钟来结束。使用片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)观察PCR产物以确定是否实现扩增。若观察到一个或多个毒素基因，那么根据它们的毒素基因谱对各分离株进行毒素类型鉴定(Songer，1996)。利用阳性产气荚膜梭菌与总梭菌分离株的比率以基于总梭菌计数计算估计的产气荚膜梭菌计数。
利用对所选分离株进行的随机扩增多态性DNA(RAPD)分析产生独特的菌株特异性遗传指纹以确定产气荚膜梭菌分离株中的多样性。PCR包含5μl DNA、2.5μl RAPD引物2(10μM)(表1)和添加至Ready-To-Go RAPD分析珠(Life Sciences，27-9500-01)的17.5μl无菌水。所述混合物经历95℃5分钟；接着45个循环：95℃1分钟、36℃1分钟、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸5分钟来结束。在片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)上观察PCR产物以确定扩增模式且导入到BioNumerics生物信息学软件以用于分析。将RAPD模式与基于带的Dice相关分析法比较以确定RAPD模式之间的相似性(作为监测分离株之间的多样性的方式)。簇群截止是75％相似性。
为鉴定不具有对产气荚膜梭菌具特异性的至少一种毒素基因的梭菌，对分离株DNA使用引物27F-YM和1492R-Y(表1)进行PCR反应来扩增rDNA的16S区。在不含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因的分离株的20％进行此举。PCR混合物包含5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、1μl 50mM dNTP、0.4μM各引物(表1)、0.2μl InvitrogenTM PlatinumTM TaqDNA聚合酶、5μl DNA，并且添加无菌水以达到总反应体积50μl。所述混合物经历95℃4分钟；接着35个循环：95℃30秒、50℃30秒、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸7分钟来结束。对于扩增进行质量检查且将PCR产物送到Genewiz(https://www.genewiz.com)以获得16S基因的序列。将序列与从EZbiocloud在线电子数据库(http://www.ezbiocloud.net/)获得的已知类型的菌株进行比较。基于这些序列的比较，细菌鉴定指定给分离株。
结果：农场ALJ(图83)的总梭菌计数与德克萨斯州研究期间确定的那些之间并无显著差异(实施例6)。在关于产品的110天期间，总梭菌显著减少。虽然用芽孢杆菌属共混物处理产气荚膜梭菌中没有减少(图84)，但在处理期间分离的产气荚膜梭菌的菌株多样性有所减少，这是通过产气荚膜梭菌RAPD模式的Shannon-Wiever指数指示的(表23)。在处理期间非产毒梭菌的多样性也减少，并且主要拜氏梭菌组分离株在处理期间被第三梭菌组分离株代替(图85和表24)。
讨论：芽孢杆菌属菌株的共混物引起母牛中总梭菌计数减少以及产气荚膜梭菌菌株的多样性减小。芽孢杆菌属产品还减小非产毒梭菌物种的多样性并引起拜氏梭菌组菌株被第三梭菌组替代。这些数据证实产品引起梭菌计数减少以及产气荚膜梭菌分离株的多样性和梭菌属物种的多样性和类型减少。已知可产生高水平的丁醇和丙酮的拜氏梭菌组的比例的减小将很大可能改善瘤胃发酵且提高饲料效率以及奶牛产奶量。
表23.产气荚膜梭菌分离株随时间的RAPD指纹多样性。
表24.非产毒梭菌属物种的多样性和这两种主要组的比例随时间的变化。
实施例13：芽孢杆菌属菌株的组合对威斯康辛州农场E奶牛的梭菌群体的影响
引言：最先于1991年报导肠道出血综合征(HBS)，是在爱达荷州一个牛奶场(dairy)的五头高产奶荷斯坦牛观察到的(Sockett，2004)。症状包括点源粘膜下血肿，每头累及10-20cm空肠。这五头牛每头均展示血肿破裂且放血进入至空肠的肠腔中。虽然已知烟曲霉和产气荚膜梭菌与HBS的病因有关，但该综合征本质上最好描述为是多微生物和多因素的。增加高能量饮食的消耗似乎是已经描述的所有危险因素的最合理的共同途径(Berghaus等人，2005)。
HBS表征为产奶量突然降低、由于肠阻塞引起的腹痛和贫血(Anderson，2002)。所述疾病的临床体征是减少饲料摄入、抑郁、产奶量降低、脱水、腹胀和粪便中带暗血凝块。在阻塞性血凝块栓发作的48小时内死亡。因偶发性、急性病因的缘故，已知的有效治疗法很少。
除了引起肠道疾病的一些物种的梭菌属分离株外，其他梭菌属物种产生高水平的丙酮、丁醇、1,3-丙二醇和丁酸(已知作为它们代谢终产物)。若产生于瘤胃中，那么这些代谢终产物可能会影响瘤胃功能且减低效率。
由本发明人选择的可以抑制病原体的芽孢杆菌属菌株产生针对其他微生物具有抑制活性的多种化合物，其中包含超过十个操纵子的许多菌株产生抗真菌化合物和抗细菌化合物。多种细菌素在体外直接在芽孢杆菌属菌株作用的位点之处产生，因此细菌素的稳固共混物以低于所分离的细菌素直接加入饲料的情况下所需要的剂量的剂量存在。
本研究的目的是经220天测量经过根据本发明此实施方案的产品处理的(本文称为“经处理的”)威斯康辛州农场E奶牛中梭菌的水平和多样性。
材料和方法：选择威斯康辛州(农场E)奶牛牛群来研究根据本发明此实施方案的芽孢杆菌属产品对梭菌水平和多样性的影响。所述牛群由圈养在散养畜棚中的650头奶牛组成且奶牛是睡在沙地上。
根据本发明此实施方案的产品是三种芽孢杆菌属菌株的组合产品；芽孢杆菌747(50％)、芽孢杆菌1781(45％)和芽孢杆菌1541(5％)，以每天约二十亿CFU/头的剂量掺入全混合日粮(TMR)。
粪便样品是从处理前和处理期间的母牛获得。样品数据和采样动物的数量指示于表25中。
用无菌蛋白胨1:10稀释母牛粪便样品，在60℃下热休克30分钟，于无菌蛋白胨中计数继而倾注于具有D-环丝氨酸(400mg/L)的胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸(TSC)琼脂板上以选择梭菌物种。在37℃下厌氧孵育琼脂板24小时。若存在，那么将分离的亚硫酸盐还原菌落经过计数得到总梭菌计数(CFU/g)，并且将代表性分离株挑入强化梭菌培养基(RCM)(Oxoid，CM0149)中且在37℃下厌氧孵育24小时。在孵育24小时后，将培养物转移(10％)到脑心浸液(BHI)肉汤培养基(BD，211059)且在37℃下厌氧孵育24小时。
