CN109022331A - 一种复合微生态制剂及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种复合微生态制剂及其制备和应用。本发明复合微生态制剂制备方法包括：植物乳杆菌植物亚种Zhang‑LL和副干酪乳杆菌KL1发酵培养所得发酵液分别进行离心后，得到菌泥；两种菌泥分别与冻干保护剂混合后，进行冻干处理，复配得到复合微生态制剂。本发明复合微生态制剂体外抑制沙门氏菌作用强，对鸡白痢沙门氏菌病具有优异的预防作用，能够抑制肠道沙门氏菌的生长，维持雏鸡肠内微生态平衡，对于染菌雏鸡的病变组织具有良好的修复作用；能够改善感染鸡白痢沙门氏菌雏鸡的生长性能，提高雏鸡的免疫力，提高机体抗应激能力和抗氧化能力，为预防鸡沙门氏菌病的发生提供一种有效方法，也为新型生物饲料添加剂的开发提供了思路。

Description

一种复合微生态制剂及其制备和应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵制品领域，具体而言，涉及一种复合微生态制剂及其制备和应用。
背景技术
沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科的一类革兰氏阴性肠道杆菌，无荚膜、芽孢，具有周身鞭毛，能吸附于宿主细胞表面，主要寄居于人和其它温血动物的肠道中。沙门氏菌不仅能引起家禽发病死亡造成严重的经济损失，而且被沙门氏菌污染的家禽产品会严重危害人类健康。
家禽业已成为许多国家的重要经济来源。商业化养殖使得家禽易受环境应激影响发病，且导致生长环境恶化，导致严重的经济损失。自20世纪40年代末以来，抗生素被大量投入工业化生产，它对于预防甚至治疗人和畜禽由病原菌引起的多种疾病有极显著的效果。然而抗生素所带来的副作用逐渐被揭示：抗生素在抑制致病菌的同时，对机体肠道内的正常生理菌群亦被抑制，因此造成肠道内菌群失衡，严重时引起内源感染；抗生素的长期使用甚至滥用导致了细菌耐药性，使得其抗病效果越来越差，而这又导致更大剂量的使用，从而产生更强的耐药性，如此造成恶性循环；长期使用抗生素导致了机体细胞免疫及体液免疫能力降低，甚至出现了动物发病或死亡的情况；畜禽产品的连锁影响又导致人类生存环境恶化。
复合微生态制剂是指运用微生态学原理，由对宿主有益的益生菌，经发酵培养、冷冻干燥等一些工艺制成的活菌制剂，是随着益生菌的发展而发展起来的。复合微生态制剂可由两菌株组成，或者也可以含有多种菌株。复合微生态制剂中所含有的益生菌能够定植于肠道，通过竞争性排斥和拮抗作用维持正常的肠道微生物群落；同时，也能够通过增加消化酶活性并降低有害细菌酶活性和氨的产生来改变代谢作用；进一步的也能起到改善采食和消化，以及刺激免疫系统等功效，进而实现提高家禽生长性能，改善肠道微生态和肠道完整形态，增强机体免疫力，改善肉品质等作用。
然而，目前对于家禽中鸡白痢沙门氏菌病的普遍发生，尚无有效的防治性措施，而抗生素的滥用更是导致了难以解决的耐药性和环境问题，开发安全、绿色、稳定、有效的新型生物饲料添加剂来替代抗生素刻不容缓。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种复合微生态制剂，所述的复合微生态制剂具有良好的预防和抗菌作用。
本发明的第二目的在于提供一种所述的复合微生态制剂的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种所述的复合微生态制剂的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种复合微生态制剂的制备方法，包括：将植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL和副干酪乳杆菌KL1发酵培养所得发酵液分别进行离心后得到对应的菌泥；将两种菌泥与冻干保护剂混合后