CN109943505A - 一种用于无害化处理粪渣卧床垫料的复合益生菌菌剂 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种用于无害化处理粪渣卧床垫料的复合益生菌菌剂，所述复合益生菌菌剂包括植物乳杆菌P‑8菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP3菌剂和植物乳杆菌LP4菌剂，使用所述复合益生菌菌剂发酵固液分离后粪渣，能够加快粪渣发酵过程的升温速度，增强粪渣的保温能力，快速脱除粪渣的异臭味，分解有机物，从而改善粪渣质地，提高粪渣垫料中有益菌的数量，降低病原菌和腐败菌的数量，杀灭虫卵，综合提高卧床垫料的舒适度和生物安全性。

Description

一种用于无害化处理粪渣卧床垫料的复合益生菌菌剂

技术领域

本发明属于益生菌微生态制剂领域，特别涉及一种用于无害化处理粪渣卧床垫料的复合益生菌菌剂。

背景技术

养殖场，例如高产奶牛养殖场，由于奶牛每天需要休息12-14小时以保证奶牛的睡眠质量和产奶量，因此，通常在奶牛养殖场中设置有专供奶牛休息的牛卧床。由于牛卧床舒适与否直接影响奶牛的上床率，例如，如果牛卧床是水泥地面，奶牛大约只休息7小时，而如果在牛卧床上铺设有卧床垫料，则奶牛可在牛卧床上休息达14个小时，从而保证了充足的休息时间。卧床垫料一般要求干净卫生，水分含量适当、病原微生物以及寄生虫卵等有害物质含量低，避免引起牛乳头炎等病症。

近年，规模化养殖场的数量越来越多，养殖场卧床垫料的需求量也随之增大，目前养殖场普遍以沙子、稻壳、锯末等作为卧床垫料，或以晾干的粪渣为主，并按照一定比例掺入一部分上述原料作为卧床垫料，以上方法均存在一定的缺点，例如以沙子为卧床垫料需要养殖场附近有沙场，否则运输成本非常高，养殖场难以承受，并且廉价的沙子中一般含有大量的小石子，作为卧床垫料时，沙子中的小石子会对动物造成一定的物理性损伤，效果较差，并且使用沙子作为卧床垫料无法重复利用，折算成本更好。以稻壳和锯末作为卧床垫料效果较好，但原料成本高昂，并且规模化养殖场对卧床垫料的需求量非常大，因此需要选多家原料公司提供，进行管理是比较复杂。因此目前主要以晾干的粪渣掺入一定比例的稻壳或锯末制作卧床垫料，但该方法需要在前期对粪渣进行发酵，确保粪渣的安全性。

发明内容

本发明目的是提供一种用于无害化处理粪渣卧床垫料的复合益生菌菌剂，所述菌剂包括植物乳杆菌P-8菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP3菌剂和植物乳杆菌LP4菌剂，使用所述复合益生菌菌剂发酵固液分离后粪渣，能够加快粪渣发酵过程的升温速度，增强粪渣的保温能力，快速脱除粪渣的异臭味，分解有机物，从而改善粪渣质地，提高粪渣垫料中有益菌的数量，降低病原菌和腐败菌的数量，杀灭虫卵，综合提高卧床垫料的舒适度和生物安全性。

本申请中所用的菌种为现有技术中公开的菌种，具体地，所述植物乳杆菌P-8(Lactobacillus plantrum P-8)在中国专利CN 103893214 A中被公开，植物乳杆菌C2(Lactobacillus plantrum C2)在中国专利CN 107988117A中被公开，植物乳杆菌LP3(Lactobacillus plantrum LP3)和植物乳杆菌LP4(Lactobacillus plantrum LP4)均在中国专利CN108125902A中被公开。

本申请提供的用于无害化处理粪渣卧床垫料的复合益生菌菌剂，所述菌剂包括：植物乳杆菌P-8菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP3菌剂和植物乳杆菌LP4菌剂。

