CN108330080B - 一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂，所述青贮剂包括布氏乳杆菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌；所述布氏乳杆菌于2017年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.14508，分类命名为Lactobacillus buchneri，所述植物乳杆菌于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12554，分类命名为Lactobacillus plantarum；所述凝结芽孢杆菌于2016年5月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12553，分类命名为Bacillus coagulans。本发明的饲料青贮剂应用于全株玉米青贮，可明显降低玉米青贮的pH值，乙酸和乳酸的含量明显增多，乳酸菌含量也明显提高，而霉菌和酵母菌含量则低于检测限，从而提高玉米青贮的发酵品质。

Description

一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于青贮饲料领域，特别涉及一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂及其制备方法和应用。
背景技术
青贮饲料是将新鲜的青绿饲料进行适当的加工处理后，在厌氧条件下经过乳酸菌等微生物的发酵作用而调制保存的多汁饲料，其不仅能够很好地保持原料青绿多汁的特性，而且具有特殊的酸香气味，质地柔软，营养丰富，适口性好。近年来，随着畜牧经济的快速发展，采用青贮全年均衡供应青绿多汁饲料，已成为奶业健康发展的重要手段。为了获得理想的发酵品质，青贮饲料中的乳酸菌数量应达到105cfu/g或以上。然而，在一般情况下，饲料作物上附着的乳酸菌数量不足，青贮早期繁殖缓慢，而有害微生物繁殖较快，导致难以获得品质优良的青贮饲料。因此，需额外添加优质乳酸菌制剂，以保证青贮发酵初期的乳酸菌数量及乳酸菌发酵能力。
公开号为CN1409985A的中国专利申请公开了一种青贮专用乳酸菌接种剂，含两种活性干菌粉，纤维素酶，半纤维素酶，碳水化合物，硫酸锰，硅藻土等。该青贮饲料在短时间内的发酵力度不够，使青贮速度达到pH值为4的时间较长，并且对杂菌的抑制力度缺乏，容易造成营养物质的损失。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂和其制备方法及应用。
为了达成上述的目的，本发明提供一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂，所述青贮剂包括由布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)和凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)。
进一步地，其中所述布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)HEW-A666已于2017年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNO.14508，分类命名为布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)。植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)HEW-A490已于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12554。凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)HEW-B379已于2016年5月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.12553。
进一步地，其中，按重量百分比计，所述布氏乳杆菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌三者之间的比例为(0.1-1.0)：(0.1-0.5)：0.1；所述青贮剂中布氏乳杆菌活性达1×1010-1×1011CFU/g，植物乳杆菌活性达1×1010-5×1010CFU/g，凝结芽孢杆菌活性为1×1010CFU/g。
进一步地，所述饲料青贮剂的制备方法，包括以下步骤：
⑴菌株扩大培养：布氏乳杆菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌分别进行一级、二级和三级培养，最终获得它们的发酵液；