进行冻干处理，将所得冻干菌粉混合得到复合微生态制剂；其中，植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL冻干菌粉活菌数为(1～2)×1010CFU/mL；副干酪乳杆菌KL1冻干菌粉活菌数为(1～2)×1010CFU/mL；植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL与副干酪乳杆菌KL1冻干菌粉复配的质量比为1:2～2:1；优选的，植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL与副干酪乳杆菌KL1冻干菌粉复配的质量比为1:1。
同时，本发明还提供了由本发明制备方法所得到的复合微生态制剂。
同样的，本发明也提供了本发明复合微生态制剂在抗菌剂中的应用；优选的，所述抗菌剂为鸡白痢沙门氏菌抗菌剂。
进一步的，本发明还提供了本发明复合微生态制剂在改善家禽生长性能中的应用；优选的，所述家禽为雏鸡。
同时，本发明也提供了本发明复合微生态制剂作为饲料添加剂的应用。
同样的，本发明还进一步提供了包含本发明复合微生态制剂的饲料。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明复合微生态制剂主要由益生菌发酵得到，绿色、安全、环保、稳定，且不会产生残留；
同时，本发明复合微生态制剂不仅具有优良的沙门氏菌体外抑菌性能，而且对于鸡白痢沙门氏菌病具有优异的预防效果，能够抑制肠道沙门氏菌的生长，维持雏鸡肠内微生态平衡，并对于染菌雏鸡的病变组织具有良好的修复作用；同时能够改善感染鸡白痢沙门氏菌雏鸡的生长性能，提高雏鸡的免疫力，提高机体抗应激能力和抗氧化能力。
本发明复合微生态制剂为预防鸡沙门氏菌病的发生提供一种有效方法，同时也为新型生物饲料添加剂的开发提供思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实验例1中体外抑菌实验结果图。
图2为雏鸡不同处理组回肠病理变化(HE染色，×40)。
图3为雏鸡不同处理组盲肠病理变化(HE染色，×40)。
图4为雏鸡不同处理组肝脏病理变化(HE染色，×40)。
其中，图2-4中，A-空白对照组；B-沙门氏菌感染对照组；C-微生态制剂治疗组；D-微生态制剂预防组
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明所提供的复合微生态制剂，是一种以植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)Zhang-LL(现有菌种，可参见CN104726360A，保藏号：CGMCCNo.6936)和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1(现有菌种，可参见CN106635886A，保藏号：CGMCC：No.11533)的发酵培养物为主要功能性物质的菌剂产品，能够实现对于包括鸡白痢沙门氏菌在内等家禽病原菌感染的预防作用，从而解决现有抗生素使用所存在的种种问题。
具体的，本发明复合微生态制剂，主要由如下方法制备得到：
(1)菌种活化及扩大培养
分别将以低温保存的Zhang-LL和KL1菌株以2％接种于5mL改良MRS培养基中，在37℃条件下培养12h，传代培养两次得到活化菌种；
然后，将活化菌种分别以2％接种于50mL改良MRS培养基中，37℃培养12h，得到扩大培养液。
此步骤中，所用改良MRS培养基由：胰蛋白胨6.25g，水解酪蛋白胨6.25g，牛肉膏10g，酵母干粉5g，柠檬酸氢二铵2g，磷酸氢二钾1.53g，乙酸钠5g，七水合硫酸镁0.58g，硫酸锰0.19g，葡萄糖20g，以及吐温-801mL，加入1000mL蒸馏水中混合后，调节pH至6.5得到。
(2)菌种发酵
