CN106399196B

CN106399196B - 一株植物乳杆菌hew-a490及其应用

Info

Publication number: CN106399196B
Application number: CN201610963739.1A
Authority: CN
Inventors: 李雪平
Original assignee: Beijing Heswof Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Heswof Biotechnology Co ltd
Priority date: 2016-11-04
Filing date: 2016-11-04
Publication date: 2019-07-19
Anticipated expiration: 2036-11-04
Also published as: CN106399196A

Abstract

本发明提供一株新分离的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HEW‑A490，该菌具有显著的益生性以及抗逆性，由其制备的微生态制剂进入动物肠道，迅速活化、增殖，并能够形成有益优势菌群，维持肠道平衡，不但可以提高动物的饲料利用效率，节约成本，而且改善了动物体内消化道内环境的稳态，促进营养的吸收利用，促进动物生长，提高经济效益等功效，有着良好的应用前景。

Description

一株植物乳杆菌HEW-A490及其应用

技术领域

本发明涉及畜牧饲用益生菌，特别涉及一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)HEW-A490及其应用。

背景技术

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是人和动物肠道的正常菌群，广泛存在于传统发酵食品中，已有众多研究证明植物乳杆菌在抑制病原菌生长繁殖，促进机体对营养物质消化吸收，提高机体免疫力等方面具有重要的生物学功能。植物乳杆菌通过与病原菌对限制性营养素的能力竞争，来抑制病原菌的生长，调节肠道微生态的组成，形成生物学屏障。同时，通过其代谢所产生的代谢产物乳酸、细菌素、以及双乙酰对其它细菌的作用，调整菌群之间的关系，维持和保证菌群最佳优势组合以及这种组合的稳定，阻止了致病菌的定殖和入侵，拮抗致病菌和有害微生物的生长及其毒素的粘附，是一种理想的微生物饲料添加剂。同时植物乳杆菌的中β葡萄糖苷酶具有较高的活性，能降解饲料中的植物性原料常含有毒性和抗营养化合物。因此，植物乳杆菌在畜牧生产中有广泛的应用前景。但大多益生菌对饲料加工中的制粒工艺的高温、运输及胃肠液和胆汁的耐受性较差，进入肠道的活植物乳杆菌的种类和数量不多，因此筛选获得耐高温、耐胃肠液和胆汁的植物乳杆菌可以解决这一系列的问题。

植物乳杆菌的来源很多，可购买工业菌株和标准菌株，也可以从自然环境、土壤、酸奶、泡菜等分离。然而益生菌最终是要饲喂动物，因此相对其他来源的菌株，动物无疑是最好的来源。来源于动物肠道的植物乳杆菌能够适应动物肠道环境，耐受胃酸和胆盐的消化。筛选功能植物乳杆菌对开发多功能性的微生物饲料添加剂具有现实意义，同时多功能性微生物饲料添加剂也是发展生态农业，提高畜牧业经济效益，保障畜产品品质和畜产食品安全的重要发展方向。

现有的植物乳杆菌耐热性、耐酸碱性、抑菌性能及发酵性能等都不理想，不能适应日益发展的工业化需求，尤其离目前饲料工业及畜牧养殖业目标还有一定差距。为了弥补上述领域的不足，并更好地适应日益发展的工业化需求，分离、纯化更加适合畜牧业发展需求的益生植物乳杆菌菌株仍是本领域技术人员的责任和追求。

发明内容

本发明的目的是提供一株抗逆性和益生性强的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)HEW-A490及其应用。

本发明的另一目的是提供由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HEW-A490制备的微生态制剂及动物饲料。

为了实现本发明目的，本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HEW-A490是从健康鸡肠道内容物中分离的乳酸杆菌菌株，通过菌落形态观察、生理生化特征、分子生物学鉴定等确定其为植物乳杆菌。该菌株具有耐酸碱、耐高温性能，抗逆性强，且对腐败菌有抑制作用等。