⑵活性菌泥的收集：分别将获得的布氏乳杆菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌发酵液在8000-14000r/m的转速下离心20-30min，获得它们的活性菌泥；
⑶青贮剂的制备：将离心获得的三种菌的活性菌泥与保护剂按比例混合，通过真空冷冻干燥技术冻干成粉末，制得含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂。
进一步地，其中步骤⑴中所述布氏乳杆菌HEW-A666发酵采用的一级种子培养基的组成(按重量百分比计)为：葡萄糖0.5-2.5％，乳糖0.5-2.5％，酵母提取物0.2-2.0％，蛋白胨0.5-2.0％，硫酸镁0.01-1.0％，磷酸氢二钾0.01-0.5％，碳酸钙0.05-0.5％，氯化钠0.05-1.0％，硫酸锰0.01-0.5％，余量为水，pH6.8±0.2；优选地，上述种子培养基的组成：葡萄糖1.5％，乳糖0.5％，酵母提取物0.4％，蛋白胨1.5％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.02％，碳酸钙0.15％，氯化钠0.2％，硫酸锰0.02％，余量为水，pH6.8±0.2。
进一步地，其中步骤⑴中所述布氏乳杆菌HEW-A666发酵采用的二级和三级发酵培养基的组成相同，其组分(按重量百分比计)为：葡萄糖0.5-3.0％，乳糖0.5-2.5％，酵母粉0.5-2.5％，胰蛋白胨0.5-2.0％，硫酸镁0.01-0.25％，磷酸氢二钾0.01-0.2％，碳酸钙0.05-0.5％，氯化钠0.1-2.0％，硫酸锰0.01-0.1％，余量为水，pH6.8±0.2。优选为：葡萄糖2％，乳糖1％，酵母粉1.6％，胰蛋白胨0.8％，硫酸镁0.04％，磷酸氢二钾0.01％，碳酸钙0.1％，氯化钠0.3％，硫酸锰0.05％，余量为水，pH6.8±0.2。
进一步地，其中步骤⑴中所述植物乳杆菌发酵时采用的一级种子培养基的组成(按重量百分比计)为：乳糖0.5-3％，蔗糖0.5-2％，全脂奶粉01-1.％，豆粕粉0.5-2％，酵母浸粉0.5-3.％，NaH2PO40.1-0.7％，KH2PO40.1-0.7％，氯化镁0.01-0.1％，柠檬酸铁铵0.01-0.1％，MnSO40.01-0.1％，氯化钙0.05-1％，余量为水，pH5.8-7.2；优选为乳糖1.25％，蔗糖0.8％，全脂奶粉0.5％，豆粕粉1.5％，酵母浸粉0.85％，NaH2PO40.4％，KH2PO40.6％，氯化镁0.05％，柠檬酸铁铵0.04％，MnSO40.04％，氯化钙0.1％，余量为水，pH6.4±0.2。
进一步地，其中步骤⑴中所述植物乳杆菌发酵时采用的二级和三级发酵培养基的组成相同，其组分(按重量百分比计)为：蔗糖1-4％，玉米淀粉0.5-2.0％，玉米浆干粉1-3％，酵母提取物0.5-3％，磷酸氢二钾0.01-0.15％，硫酸镁0.01-0.2％，氯化钠0.1-0.5％，碳酸钙0.05-0.4％，硫酸锰0.01-0.05，余量为水，pH6.8±0.2；优选为蔗糖1.5％，玉米淀粉2.0％，玉米浆干粉1.2％，酵母提取物1.4％，磷酸氢二钾0.08％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.2％，碳酸钙0.15％，硫酸锰0.03％，余量为水，pH6.8±0.2。
进一步地，其中步骤⑴中所述凝结芽孢杆菌的一级、二级种子培养基的组成(按重量百分比计)为：红糖1％-5％，大豆蛋白胨0.5％-1.5％，酵母膏0.3％-1.0％，NaCl 0.1％-0.5％，K2HPO40.2％-0.5％，硫酸镁0.01％-0.1％，MnSO40.05％-0.15％，余量为水，pH7.0±0.2；优选地，凝结芽孢杆菌发酵时采用的一级、二级种子培养基的组成为：红糖3％，大豆蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 0.5％，K2HPO40.3％，硫酸镁0.05％，MnSO40.1％，余量为水，pH7.0±0.2。三级发酵培养基为：1-25％麸皮浸出液(将小麦麸皮与水按照1:4的比例混合均匀，煮沸20分钟，过滤除去麸皮即得)、1-5％淀粉、1-5％豆粕、1-5％玉米浆干粉、0.05-0.1％磷酸氢二钾、0.05-0.5％硫酸镁、0.1-2.0％氯化钠、0.01-0.05％硫酸锰、0.1-1.0％碳酸钙，余量为水，pH6.0-8.0。