在每孔含500μl假定梭菌培养物的96孔块中进行DNA的提取。通过以4,700rpm离心10分钟、去除上清液来收获细胞。将细胞重悬浮于500μl的50mM EDTA-2Na(pH＝8.0)中。将300μl悬浮细胞的等分试样转移到新的96孔块并与来自鸡蛋白(西格马(Sigma)，L6876)溶液(100mg/ml，在50mM EDTA中)的20μl溶菌酶组合以裂解细菌细胞。在37℃下孵育96孔块1小时以裂解细菌细胞。在孵育后添加220μl裂解缓冲液(6M胍、20％Triton-X 100、10mMTris-HCL，pH 7.5)，混合然后在室温下孵育15分钟。在孵育后向每孔添加20μl蛋白酶K(NEB，800U/mL)，混合并且在55℃下孵育30分钟以降解蛋白质。然后将细胞裂解物转移到96孔结合板(Promega，A2278)并且以4,700rpm离心5分钟。丢弃流通物，通过以4700rpms离心750μl柱洗涤溶液(Promega，A1318)持续1分钟30秒、丢弃在每次旋转结束时的流通物来执行结合板柱的三次洗涤。将结合板以4,700rpm再离心10分钟以去除任何残留的乙醇。然后将干净的洗脱板置于结合板之下，并且用200μl预热(55℃)的无核酸酶水(Promega，P1195)洗脱DNA。
利用聚合酶链式反应(PCR)，针对对产气荚膜梭菌具有特异性的毒素基因(α、β、ε及ι)筛选DNA。利用包含四个引物组的多重PCR(Yoo等人，1997)执行毒素基因的扩增(表1)。PCR混合物包含2.5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、0.5μM各引物(表1)、0.1μlInvitrogenTM PlatinumTM Taq DNA聚合酶、2.5μl DNA，添加无菌水以达到总反应体积25μl。所述混合物经历94℃5分钟；接着30个循环：94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟；最后以72℃最终延伸3分钟来结束。使用片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)观察PCR产物以确定是否实现扩增。若观察到一个或多个毒素基因，那么根据它们的毒素基因谱对各分离株进行毒素类型鉴定(Songer，1996)。利用阳性产气荚膜梭菌与总梭菌分离株的比率以基于总梭菌计数计算估计的产气荚膜梭菌计数。
利用对所选分离株进行的随机扩增多态性DNA(RAPD)分析产生独特的菌株特异性遗传指纹以确定产气荚膜梭菌分离株中的多样性。PCR包含5μl DNA、2.5μl RAPD引物2(10μM)(表1)和添加至Ready-To-Go RAPD分析珠(Life Sciences，27-9500-01)的17.5μl无菌水。所述混合物经历95℃5分钟；接着45个循环：95℃1分钟、36℃1分钟、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸5分钟来结束。在片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)上观察PCR产物以确定扩增模式且导入到BioNumerics生物信息学软件以用于分析。将RAPD模式与基于带的Dice相关分析法比较以确定RAPD模式之间的相似性(作为监测分离株之间的多样性的方式)。簇群截止是75％相似性。
为鉴定不具有对产气荚膜梭菌具特异性的至少一种毒素基因的梭菌，对分离株DNA使用引物27F-YM和1492R-Y(表1)进行PCR反应来扩增rDNA的16S区。在不含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因的分离株的20％进行此举。PCR混合物包含5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、1μl 50mM dNTP、0.4μM各引物(表1)、0.2μl InvitrogenTM PlatinumTM TaqDNA聚合酶、5μl DNA，并且添加无菌水以达到总反应体积50μl。所述混合物经历95℃4分钟；接着35个循环：95℃30秒、50℃30秒、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸7分钟来结束。对于扩增进行质量检查且将PCR产物送到Genewiz(https://www.genewiz.com)以获得16S基因的序列。将序列与从EZbiocloud在线电子数据库(http://www.ezbiocloud.net/)获得的已知类型的菌株进行比较。基于这些序列的比较，细菌鉴定指定给分离株。
结果：农场E的总梭菌计数(图86)与威斯康辛州研究期间确定的那些之间并无显著差异(实施例5)。虽然在用芽孢杆菌属共混物处理期间梭菌(图86)或产气荚膜梭菌(图87)中没有减少，但在处理期间分离的产气荚膜梭菌的菌株多样性有所减少，这是通过产气荚膜梭菌RAPD模式的Shannon-Wiever指数指示的(表26)。在处理期间非产毒梭菌的多样性也减少，并且主要拜氏梭菌组分离株在处理期间完全被双酶梭菌组分离株代替(图88和表27)。
讨论：选择可抑制产气荚膜梭菌的芽孢杆菌属菌株的共混物减少了母牛中产气荚膜梭菌菌株的多样性。芽孢杆菌属产品还减小非产毒梭菌物种的多样性并引起拜氏梭菌组菌株被双酶梭菌和其他替代。这些数据证实甚至在梭菌计数落在本地区正常范围内且未因产品被减少时，产气荚膜梭菌分离株的多样性和所存在的梭菌物种的多样性及类型仍有减少。处理前拜氏梭菌组占优势(96％)，但于处理220天后未检测到。已知可产生高水平的丁醇和丙酮的拜氏梭菌组的比例的减小将很大可能改善瘤胃发酵且提高饲料效率以及奶牛产奶量。
表25：在威斯康辛州农场E的各采样点采集的粪便样品数量。
样品 日期 母牛粪便
处理前 2016年5月11日 40
处理第60天 2016年7月13日 38
处理第220天 2016年12月20日 41
表26.来自威斯康辛州农场E的产气荚膜梭菌分离株随时间的RAPD指纹多样性。
表27.非产毒梭菌属物种的多样性和这两种主要组的比例随时间的变化。
实施例14：芽孢杆菌属菌株的组合对德克萨斯州农场BS-TX奶牛的梭菌群体的影响
引言：最先于1991年报导肠道出血综合征(HBS)，是在爱达荷州一个牛奶场(dairy)的五头高产奶荷斯坦牛观察到的(Sockett，2004)。症状包括点源粘膜下血肿，每头累及10-20cm空肠。这五头牛每头均展示血肿破裂且放血进入至空肠的肠腔中。虽然已知烟曲霉和产气荚膜梭菌与HBS的病因有关，但该综合征本质上最好描述为是多微生物和多因素的。增加高能量饮食的消耗似乎是已经描述的所有危险因素的最合理的共同途径(Berghaus等人，2005)。
HBS表征为产奶量突然降低、由于肠阻塞引起的腹痛和贫血(Anderson，2002)。所述疾病的临床体征是减少饲料摄入、抑郁、产奶量降低、脱水、腹胀和粪便中带暗血凝块。在阻塞性血凝块栓发作的48小时内死亡。因偶发性、急性病因的缘故，已知的有效治疗法很少。
除了引起肠道疾病的一些物种的梭菌属分离株外，其他梭菌属物种产生高水平的丙酮、丁醇、1,3-丙二醇和丁酸(已知作为它们代谢终产物)。若产生于瘤胃中，那么这些代谢终产物可能会影响瘤胃功能且减低效率。
由本发明人选择的可以抑制病原体的芽孢杆菌属菌株产生针对其他微生物具有抑制活性的多种化合物，其中包含超过十个操纵子的许多菌株产生抗真菌化合物和抗细菌化合物。多种细菌素在体外直接在芽孢杆菌属菌株作用的位点之处产生，因此细菌素的稳固共混物以低于所分离的细菌素直接加入饲料的情况下所需要的剂量的剂量存在。