在本申请中，所述菌剂为由相应菌株发酵而得的产物，包括相应的菌株及其发酵代谢产物。

本申请所使用的植物乳杆菌P-8是2003年从内蒙古自治区牧民家庭中的自然发酵酸牛奶中分离并筛选出的一株具有优良益生特性的乳酸菌株。并且，通过体外实验、动物模型和人体试验对菌株的益生功能进行了系统评价，并利用基因组学的手段对菌株的益生机制进行深入剖析，本申请人发现，该菌株具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够在动物肠道环境中定殖并调节菌群，提高机体免疫能力。

本申请所使用的植物乳杆菌C2是2012年从四川省自然发酵的泡菜中分离并筛选出的一株具有优良益生特性的乳酸菌株，发酵农作物或动物粪便能够快速产酸控制物料pH值，并且，可以高产4-羟基苯乳酸等有机酸，本申请人还发现该菌具有优良的粪大肠菌群抑制能力。

本申请所使用的所述植物乳杆菌LP3是2012年从四川省自然发酵的泡菜中分离并筛选出的一株具有优良益生特性的乳酸菌株，本申请人发现，使用该菌发酵动物粪便能够快速产酸，降低体系的pH值，并且能够广谱抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的生长及繁殖。

本申请所使用的所述植物乳杆菌LP4是从自然发酵的酸马奶样品中分离并筛选出的一株具有优良益生特性的乳酸菌株，本申请人发现，使用该菌能够快速产酸，抑制霉菌是生长于繁殖并吸附降解真菌毒素。

在所述复合益生菌菌剂中，在复配前，所述植物乳杆菌P-8菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP3菌剂和植物乳杆菌LP4菌剂的活菌数量均≥2×10¹¹CFU/g，并且，在复配后，所述复合益生菌菌剂的总活菌数量大于2×10⁹CFU/g。

进一步地，所述植物乳杆菌P-8菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP3菌剂和植物乳杆菌LP4菌剂的重量之比为所述植物乳杆菌P-8菌剂:植物乳杆菌C2菌剂:植物乳杆菌LP3菌剂:植物乳杆菌LP4菌剂＝(0.8～1.2):(0.8～1.2):(1.8～2.2):(1.8～2.2)，优选为1:1:2:2。

本申请人发现，所述复合益生菌菌剂中总活菌数量达到2×10⁹CFU/g以上，并且，各菌株的重量比为上述比例范围时，该复合益生菌菌剂在发酵粪渣时，能够快速脱除粪渣臭味减少周边环境的大气污染，改善粪渣质地提高发酵后作为卧床垫料的舒适度，提高粪渣垫料中有益菌的数量，降低粪大肠菌群、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等病原菌的数量，降低直接接触卧床引起的病原菌附着的风险，继而降低相关疾病的发病率，提高虫卵死亡率，减少卧床中蚊蝇的滋生。

在一种可实现的方式中，所述复合益生菌菌剂还包括稀释载体，所述稀释载体为碳水化合物，优选为麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、淀粉，更优选为麦芽糊精。本申请人发现，使用上述稀释载体，特别是使用麦芽糊精作为载体，制得的复合益生菌剂产品的均匀度和流动性较好。

其中，所述稀释载体的重量与所述各菌剂的总重量之比为稀释载体的重量:各菌剂的总重量＝(9-9.5):1，其中，所述各菌剂的总重量为所述复合益生菌菌剂中植物乳杆菌P-8菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP3菌剂和植物乳杆菌LP4菌剂的重量之和。本申请人发现，按照该比例制成的复合益生菌剂性价比较高。

本申请还提供一种制备前述复合益生菌菌剂的方法，所述方法包括：

步骤1，分别制备植物乳杆菌P-8发酵液、植物乳杆菌C2发酵液、植物乳杆菌LP3发酵液和植物乳杆菌LP4发酵液。

在本实施例中，以制备植物乳杆菌P-8发酵液为例说明制备上述各菌株发酵液的方法，即对各菌株分别进行高密度发酵，所述制备方法具体包括：

步骤1-1，取一级活化后的植物乳杆菌P-8菌剂的斜面菌体接种至MRS培养基中，在温度为33-37℃，转速为50-100rpm条件下培养18-24h，分别得到一级种子液；