本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HEW-A490已于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNO.12554，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HEW-A490具有以下微生物学特征：在MRS培养基生菌落呈乳白色、圆形且边缘规则、湿润且光滑，易挑起，菌落直径为2～3mm，菌落形态见图1；显微形态见图2；其菌体呈短杆状，无鞭毛，无芽孢，革兰氏阳性；植物乳杆菌HEW-A490兼性厌氧菌，生长适宜温度范围：4℃-65℃，最适生长温度：25℃-45℃；生长适宜pH2.5-10，最适pH值为5-8；部分生理生化特性见表1。

表1植物乳杆菌HEW-A490部分生理生化特性

注：“+”表示反应阳性；“－”表示反应阴性。

将菌株HEW-A490的16S rDNA的序列与GenBank中已知序列进行Blast比对，从数据库中获得相关的种属的16S rDNA，构建系统发育树，并通过菌种的细胞形态、生理生化特征和16S rDNA序列等实验数据综合确定该菌株属于乳杆菌属，最终确定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

本发明植物乳杆菌HEW-A490具有显著的抑菌性能，可有效抑制肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌及大肠杆菌等腐败菌的生长繁殖。

本发明植物乳杆菌HEW-A490具有较强的抗逆性，可以耐高温、耐模拟胃液、耐胆盐性，且能保持90％以上的存活率。

本发明植物乳杆菌HEW-A490对肠上皮细胞株HT-29细胞有较强的粘附作用，粘附率达54％。

本发明还提供植物乳杆菌HEW-A490的培养方法，其中，种子培养基由下述组分组成：葡萄糖0.5-2％，蔗糖0.5-2.5％，酵母膏0.5-2％，胰蛋白胨0.5-1.5％，磷酸氢二钾0.02-0.10％，硫酸镁0.01-0.15％，氯化钠0.1-0.5％，碳酸钙0.1-0.5％，余量为水，pH6.8±0.2；优选地，上述种子培养基由下述组分组成：葡萄糖0.5％，蔗糖1.2％，酵母膏0.8％，胰蛋白胨1.0％，磷酸氢二钾0.05％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.25％，碳酸钙0.17％，余量为水，pH6.8±0.2。

其中摇瓶发酵的条件为：发酵温度30-45℃，转速为150-220r/m，发酵时间5-20h；优选为：发酵温度37℃，转速为180r/m，发酵时间15h。

发酵培养基(包括二级发酵培养基和三级扩大培养基)由下述组分组成：蔗糖1-4％，玉米淀粉0.5-2.0％，玉米浆干粉1-3％，酵母提取物0.5-3％，磷酸氢二钾0.01-0.15％，硫酸镁0.01-0.2％，氯化钠0.1-0.5％，碳酸钙0.05-0.4％，硫酸锰0.01-0.05，余量为水，pH6.8±0.2；优选地，由下述组分组成：蔗糖1.5％，玉米淀粉2.0％，玉米浆干粉1.2％，酵母提取物1.4％，磷酸氢二钾0.08％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.2％，碳酸钙0.15％，硫酸锰0.03％，余量为水，pH6.8±0.2。

发酵条件(包括二级发酵和三级扩大培养)包括：发酵温度为30-45℃，发酵时间5-20h，搅拌转速100-220r/min；优选为发酵温度为37℃，搅拌转速120r/min，发酵时间10h。

二级发酵培养以50L发酵罐中试发酵条件为例：装液量为20-40L培养基，接种量为200-600mL摇瓶种子液；优选为：装液量为30L培养基，接种量为300mL摇瓶种子液。

三级发酵培养以5T发酵罐培养为例，5T发酵罐培养基与二级发酵培养基相同。5T发酵罐发酵条件为：装液量为2T-4T培养基，接种量为20-40L二级培养液，发酵温度为30-45℃，发酵时间10-25h，搅拌转速100-220r/min。其中，优选为：装液量为3.5T培养基，接种量为30L，发酵温度为37℃，搅拌转速110r/min，发酵时间20h。活菌数可达2.5×10¹⁰CFU/mL

具体地，上述植物乳杆菌HEW-A490的培养方法，包括将植物乳杆菌HEW-A490在MRS斜面上划线，37℃培养20h，将斜面加入2mL灭菌生理盐水制成菌悬液，将菌悬液转接于300mL种子培养基中进行摇瓶发酵培养，37℃、180r/min震荡15h，制成种子液。可取种子液1-5mL(种子液其活菌浓度以10⁹CFU/mL计)，接种到300mL培养基中，进行摇瓶发酵培养。还可以继续进行二级培养、三级培养等扩大培养。