本研究的目的是经107天测量经过根据本发明此实施方案的产品处理的(本文称为“经处理的”)农场B-TX奶牛产奶量和梭菌的水平和多样性。
材料和方法：选择德克萨斯州(农场BS)奶牛牛群来研究根据本发明此实施方案的芽孢杆菌属产品对产奶量和梭菌水平和多样性的影响。这一牛群由圈养在强制通风的畜棚中的5500头奶牛组成且奶牛是睡在沙地上。
根据本发明此实施方案的产品是相等比例的两种芽孢杆菌属菌株的组合产品；芽孢杆菌747和芽孢杆菌1781，以每天约二十亿CFU/头的剂量掺入全混合日粮(TMR)。
计算喂饲芽孢杆菌属给奶牛之前的平均能量校正牛奶(ECM)产量持续4个月。将产品加入饲料中后计算ECM产量持续4个月。ECM是一种基于总能量考虑液态产奶量(lb)、牛奶脂肪(lb)和牛奶蛋白(lb)使产奶体积标准化的计算。这一计算调整实际牛奶脂肪(lb)到3.5％且实际牛奶蛋白(lb)调整到标准化的3.2％。这一计算允许生产者基于标准化来比较产奶体积。
ECM的公式：
ECM＝(0.327x牛奶磅数)+(12.95x脂肪磅数)+(7.65x蛋白质磅数)
粪便样品是从处理前的60头母牛和处理107天后的60头母牛获得。
用无菌蛋白胨1:10稀释母牛粪便样品，在60℃下热休克30分钟，于无菌蛋白胨中计数继而倾注于具有D-环丝氨酸(400mg/L)的胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸(TSC)琼脂板上以选择梭菌物种。在37℃下厌氧孵育琼脂板24小时。若存在，那么将分离的亚硫酸盐还原菌落经过计数得到总梭菌计数(CFU/g)，并且将代表性分离株挑入强化梭菌培养基(RCM)(Oxoid，CM0149)中且在37℃下厌氧孵育24小时。在孵育24小时后，将培养物转移(10％)到脑心浸液(BHI)肉汤培养基(BD，211059)且在37℃下厌氧孵育24小时。
在每孔含500μl假定梭菌培养物的96孔块中进行DNA的提取。通过以4,700rpm离心10分钟、去除上清液来收获细胞。将细胞重悬浮于500μl的50mM EDTA-2Na(pH＝8.0)中。将300μl悬浮细胞的等分试样转移到新的96孔块并与来自鸡蛋白(西格马(Sigma)，L6876)溶液(100mg/ml，在50mM EDTA中)的20μl溶菌酶组合以裂解细菌细胞。在37℃下孵育96孔块1小时以裂解细菌细胞。在孵育后添加220μl裂解缓冲液(6M胍、20％Triton-X 100、10mMTris-HCL，pH 7.5)，混合然后在室温下孵育15分钟。在孵育后向每孔添加20μl蛋白酶K(NEB，800U/mL)，混合并且在55℃下孵育30分钟以降解蛋白质。然后将细胞裂解物转移到96孔结合板(Promega，A2278)并且以4,700rpm离心5分钟。丢弃流通物，通过以4700rpms离心750μl柱洗涤溶液(Promega，A1318)持续1分钟30秒、丢弃在每次旋转结束时的流通物来执行结合板柱的三次洗涤。将结合板以4,700rpm再离心10分钟以去除任何残留的乙醇。然后将干净的洗脱板置于结合板之下，并且用200μl预热(55℃)的无核酸酶水(Promega，P1195)洗脱DNA。
利用聚合酶链式反应(PCR)，针对对产气荚膜梭菌具有特异性的毒素基因(α、β、ε及ι)筛选DNA。利用包含四个引物组的多重PCR(Yoo等人，1997)执行毒素基因的扩增(表1)。PCR混合物包含2.5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、0.5μM各引物(表1)、0.1μlInvitrogenTM PlatinumTM Taq DNA聚合酶、2.5μl DNA，添加无菌水以达到总反应体积25μl。所述混合物经历94℃5分钟；接着30个循环：94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟；最后以72℃最终延伸3分钟来结束。使用片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)观察PCR产物以确定是否实现扩增。若观察到一个或多个毒素基因，那么根据它们的毒素基因谱对各分离株进行毒素类型鉴定(Songer，1996)。利用阳性产气荚膜梭菌与总梭菌分离株的比率以基于总梭菌计数计算估计的产气荚膜梭菌计数。
利用对所选分离株进行的随机扩增多态性DNA(RAPD)分析产生独特的菌株特异性遗传指纹以确定产气荚膜梭菌分离株中的多样性。PCR包含5μl DNA、2.5μl RAPD引物2(10μM)(表1)和添加至Ready-To-Go RAPD分析珠(Life Sciences，27-9500-01)的17.5μl无菌水。所述混合物经历95℃5分钟；接着45个循环：95℃1分钟、36℃1分钟、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸5分钟来结束。在片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)上观察PCR产物以确定扩增模式且导入到BioNumerics生物信息学软件以用于分析。将RAPD模式与基于带的Dice相关分析法比较以确定RAPD模式之间的相似性(作为监测分离株之间的多样性的方式)。簇群截止是75％相似性。
为鉴定不具有对产气荚膜梭菌具特异性的至少一种毒素基因的梭菌，对分离株DNA使用引物27F-YM和1492R-Y(表1)进行PCR反应来扩增rDNA的16S区。在不含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因的分离株的20％进行此举。PCR混合物包含5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、1μl 50mM dNTP、0.4μM各引物(表1)、0.2μl InvitrogenTM PlatinumTM TaqDNA聚合酶、5μl DNA，并且添加无菌水以达到总反应体积50μl。所述混合物经历95℃4分钟；接着35个循环：95℃30秒、50℃30秒、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸7分钟来结束。对于扩增进行质量检查且将PCR产物送到Genewiz(https://www.genewiz.com)以获得16S基因的序列。将序列与从EZbiocloud在线电子数据库(http://www.ezbiocloud.net/)获得的已知类型的菌株进行比较。基于这些序列的比较，细菌鉴定指定给分离株。
结果：随着ECM每天增加0.6lb，处理期间农场BS产奶量增加。
农场BS的平均总梭菌计数(图89)显著高于(P>0.05)德克萨斯州研究期间确定的那些(实施例6)。在用芽孢杆菌共混物处理期间总体梭菌或总体产气荚膜梭菌无变化(图90)，但在处理期间分离的产气荚膜梭菌的菌株多样性有所减少，这是通过产气荚膜梭菌RAPD模式的Shannon-Wiever指数指示的(表28)。在处理期间拜氏梭菌组分离株被双酶梭菌组分离株代替(图91和表29)。