进一步地，其中步骤⑴中所述布氏乳杆菌的发酵方法为：将甘油管保藏的布氏乳杆菌HEW-A666在MRS平板上划线，30℃，48h，从平板上挑取单菌落于100mL种子培养基中，30℃，180r/min震荡培养24h，获得HEW-A666种子液；可取种子液1-5mL(种子液其活菌浓度以109CFU/mL计)，接种到300mL培养基中，进行摇瓶发酵培养，发酵温度25-40℃，转速为120-200r/min，发酵时间15-30h；优选为：发酵温度30℃，转速为180r/min，发酵时间24h。将一级种子液转接到50L发酵罐二级种子培养基中，发酵3.5-5h后，将二级种子液转接于三级发酵培养基中，发酵完成后获得三级发酵液，二级和三级培养发酵条件为装液量为35-65％，接种量为0.5-4％，发酵温度为25-40℃，搅拌转速为80-150r/min，二级发酵时间为3-10h，三级发酵时间为16-30h。优选为：装液量为60％，接种量为1％，发酵温度为30℃，搅拌转速为110r/min，二级发酵时间为5h，三级发酵时间为24h，三级发酵活菌数可达2.0×1010CFU/mL。
进一步地，其中步骤⑴中所述植物乳杆菌的发酵方法为：将植物乳杆菌HEW-A490在MRS斜面上划线，37℃培养20h，将斜面加入2mL灭菌生理盐水制成菌悬液，将菌悬液转接于300mL种子培养基中进行摇瓶发酵培养，37℃、180r/min震荡15h，制成种子液。可取种子液1-5mL(种子液其活菌浓度以109CFU/mL计)，接种到300mL培养基中，进行摇瓶发酵培养获得一级种子液，发酵温度30-45℃，转速为150-220r/m，发酵时间5-20h；优选为：发酵温度37℃，转速为180r/m，发酵时间15h。将一级种子液转接于二级种子培养基中，发酵温度为30-45℃，发酵时间5-20h，搅拌转速100-220r/min；优选为发酵温度为37℃，搅拌转速120r/min，发酵时间10h，获得二级种子液。将二级种子液转接于三级发酵培养基中，装液量为2T-4T培养基，接种量为20-40L二级培养液，发酵温度为30-45℃，发酵时间10-25h，搅拌转速100-220r/min。其中，优选为：装液量为3.5T培养基，接种量为30L，发酵温度为37℃，搅拌转速110r/min，发酵时间20h。活菌数可达2.5×1010CFU/mL。
进一步地，其中步骤⑴中所述凝结芽孢杆菌的发酵方法为：取凝结芽孢杆菌甘油管保藏的菌种，接种于300mL一级种子培养基中，进行摇瓶发酵培养，发酵温度为37±5℃、转速200r/min，发酵时间15-25h，得到一级种子液(活菌浓度为109CFU/mL)。将一级种子液转接到50L发酵罐二级种子培养基中，接种量为2％，装液量为20L、发酵温度为37±5℃、搅拌转速150r/min，培养7-15h得到二级种子液。将二级种子液转接于三级发酵培养基中，接种量为35mL，发酵温度为40℃，pH值6.8，搅拌转速150r/min，发酵时间30h获得三级发酵液，活菌数可达5.0×1010CFU/mL。
进一步地，其中步骤⑶中所述三种菌的活性菌泥与保护剂按比例混合，是将布氏乳杆菌活性菌泥、植物乳杆菌活性菌泥、凝结芽孢杆菌活性菌泥和保护剂按照(0.5-1):(0.5-1):(0.1-0.5):(1-2.5)的重量百分比混合，优选比例为0.75:0.5:0.2:1.45。
进一步地，其中步骤⑶中所述保护剂按照重量份数计的组成为：0.1-8.0份海藻糖、1-5份山梨醇、0.1-3.0份丙三醇、1-10份明胶、2-20份脱脂奶粉、0.5-2份聚乙烯吡咯酮、0.1-2.0份维生素E、0.1-2.0份维生素C、2-8份脱脂乳清粉、水20-50份。优选为：4.5份海藻糖、1.0份山梨醇、0.5份丙三醇、2.5份明胶、8份脱脂奶粉、1.2份聚乙烯吡咯酮、0.5份维生素E、0.5份维生素C、2.5份脱脂乳清粉、24.5份水；将各成分依次加入水中，边溶解边搅拌，搅拌20min后完成。
本发明提供了一种上述含有布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)HEW-A666的饲料青贮剂在用于制备动物饲料中的应用。
本发明提供的布氏乳杆菌HEW-A666可用于全株玉米青贮，提高了全株玉米青贮的感官品质和有氧稳定性，且营养成分高，有利于动物对青贮玉米的饲用。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供的含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂应用于全株玉米青贮，可明显降低玉米青贮的pH值，乙酸和乳酸的含量明显增多，乳酸菌含量也明显提高，而霉菌和酵母菌含量则低于检测限，从而提高玉米青贮的发酵品质。在青贮中添加布氏乳杆菌青贮剂可消耗淀粉，提高中性洗涤纤维含量，有利于奶牛等瘤胃动物维持瘤胃正常发酵功能；还可有效提高全株玉米青贮的感官品质和有氧稳定性，且营养成分高。
2.本发明提供的全株玉米青贮饲喂肉牛(西门塔尔杂交牛)，当其添加比例为50％时，肉牛日增重最高，显著高于对照组(P＜0.05)，提高了6.57％，降低料肉比0.38。