步骤1-2，将步骤1-1制备的一级种子液按接种量3％-10％(v/v)再次转接入新的MRS培养基进行二次活化，活化18-24h后获得二级种子液；

步骤1-3，将步骤1-2制备的二级种子液按照接种量3％-10％(v/v)分别单独接入到发酵罐培养基中，在温度为33-37℃，转速为50-100rpm，通风量为0.3-1L/min，发酵全程调节发酵液pH值为5.6-6.2条件下培养8-12小时，获得植物乳杆菌P-8发酵液。

在本申请中，植物乳杆菌P-8发酵液、植物乳杆菌C2发酵液、植物乳杆菌LP3发酵液和植物乳杆菌LP4发酵液中，活菌数均达到10¹⁰CFU/ml以上。

进一步地，步骤1-3中所述发酵罐培养基包括如下重量比的组分：

余量为水，

其中，所述发酵罐培养基的pH为7.0。

本申请人发现，使用该培养基配方，菌株生长繁殖较快、发酵水平较高。

其余三种发酵液，即，植物乳杆菌C2发酵液、植物乳杆菌LP3发酵液和植物乳杆菌LP4发酵液可以采用相同的方法，相同的条件分别进行发酵而制得。

步骤2，将步骤1获得的4种发酵液分别离心，向离心后的体系中分别加入保护剂，从而提高乳酸菌存活率。

在本申请中，各所述发酵液与保护剂的重量比为发酵液的重量:保护剂的重量＝1:(5-10)。本申请人发现，该比例下活菌数较高，保护效果较好。

在本申请提供的方法中，步骤2中所述保护剂包括以下重量比的组分：

步骤3，将步骤2获得的体系分别进行冷冻干燥，分别获得植物乳杆菌P-8菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP3菌剂和植物乳杆菌LP4菌剂。

在本申请中，对步骤2制备的各株体系的冷冻干燥的方法可以采用现有技术中任意一种对活菌进行冷冻干燥的方法，例如，真空冷冻干燥等。

步骤4，将步骤3获得的植物乳杆菌P-8菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP3菌剂和植物乳杆菌LP4菌剂混合，并加入稀释载体进行复配。

在本申请中，植物乳杆菌P-8菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP3菌剂和植物乳杆菌LP4菌剂中活菌数量均达到2×10⁹CFU/g。

本申请还提供前述复合益生菌菌剂用于无害化处理粪渣卧床垫料的用途。

具体地，可以采用以下方法对粪渣进行无害化处理：在每吨固液分离后粪渣中添加所述复合益生菌剂，添加量为1kg/吨，所述复合益生菌剂添加粪便含水量35-55％，粪便粒径低于0.5cm，添加时，将粪渣摊开，将对应量的菌剂均匀干撒到粪渣中，混匀后，将粪渣码成条垛或堆形进行发酵。

与现有技术相比，采用本发明提供的复合益生菌剂对固液分离后粪渣进行发酵制备卧床垫料，能够加快粪渣发酵起温速度，能够快速脱除粪渣臭味减少周边环境的大气污染，改善粪渣质地提高发酵后作为卧床垫料的舒适度，提高粪渣垫料中有益菌的数量，降低粪大肠菌群、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等病原菌的数量，降低直接接触卧床引起的病原菌附着的风险，继而降低相关疾病的发病率，提高虫卵死亡率，减少卧床中蚊蝇的滋生。而且，在感官上，固液分离粪渣中添加复合益生菌剂进行发酵后无异臭味，颜色加深，结构酥松干爽。