讨论：在处理期间产奶量提高，此外，根据本发明此实施方案的芽孢杆菌属菌株的共混物使得母牛中产气荚膜梭菌菌株的多样性减小。芽孢杆菌属产品还减小非产毒梭菌物种的多样性并引起拜氏梭菌组菌株被双酶梭菌替代。这些数据证实甚至在梭菌计数未因芽孢杆菌属菌株大大地减少时，产气荚膜梭菌分离株的多样性和梭菌物种的类型也受产品影响。已知可产生高水平的丁醇及丙酮的拜氏梭菌组的比例的减小很大可能改善瘤胃发酵和饲料效率，从而增加产奶量，如在这些奶牛中测量到的。
表28.来自德克萨斯州农场BS的产气荚膜梭菌分离株随时间的RAPD指纹多样性。
表29.来自德克萨斯州农场BS的非产毒梭菌物种的多样性和两种最主要组的比例随时间的变化。
实施例15：肠上皮细胞系中芽孢杆菌属菌株针对LPS激发的免疫基因表达应答
引言：进行体外细胞培养物筛选研究以确定芽孢杆菌属菌株和菌株的组合对肠上皮细胞系中炎性细胞因子基因表达应答的影响。在LPS激发模型中的IEC-6大鼠肠上皮细胞系中筛选芽孢杆菌属菌株以确定每种芽孢杆菌属菌株及组合对进行及不进行LPS激发的炎性细胞因子基因表达应答的影响。在模型中测试的芽孢杆菌属菌株和组合包括：
芽孢杆菌属菌株 747
芽孢杆菌属菌株 1781
芽孢杆菌属菌株 1104
芽孢杆菌属菌株 1541
芽孢杆菌属菌株 2018
芽孢杆菌属菌株 747+1781
材料和方法：细胞培养物制剂：本研究中使用IEC6大鼠肠上皮细胞系(ATCC)：在37℃的培养箱中在5％CO2下将细胞在组织培养烧瓶内的CCM完全生长培养基(DMEM：含有4mML-谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖；1.5g/L碳酸氢钠；0.1单位/mL牛胰岛素，90％；10％FBS：胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养基)(具有1％抗生素(青霉素，10U/mL/链霉素，10mg/mL))中扩增至第18代达到80％的汇合率。从烧瓶移走生长培养基，然后将细胞用达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤两次。在烧瓶中添加加热到37℃的胰蛋白酶以覆盖细胞单层，并且在37℃下孵育直到使细胞离开烧瓶表面。立刻将CCM生长培养基添加至胰蛋白酶消化的细胞，通过吸移彻底地混合并移至15mL圆锥管。通过以1500rpm离心10分钟将细胞沉淀。丢弃上清液后，将细胞悬浮于2-3mL CCM生长培养基中，并且通过在台盼蓝(Trypan Blue)中稀释一部分细胞悬浮液并于血细胞计数器上计数来确定细胞浓度与活力。将细胞稀释至3x105个细胞/mL，取1mL的此细胞悬浮液添加至24-孔板的各孔，并于37℃培养箱在5％CO2下孵育过夜以使细胞粘附至孔底部并形成单层。第二天，从各孔移去生长培养基，用DPBS洗涤细胞单层两次，并将处理给予至指定的孔。
细胞培养物处理给予：将处理给予至24-孔中的各孔。当给予处理时，在此测定阶段内使用无抗生素的CCM培养基。在无抗生素的CCM培养基中制备30ng/mL LPS溶液，且将500uL此溶液给予至各个经过LPS处理的孔，导致将15ng给予至各个合适的孔。使芽孢杆菌属菌株生长于胰蛋白酶大豆肉汤中过夜且于DPBS中稀释，这样使得将250uL的各对应处理给予至各孔以递送1x105cfu/孔。将1mL总体积给予至各孔，视情况添加DPBS或CCM培养基以使各孔达到相等体积1mL。给予至未刺激的LPS、芽孢杆菌属和芽孢杆菌属+LPS指定孔的特定体积示于表30中。
在向指定孔给予处理后，在37℃及5％CO2下孵育板1小时。在一小时的孵育后，从孔去除培养基且用温DPBS洗涤细胞2次。在第二次DPBS洗涤后，立即将400uL三唑添加至各孔且允许在室温下孵育5分钟。从各孔去除三唑，放在用指定处理标记的1.5mL微量离心管中并立刻于液氮中速冻。将管储存于-80℃以供以后进行RNA提取及qPCR基因表达分析。
RNA提取和cDNA合成：从冷冻储藏室移走冷冻三唑管且允许在冰上解冻。使用Direct-zol RNA MiniPrep试剂盒(Zymo Research，Irvine，CA)根据制造商说明书提取RNA。RNA浓度是在Qubit荧光计(ThermoFisher Scientific,Inc.)上检查，且被记录以记载从细胞培养实验模板的各孔进行的RNA提取。使用QuantiNova逆转录试剂盒(Qiagen，Germantown，MD)按照制造商说明书来制备cDNA。
实时定量PCR：在Applied Biosystems StepOne Plus实时PCR系统(AppliedBiosystems，Foster City，CA)上使用表31中所列的Platinum Taq聚合酶和引物进行qPCR。β-肌动蛋白用作管家基因，并且通过从与管家基因有关的PCR循环数减去与目标基因有关的PCR循环数来确定各孔处理的ΔCt值。还使用ΔΔCt法来计算基因表达的倍数变化，可计算得到相对未刺激的细胞而言各LPS和芽孢杆菌处理的基因表达的倍数变化。
结果：所测试的所有芽孢杆菌属菌株当在暴露于肠上皮细胞系时引发一些炎症应答，这是通过炎性细胞因子MIP-2和TNF-α的基因表达的倍数变化的增加指示的(图92至图96)。在所测试的五个芽孢杆菌属菌株中，与其他相比芽孢杆菌747(图92)展现炎性细胞因子基因的表达的倍数的增加大幅减小。当与LPS组合时，芽孢杆菌属菌株中的三种(芽孢杆菌1781、芽孢杆菌1104和芽孢杆菌2018；分别为图93、图94和图96)相较于单独LPS炎症激发减少了炎性细胞因子基因表达，指示这些芽孢杆菌属菌株具有改善胃肠组织中对炎症激发应答的能力。向IEC-6上皮细胞系给予的芽孢杆菌747与芽孢杆菌1781的组合导致基因表达的倍数变化，所述倍数变化类似于单独给予的芽孢杆菌747；并且所述组合展现出具有减小由LPS激发诱导的炎症应答的适中倾向，这类似于芽孢杆菌1781(图97)。
讨论：这些数据说明炎症激发模型(模拟革兰氏阴性细菌致病性感染的影响)中芽孢杆菌属菌株的免疫调节潜力。另外，单独的芽孢杆菌属菌株引发对炎症的不同免疫调节作用，表明芽孢杆菌属菌株可针对特定功能(炎症或抗炎症)来满足宿主的健康需求。
表30.用于细胞培养物发酵产品研究中的引物序列。
表31.基于指定处理给予各孔的体积。
实施例16：将含有芽孢杆菌属和乳杆菌属菌株的直接喂饲型微生物给予至小牛代乳品
引言：当喂饲补充于代乳品中的直接喂饲型微生物(DFM)时幼小小奶牛的断奶前后性能及健康
材料和方法：试验中包括总共100头荷斯坦小母牛(39.2±0.65kg体重)以评估呈加入小牛代乳品的直接喂饲型微生物(DFM)给予的两种不同微生物组合的效果。56天的研究包括对小牛给予20/20(20％脂肪/20％蛋白质)代乳品的42天断奶前部分和对小牛完全喂饲干饮食的14天断奶后时期。将全乳蛋白质(非药用代乳品)以0.28kg于2L水中从第1天到第35天每天2次且从第36天至第42天(断奶)每天喂饲l次。本研究中所使用的代乳品与干饲料的养分组成概述于表32中。小牛被随机分配到四种处理之一中(25头小牛/处理)，将这些处理添加至单独地给予每头测试小牛的每日小牛代乳品混合物中：