本发明还提供由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HEW-A490制备的微生态制剂。

本发明还提供上述微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)发酵培养：将植物乳杆菌HEW-A490的种子液接种于发酵培养基中发酵培养得到发酵液；

2)将发酵液经离心获得菌泥，将菌泥和保护剂按比例混合均匀，加适量水制成微囊湿粉，然后与包被剂溶液混合均匀，进行干燥制粒，获得植物乳杆菌HEW-A490微生态制剂。

所述保护剂的原料包括：海藻糖、菊糖、脱脂奶粉、糊化变性淀粉、脱盐乳清粉、麦芽糊精、白蛋白、维生素E、微晶纤维素、甘油。

优选地，所述保护剂包括以下重量百分比的原料：1-10％海藻糖、1-5％菊糖、2-15％脱脂奶粉、10-20％糊化变性淀粉、2-6％脱盐乳清粉、1-6％麦芽糊精、1-3％白蛋白、2-5％维生素E、2-10％微晶纤维素、1-5％甘油、余量为水；进一步优选地，所述保护剂包括以下重量百分比的原料：8.5％海藻糖、2.4％菊糖、11％脱脂奶粉、14％糊化变性淀粉、2.5％脱盐乳清粉、3％麦芽糊精、1％白蛋白、2.2％维生素E、5％微晶纤维素、4.5％甘油、余量为水。

优选地，所述菌泥和保护剂的重量比例为0.5-1.2：0.8-2，进一步优选为1:0.8。

优选地，所述菌泥中有效活菌数为5.0×10¹¹-1.0×10¹²CFU/g，进一步优选为8.0×10¹¹CFU/g。

所述包被剂溶液的原料包括：海藻酸钠、羟甲基纤维素、黄原胶、卡拉胶、壳聚糖、甘露聚糖、低聚果糖。

优选地，所述包被剂溶液包括以下重量百分比的原料：2-12％海藻酸钠、2-10％羟甲基纤维素、2-8％黄原胶、1-4％卡拉胶、1-12％壳聚糖、3-8％甘露聚糖、2-15％低聚果糖、余量为水；进一步优选地，所述包被剂溶液包括以下重量百分比的原料：9％海藻酸钠、6.5％羟甲基纤维素、3.6％黄原胶、2％卡拉胶、8.5％壳聚糖、4％甘露聚糖、8％低聚果糖、余量为水。

优选地，所述植物乳杆菌HEW-A490微生态制剂中有效活菌数为5×10¹⁰-1.2×10¹¹CFU/g，进一步优选为1×10¹¹CFU/g。

本发明还提供上述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HEW-A490或上述微生态制剂在制备动物饲料中的应用。

本发明还提供含有上述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HEW-A490或上述微生态制剂的动物饲料。

本发明提供的植物乳杆菌HEW-A490、上述微生态制剂可用于发酵豆粕，提高了豆粕的营养价值，改善了风味，有利于动物对发酵豆粕的饲用。

本发明提供的植物乳杆菌HEW-A490、上述微生态制剂可用于牧草青贮，提高牧草青贮的发酵品质。

本发明提供的植物乳杆菌HEW-A490、上述微生态制剂可用于非治疗目的的抑制细菌、调节动物肠道微生物平衡、促进动物对营养的吸收、提高饲料转化率、提高动物生产性能等。

本发明的有益效果：

1.本发明植物乳杆菌HEW-A490具有显著的益生性，能显著抑制肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌及大肠杆菌等腐败菌的生长繁殖，具有广谱抑菌性。

2.本发明植物乳杆菌HEW-A490具有较强的抗逆性，能够耐受模拟胃酸、胆盐以及高温环境，并且能保持较高的活菌存活率，其活菌存活率可达到90％以上，更加适合饲料工业和畜牧养殖业的要求。