附图说明

图1示出两组粪渣15天温度变化情况；

图2示出两组粪渣15天水分含量变化情况；

图3示出两组粪渣15天pH值变化情况；

图4示出两组粪渣15天碳氮比变化情况；

图5示出两组粪渣15天乳酸菌数量变化情况；

图6示出两组粪渣15天大肠菌群数量变化情况；

图7示出两组粪渣15天金黄色葡萄球菌数量变化情况；

图8示出两组粪渣15天沙门氏菌数量变化情况；

图9示出两组粪渣15天沙蛔虫卵死亡率情况。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1植物乳杆菌C2耐酸、耐胆盐特性及其抑菌特性实验

(一)将冷冻保存的植物乳杆菌C2接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下静态培养18h，如此传代培养2次得到活化发酵液。

所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。

(二)耐酸、耐胆盐特性实验：

在pH2.5(用1mol/L HCl调整)灭菌的PBS缓冲液中，加入3.5g/L胃蛋白酶，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟胃液；将(一)中制备的活化发酵液离心收集菌体，加入与上述MRS液体培养基等重量的pH2.5模拟胃液，37℃培养3h，分别于0h、3h用MRS琼脂培养基倾注法测定其活菌数。

在pH8.0(用0.1mol/L NaOH调整)灭菌PBS中，加入0.1％胰蛋白酶和1.8％牛胆盐用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，制成模拟肠液；将模拟胃液中处理3h后的菌液，离心洗菌两次收集菌体后，加入与之前模拟胃液等量的模拟肠液继续37℃培养，于4h、8h用MRS琼脂培养基倾注法测活菌数，试验结果见下表1所示：

表1植物乳杆菌C2人工模拟胃液和肠液的存活率

其中，存活率＝[N1/N0]×100％(N0表示0h活菌数；N1表示经模拟肠、胃液消化后的活菌数)

表1中4h存活率与8h存活率均是在胃液中培养得到的结果。

(三)用琼脂孔扩散法(Well-diffusion Agar Assay)测定植物乳杆菌C2发酵液的抑菌效果：

将灭菌后冷却至50℃左右的MRS琼脂培养基(20ml)与200μL肠道致病菌液(10⁶cfu/ml)一起倒入平板混匀。待加有肠道致病菌的MRS琼脂培养基冷却凝固结实后，使用打孔器在平板上打出直径8mm左右的孔。

本实施例中，所述肠道致病菌包括大肠杆菌0517:H7。

每孔加入100μL植物乳杆菌C2发酵液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。抑菌圈直径大小使用游标卡尺进行测量(保留两位有效数字)，实验结果见下表2所示：

表2 C2发酵液中苯乳酸、4-羟基苯乳酸含量和抑菌特性

项目	测定结果
		苯乳酸(mg/L)	56.25±0.98
4-羟基苯乳酸(mg/L)	20.76±1.35
		大肠杆菌0517:H7(mm)	42.50±1.18

注：打孔器直径为8mm。

表2中苯乳酸以及4-羟基苯乳酸含量是在未加入致病菌发酵液中测得的结果。

由表1、表2试验结果可知，C2菌株具有较好的耐酸以及耐胆盐特性，其在pH2.5的人工模拟胃液中消化3h后继续在pH8.0的人工肠液中消化8h，其存活率高达82.42％。同时菌株C2具有优良的粪大肠杆菌抑制特性。

实施例2植物乳杆菌LP3对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌特性实验

用琼脂孔扩散法(Well-diffusion Agar Assay)测定植物乳杆菌LP3发酵液的抑菌效果：将灭菌后冷却至50℃左右的MRS琼脂培养基(20ml)与200μL肠道致病菌液(10⁶cfu/ml)一起倒入平板混匀。待加有肠道致病菌的MRS琼脂培养基冷却凝固结实后，使用打孔器在平板上打出直径8mm左右的孔。

本实施例中，所述肠道致病菌包括沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。

每孔加入100μL植物乳杆菌LP3发酵液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。抑菌圈直径大小使用游标卡尺进行测量(保留两位有效数字)，实验结果见下表：