将步骤(1)所得扩大培养液按2％～3％接种量，分别接种到1000mL灭菌改良MRS培养基中，37℃培养14～16h，得到发酵菌液。
此步骤中，所用改良MRS培养基与步骤(1)中相同。
(3)菌体收集
发酵结束后，将步骤(2)所得发酵菌液分别于4℃条件下，8000r/min离心20min，无菌条件下弃去上清液，收集菌泥。
将收集得到的Zhang-LL和KL1菌泥，分别加入发酵液原体积1/10的冻干保护剂，混合均匀后，分别得到Zhang-LL菌泥与冻干保护剂的混合物，以及KL1菌泥与冻干保护剂的混合物；
此步骤中，所用冻干保护剂由脱脂乳粉与麦芽糊精混合后高温灭菌(115℃，20min)得到；其中，脱脂乳粉的质量占比为14.5％(m/v)，麦芽糊精的质量占比为5.5％(m/v)。
(4)预冻和冻干
将步骤(3)所得混合物分别于-80℃冰箱中预冻2～4h，得到预冻活菌制剂；
然后，在真空冷冻干燥机中，将预冻活菌制剂分别在冻干温度-50℃、真空度0.20mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态；
分别收集冻干菌粉(Zhang-LL冻干菌粉的活菌数为1.76×1010CFU/mL，KL1冻干菌粉的活菌数为1.31×1010CFU/mL)，按1:1质量比复配得到复合微生态制剂，于-80℃冰箱中储存备用。
由如上方法所得到的复合微生态制剂，对于鸡白痢沙门氏菌病具有优异的预防作用；同时还能够促进雏鸡生长发育，提高生长性能和抗病能力，因而能够取代传统的抗生素而用于饲料中。
实施例1
(1)分别将-80℃甘油管保存的植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL和副干酪乳杆菌KL1以2％接种于5mL改良MRS培养基中，在37℃条件下培养12h，传代培养两次得到活化菌种；
然后，将活化菌种分别以2％接种于50mL改良MRS培养基中，37℃培养12h，得到扩大培养液。
(2)扩大培养液按2％～3％％接种量，分别接种到1000mL灭菌改良MRS培养基中，37℃培养14～16h，得到发酵菌液。
(3)将所得发酵菌液分别于4℃条件下，8000r/min离心20min，无菌条件下弃去上清液，收集菌泥；
向所收集的Zhang-LL和KL1菌泥中，分别加入发酵液原体积1/10的冻干保护剂，混合均匀后，得到Zhang-LL菌泥与冻干保护剂的混合物，以及KL1菌泥与冻干保护剂的混合物。
此步骤中，所用冻干保护剂由脱脂乳粉与麦芽糊精混合后高温灭菌(115℃，20min)得到；其中，脱脂乳粉的质量占比为14.5％(m/v)，麦芽糊精的质量占比为5.5％(m/v)。
(4)将混合物分别于-80℃冰箱中预冻2～4h，得到预冻活菌制剂；
然后，在真空冷冻干燥机中，将预冻活菌制剂分别在冻干温度-50℃、真空度0.20mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态；
分别收集Zhang-LL和KL1菌株冻干菌粉，按1:1质量比复配得到复合微生态制剂，于-80℃冰箱中储存备用。
以改良MRS琼脂培养基(改良MRS培养基添加1.7％琼脂粉)倾注平板法测定Zhang-LL和KL1菌株冻干菌粉的活菌数量。具体操作如下：
(1)取1g菌粉于9mL灭菌生理盐水中，漩涡振荡1分钟；
(2)移液枪吸取1mL上述稀释液于9mL灭菌生理盐水中，漩涡振荡30s；
(3)重复上述操作，连续稀释，直到得到10-10稀释度的菌液；
(4)倾注法培养计数10-8、10-9、10-10三个稀释度，每个稀释度三个重复；
(5)37℃培养48h后，平板计数，计算Zhang-LL和KL1菌株各自的平均冻干菌粉的活菌数，结果如下表所示：
菌株名称 活菌数/CFU·mL-1
Lactobacillus plantarum subsp.plantarum Zhang-LL 1.76×1010