1)对照-20/20代乳品
2)抗生素-对照补充有新霉素和土霉素，给予率为22mg/kg BW，持续14天
3)芽孢杆菌747-对照补充有每次饲喂中含芽孢杆菌属菌株747(1x109CFU/头/天)的5g DFM预混物，持续42天
4)芽孢杆菌747+1781-对照补充有含芽孢杆菌属菌株747+1781的5g DFM预混物(lx109CFU/头/天，为总CFU，其中每种芽孢杆菌属菌株代表全部的50％)，饲喂持续42天。
在研究的第14天、第28天、第42天和第56天记录小牛的体重，且计算平均日增重(ADG)。在研究的第1天和第56天对每头小牛的臀高进行测量并记录。每天记录总采食量且每两周按处理总结。每天对小牛实施粪便评分，且使用定义为l＝正常、2＝稀、3＝很稀但没有水样分离和4＝很水的1至4标度在研究的前四周中每周进行总结。在整个研究中记录了健康记录，包括药物处理、处理天数、药物处理成本和死亡率。
在最初的处理给予后14天，从每头小牛获得10mL血样于EDTA管中。从10mL样品移走0.5mL子样并放入RNA保护管(Qiagen,Inc.，Valencia，CA)。从剩余的全血样品收集血浆且分析急性期蛋白触珠蛋白。根据制造商说明书通过ELISA试剂盒(MyBioSource，SanDiego，CA)分析触珠蛋白。使用RNA保护管中的血液以从血液细胞提取RNA，并且在四个处理组间测量各种免疫细胞因子的基因表达分析。简言之，根据制造商说明书使用RNEasy保护动物血液试剂盒(Qiagen,Inc.)对储存于RNA保护管中的血样进行RNA提取。使用QuantiNova逆转录试剂盒(Qiagen，Germantown，MD)按照制造商说明书来制备cDNA。在Applied Biosystems StepOne Plus实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)上使用Platinum Taq聚合酶和表33中所列的引物来进行实时定量PCR(RT-qPCR)。甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用作管家基因，并且通过从与管家基因有关的PCR循环数减去与靶基因有关的PCR循环数来确定各孔处理的ΔCt值。
使用SAS的PROC MIXED程序分析生长性能和小牛健康数据，且视情况应用重复测量分析。使用一般线性模型程序采用JMP来分析血清急性期蛋白质和细胞因子基因表达数据。采用学生t检验，使用最小二乘均值来区分处理效果。初始体重(BW)在显著时用作BW、ADG和干物质采食量(DMI)数据的协变量。初始臀高用作第56天臀高与臀高增高的协变量。
结果：喂饲抗生素处理(TRT2)和芽孢杆菌747(TRT3)的小牛相较于喂饲对照(TRT1)代乳品的小牛在研究的第56天具有更高的(P＝0.05)体重且倾向于(P<0.10)具有更高的ADG和总体重增重，然而，给予芽孢杆菌747+1781(TRT4)的小牛是介于对照与其他处理之间(表34)。所有处理中，代乳品和小牛开食料采食量都相似(表35和表36)，且观察到血清蛋白、粪便评分、洗擦日或处理成本无差异(表37)。
所有这四种处理的血浆触珠蛋白浓度相似(图98)。给予芽孢杆菌747+1781处理的小牛相较于所有其他而言血液细胞中活性氧化合物iNOS的基因表达更高(P<0.05)(表38)。另外，相较于给予对照和芽孢杆菌747处理的小牛而言喂饲抗生素处理的小牛中炎性细胞因子IL-6的基因表达更高(P<0.05)，且相较于喂饲抗生素或芽孢杆菌747的小牛而言给予对照代乳品和芽孢杆菌747+1781补充的小牛中具有更高(P<0.05)的细胞因子CCL8的基因表达。本研究中观察到的细胞因子基因表达差异指示单独给予的芽孢杆菌747相较于芽孢杆菌747+1781的组合而言促进较少炎症环境，如通过在喂饲芽孢杆菌747+1781的小牛中观察到更高的iNOS和CCL8基因表达指示的。
讨论：喂饲具有芽孢杆菌属补充剂的代乳品的小牛具有与连续14天供给含有抗生素、硫酸新霉素:土霉素的代乳品的小牛相似的生长和健康，指示给予小牛的芽孢杆菌属有潜力用作抗生素给予的替代品，以促进健康和高效生长。另外，本研究显示单独或呈组合方式的特定芽孢杆菌属菌株引发不同的免疫调节活性，促进了年轻小牛中炎症或静态免疫环境，潜在地导致免疫发育与功能差异。
表32.基础代乳品(MR)和基础小牛开食料(CS)的养分组成。
养分分析 MR CS
干物质，％ 96.14 86.31
ADF<sup>1</sup>，％ --- 10.22
NDF<sup>1</sup>，％ 0.25 16.97
CP<sup>1</sup>，％ 21.34 19.72
灰分，％ 10.15 6.61
醚提取物，％ 20.35 3.95
淀粉，％ --- 35.98
钙，％ 0.90 1.08
磷，％ 0.91 0.63
钾，％ 2.72 1.31
镁，％ 0.20 0.31
TDN<sup>1</sup>，％ --- 76.77
NFC<sup>1</sup>，％ 47.92 53.53
1ADF＝酸性洗涤纤维；NDF＝中性洗涤纤维；CP＝粗蛋白；TDN＝总可消化养分；NFC＝非纤维碳水化合物
表33.采用RT-qPCR进行免疫基因表达分析所需要的牛引物序列。
表34.在本研究的第1天至第56天测量的小牛生长参数。
1TRT1对照；TRT2＝抗生素；TRT3＝芽孢杆菌747；TRT4＝芽孢杆菌747+1781。
2初始体重(BW)用作体重与平均日增重数据的协变量。
3初始臀高(HH)用作第56天的臀高测量值与HH增高的协变量。
a,b,c表示具有不同上标的同一排中的是不同的(P＝0.05)。
x,y,z表示具有不同上标的同一排中的是不同的(P<0.10)。
表35.在本研究的第1天至第42天测量的小牛代乳品(MR)采食量。
1TRT1＝对照；TRT2＝抗生素；TRT3＝芽孢杆菌747；TRT4＝芽孢杆菌747+1781。
表36.在本研究的第1天至第56天测量的小牛开食饲料、干物质(DM)采食量和饲料效率。
1TRT1＝对照；TRT2＝抗生素；TRT3＝芽孢杆菌747；TRT4＝芽孢杆菌747+1781。
表37.从本研究的第1天至第56天小牛的血清蛋白和健康测量值。
TRT1<sup>1</sup> TRT2<sup>1</sup> TRT3<sup>1</sup> TRT4<sup>1</sup> SEM
血清蛋白 5.96 5.87 5.87 5.87 0.15
粪便得分<sup>2</sup>
第1天至第14天 1.74 1.98 1.82 1.77 0.06
第15天至第28天 1.26 1.31 1.24 1.30 0.04
第29天至第42天 1.07 1.06 1.09 1.03 0.02
第1天至第42天 1.35 1.45 1.38 1.37 0.03
第43天至第56天 1.10 1.05 1.08 1.03 0.03
第1天至第56天 1.29 1.35 1.31 1.28 0.02
洗擦日<sup>3</sup>
第1天至第42天 2.71 3.26 2.38 3.08 0.36