表3菌株LP3的抑菌特性

项目	测定结果
		沙门氏菌(mm)	23.24±1.06
金黄色葡萄球菌(mm)	22.57±1.13

注：打孔器直径为8mm。

由表3试验结果可知，菌株LP3具有优良的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌抑制效果。

实施例3植物乳杆菌LP4对霉菌的抑菌特性实验

用琼脂孔扩散法(Well-diffusion Agar Assay)测定植物乳杆菌LP4发酵液的抑菌效果：将灭菌后冷却至50℃左右的MRS琼脂培养基(20ml)与200μL肠道致病菌液(106cfu/ml)一起倒入平板混匀。待加有肠道致病菌的MRS琼脂培养基冷却凝固结实后，使用打孔器在平板上打出直径8mm左右的孔。

本实施例中，所述肠道致病菌包括寄生曲霉、黄曲霉和娄地青霉。

每孔加入100μL植物乳杆菌LP4发酵液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。抑菌圈直径大小使用游标卡尺进行测量(保留两位有效数字)，实验结果见下表：

表4菌株LP4的抑菌特性

项目	测定结果
		寄生曲霉(mm)	12.11±0.18
黄曲霉(mm)	10.06±0.57
		娄地青霉(mm)	12.82±0.76

注：打孔器直径为8mm。

由表4试验结果可知，菌株LP4具有优良的寄生曲霉、黄曲霉、娄地青霉抑制效果。

实施例4复合益生菌剂耐酸、耐胆盐特性及其抑菌特性实验

(一)耐酸、耐胆盐特性实验：

本实施例所用方法与实施例1所述方法类似，区别在于使用复合益生菌菌剂替代植物乳杆菌C2，结果如下表5所示。

表5复合益生菌菌剂人工模拟胃液和肠液的存活率

其中，存活率＝[N1/N0]×100％(N0表示0h活菌数；N1表示经模拟肠、胃液消化后的活菌数)

(二)用琼脂孔扩散法(Well-diffusion Agar Assay)测定复合益生菌菌剂的抑菌效果：

将灭菌后冷却至50℃左右的MRS琼脂培养基(20ml)分别与200μL肠道致病菌液(10⁶cfu/ml)一起倒入平板混匀。待加有肠道致病菌的MRS琼脂培养基冷却凝固结实后，使用打孔器在平板上打出直径8mm左右的孔。

本实施例中，所述肠道致病菌包括大肠杆菌0517:H7、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、寄生曲霉、黄曲霉和娄地青霉。

每孔加入100μL植物乳杆菌LP3发酵液，于4℃冰箱中扩散12h后37℃培养恒温48h，观测抑菌圈的大小。抑菌圈直径大小使用游标卡尺进行测量(保留两位有效数字)，实验结果如下表6所示：

表6复合益生菌菌剂中苯乳酸、4-羟基苯乳酸含量和抑菌特性

项目	测定结果
		苯乳酸(mg/L)	53.33±0.74
4-羟基苯乳酸(mg/L)	23.28±0.81
		大肠杆菌0517:H7(mm)	43.16±0.78
沙门氏菌(mm)	20.58±0.91
		金黄色葡萄球菌(mm)	24.10±1.08
寄生曲霉(mm)	13.13±0.54
		黄曲霉(mm)	12.22±0.66
娄地青霉(mm)	11.57±1.10

在本实施例中，表6中苯乳酸以及4-羟基苯乳酸含量是在未加入致病菌发酵液中测得的结果。

由表6可知，本申请提供的复合益生菌菌剂具有提升粪渣的无害化处理效果，降低卧床垫料传播病原菌，降低乳房炎发病的风险，抑制粪渣中的霉菌从而减少潜在真菌毒素，降低卧床垫料的毒性等效果。