3.本发明植物乳杆菌HEW-A490对肠上皮细胞株HT-29细胞有较强的粘附作用，可以通过与肠上皮细胞受体粘附，占位定植并阻止病原菌与细胞受体粘附，抑制病原菌，调节肠道菌群平衡。

4.本发明植物乳杆菌HEW-A490发酵豆粕可提高豆粕营养价值，显著降低豆粕中抗营养因子含量，改善适口性，促进动物对营养的吸收。

5.本发明植物乳杆菌HEW-A490应用于青贮牧草，可明显降低牧草青贮的pH值，乙酸和乳酸的含量明显增多，乳酸菌含量也明显提高，而丁酸、大肠杆菌、霉菌和酵母菌含量则低于检测限，从而提高牧草青贮的发酵品质。

6.本发明植物乳杆菌HEW-A490具有优良的微生物学特性、显著的益生性及抗逆性和超强的发酵性能，不但可以提高动物的饲料利用效率，节约成本，而且大大改善了动物体内消化道内环境的稳态，促进营养的吸收利用，促进动物生长，显著提高了动物的生产性能。在其用量较少，例如在饮水中仅为10⁶CFU/mL时即可发挥显著作用，具体表现在：可显著提高雏鸡的生产性能，与对照组相比，试验组可显著提高雏鸡日增重(P<0.05)，显著降低雏鸡料肉比(P<0.05)。

附图说明

图1是实施例1植物乳杆菌HEW-A490在MRS培养基上的菌落形态图；

图2是实施例1植物乳杆菌HEW-A490菌株革兰氏染色图。

具体实施方式

下面结合实施例解释本发明，实施案例仅用于说明本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

实施例1植物乳杆菌HEW-A490的分离筛选、鉴定及保藏

1、植物乳杆菌的分离纯化

无菌取健康鸡肠道内容物于100mL MRS液体培养基中进行富集培养，吸取0.5mL富集培养液于4.5mL灭菌生理盐水中，依次进行10倍梯度稀释，选择合适的稀释度取0.1mL稀释液于MRS+碳酸钙的培养基平板上，涂布均匀，37℃倒置培养24-48h，挑取产生溶钙圈的不同形态的菌落进行划线接种纯培养，于4℃保藏备用。

2、菌落形态的观察

菌落在MRS平板上呈乳白色，圆形，边缘整齐，表明湿润光滑，容易挑起。

3、优良植物乳杆菌的筛选

镜检选取革兰氏阳性杆菌，且不产芽孢的植物乳杆菌共58株，分别编号，按下述方法进行筛选。

以下仅对菌株HEW-A490的性能进行描述，其余植物乳杆菌性能均不如菌株HEW-A490。

1)菌株HEW-A490发酵液制备

将菌株HEW-A490在MRS斜面上划线，37℃培养20h，将斜面加入2mL灭菌生理盐水制成菌悬液，将菌悬液转接于300mL种子培养基中进行摇瓶发酵培养，37℃、180r/min震荡15h，制成HEW-A490发酵液。检测发酵液活菌数为5.4×10⁹CFU/mL，发酵液于4℃保存在冰箱内备用。

其中，种子培养基由下述组分组成：葡萄糖0.5％，蔗糖1.2％，酵母膏0.8％，胰蛋白胨1.0％，磷酸氢二钾0.05％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.25％，碳酸钙0.17％，余量为水，pH6.8±0.2。摇瓶发酵的条件为：发酵温度37℃，转速为180r/m，发酵时间15h。

二级发酵培养以50L发酵罐培养为例，50L发酵罐中试培养基为蔗糖1.5％，玉米淀粉2.0％，玉米浆干粉1.2％，酵母提取物1.4％，磷酸氢二钾0.08％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.2％，碳酸钙0.15％，硫酸锰0.03％，余量为水，pH6.8±0.2。

50L发酵罐中试发酵条件为：装液量为30L培养基，接种量为300mL，发酵温度为37℃，搅拌转速120r/min，发酵时间10h。

三级发酵培养以5T发酵罐培养为例，5T发酵罐培养基与二级发酵培养基相同。5T发酵罐发酵条件为：装液量为3.5T培养基，接种量为30L，发酵温度为37℃，搅拌转速110r/min，发酵时间20h。活菌数可达2.5×10¹⁰CFU/mL。