具体实施方式
下面结合实施例解释本发明，实施案例仅用于说明本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指重量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
实施例1活性菌泥和保护剂的制备
⑴布氏乳杆菌HEW-A666活性菌泥的制备
将甘油管保藏的菌株HEW-A666在MRS平板上划线培养，30℃，48h，从平板上挑取单菌落于100mL种子培养基中，30℃，180r/min震荡培养24h，获得HEW-A666种子液，活性达4.0×109CFU/mL；
取活菌浓度以109CFU/mL计的种子液1-5mL，接种到300mL培养基中，进行摇瓶发酵培养获得HEW-A666一级种子液；
将HEW-A666一级种子液转接到50L发酵罐的二级种子培养基中，进行二级发酵，发酵5h后得HEW-A666二级种子液；
将HEW-A666二级种子液转接于5T发酵罐的三级发酵培养基中，进行三级发酵，发酵24h后获得HEW-A666三级发酵液，活性达到2.0×1010CFU/mL；
将HEW-A666三级发酵液通过碟式离心机离心(6000r/m)获得HEW-A666菌泥，活性(活菌数)达到8.0×1011CFU/g。
其中，二级和三级发酵的共同条件如下，装液量为60％(v/v)，接种量为1％(v/v)，发酵温度为30℃，搅拌转速为110r/min，三级发酵活菌数达到2.0×1010CFU/mL；
种子培养基由下述组分组成(按重量百分比计)：葡萄糖1.5％，乳糖0.5％，酵母提取物0.4％，蛋白胨1.5％，硫酸镁0.05％，磷酸氢二钾0.02％，碳酸钙0.15％，氯化钠0.2％，硫酸锰0.02％，余量为水，pH6.8±0.2。摇瓶发酵的条件为：发酵温度30℃，转速为180r/min，发酵时间24h。
二级和三级发酵培养基相同，按重量百分比计，均为葡萄糖2％，乳糖1％，酵母粉1.6％，胰蛋白胨0.8％，硫酸镁0.04％，磷酸氢二钾0.01％，碳酸钙0.1％，氯化钠0.3％，硫酸锰0.05％，余量为水，pH6.8±0.2。
⑵植物乳杆菌HEW-A490活性菌泥的制备
将菌株HEW-A490(保藏编号为CGMCC NO.12554，其在公开号为CN106399196A的中国专利申请中已保藏)在MRS斜面上划线，37℃培养20h，将斜面加入2mL，0.85wt％的灭菌生理盐水制成菌悬液，将菌悬液转接于300mL种子培养基中进行摇瓶发酵培养，37℃、180r/min震荡15h，制成HEW-A490种子液，检测种子液活菌数为5.4×109CFU/mL，种子液于4℃保存在冰箱内备用；
取活菌浓度以109CFU/mL计的种子液1-5mL，接种到300mL一级种子培养基中，进行摇瓶发酵培养获得HEW-A490一级种子液，发酵温度37℃，转速为180r/m，发酵时间15h；
将HEW-A490一级种子液转接到50L发酵罐的二级种子培养基中，进行二级发酵，发酵10h后得HEW-A490二级种子液；
将HEW-A490二级种子液转接于5T发酵罐的三级发酵培养基中，进行三级发酵，发酵20h后获得HEW-A490三级发酵液；
将三级发酵液通过碟式离心机离心(6000r/m)获得HEW-A490菌泥，活性达6.5×1011CFU/g。
其中，二级和三级发酵的共同条件如下，装液量为70％(v/v)，接种量为60％(v/v)，发酵温度为37℃，搅拌转速110r/min；三级活菌数可达2.5×1010CFU/mL；
其中，一级种子培养基由下述组分组成(按重量百分比计)：乳糖1.25％，蔗糖0.8％，全脂奶粉0.5％，豆粕粉1.5％，酵母浸粉0.85％，NaH2PO40.4％，KH2PO40.6％，氯化镁0.05％，柠檬酸铁铵0.04％，MnSO40.04％，氯化钙0.1％，余量为水，pH6.8±0.2。摇瓶发酵的条件为：发酵温度37℃，转速为180r/m，发酵时间15h。
二级和三级发酵培养基相同，按重量百分比计，均为蔗糖1.5％，玉米淀粉2.0％，玉米浆干粉1.2％，酵母提取物1.4％，磷酸氢二钾0.08％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.2％，碳酸钙0.15％，硫酸锰0.03％，余量为水，pH6.8±0.2。
⑶凝结芽孢杆菌HEW-B379活性菌泥的制备
取甘油管保藏的凝结芽孢杆菌菌种HEW-B379(保藏编号为CGMCC No.12553，其在公开号为CN106011036A的中国专利申请中已保藏)，接种于300mL一级种子培养基中，进行摇瓶发酵培养，发酵温度为40℃、pH6.8、转速200r/min，发酵时间10h，得到活菌浓度为109CFU/mL的HEW-B379一级种子液；