实施例5复合益生菌剂发酵固液分离粪渣的效果验证实验

(1)复合益生菌菌剂的使用方法：

将600吨固液分离后粪渣平均分成2堆，每堆300吨，分别作为实验组和对照组，其中，对照组进行自然发酵，实验组添加复合益生菌剂进行发酵，具体方法为：将固液分离后粪渣摊开，将复合益生菌剂均匀干撒到粪渣中，添加量为1kg/吨粪渣，拌匀后堆成3米宽2米高的条状肥垛进行发酵，发酵过程中，每日进行一次翻抛，持续发酵15天即可使用。

(2)试验方法：

发酵前后粪渣感官评定：发酵前后，对实验组和对照组粪渣的气味、颜色和质地进行感官评定并记录。

堆体温度跟踪检测：试验开始每日检测堆体温度，并记录。

水分含量检测：参照中华人民共和国农业行业标准NY 525-2012，准确称量粪渣样品10克，采用真空烘干法检测样品中的水分含量。

pH值检测：参照中华人民共和国农业行业标准NY 525-2012，准确称量粪渣样品10克，并用90mL PBS溶液进行溶解，并用pH酸度计测定样品pH值。

碳氮比检测：参照中华人民共和国农业行业标准NY 525-2012，采用重铬酸钾容量法测定粪渣样品中的碳的含量。参照中华人民共和国农业行业标准NY 525-2012，将粪肥样品采用硫酸-过氧化氢消煮，采用硼酸溶液吸收碱化蒸馏出来的氨，再用标准酸溶液滴定测定样品中氮的含量。

乳酸菌检测：参照中华人民共和国国家标准GB 4789.35-2016，采用微生物培养的方法测定样品中的乳酸菌活菌数。

粪大肠菌群检测：参照中华人民共和国国家标准GBT 19524.1-2004，采用微生物培养的方法测定样品中的粪大肠菌群数。

沙门氏菌检测：参照中华人民共和国国家标准GB/T 28642-2012，采用聚合酶链式反应法测定样品中的沙门氏菌含量。

金黄色葡萄球菌检测：参照中华人民共和国国家标准GB 4789.10-2016，采用微生物培养的方法测定样品中的金黄色葡萄球菌数。

蛔虫卵死亡率检测：参照中华人民共和国国家标准GBT 19524.2-2004，采用培养的方法测定蛔虫卵死亡率。

(3)试验结果：

感官评定结果如表7显示，发酵前实验组和对照组粪渣均有浓烈的异臭味，颜色呈褐色，质地粘结。发酵15天后，实验组粪渣异臭味得到脱除，颜色呈黑褐色，质地酥松不粘手；对照组仍为原粪渣的异臭味，颜色呈棕绿色，质地粘结。可见，实验组粪渣的发酵效果明显优于对照组。

图1示出两组粪渣15天温度变化情况，如图1所示，试验前，实验组平均温度为28℃，对照组平均温度为29℃，实验组发酵2天后温度达到50℃以上，对照组发酵4天达到50℃以上，与实验组相比，发酵速度较慢。每日进行翻抛后实验组可以迅速回温，达到50℃以上，对照组翻抛后回温速度较慢，试验过程中，实验组保持50℃以上高温持续10天后温度出现下降趋势，表面发酵已经完成且发酵过程较充分，对照组只有5天达到50℃以上，保温较差，并且在发酵15天后仍有上升的趋势，表明对照组发酵不完全。

图2示出两组粪渣15天水分含量变化情况，如图2所示，试验前，实验组和对照组水分含量分别为57.8和58.1g/100g；发酵15天后，实验组水分含量下降到37.0g/100g，对照组下降到43.1g/100g，组间差异显著(P＜0.01)。

图3示出两组粪渣15天pH值变化情况，如图3所示，试验前，实验组和对照组pH值分别为8.24和8.22，发酵15天后，实验组下降到7.75，对照组上升到8.43，差异显著。可见实验组益生菌剂中的乳酸菌能够在粪渣中很好的定殖，并产生一定量的有机酸，降低粪渣的pH值。