2)耐酸性能测定

取制备的HEW-A490发酵液10mL于90mL标准人工胃液中，分别处理1h、2h和3h后，检测活菌数，分别与处理前菌株活菌数对比，在处理前植物乳杆菌HEW-A490发酵液活菌数为5.4×10⁹CFU/mL，处理1h后，活菌数为5.2×10⁹CFU/mL；处理2h后，活菌数为5.0×10⁹CFU/mL；处理3h后，活菌数为4.9×10⁹CFU/mL。在pH1.5的标准人工胃液处理3h后，菌株HEW-A490的存活率达90.74％，表明该菌株有很高的耐酸性，可以耐受胃酸，顺利到达肠道发挥其作用。

3)耐胆盐性能测定

将MRS液体培养基中加入猪胆盐使其浓度分别为0.1％、0.2％和0.3％，制成MRS-胆盐培养基，灭菌后备用，取10mL HEW-A490发酵液于MRS-胆盐培养基中，分别处理1h、2h和3h后，检测活菌数，分别与处理前活菌数对比，计算存活率，判断菌株的耐胆盐能力。结果如表2所示，菌株HEW-A490在3％胆盐-MRS培养基中处理3h存活率达97.69％，表明该菌株有较高的耐胆盐性能，可以在肠道高胆盐环境下存活，从而发挥作用。

表2菌株HEW-A490在不同浓度胆盐-MRS培养基中的存活率

4)耐高温性能测定

取10mL菌株HEW-A490发酵液于试管中，85℃水浴锅中加热15min，检测加热后的菌株HEW-A490发酵液活菌数，与处理前对比，计算存活率。结果表明菌株HEW-A490的存活率达90％，表明该菌株的可以耐受高温，从而可以耐受饲料加工的高温，保持活性。

5)抑菌性能测定

将肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌及大肠杆菌作为抑菌指示菌，分别制备菌悬液，使其浓度为10⁹CFU/mL，涂布在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，然后灭菌后的牛津杯放置在含有指示菌的平板上，分别向每个牛津杯中加入0.2mL浓度为10⁹CFU/mL菌株HEW-A490发酵液。勿使其外溢，37℃培养24-48h，然后测量抑菌圈直径。结果如见表3，可知菌株HEW-A490对肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌及大肠杆菌这六株病原菌有较强抑制作用，其抑菌性能强。

表3菌株HEW-A490对病原菌的抑菌效果

6)粘附性能检测

将活化好的菌株HEW-A490用PBS溶液清洗2-3次，制备成10⁸CFU/mL的菌悬液，将培养好的HT-29细胞消化，使用美国Gibco公司生产的RPMI-1640细胞培养液制成细胞培养液(5×10⁴个/mL)，向预先已放置盖玻片的六孔板每孔内加入2mL细胞悬液，37℃，CO₂培养箱中培养。细胞帖壁后，无菌PBS冲洗2次，每孔加入1mL HEW-A490菌液(含菌体1×10⁸个/mL)与1mL1640细胞培养液的混合液，37℃，CO₂培养箱中培养2h。无菌PBS冲洗，10％甲醛固定0.5h，革兰氏染色，镜检，随机挑选20个视野，计算50个细胞上粘附的细菌数。结果表明该菌株在肠上皮细胞株HT-29细胞的粘附个数达27个，说明该菌株的粘附能力较强。益生菌可以通过与肠上皮细胞受体粘附，占位定植并阻止病原菌与细胞受体粘附，抑制病原菌，调节肠道菌群平衡。

综合考虑各植物乳杆菌的耐酸能力、耐胆盐能力、耐高温能力、抑菌活性及粘附性能，最终获得一株菌HEW-A490，其耐酸能力、耐胆盐能力、耐高温能力及粘附性能强，对鸡常见致病菌——肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、空肠弯曲杆菌及大肠杆菌的抑菌效果好。