第43天至第56天 0.00 0.06 0.00 0.03 0.03
天数＝4
第1天至第42天 0.30 0.36 0.30 0.34 0.12
处理成本，$
第1天至第42天 0.41 0.43 0.70 0.62 0.19
第43天至第56天 0.00 0.00 0.15 0.00 0.18
第1天至第56天 0.34 0.37 0.85 0.56 0.29
1TRT1＝对照；TRT2＝抗生素；TRT3＝芽孢杆菌747；TRT4＝芽孢杆菌747+1781。
2粪便得分值为从1至4，其中1＝正常，到4＝水样。
3洗擦日＝粪便评分≥3的任何天。
表38.给予代乳品处理后14天，小牛的免疫基因表达。
1TRT1对照；TRT2＝抗生素；TRT3＝芽孢杆菌747；TRT4＝芽孢杆菌747+1781。
2注：ΔCt测量PCR循环数且与基因表达成反比；ΔCt越大＝基因表达越低。
a,b,c表示具有不同上标的同一排中的是不同的(P<0.05)。
实施例17：芽孢杆菌属菌株的组合对威斯康辛州五个牛群的奶牛的牛群产奶量的影响
引言：最先于1991年报导肠道出血综合征(HBS)，是在爱达荷州一个牛奶场(dairy)的五头高产奶荷斯坦牛观察到的(Sockett，2004)。症状包括点源粘膜下血肿，每头累及10-20cm空肠。这五头牛每头均展示血肿破裂且放血进入至空肠的肠腔中。虽然已知烟曲霉和产气荚膜梭菌与HBS的病因有关，但该综合征本质上最好描述为是多微生物和多因素的。增加高能量饮食的消耗似乎是已经描述的所有危险因素的最合理的共同途径(Berghaus等人，2005)。
HBS表征为产奶量突然降低、由于肠阻塞引起的腹痛和贫血(Anderson，2002)。所述疾病的临床体征是减少饲料摄入、抑郁、产奶量降低、脱水、腹胀和粪便中带暗血凝块。在阻塞性血凝块栓发作的48小时内死亡。因偶发性、急性病因的缘故，已知的有效治疗法很少。
除了引起肠道疾病的一些物种的梭菌属分离株外，其他梭菌属物种产生高水平的丙酮、丁醇、1,3-丙二醇和丁酸(已知作为它们代谢终产物)。若产生于瘤胃中，那么这些代谢终产物可能会影响瘤胃功能且减低效率。
由本发明人选择的可以抑制病原体的芽孢杆菌属菌株产生针对其他微生物具有抑制活性的多种化合物，其中包含超过十个操纵子的许多菌株产生抗真菌化合物和抗细菌化合物。多种细菌素在体外直接在芽孢杆菌属菌株作用的位点之处产生，因此细菌素的稳固共混物以低于所分离的细菌素直接加入饲料的情况下所需要的剂量的剂量存在。
本研究的目的是测量威斯康辛州五个农场上经根据本发明此实施方案的产品处理的奶牛的产奶量。
材料和方法：选择五个威斯康辛州奶牛场来研究根据本发明此实施方案的芽孢杆菌属对能量校正牛奶(ECM)的影响。ECM是一种基于总能量考虑液态产奶量(lb)、牛奶脂肪(lb)和牛奶蛋白(lb)使产奶体积标准化的计算。这一计算调整实际牛奶脂肪(lb)到3.5％且实际牛奶蛋白(lb)调整到标准化的3.2％。这一计算允许生产者基于标准化来比较产奶体积。
ECM的公式：
ECM＝(0.327x牛奶磅数)+(12.95x脂肪磅数)+(7.65x蛋白质磅数)
本研究的牛群大小在185头至940头范围内。选择的用于本概述的农场被认为是典型威斯康辛州奶牛场。在测量时间期间，所选择的这五个牛群的管理无重大改变。
根据本发明此实施方案的产品是三种芽孢杆菌属菌株的组合产品；芽孢杆菌1104(50％)、芽孢杆菌1781(45％)和芽孢杆菌1541(5％)，以每天二十亿CFU/头的剂量掺入全混合日粮(TMR)。
计算喂饲芽孢杆菌属给奶牛之前的平均ECM产量持续4个月。每天(芽孢杆菌属处理期)将芽孢杆菌属包含于奶牛饲料日粮中。将芽孢杆菌属加入饲料中后计算ECM产量持续4个月。
结果：牛群反应(表39)的范围是从0.4lb ECM/天(牛群ID#2)直到高达2.8lb ECM/天(牛群ID#5)。所有这5个牛群的平均ECM增量为1.82lb/天。
讨论：所选择的可抑制梭菌的根据本发明此实施方案的芽孢杆菌属菌株的共混物一致地提高了产奶量，如通过跨威斯康辛州各种大小的多个农场的ECM测量的。
表39.使用芽孢杆菌属产品时威斯康辛州五个牛群的能量校正牛奶(ECM)的提高。
实施例18：芽孢杆菌属菌株的组合对威斯康辛州农场WB奶牛的牛群健康、产奶量和梭菌群体的影响
引言：最先于1991年报导肠道出血综合征(HBS)，是在爱达荷州一个牛奶场(dairy)的五头高产奶荷斯坦牛观察到的(Sockett，2004)。症状包括点源粘膜下血肿，每头累及10-20cm空肠。这五头牛每头均展示血肿破裂且放血进入至空肠的肠腔中。虽然已知烟曲霉和产气荚膜梭菌与HBS的病因有关，但该综合征本质上最好描述为是多微生物和多因素的。增加高能量饮食的消耗似乎是已经描述的所有危险因素的最合理的共同途径(Berghaus等人，2005)。
HBS表征为产奶量突然降低、由于肠阻塞引起的腹痛和贫血(Anderson，2002)。所述疾病的临床体征是减少饲料摄入、抑郁、产奶量降低、脱水、腹胀和粪便中带暗血凝块。在阻塞性血凝块栓发作的48小时内死亡。因偶发性、急性病因的缘故，已知的有效治疗法很少。
除了引起肠道疾病的一些物种的梭菌属分离株外，其他梭菌属物种产生高水平的丙酮、丁醇、1,3-丙二醇和丁酸(已知作为它们代谢终产物)。若产生于瘤胃中，那么这些代谢终产物可能会影响瘤胃功能且减低效率。
由本发明人选择的可以抑制病原体的芽孢杆菌属菌株产生针对其他微生物具有抑制活性的多种化合物，其中包含超过十个操纵子的许多菌株产生抗真菌化合物和抗细菌化合物。多种细菌素在体外直接在芽孢杆菌属菌株作用的位点之处产生，因此细菌素的稳固共混物以低于所分离的细菌素直接加入饲料的情况下所需要的剂量的剂量存在。
本研究的目的是经86天测量经过根据本发明此实施方案的产品处理的(本文称为“经处理的”)农场WB奶牛中的牛群健康、产奶量、梭菌水平和多样性。将处理停止98天且然后推荐进行第二期。
材料和方法：选择威斯康辛州(农场WB)奶牛牛群来研究根据本发明此实施方案的芽孢杆菌属产品对牛群健康和产奶量的影响。所述牛群由圈养在散养畜棚中的900头奶牛组成且奶牛是睡在沙地上。这一牛群每天挤奶3次且具有每年约30,000磅/母牛的牛群年度平均产奶量(rolling herd average)。
根据本发明此实施方案的产品是相等比例的三种芽孢杆菌属菌株的组合产品；芽孢杆菌747、芽孢杆菌1781和芽孢杆菌2018，以每天二十亿CFU/头的剂量掺入全混合日粮(TMR)。
通过测量由于消化问题引起的母牛死亡来确定牛群健康。
使用能量校正牛奶(ECM)跟踪农场产奶量。ECM是一种基于总能量考虑液态产奶量(lb)、牛奶脂肪(lb)和牛奶蛋白(lb)使产奶体积标准化的计算。这一计算调整实际牛奶脂肪(lb)到3.5％且实际牛奶蛋白(lb)调整到标准化的3.2％。这一计算允许生产者基于标准化来比较产奶体积。
ECM的公式：
ECM＝(0.327x牛奶磅数)+(12.95x脂肪磅数)+(7.65x蛋白质磅数)
粪便样品是从处理前、处理期间和处理后的母牛获得。样品数据和采样动物的数量指示于表1中。