图4示出两组粪渣15天碳氮比变化情况，采用重铬酸钾容量法和凯氏定氮法测定碳和氮并计算碳氮比，如图4所示，试验前，实验组和对照组碳氮比分别为23.6和23.8，发酵15天后，实验组碳氮比显著下降到为17.3，对照组下降到22.2，实验组显著低于对照组(P＜0.001)，可见，益生菌剂中的微生物在粪渣中大量生长和繁殖，使得粪渣得到有效发酵，对照组发酵不明显。

图5示出两组粪渣15天乳酸菌数量变化情况，如图5所示，试验前实验组和对照组乳酸菌数分别为3.27和3.24logCFU/g；添加益生菌剂后发酵2天后，实验组和对照组分别变为6.65和3.51logCFU/g，组间差异显著(P＜0.001)，可见，益生菌剂中的乳酸菌能够快速定殖在粪渣中，实现生长和繁殖；高温发酵15天后，两组数量均有所降低，实验组下降为3.34，对照组下降为2.08，实验组仍显著高于对照组(P＜0.01)，含有有益菌的卧床垫料有益于动物健康。

图6示出两组粪渣15天大肠菌群数量变化情况，如图6所示，6试验前实验组和对照组大肠菌群数均为2.55log CFU/g；发酵2天后，实验组大肠菌群数得到抑制，降低为2.01log CFU/g，对照组升高为3.18log CFU/g，组间差异显著(P＜0.01)；发酵15天后，实验组和对照组均不同程度降低，分别为1.13和2.77log CFU/g，组间差异显著(P＜0.001)。大肠菌群是引发奶牛和奶山羊乳腺炎的重要微生物，控制卧床垫料中大肠菌群的数量可以降低乳腺炎的患病风险。

图7示出两组粪渣15天金黄色葡萄球菌数量变化情况，如图7所示，试验前实验组和对照组金黄色葡萄球菌数分别为1.65和1.64log CFU/g；发酵2天后，实验组和对照组分别下降到1.07和1.48log CFU/g，组间差异显著(P＜0.01)；发酵15天后，实验组进一步下降到0.49log CFU/g，对照组下降到1.25log CFU/g，组间差异显著(P＜0.001)。金黄色葡萄球菌是养殖场常见致病菌，能够引起呼吸道疾病、腹泻、脱水等疾病，控制卧床垫料中金黄色葡萄球菌，能够改善圈舍微生态环境，降低金黄色葡萄球菌通过呼吸道进入动物体内引发疾病的风险。

图8示出两组粪渣15天沙门氏菌数量变化情况，如图8所示，试验前实验组和对照组沙门氏菌数分别为1.58和1.59log CFU/g；发酵2天后，实验组显著下降到0.87log CFU/g，对照组无明显变化，组间差异显著(P＜0.001)；发酵15天后，实验组进一步下降到0.55log CFU/g，对照组略有下降到1.46log CFU/g，组间差异显著(P＜0.001)。沙门氏菌是禽类常见的病原菌，少量的沙门氏菌即可引起禽类腹泻、痢疾甚至中毒死亡，因此，降低垫料中沙门氏菌的数量可在一定程度上提升禽类的健康。

图9示出两组粪渣15天沙蛔虫卵死亡率情况，如图9所示，试验前实验组和对照组蛔虫卵死亡率分别为94.0和93.8％；发酵15天后，实验组和对照组分别上升到97.3和95.5％。实验组蛔虫卵死亡率更好。提高卧床垫料的蛔虫卵死亡率能够有效降低后期圈舍中蚊蝇的滋生，提高圈舍舒适度。

由此可见，固液分离粪渣中添加复合益生菌剂发酵制备卧床垫料效果优良，具体表现为：促进固液分离后粪渣升温和保温，快速淡化粪渣异臭味，改善其颜色和质地；提高粪渣中有益乳酸菌数，降低粪渣中大肠菌群数、金黄色葡萄球菌数和沙门氏菌数，提高粪渣蛔虫卵死亡率。