4、菌株属的鉴定

菌株HEW-A490具有以下微生物学特征：在MRS培养基生菌落呈乳白色、圆形且边缘规则、湿润且光滑，易挑起，菌落直径为2～3mm，菌落形态见图1；显微形态见图2；其菌体呈短杆状，无鞭毛，无芽孢，革兰氏阳性；植物乳杆菌HEW-A490兼性厌氧菌，生长适宜温度范围：4℃-65℃，最适生长温度：25℃-45℃；生长适宜pH2.5-10，最适pH值为5-8。

对菌株HEW-A490分别进行染色、镜检，选取无芽孢的革兰式阳性杆菌进行生理生化试验(接触酶、明胶液化、硝酸盐还原及糖醇类发酵等)，参照《常见细菌系统鉴定手册》、《乳酸菌细菌分类鉴定及实验方法》鉴定菌株的种属。结果显示菌株HEW-A490为植物乳杆菌。该菌的部分生理生化特性见表1。

5、16S rDNA序列测定

采用改良CTAB法提取菌株HEW-A490的基因组DNA。利用通用引物对菌株HEW-A490的16S rDNA基因片段进行PCR扩增，PCR扩增体系(25μL)包括引物F和R各1.0μL，Taq DNA聚合酶1.5U，10×Taq酶缓冲液2.5μL，Mg²⁺(25mmoL/L)1.5μL，菌株基因组DNA 50ng。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性40s，53℃退火1min，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃温浴10min。反应结束后取3μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。所得PCR产物回收纯化，送生物工程(上海)有限公司进行DNA序列的测定。将所测得的序列与GenBank中的16SrDNA序列进行Blast分析比对，结果菌株HEW-A490与乳杆菌的同源性达到99.96％。通过菌株HEW-A490的形态特征、生理生化特征、16S rDNA特征，确定菌株HEW-A490为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。

菌株HEW-A490的16S rDNA序列如序列表所示。

将以上获得的植物乳杆菌HEW-A490于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.12554。

实施例2植物乳杆菌HEW-A490微生态制剂的制备

将植物乳杆菌HEW-A490(保藏编号为CGMCC No.12554)按实施例1步骤3方法制备HEW-A490发酵液，将该发酵液于10000r/m离心30min得植物乳杆菌HEW-A490活性菌泥，将该植物乳杆菌HEW-A490活性菌泥和保护剂按1:0.8的重量比例混合均匀，加水调节使菌浓度为10¹¹CFU/g，制成微囊湿粉，然后与包被剂溶液混合均匀，投入喷雾制粒干燥机中，进行干燥制粒，获得植物乳杆菌HEW-A490微生态制剂，有效活菌数达1×10¹¹CFU/g。

所述保护剂为8.5％海藻糖、2.4％菊糖、11％脱脂奶粉、14％糊化变性淀粉、2.5％脱盐乳清粉、3％麦芽糊精、1％白蛋白、2.2％维生素E、5％微晶纤维素、4.5％甘油、余量为水。

所述包被剂溶液为：9％海藻酸钠、6.5％羟甲基纤维素、3.6％黄原胶、2％卡拉胶、8.5％壳聚糖、4％甘露聚糖、8％低聚果糖、余量为水。

实施例3植物乳杆菌HEW-A490微生态制剂发酵饲料应用研究

取20kg普通豆粕，调节湿度60％，灭菌后，添加实施例2制备的植物乳杆菌HEW-A490微生态制剂0.2g，用灭菌生理盐水活化15-30min，接种到豆粕中，混合搅拌均匀，装桶密封，37℃发酵3d，烘干并粉碎，过筛(80目)，检测豆粕发酵前后的抗营养因子含量。结果见表4所示。添加植物乳杆菌HEW-A490可显著降低豆粕中的蔗糖、水苏糖、棉籽糖、单宁、大豆球蛋白和胰蛋白酶抑制因子等抗营养因子的含量，提高了豆粕的营养价值，改善了风味，有利于动物对发酵豆粕的饲用。