用无菌蛋白胨1:10稀释母牛粪便样品，在60℃下热休克30分钟，于无菌蛋白胨中计数继而倾注于具有D-环丝氨酸(400mg/L)的胰蛋白胨亚硫酸盐环丝氨酸(TSC)琼脂板上以选择梭菌物种。在37℃下厌氧孵育琼脂板24小时。若存在，那么将分离的亚硫酸盐还原菌落经过计数得到总梭菌计数(CFU/g)，并且将代表性分离株挑入强化梭菌培养基(RCM)(Oxoid，CM0149)中且在37℃下厌氧孵育24小时。在孵育24小时后，将培养物转移(10％)到脑心浸液(BHI)肉汤培养基(BD，211059)且在37℃下厌氧孵育24小时。
在每孔含500μl假定梭菌培养物的96孔块中进行DNA的提取。通过以4,700rpm离心10分钟、去除上清液来收获细胞。将细胞重悬浮于500μl的50mM EDTA-2Na(pH＝8.0)中。将300μl悬浮细胞的等分试样转移到新的96孔块并与来自鸡蛋白(西格马(Sigma)，L6876)溶液(100mg/ml，在50mM EDTA中)的20μl溶菌酶组合以裂解细菌细胞。在37℃下孵育96孔块1小时以裂解细菌细胞。在孵育后添加220μl裂解缓冲液(6M胍、20％Triton-X 100、10mMTris-HCL，pH 7.5)，混合然后在室温下孵育15分钟。在孵育后向每孔添加20μl蛋白酶K(NEB，800U/mL)，混合并且在55℃下孵育30分钟以降解蛋白质。然后将细胞裂解物转移到96孔结合板(Promega，A2278)并且以4,700rpm离心5分钟。丢弃流通物，通过以4700rpms离心750μl柱洗涤溶液(Promega，A1318)持续1分钟30秒、丢弃在每次旋转结束时的流通物来执行结合板柱的三次洗涤。将结合板以4,700rpm再离心10分钟以去除任何残留的乙醇。然后将干净的洗脱板置于结合板之下，并且用200μl预热(55℃)的无核酸酶水(Promega，P1195)洗脱DNA。
利用聚合酶链式反应(PCR)，针对对产气荚膜梭菌具有特异性的毒素基因(α、β、ε及ι)筛选DNA。利用包含四个引物组的多重PCR(Yoo等人，1997)执行毒素基因的扩增(表1)。PCR混合物包含2.5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、0.5μM各引物(表1)、0.1μlInvitrogenTM PlatinumTM Taq DNA聚合酶、2.5μl DNA，添加无菌水以达到总反应体积25μl。所述混合物经历94℃5分钟；接着30个循环：94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟；最后以72℃最终延伸3分钟来结束。使用片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)观察PCR产物以确定是否实现扩增。若观察到一个或多个毒素基因，那么根据它们的毒素基因谱对各分离株进行毒素类型鉴定(Songer，1996)。利用阳性产气荚膜梭菌与总梭菌分离株的比率以基于总梭菌计数计算估计的产气荚膜梭菌计数。
利用对所选分离株进行的随机扩增多态性DNA(RAPD)分析产生独特的菌株特异性遗传指纹以确定产气荚膜梭菌分离株中的多样性。PCR包含5μl DNA、2.5μl RAPD引物2(10μM)(表1)和添加至Ready-To-Go RAPD分析珠(Life Sciences，27-9500-01)的17.5μl无菌水。所述混合物经历95℃5分钟；接着45个循环：95℃1分钟、36℃1分钟、72℃2分钟；以72℃最终延伸5分钟来结束。使用片段分析仪(Fragment Analyzer)(Advanced Analytics)观察PCR产物以确定扩增模式，并且输入到BioNumerics(生物信息学软件)中用于分析。将RAPD模式与基于带的Dice相关分析法比较以确定RAPD模式之间的相似性(作为监测分离株之间的多样性的方式)。簇群截止是75％相似性。
为鉴定不具有对产气荚膜梭菌具特异性的至少一种毒素基因的梭菌，对分离株DNA使用引物27F-YM和1492R-Y(表1)进行PCR反应来扩增rDNA的16S区。在不含对产气荚膜梭菌具特异性的毒素基因的分离株的20％进行此举。PCR混合物包含5μl 10X PCR缓冲液、2μl 50mM MgCl2、1μl 50mM dNTP、0.4μM各引物(表1)、0.2μl InvitrogenTM PlatinumTM TaqDNA聚合酶、5μl DNA，并且添加无菌水以达到总反应体积50μl。所述混合物经历95℃4分钟；接着35个循环：95℃30秒、50℃30秒、72℃2分钟；最后以72℃最终延伸7分钟来结束。对于扩增进行质量检查且将PCR产物送到Genewiz(https://www.genewiz.com)以获得16S基因的序列。将序列与从EZbiocloud在线电子数据库(http://www.ezbiocloud.net/)获得的已知类型的菌株进行比较。基于这些序列的比较，细菌鉴定指定给分离株。
结果：在处理前时期期间据记录牛群中由于消化问题引起的母牛死亡为5例。从2016年4月16日开始每天将根据本发明此实施方案的芽孢杆菌属产品包含于奶牛饲料日粮中且继续包含直到2016年9月1日。在此芽孢杆菌属处理期#1中，据记录牛群中由于消化问题引起的母牛死亡为一例。在从2016年9月2日至2016年12月8日的处理后时期饲料中不含芽孢杆菌属。在此时期期间，据农场记录由于消化问题引起的母牛死亡为6例。芽孢杆菌处理期#2是在2016年12月9日开始，且据农场记录到2017年5月1日由于消化问题引起的母牛死亡为0例(表41)。
结果指示在芽孢杆菌属处理期间ECM增加3.9lb/天且牛奶脂肪增加0.3％(表42)。
记录2015年的时间期的平均温度且与2016年的相同时间期作比较。这一做法是为确保芽孢杆菌属处理期间所记录的阳性牛奶反应不单单是因为平均温度较低所引起。2016年的芽孢杆菌处理期为六月平均高出+2.6F以及七月平均高出+2.7F(表43)。
农场WB的总梭菌计数(图99)与威斯康辛州研究期间确定的那些之间并无显著差异(实施例5)。与处理前相比较，在使用该产品的最初16天中，总梭菌显著减少，并且然后没有区别(第30天和第86天)或更高(第58天)。停用该产品98天后所采集的样品的梭菌计数显著高于开始用该产品之前。虽然用芽孢杆菌属共混物处理期间或之后的任何时间产气荚膜梭菌没有减少(图100)，但在处理期间分离的产气荚膜梭菌的菌株多样性有所减少并且在处理后这种减少得以维持，如通过产气荚膜梭菌RAPD模式的Shannon-Wiever指数指示的(表44)。在处理期间非产毒梭菌的多样性也减少，并且主要拜氏梭菌组分离株在处理期间被双酶梭菌组分离株代替(图101和表45)。当停止处理时，拜氏梭菌组菌株又变成主要的非产毒梭菌。
讨论：所选择的可抑制梭菌的根据本发明此实施方案的芽孢杆菌属菌株的共混物减少了由于消化问题(如HBS)引起的母牛死亡数。当停用该产品时消化系统性死亡数又增加。产奶量(以ECM测量)和牛奶脂肪也提高了。尽管在处理期间存在更多的潜在热应力，但还是出现这种产量的增加。所选择的可抑制产气荚膜梭菌的根据本发明此实施方案的芽孢杆菌属菌株的共混物最初引起总梭菌计数减少且减少了母牛中产气荚膜梭菌菌株的多样性。非产毒梭菌物种的多样性也减少，且该产品引起拜氏梭菌组菌株被双酶梭菌替代。当停止处理时拜氏梭菌组的比例又增加了。这些数据证实根据本发明该实施方案的产品通过减少产气荚膜梭菌分离株的水平和多样性及存在的梭菌属物种的多样性和类型而提高牛群健康和产奶量。已知可产生高水平的丁醇和丙酮的拜氏梭菌组的比例的减小可能改善瘤胃发酵且提高饲料效率，导致奶牛产奶量增加。