将HEW-B379一级种子液转接到50L发酵罐的二级种子培养基中，接种量为2％(v/v)，装液量为0.4％(v/v)、发酵温度为40℃、搅拌转速150r/min，pH值6.8，培养10h得到HEW-B379二级种子液；
将HEW-B379二级种子液转接于500L发酵罐的三级培养基中，控制罐压0.02-0.05MpB，装液量为60％(v/v)，接种量为0.6％(v/v)，发酵温度为40℃，pH值6.8，搅拌转速150r/min，发酵30h，获得HEW-B379三级发酵液，发酵结束后，经检测发酵液活菌数为6.1×1010CFU/mL；
将三级发酵液通过碟式离心机离心(6000r/m)获得HEW-B379菌泥，活性达1.0×1012CFU/g。
其中，一级、二级种子培养基的组成(按重量百分比计)为：红糖3％，大豆蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl 0.5％，K2HPO40.3％，硫酸镁0.05％，MnSO40.1％，余量为水，pH7.0±0.2；
三级发酵培养基成分(按重量百分比计)为：2.5％麸皮浸出液、1.25％淀粉、2.5％豆粕、1.48％玉米浆干粉、0.08％磷酸氢二钾，0.12％硫酸镁，0.56％氯化钠，0.03％硫酸锰、0.24％碳酸钙，余量为水，pH6.0-8.0。
⑷保护剂的制备
保护剂(按重量份数计)的组成为：4.5份海藻糖、1.0份山梨醇、0.5份丙三醇、2.5份明胶、8份脱脂奶粉、1.2份聚乙烯吡咯酮、0.5份维生素E、0.5份维生素C、2.5份脱脂乳清粉、24.5份水；将各成分依次加入水中，边溶解边搅拌，搅拌20min后完成。
实施例2一种含有布氏乳杆菌HEW--A666的饲料青贮剂的制备
将实施例1中所述的三种菌的活性菌泥与保护剂按比例混合，即布氏乳杆菌活性菌泥、植物乳杆菌活性菌泥、凝结芽孢杆菌活性菌泥和保护剂按照0.75:0.5:0.2:1.45的比例(重量百分比)混合均匀。
三种菌的活性菌泥与保护剂混合均匀后，-80℃预冻3-6h，然后进行冷冻干燥30-48h，获得一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂，该饲料青贮剂中布氏乳杆菌活性为5.0×1010cfu/g、植物乳杆菌活性为3.0×1010cfu/g，凝结芽孢杆菌活性为2.0×1010cfu/g。
实施例3一种含有布氏乳杆菌HEW--A666的饲料青贮剂的制备
与实施例2的区别在于布氏乳杆菌活性菌泥、植物乳杆菌活性菌泥、凝结芽孢杆菌活性菌泥和保护剂按照0.5:0.2:0.1:1.25的比例(重量百分比)混合均匀。
三种菌的活性菌泥与保护剂混合均匀后，-80℃预冻3-6h，然后进行冷冻干燥30-48h，获得一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂，该饲料青贮剂中布氏乳杆菌活性为3.5×1010cfu/g、植物乳杆菌活性为1.8×1010cfu/g，凝结芽孢杆菌活性为5.0×109cfu/g。
实施例4一种含有布氏乳杆菌HEW--A666的饲料青贮剂的制备
与实施例2的区别在于布氏乳杆菌活性菌泥、植物乳杆菌活性菌泥、凝结芽孢杆菌活性菌泥和保护剂按照0.75:0.5:0.2:0.8的比例(重量百分比)混合均匀。
三种菌的活性菌泥与保护剂混合均匀后，-80℃预冻3-6h，然后进行冷冻干燥30-48h，获得一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂，该饲料青贮剂中布氏乳杆菌活性为8.5×1010cfu/g、植物乳杆菌活性为6.8×1010cfu/g，凝结芽孢杆菌活性为4.5×1010cfu/g。
实施例5一种含有布氏乳杆菌HEW--A666的饲料青贮剂的制备
与实施例2的区别在于布氏乳杆菌活性菌泥、植物乳杆菌活性菌泥、凝结芽孢杆菌活性菌泥和保护剂按照0.6:0.6:0.4:1.45比例(重量百分比)混合均匀。
三种菌的活性菌泥与保护剂混合均匀后，-80℃预冻3-6h，然后进行冷冻干燥30-48h，获得一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂，该饲料青贮剂中布氏乳杆菌活性为4.5×1010cfu/g、植物乳杆菌活性为4.0×1010cfu/g，凝结芽孢杆菌活性为3.5×1010cfu/g。
实施例6一种含有布氏乳杆菌HEW--A666的饲料青贮剂的制备
与实施例2的区别在于布氏乳杆菌活性菌泥、植物乳杆菌活性菌泥、凝结芽孢杆菌活性菌泥和保护剂按照0.25:0.5:0.2:0.6比例(重量百分比)混合均匀。
三种菌的活性菌泥与保护剂混合均匀后，-80℃预冻3-6h，然后进行冷冻干燥30-4混合8h，获得一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂，该饲料青贮剂中布氏乳杆菌活性为2.7×1010cfu/g、植物乳杆菌活性为7.0×1010cfu/g，凝结芽孢杆菌活性为5.0×1010cfu/g。