表4豆粕发酵前后的抗营养因子含量

注：同列数字上标字母相同者或无标记者，差异不显著(P＞0.05)，相异者差异显著(P<0.05)。

实施例4植物乳杆菌HEW-A490微生态制剂在牧草青贮中的应用

试验组：取牧草20kg，添加实施例2制备的植物乳杆菌HEW-A490微生态制剂0.2g，用灭菌生理盐水活化15-30min，均匀喷洒在牧草上，混匀后装入青贮桶内并密封，室温保存。对照组：20kg牧草，喷洒同样体积的不含植物乳杆菌的灭菌生理盐水，混匀后同样装入青贮桶内并密封，室温保存。每组至少做三个重复，密封60天后开封，检测发酵产物的pH、有机酸组分、微生物含量等，结果如表5所示，可知，与对照组相比，植物乳杆菌HEW-A490可明显降低牧草青贮的pH值，乙酸和乳酸的含量明显增多，乳酸菌含量也明显提高，而丁酸、大肠杆菌、霉菌和酵母菌含量则低于检测限，充分提高了牧草青贮的发酵品质。

表5牧草青贮的pH、有机酸(g/kg)及微生物含量(log cfu/g)

实施例5植物乳杆菌HEW-A490微生态制剂在雏鸡饲养中的应用

选用1日龄体重在35±1gAA肉鸡200只，随机分为两组，每组10个重复，每个重复10只雏鸡，试验组饲喂添加实施例2制备的植物乳杆菌HEW-A490微生态制剂的自来水(1g该制剂加入10L自来水)，对照组饲喂不添加植物乳杆菌HEW-A490制剂的自来水，试验30d，分别在试验第1、15、31天早上称量鸡的空腹重(禁食12h)，并记录采食量，计算鸡的平均日增重、平均日采食量、饲料转化率等，结果如表6所示。结果显示，在育雏期1～30d，在雏鸡日常饮水中添加植物乳杆菌HEW-A490制剂可显著提高雏鸡日增重(P<0.05)，显著降低料重比(P<0.05)，表明植物乳杆菌HEW-A490制剂可提高雏鸡的生产性能，促进鸡饲料的吸收。

表6植物乳杆菌HEW-A490制剂对雏鸡生产性能的影响

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京好实沃生物技术有限公司

<120> 一株植物乳杆菌HEW-A490及其应用

<130> KHP161116617.4

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1428

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）

<400> 1

ggttcctaaa aggttacccc accgactttg ggtgttacaa actctcatgg tgtgacgggc 60

ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga 120

ttccgacttc atgtaggcga gttgcagcct acaatccgaa ctgagaatgg ctttaagaga 180

ttagcttact ctcgcgagtt cgcaactcgt tgtaccatcc attgtagcac gtgtgtagcc 240

caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg 300

cagtctcacc agagtgccca acttaatgct ggcaactgat aataagggtt gcgctcgttg 360

cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtatcc 420

atgtccccga agggaacgtc taatctctta gatttgcata gtatgtcaag acctggtaag 480

gttcttcgcg tagcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa 540

ttcctttgag tttcagcctt gcggccgtac tccccaggcg gaatgcttaa tgcgttagct 600

gcagcactga agggcggaaa ccctccaaca cttagcattc atcgtttacg gtatggacta 660

ccagggtatc taatcctgtt tgctacccat actttcgagc ctcagcgtca gttacagacc 720

agacagccgc cttcgccact ggtgttcttc catatatcta cgcatttcac cgctacacat 780

ggagttccac tgtcctcttc tgcactcaag tttcccagtt tccgatgcac ttcttcggtt 840

gagccgaagg ctttcacatc agacttaaaa aaccgcctgc gctcgcttta cgcccaataa 900

atccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtgg 960

ctttctggtt aaataccgtc aatacctgaa cagttactct cagatatgtt cttctttaac 1020

aacagagttt tacgagccga aacccttctt cactcacgcg gcgttgctcc atcagacttt 1080

cgtccattgt ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtttgggcc gtgtctcagt 1140

cccaatgtgg ccgattaccc tctcaggtcg gctacgtatc attgccatgg tgagccgtta 1200

ccccaccatc tagctaatac gccgcgggac catccaaaag tgatagccaa agccatcttt 1260

caagctcgga ccatgcggtc caagttgtta tgcggtatta gcatctgttt ccaggtgtta 1320

tcccccgctt ctgggcaggt ttcccacgtg ttactcacca gttcgccact cactcaaatg 1380

taaatcatga tgcaagcacc aatcaatacc agagttcgtt cgacttgc 1428

Claims

1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HEW-A490，其保藏编号为CGMCC NO.12554。