两组粪渣发酵前后的感官评定结果如下表7所示：

表7发酵前后粪渣感官评定

注：实验组为畜禽有机堆肥中添加复合益生菌剂进行腐熟，对照组为畜禽有机堆肥自然腐熟。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种用于无害化处理粪渣卧床垫料的复合益生菌菌剂，其特征在于，所述菌剂包括：植物乳杆菌P-8菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP3菌剂和植物乳杆菌LP4菌剂。

2.根据权利要求1所述的复合益生菌菌剂，其特征在于，在复配成所述复合益生菌菌剂前，所述植物乳杆菌P-8菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP3菌剂和植物乳杆菌LP4菌剂的活菌数量均≥2×10¹¹CFU/g。

3.根据权利要求1所述的复合益生菌菌剂，其特征在于，所述植物乳杆菌P-8菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP3菌剂和植物乳杆菌LP4菌剂的重量之比为所述植物乳杆菌P-8菌剂:植物乳杆菌C2菌剂:植物乳杆菌LP3菌剂:植物乳杆菌LP4菌剂＝(0.8～1.2):(0.8～1.2):(1.8～2.2):(1.8～2.2)。

4.根据权利要求1所述的复合益生菌菌剂，其特征在于，所述复合益生菌菌剂还包括稀释载体，所述稀释载体为碳水化合物，优选为麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖、淀粉，更优选为麦芽糊精。

5.根据权利要求4所述的复合益生菌菌剂，其特征在于，所述稀释载体的重量与所述各菌剂的总重量之比为稀释载体的重量:各菌剂的总重量＝(9-9.5):1，其中，所述各菌剂的总重量为所述复合益生菌菌剂中植物乳杆菌P-8菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP3菌剂和植物乳杆菌LP4菌剂的重量之和。

6.一种制备权利要求1至5任一项所述复合益生菌菌剂的方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1，分别制备植物乳杆菌P-8发酵液、植物乳杆菌C2发酵液、植物乳杆菌LP3发酵液和植物乳杆菌LP4发酵液；

步骤2，将步骤1获得的4种发酵液分别离心，向离心后的体系中分别加入保护剂；

步骤3，将步骤2获得的体系分别进行冷冻干燥，分别获得植物乳杆菌P-8菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP3菌剂和植物乳杆菌LP4菌剂；

步骤4，将步骤3获得的植物乳杆菌P-8菌剂、植物乳杆菌C2菌剂、植物乳杆菌LP3菌剂和植物乳杆菌LP4菌剂混合，并加入稀释载体进行复配。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，分别制备植物乳杆菌P-8发酵液、植物乳杆菌C2发酵液、植物乳杆菌LP3发酵液和植物乳杆菌LP4发酵液具体包括：

步骤1-1，分别取一级活化后的植物乳杆菌P-8菌剂的斜面菌体、植物乳杆菌C2菌剂的斜面菌体、植物乳杆菌LP3菌剂的斜面菌体以及植物乳杆菌LP4菌剂的斜面菌体分别单独接种至MRS培养基中，在温度为33-37℃，转速为50-100rpm条件下培养18-24h，分别得到一级种子液；

步骤1-2，将步骤1-1制备的一级种子液按接种量3％-10％(v/v)再次转接入新的MRS培养基进行二次活化，活化18-24h后获得二级种子液；

步骤1-3，将步骤1-2制备的二级种子液分别按照接种量3％-10％(v/v)分别单独接入到不同的发酵罐培养基中，在温度为33-37℃，转速为50-100rpm，通风量为0.3-1L/min，发酵全程调节发酵液pH值为5.6-6.2条件下培养8-12小时。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1-3中所述发酵罐培养基包括如下重量比的组分：

其中，所述发酵罐培养基的pH为7.0。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2中所述保护剂包括以下重量比的组分：

10.权利要求1至5任一项所述复合益生菌菌剂用于无害化处理粪渣卧床垫料的用途。