Lactobacillus paracasei KL1 1.31×1010
实验例1
一、体外抑菌实验
分别以实施例1的Zhang-LL冻干菌粉，KL1冻干菌粉以及复合微生态制剂为实验材料，进行体外抑菌实验，具体如下：
将Zhang-LL冻干菌粉、KL1冻干菌粉，以及复合微生态制剂(Zhang-LL冻干菌粉与KL1冻干菌粉质量比为1:1)分别按照2‰的质量体积比加入100mL改良MRS培养基中，溶解混匀后于37℃培养24h，得到Zhang-LL菌株、KL1菌株发酵液，以及Zhang-LL菌株和KL1菌株混合发酵液。将上述各菌株发酵液为待测溶液，进行如下实验：
将牛津杯垂直轻放在鸡白痢沙门氏菌(CVCC523)细胞浓度为107CFU/mL的平板上，取100μL待测溶液加入牛津杯中，4℃低温扩散3～4h后，在37℃温箱中培养12h，观察抑菌圈，并用游标卡尺精确测量抑菌圈的大小。
结果显示，Zhang-LL冻干菌粉组的抑菌圈为17.93±0.99mm，KL1冻干菌粉组的抑菌圈为16.69±0.49mm，复合微生态制剂组的抑菌圈为16.97±0.62mm。
由此可见，本发明复合微生态制剂以及其原料Zhang-LL冻干菌粉剂和KL1冻干菌粉剂均具有良好的鸡白痢沙门氏菌CVCC523体外抗菌性能，且三者的抑菌作用无显著性差异(P＞0.05)。
体外抑菌实验结果如图1所示，图1中，标号1为Zhang-LL冻干菌粉组抑菌圈，标号2为KL1冻干菌粉组抑菌圈，标号3为复合微生态制剂组抑菌圈。
二、动物试验
(一)试验设计
选取体质量差异不显著、健康的1日龄的农大3号矮小鸡雏公鸡80只，随机分成4组，每组20只(5个重复，每重复4只)。A为空白对照组；B为感染对照组；C为复合微生态制剂治疗组(实施例1复合微生态制剂)；D为复合微生态制剂预防组(实施例1复合微生态制剂)。分别饲养于隔离仓中，雏鸡自由采食和饮水，各组雏公鸡出壳后分别插翅号。
A：空白对照组口服无菌生理盐水。
B-C：1日龄雏鸡口服鸡白痢沙门氏菌培养液0.2mL，观察雏鸡发病情况，对发病鸡只屠宰采样，制作组织切片，进行组织病理学观察；
试验4d，C组口服复合微生态制剂溶液0.2mL/只，连续饲喂7d；
其中，复合微生态制剂溶液由复合微生态制剂冻干菌粉经无菌生理盐水10倍稀释得到。
试验11d，雏鸡心脏采血，并屠宰取样，进行生长性能、组织病理学观察和血常规指标和血清指标测定。
D：1日龄雏鸡口服复合微生态制剂溶液0.2mL/只，试验4d进行攻毒试验，口服鸡白痢沙门氏菌培养液0.2mL，同时继续饲喂复合微生态制剂溶液7d。
试验11d，雏鸡心脏采血，并屠宰取样，进行生长性能、组织病理学观察和血常规指标和血清指标测定。
具体试验方式参见如下表格(动物实验结果部分中A-D组代表组别均与下表中释义相同)：
试验期间，各组雏鸡基础饲粮配制参考NRC(1994)标准，其组成如表所示。
1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the fol lowing per kg ofdiets：VA 9500IU，VB1 1.5mg，VB2 9.0mg，VB6 3.0mg，VB12 0.02mg，VD3 2375IU，VE 19IU，VK3 1.40mg，生物素biotin 0.95mg，叶酸folic acid 0.93mg，D-泛酸钙D-pantothenicacid 9.3mg，Cu(as copper sulfate)15mg，Fe(as ferrous sulfate)60mg，Mn(asmanganese sulfate)100mg，Zn(as zinc sulfate)70mg，I(as potassium iodide)0.50mg，Se(as sodium selenite)0.59mg。
2)营养水平均为计算值。Nutrient levels were calculated values.