表41.威斯康辛州农场WB中由于消化问题引起的母牛死亡数。
表42.在威斯康辛州农场WB在处理前时期(2015年4月1日至2015年8月1日)和芽孢杆菌属处理期(2016年4月1日至2016年8月1日)期间跟踪ECM生产水平。
表43.气象站记录-威斯康辛州农场WB的温度，单位为华氏度(F)。
表44.来自威斯康辛州农场WB的产气荚膜梭菌分离株随时间的RAPD指纹多样性。
分离株 簇群 Shannon-Wiener
处理前 316 81 3.93
处理第16天 196 43 3.11
处理第30天 145 33 3.02
处理第58天 205 56 3.78
处理第86天 328 64 3.60
处理后 180 31 2.59
表45.威斯康辛州农场WB的非产毒梭菌物种的多样性和两种主要组的比例随时间的变化。
考虑到从本文所公开的本发明的说明书和实践，本发明的其他实施方案及用途将对本领域技术人员而言是清楚的。将本文出于任何原因所引用的所有参考文献(包括所有期刊的引用和美国/外国专利和专利申请案)通过引用确切且完整地并入本文。应理解，本发明不受限于本文所说明和描述的具体试剂、配制品、反应条件等，而是涵盖落入所附权利要求范围内的对本发明的此类修改形式。
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1
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Claims (19)

1.一种用于减少梭菌的组合物，所述组合物包含芽孢杆菌属菌株的有效量的生物纯培养物，所述芽孢杆菌属菌株选自下组，所述组由芽孢杆菌1104、芽孢杆菌1781、芽孢杆菌747、芽孢杆菌1541、芽孢杆菌1999和芽孢杆菌2018组成。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述梭菌选自下组，所述组由产气荚膜梭菌、双酶梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、第三梭菌和索氏梭菌组成。
3.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含布置在分离的芽孢杆菌属菌株周围的冷冻保护剂，并且其中所述分离的芽孢杆菌属菌株是粉状冻干菌株。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述生物纯粉状冻干芽孢杆菌属菌株呈芽孢杆菌属孢子的形式。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其作为直接喂饲型微生物用于控制已摄入有效量的所述直接喂饲型微生物的反刍动物的消化系统中的所述梭菌。
6.如权利要求5所述的组合物，其中由所述反刍动物每天所摄入的所述直接喂饲型微生物的所述有效量包括以下浓度：在约2.0x108CFU所述分离的芽孢杆菌属菌株/反刍动物与约2.0x1010CFU所述分离的芽孢杆菌属菌株/反刍动物之间。
7.如权利要求6所述的组合物，其中由所述反刍动物每天所摄入的所述直接喂饲型微生物的所述有效量包括以下浓度：约2.0x109CFU所述分离的芽孢杆菌属菌株/反刍动物。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，所述组合物作为青贮控制微生物以一个体积的包含有效量的所述组合物的青贮与一个体积的产生所述青贮的饲喂料混合的方式用于抑制梭菌的生长。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述芽孢杆菌属菌株的所述生物纯培养物抑制选自下组的致病微生物的生长，所述组由大肠杆菌、产气荚膜梭菌、双酶梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、第三梭菌、索氏梭菌、大肠菌群、酵母和霉菌组成。
10.如权利要求8所述的组合物，其中所述芽孢杆菌属菌株的所述生物纯培养物增加了所述青贮中乳酸和乙酸的浓度。
11.如权利要求8所述的组合物，其中所述芽孢杆菌属菌株的所述生物纯培养物减少了所述青贮的腐败。
12.一种用于减少青贮中致病微生物的生长的方法，所述方法包括将一个体积的饲喂料与有效量的根据权利要求1-4中任一项所述的组合物混合以减少所述致病微生物的生长。
13.一种用于提高反刍动物性能的方法，所述方法包括向所述反刍动物给予有效量的根据权利要求1-4中任一项所述的组合物以提供选自如下的至少一种益处：
抑制在一种或多种反刍动物中选自产气荚膜梭菌、双酶梭菌、拜氏梭菌、丁酸梭菌、第三梭菌和索氏梭菌中的至少一种的病原体；
降低所述一种或多种反刍动物的死亡率；
改善所述一种或多种反刍动物的饲料效率；
减少所述一种或多种反刍动物中肠道出血综合征的发生；
改善所述一种或多种反刍动物中的瘤胃发酵；
提高所述一种或多种反刍动物的产奶量；以及
调节所述一种或多种反刍动物的全身免疫细胞和肠免疫细胞中炎性细胞因子的免疫应答。
14.如权利要求13所述的方法，其中芽孢杆菌属菌株的所述生物纯培养物包含芽孢杆菌1781和芽孢杆菌747，并且在所述一种或多种反刍动物是奶牛时，给予所述组合物提供了增加所述一种或多种反刍动物中平均能量校正牛奶产量的益处。
15.如权利要求13所述的方法，其中芽孢杆菌属菌株的所述生物纯培养物包含芽孢杆菌1781、芽孢杆菌747和芽孢杆菌2018，并且给予所述组合物提供了在直接喂饲型微生物给予期间降低所述一种或多种反刍动物的与消化系统有关的死亡率的益处。
16.一种芽孢杆菌属菌株，其选自下组，所述组由芽孢杆菌1104、芽孢杆菌1781、芽孢杆菌747、芽孢杆菌1541、芽孢杆菌1999和芽孢杆菌2018组成，所述芽孢杆菌属菌株用于在直接喂饲型微生物中使用以控制反刍动物消化系统中的梭菌。
17.一种芽孢杆菌属菌株，其选自下组，所述组由芽孢杆菌1104、芽孢杆菌1781、芽孢杆菌747、芽孢杆菌1541、芽孢杆菌1999和芽孢杆菌2018组成，所述芽孢杆菌属菌株用于在制造用以控制反刍动物消化系统中的梭菌的直接喂饲型微生物中使用。
18.一种芽孢杆菌属菌株，其选自下组，所述组由芽孢杆菌1104、芽孢杆菌1781、芽孢杆菌747、芽孢杆菌1541、芽孢杆菌1999和芽孢杆菌2018组成，所述芽孢杆菌属菌株用于在青贮控制微生物中使用以抑制青贮中梭菌的生长。
19.一种芽孢杆菌属菌株，其选自下组，所述组由芽孢杆菌1104、芽孢杆菌1781、芽孢杆菌747、芽孢杆菌1541、芽孢杆菌1999和芽孢杆菌2018组成，所述芽孢杆菌属菌株用于在制造用以抑制青贮中梭菌的生长的青贮控制微生物中使用。
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