实施例7饲料青贮剂在全株玉米青贮中的应用
试验组：刈割后的全株玉米(无腐烂变质)，切至2-3cm段，作为青贮原料，将含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂与0.85wt％的生理盐水按照10％的比例混合使其完全溶解后，均匀地喷洒在青贮原料上，使布氏乳杆菌活性为105CFU/g的青贮原料、植物乳杆菌活性为105CFU/g的青贮原料及凝结芽孢杆菌活性为104CFU/g的青贮原料，填装压实，要确保青贮桶的周围及边角充分压实，封膜并踩实封严，25℃厌氧发酵4个月，得到青贮饲料。
对照组：用等量的灭菌生理盐水作对照。
青贮结束后，观察青贮饲料品质，检测青贮饲料中各营养成分(干物质、可溶性碳水化合物、淀粉、粗蛋白、中性和酸性洗涤纤维、氨态氮)含量、有机酸含量、霉菌、酵母菌含量及有氧稳定性(表1)。
表1青贮剂对全株玉米青贮营养成分的影响
营养成分 对照组 试验组
气味 有霉臭味 无丁酸臭味，有芳香味
结构 茎叶结构较差 茎叶结构保持良好
颜色 变色严重 接近于原料原色
pH 4.68±0.12 3.54±0.05
干物质(占总重)％ 32.67±0.87<sup>a</sup> 36.12±1.24<sup>b</sup>
可溶性碳水化合物(占干物质)％ 0.98±0.02 1.08±0.01
淀粉(占干物质)％ 18.62±0.22 15.88±0.14
粗蛋白(占干物质)％ 6.82±0.04 6.32±0.02
中性洗涤纤维(占干物质)％ 40.67±1.25<sup>a</sup> 48.06±2.17<sup>b</sup>
酸性洗涤纤维(占干物质)％ 24.15±0.69 26.52±0.74
氨态氮(占干物质)％ 7.17±0.11 6.24±0.08
水分％ 76.24±1.02 70.68±0.36
霉菌CFU/g 1.4×10<sup>4</sup> 无检出
酵母菌CFU/g 7.8×10<sup>3</sup> 无检出
乳酸菌CFU/g 2.1×10<sup>4</sup> 6.4×10<sup>6</sup>
注：同行数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)。
与对照组相比，试验组全株玉米青贮品质更佳，有较弱的酸味，淡淡的芳香味，柔软松散不粘手，黄绿色。由表1可知，在青贮中添加青贮剂可消耗淀粉，提高中性洗涤纤维含量，有利于奶牛等瘤胃动物维持瘤胃的正常发酵功能。
青贮结束，开封第0和7天，检测全株玉米有氧变败的饲料品质，结果如表2所示，可知，添加青贮剂的青贮饲料在接触氧气第7天时，pH仍然很低，与对照组相比，仍有较多的乳酸和乙酸，提高了饲料品质；添加青贮剂的全株玉米青贮刚开封时未检出霉菌，在第7天时仍未超过104CFU/g。
表2青贮剂对全株玉米青贮饲料品质的影响
Figure BDA0001468061910000101
综上所述，添加青贮剂可有效提高全株玉米青贮的感官品质和有氧稳定性，且营养成分高。
实施例8饲用全株玉米青贮饲喂肉牛试验
选择体况相近、健康、膘情较好且个体大小一致的肉牛(西门塔尔杂交牛)120头，随机分为对照组和试验组，在试验现有肉牛颗粒饲料(基础日粮)配方基础上各试验组通过固定能量、蛋白、干物质采食量、精饲料来设计日粮配方，(根据经验和预实验结果来设计，用全株玉米青贮来替代对照组中玉米秸秆)试验组以饲喂全株玉米青贮占粗饲料的最终比例(干物质比例)来设计5个试验组A组(30％)、B组(50％)、C组(70％)、D组(90％)、E组(100％)，对照组为基础日粮(如表3所示)。
表3肉牛颗粒饲料(基础日粮)配方及其配比
Figure BDA0001468061910000102
Figure BDA0001468061910000111
本试验先进行预实验2周，正式试验期10周。根据养殖场的管理规定，饲喂方式采用日喂2次的方式，即早上8:00和下午17:00各1次，按先精后粗的顺序添料，并保证饮水。试验前对牛舍进行消毒。对试验牛进行编号、分组、驱虫、健胃、适应环境等，并严格执行当地疫控部门制定的疫病防治制度及免疫接种程序。试验牛的日常管理按试验场管理规定执行。
试验期间，每日记录牛舍内温度、湿度，并观察记录各组牛只个体的身体健康情况、反刍情况及精神状态。试验预期结束后，测定并记录每头试验牛早晨空腹时的体重；试验期结束后，测定并记录每头试验牛早晨空腹时的体重；试验期间，测定并记录每次投料量和下次投料前的剩余量等(表4)。
表4不同比例全株玉米青贮对肉牛生长性能的影响
组别 初始体重(kg) 日增重(kg/d) 料重比
对照组 495.67±25.21<sup>a</sup> 1.37±0.24<sup>a</sup> 6.42±2.11