(二)试验检测指标与方法
(1)生长性能检测
(i)雏鸡体质量变化及死亡率
试验每日早晨7：00分别对每组雏鸡空腹称体质量。试验期间认真观察鸡群生长状况，记录发病情况，有无糊肛等病理特征。
其中，死亡率(％)＝各组死亡雏鸡数量/每组雏鸡数量×100％
(ii)器官指数
将雏鸡解剖后，分别对心脏、肝脏、肺脏、肾脏、肌胃、腺胃、小肠(包括十二指肠、空肠、回肠)、盲肠、脾脏和法氏囊分别称质量并记录，计算对应器官指数。
其中，器官指数(％)＝器官质量(g)/活体质量(g)×100％
(2)组织切片检测鸡肠道病变
试验11d，剖检取鸡的心脏、肝脏、脾脏和盲肠，观察并记录组织的肉眼变化，典型病变拍照，并将组织浸于4％中性福尔马林溶液中，浸泡一周。HE染色后观察病理组织学变化并摄影。
组织切片的制作：参照孟运莲主编的《现代组织学与细胞学技术》中的方法制作病理切片。具体操作如下：
1)修块：将固定于10％福尔马林溶液中的组织切取为大小基本一致，厚度约为0.5mm的组织块后，换新鲜10％福尔马林溶液再固定12h后，流水冲洗过夜；
2)脱水：将组织块浸入70％、85％、95％乙醇各2h，无水乙醇I、II、III各1h；
3)透明：将组织块浸入二甲苯I、II，分别透明10～30min，时间视透明效果而定；
4)浸蜡：透明后的组织块浸入软蜡，2h至过夜，再浸入硬蜡30min，硬蜡包埋；
5)粘块、切片：将包埋好的组织块稍做修整，粘于小木墩上进行切片(厚度为5μm)，展片，捞片，烤片；
6)HE染色：二甲苯脱蜡I、II、III各20min，无水乙醇复水I、II、III各l0min，95％、80％、70％乙醇各5min，蒸馏水冲洗lmin，苏木精染色l0min，自来水冲洗l0s，0.5％盐酸酒精分色5-10s，自来水冲洗，1％氨水促蓝色5-10s，自来水冲洗，入70％、80％、90％乙醇各5min，1％伊红染色l0min，95％乙醇5s，无水乙醇脱水I、II、III各l0min，二甲苯透明I、II、III各l0-20min，中性树胶封片；
7)组织切片的观察显微成像系统读片，进行病理组织学观察，典型病变拍照。
(3)肠道微生物主要菌群检测
1)试验11d，按每组重复随机选取1只鸡解剖(5只)，取盲肠内容物约1g，于预先称重的无菌试管中，立即将试管放入厌氧罐中，4℃冷藏；
2)取1g新鲜粪便，加入无菌生理盐水稀释液，充分拍打混匀后，梯度稀释(10-2～10-8)，分别接种选择性培养基进行培养；
4)大肠杆菌、乳酸杆菌和沙门氏菌分别接种于EMB琼脂平板、改良MRS琼脂平板和BS琼脂平板，于37℃培养18～24h；
5)待菌落长出后，以菌落形态鉴定，计算每克粪便中乳酸杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌的数量。
(4)血常规指标和血清指标检测
试验11d，各组雏鸡空腹心脏取血(采血前禁食12h，不禁水)1-2mL于含抗凝剂的采血管中，测定血液红细胞(Red blood cell，RBC)总数、血红蛋白(Hemoglobin，HGB)含量、白细胞(White blood cell，WBC)总数；另外，雏鸡心脏采血1-2mL于不含抗凝剂的离心管中，37℃倾斜放置2h，然后转移至4℃过夜，2000～3000r/min离心1～2min取上层血清，测定血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(Aspartateaminotransferase，AST)和肌酸激酶(Creatine kinase，CK)活力，相关指标委托中同蓝博检测临床检验所进行测定。
(5)盲肠黏膜IgA含量测定与感染前后盲肠细胞因子的表达
试验11d，按每重复组随机宰杀1只鸡，迅速取盲肠约1cm肠段于离心管中，置于液氮速冻，之后-80℃保存。用于测定细胞因子γ-干扰素(Interferon-γ，IFNγ)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNFα)、白细胞介素4(Interleukin-4，IL-4)和免疫球蛋白IgA。
(i)ELISA法测盲肠IgA：
(a)样品处理：
组织样本：准确称量0.1g组织样本，加入900μL PBS进行匀浆，3000r/min离心10min，取上清于新1.5mL EP管中待用。
(b)操作步骤
1)从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2)设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。