2.权利要求1所述的植物乳杆菌HEW-A490的培养方法，其特征在于，种子培养基由下述组分组成：葡萄糖0.5-2％，蔗糖0.5-2.5％，酵母膏0.5-2％，胰蛋白胨0.5-1.5％，磷酸氢二钾0.02-0.10％，硫酸镁0.01-0.15％，氯化钠0.1-0.5％，碳酸钙0.1-0.5％，余量为水，pH6.8±0.2。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述种子培养基由下述组分组成：葡萄糖0.5％，蔗糖1.2％，酵母膏0.8％，胰蛋白胨1.0％，磷酸氢二钾0.05％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.25％，碳酸钙0.17％，余量为水，pH6.8±0.2。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，摇瓶发酵的条件为：发酵温度30-45℃，转速为150-220r/m，发酵时间5-20h。

5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，摇瓶发酵的条件为：发酵温度37℃，转速为180r/m，发酵时间15h。

6.根据权利要求2-5任一项所述的培养方法，其特征在于，发酵培养基由下述组分组成：蔗糖1-4％，玉米淀粉0.5-2.0％，玉米浆干粉1-3％，酵母提取物0.5-3％，磷酸氢二钾0.01-0.15％，硫酸镁0.01-0.2％，氯化钠0.1-0.5％，碳酸钙0.05-0.4％，硫酸锰0.01-0.05，余量为水，pH6.8±0.2；和/或，

发酵条件包括：发酵温度为30-45℃，发酵时间5-20h，搅拌转速100-220r/min。

7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，发酵培养基由下述组分组成：蔗糖1.5％，玉米淀粉2.0％，玉米浆干粉1.2％，酵母提取物1.4％，磷酸氢二钾0.08％，硫酸镁0.05％，氯化钠0.2％，碳酸钙0.15％，硫酸锰0.03％，余量为水，pH6.8±0.2；和/或，

发酵温度为37℃，搅拌转速120r/min，发酵时间10h。

8.由权利要求1所述的植物乳杆菌HEW-A490制备的微生态制剂。

9.权利要求8所述微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)将发酵液经离心获得菌泥，将菌泥和保护剂按比例混合均匀，加适量水制成微囊湿粉，然后与包被剂溶液混合均匀，进行干燥制粒，即得。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述保护剂的原料包括：海藻糖、菊糖、脱脂奶粉、糊化变性淀粉、脱盐乳清粉、麦芽糊精、白蛋白、维生素E、微晶纤维素、甘油。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述保护剂包括以下重量百分比的原料：1-10％海藻糖、1-5％菊糖、2-15％脱脂奶粉、10-20％糊化变性淀粉、2-6％脱盐乳清粉、1-6％麦芽糊精、1-3％白蛋白、2-5％维生素E、2-10％微晶纤维素、1-5％甘油、余量为水。

12.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述保护剂包括以下重量百分比的原料：8.5％海藻糖、2.4％菊糖、11％脱脂奶粉、14％糊化变性淀粉、2.5％脱盐乳清粉、3％麦芽糊精、1％白蛋白、2.2％维生素E、5％微晶纤维素、4.5％甘油、余量为水。

13.根据权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述菌泥和保护剂的重量比例为0.5-1.2：0.8-2；和/或，所述菌泥中有效活菌数为5.0×10¹¹-1.0×10¹²CFU/g。

14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述菌泥和保护剂的重量比例为1:0.8；和/或，所述菌泥中有效活菌数为8.0×10¹¹CFU/g。

15.权利要求1所述植物乳杆菌HEW-A490或权利要求8所述微生态制剂在制备动物饲料中的应用。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述应用包括用于发酵豆粕，或用于牧草青贮，或用于非治疗目的的抑制细菌、调节动物肠道微生物平衡、促进动物对营养的吸收、提高饲料转化率、提高动物生产性能。

17.含有权利要求1所述植物乳杆菌HEW-A490或权利要求8所述微生态制剂或权利要求9-14任一项所述方法制备的微生态制剂的动物饲料。