试验A组 502.43±20.33<sup>a</sup> 1.35±0.15<sup>a</sup> 6.31±1.25
试验B组 498.26±18.57<sup>a</sup> 1.46±0.36<sup>b</sup> 6.04±1.04
试验C组 489.88±21.68<sup>a</sup> 1.43±0.12<sup>b</sup> 6.29±2.03
试验D组 507.12±19.85<sup>a</sup> 1.36±0.20<sup>a</sup> 6.57±3.3
试验E组 500.39±23.62<sup>a</sup> 1.21±0.32<sup>b</sup> 6.74±1.76
注：同列数据肩标不同字母表示差异显著(P＜0.05)，肩标相同字母或无肩标表示差异不显著(P＞0.05)。
从表4中可以看出，试验期间，除E组肉牛出现食欲不振，其余各组肉牛健康状况良好，无厌食情况发生。全株玉米青贮比例在50％时(B组)肉牛日增重最高，且显著高于对照组(P＜0.05)，料重比最低，比对照组降低0.38。全株玉米青贮可显著提高肉牛的日增重，降低料重比。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂，其特征在于，所述青贮剂包括布氏乳杆菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌；其中，所述布氏乳杆菌已于2017年8月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.14508，分类命名为Lactobacillus buchneri，所述植物乳杆菌已于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.12554，分类命名为Lactobacillus plantarum；所述凝结芽孢杆菌已于2016年5月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12553，分类命名为Bacillus coagulans；
按重量百分比计，所述布氏乳杆菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌三者之间的比例为（0.1-1.0）：（0.1-0.5）：0.1； 所述青贮剂中布氏乳杆菌活性达1×1010-1×1011CFU/g，植物乳杆菌活性达1×1010-5×1010CFU/g，凝结芽孢杆菌活性为1×1010-3×1010CFU/g。
2.一种权利要求1所述的含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
⑴菌株扩大培养：布氏乳杆菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌分别进行一级、二级和三级
培养，最终获得它们的发酵液；
⑵活性菌泥的收集：分别将获得的布氏乳杆菌、植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌的三级发酵液在8000-14000r/m的转速下离心20-30min，获得它们的活性菌泥；
⑶青贮剂的制备：将离心获得的三种菌的活性菌泥与保护剂按比例混合，通过真空冷冻干燥技术冻干成粉末，制得含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤⑴中，
所述布氏乳杆菌的发酵方法为：将甘油管保藏的布氏乳杆菌在MRS平板上划线，30℃，48h，从平板上挑取单菌落于100mL种子培养基中，30℃，180r/min震荡培养24h，获得种子液；取活菌浓度以109CFU/mL计的种子液1-5mL，接种到300mL培养基中，进行摇瓶发酵培养获得一级种子液，发酵温度25-40℃，转速为120-200r/min，发酵时间15-30h；将一级种子液转接到50L发酵罐的二级种子培养基中，进行二级发酵，得二级种子液，将二级种子液转接于5T发酵罐的三级发酵培养基中，进行三级发酵，得三级发酵液；其中二级和三级培养发酵条件如下，装液量为35-65%（v/v），接种量为0.5-4%（v/v），发酵温度为25-40℃，搅拌转速为80-150r/min，二级发酵时间为3-10h，三级发酵时间为16-30h；
所述植物乳杆菌的发酵方法为：将植物乳杆菌在MRS斜面上划线，37℃培养20h，将斜面加入2mL，0.85wt%灭菌生理盐水制成菌悬液，将菌悬液转接于300mL种子培养基中进行摇瓶发酵培养，37℃、180r/min震荡15h，制成种子液；取活菌浓度以109CFU/mL计的种子液1-5mL，接种到300mL一级种子培养基中，进行摇瓶发酵培养获得一级种子液，其中发酵温度30-45℃，转速为150-220r/m，发酵时间5-20h；将一级种子液转接于50L发酵罐的二级种子培养基中，进行二级发酵，获得二级种子液；将二级种子液转接于5T发酵罐的三级发酵培养基中，进行三级发酵，得三级发酵液；二级和三级培养发酵条件如下，装液量为40-80%（v/v），接种量为40-80%（v/v），发酵温度为30-45℃，搅拌转速100-220r/min，二级发酵时间5-20h，三级发酵时间10-25h；