3)样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。
4)除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
6)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育10min。
7)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
(c)采用ELISA Calc软件进行数据分析。
(ii)Real Time PCR检测雏鸡盲肠细胞因子表达量的变化
(a)引物设计
具体如下表所示：
(b)提取样本总RNA
用超纯RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA。实验操作按产品说明书进行，步骤如下：
1)样本加入1mL RLT，以每1mLRLT加入200μL氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置2min；
2)12000r/min离心10min，样品分为三层：红色有机相，中间层和无色水相，将上层水相移到一个新离心管中，进行下一步操作；
3)加入1倍体积的70％乙醇(RNase-Free Water)，混匀。将得到的溶液转入SpinColumn RM中(Spin Column RM放入2mL RNase-free Collection Tube中)，若一次不能将全部溶液加入Spin Column RM中，分两次转入；12 000r/min离心20s，弃Collection Tube中废液；
4)向Spin Column RM中加入700μL Buffer RW，10000r/min离心15s，弃废液。将Spin Column RM放回2mL Collection Tube中；
5)向Spin Column RM中加入500μL Buffer RW，10000r/min离心15s，弃废液。将Spin Column RM放回2mL Collection Tube中；
6)重复步骤5；
7)将Spin Column RM放回Collection Tube中，12000r/min离心1min；
8)将Spin Column RM转入新的1.5mL RNase-free Collection Tube中，加30μLRNase-free Water，室温放置1min，12000r/min离心1min。(c)RNA电泳
取5μLRNA用1％琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性。
(d)反转录
以HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒进行反转录，实验操作按产品说明书进行，步骤如下：
1)将RNA模板、引物、5xRT Buffer和RNase-freeWater溶解并置于冰上备用；
2)加入Primer mix 2μL，消化后RNA10μL混匀；
3)65℃孵育5min，迅速冰浴2min，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底；
4)继续向以上反应管中加入以下试剂：
试剂 反应体系/μL
5xRT Buffer 4
0.1M DTT 2
10mM dNTP Each 1
HiFi-MMLV Enzyme Mix 1
5)轻轻吸打混匀，37℃孵育50min，70℃保温10min。反应结束后的cDNA放置-20℃保存。
(e)RealTime PCR
1)反应体系：用UltraSYBR Mixture(With ROX)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×45个循环。反应体系如下表所示：
试剂 反应体系/μL
2×UltraSYBR Mixture 10
上游引物(10μM) 0.4
下游引物(10μM) 0.4
模板 2
灭菌蒸馏水 7.2
2)引物筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行5倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，用目的基因引物进行扩增，具体如下表所示：
同时在60～95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