所述凝结芽孢杆菌的发酵方法为：取甘油管保藏的凝结芽孢杆菌菌种，接种于300mL一级种子培养基中，进行摇瓶发酵培养，发酵温度为37-40℃、转速200r/min，发酵时间15-25h，得到活菌浓度为109 CFU/mL的一级种子液；将一级种子液转接到50L发酵罐的二级种子培养基中，接种量为2%，装液量为0.4%（v/v）、发酵温度为37-40℃、搅拌转速150 r/min，培养7-15h得到二级种子液；将二级种子液转接于500L发酵罐的三级培养基中，装液量为60%（v/v），接种量为0.6%（v/v），发酵温度为37-40℃，pH值6.8，搅拌转速150r/min，发酵时间30h，获得三级发酵液，活菌数达到6.1×1010CFU/mL。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤⑴中，
所述布氏乳杆菌发酵采用的一级种子培养基按重量百分比计的具体组成为：葡萄糖0.5-2.5%，乳糖0.5-2.5%，酵母提取物0.2-2.0%，蛋白胨0.5-2.0%，硫酸镁0.01-1.0%，磷酸氢二钾0.01-0.5%，碳酸钙0.05-0.5%，氯化钠0.05-1.0%，硫酸锰0.01-0.5%，余量为水，pH6.8±0.2；
所述布氏乳杆菌发酵采用的二级和三级发酵培养基的组成相同，其按重量百分比计的具体组成为：葡萄糖0.5-3.0%，乳糖0.5-2.5%，酵母粉0.5-2.5%，胰蛋白胨0.5-2.0%，硫酸镁0.01-0.25%，磷酸氢二钾0.01-0.2%，碳酸钙0.05-0.5%，氯化钠0.1-2.0%，硫酸锰0.01-0.1%，余量为水，pH6.8±0.2。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤⑴中，
所述植物乳杆菌发酵时采用的一级种子培养基按重量百分比计的具体组成为：乳糖0.5-3%，蔗糖0.5-2%，全脂奶粉01-1.%，豆粕粉0.5-2%，酵母浸粉0.5-3.%，NaH2PO4 0.1-0.7%，KH2PO4 0.1-0.7%，氯化镁0.01-0.1%，柠檬酸铁铵0.01-0.1%，MnSO4 0.01-0.1%，氯化钙0.05-1%，余量为水，pH5.8-7.2；
所述植物乳杆菌发酵时采用的二级和三级发酵培养基的组成相同，其按重量百分比计的具体组成为：蔗糖1-4%，玉米淀粉0.5-2.0%，玉米浆干粉1-3%，酵母提取物0.5-3%，磷酸氢二钾0.01-0.15%，硫酸镁0.01-0.2%，氯化钠0.1-0.5%，碳酸钙0.05-0.4%，硫酸锰0.01-0.05，余量为水，pH6.8±0.2。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤⑴中，
所述凝结芽孢杆菌的一级、二级种子培养基的组成为：红糖1%-5%，大豆蛋白胨0.5%-1.5%，酵母膏0.3%-1.0%，NaCl 0.1%-0.5%，K2HPO4 0.2%-0.5%，硫酸镁0.01%-0.1%，MnSO40.05%-0.15%，余量为水，pH7.0±0.2；
所述凝结芽孢杆菌的三级发酵培养基的组成为：1-25%麸皮浸出液、1-5%淀粉、1-5%豆粕、1-5%玉米浆干粉、0.05-0.1%磷酸氢二钾、0.05-0.5%硫酸镁、0.1-2.0%氯化钠、0.01-0.05%硫酸锰、0.1-1.0%碳酸钙，余量为水，pH6.0-8.0。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤⑶中，
所述的三种菌的活性菌泥与保护剂按比例混合，是将布氏乳杆菌活性菌泥、植物乳杆菌活性菌泥、凝结芽孢杆菌活性菌泥和保护剂按照（0.5-1）:（0.5-1）:（0.1-0.5）:（1-2.5）混合。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤⑶中，
所述保护剂按照重量份数计的组成为0.1-8.0份海藻糖、1-5份山梨醇、0.1-3.0份丙三醇、1-10份明胶、2-20份脱脂奶粉、0.5-2份聚乙烯吡咯酮、0.1-2.0份维生素E、0.1-2.0份维生素C、2-8份脱脂乳清粉、水20-50份；将各成分依次加入水中，边溶解边搅拌，搅拌20min后完成。
9.一种权利要求1所述的含有布氏乳杆菌的饲料青贮剂在用于制备动物饲料中的应用。
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