(f)样品Real Time PCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，具体如下表所示：
模板 样品cDNA 样品cDNA
重复检测孔道数 3 3
引物 目的基因引物 内参基因引物
同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
(g)仪器及分析方法
用Line Gene 9600Plus型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。
(6)数据统计分析
试验数据用IBM SPSS Statistics 22.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan氏多重比较检验。试验数据用平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
(三)动物实验结果。
(1)雏鸡体质量变化及死亡率
(i)雏鸡体质量变化
不同处理组雏鸡试验1d、4d、10d体质量变化如下表所示。
同行无字母或数据肩标相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，以下表格中均相同
由如上表格数据可知，在1d时，各组雏鸡在鸡白痢沙门氏菌攻毒前后体质量无显著差异；在4d时，复合微生态制剂预防组雏鸡体质量显著高于微生态制剂治疗组和感染对照组(P<0.05)，感染对照组雏鸡体质量显著低于空白对照组(P<0.05)；在10d时，复合微生态制剂预防组雏鸡体质量显著高于复合微生态制剂治疗组和感染对照组(P<0.05)，分别增加14.25％和29.24％，且复合微生态制剂预防组雏鸡体质量超出空白对照组12.39％(P>0.05)。
雏鸡10d的平均日增重中，复合微生态制剂预防组显著高于空白对照组、感染对照组和复合微生态制剂治疗组(P<0.05)。
综上所述，复合微生态制剂预防组能够显著提高染菌雏鸡的体质量，显示复合微生态制剂能够增强雏鸡对病原菌的抵抗能力,提高染菌雏鸡的生长性能。
(ii)雏鸡死亡率
不同处理组雏鸡试验1d、4d、10d死亡率变化如下表所示：
由如上表格数据可知，1-4d，空白对照组无雏鸡死亡，感染对照组出现雏鸡死亡，死亡率在40％左右，说明攻毒成功；4-10d，空白对照组无雏鸡死亡，复合微生态制剂治疗组死亡率较感染对照组稍低。攻毒前后，复合微生态制剂预防组无雏鸡死亡。
由此可见，本发明复合微生态制剂能够完全预防雏鸡的鸡白痢沙门氏菌病，但在雏鸡的鸡白痢沙门氏菌病治疗上的效果并不十分理想。
(2)器官指数
器官指数作为毒理实验中常用指标，常用来对比受试对象脏器与对照组相比发生的变化，从而衡量试验物对受试对象的作用情况。试验结果如下表所示：
A B C D
心脏 0.84±0.07 1.00±0.19 0.85±0.13 0.84±0.11
肝脏 3.14±0.20 3.97±1.39 3.86±0.70 3.15±0.47
肺脏 0.77±0.18 0.90±0.07 0.99±0.18 0.87±0.26
肾脏 0.32±0.08 0.38±0.13 0.38±0.09 0.34±0.14
腺胃 1.18±0.22 1.07±0.23 1.04±0.11 1.36±0.36
肌胃 7.41±0.51 7.30±0.57 6.92±0.84 7.35±1.06
小肠 6.29±0.89abc 5.13±0.18c 6.32±0.67abc 6.84±0.35ab
盲肠 3.82±0.37ab 3.38±0.40b 3.93±0.26ab 4.27±0.25a
脾脏 0.11±0.03 0.09±0.01 0.13±0.05 0.13±0.01
法氏囊 0.26±0.04ab 0.21±0.02bc 0.22±0.03b 0.30±0.02a
由如上表格数据可知，与感染对照组相比，试验组心脏指数均有所降低，且与空白对照组接近(P>0.05)；复合微生态制剂预防组小肠指数显著增加39.57％(P<0.05)，其余组均不同程度高于感染组(P>0.05)；复合微生态制剂预防组盲肠指数显著高于感染组26.33％(P<0.05)，且比空白对照组高。
由此可见，复合微生态制剂预防组能够有效促进小肠和盲肠生长发育，从而促进雏鸡消化吸收功能，进而增加雏鸡的体质量。
免疫器官的发育状况直接影响机体免疫应答的水平和抵抗外来微生物的感染和侵入的能力，其绝对质量和相对质量的增加，说明机体的细胞免疫和体液免疫机能增强。法氏囊是雏鸡重要的免疫器官之一，它可以分化生成大量的浆细胞和各种特异性的B细胞，参与体液免疫反应。
由如上表格数据进一步分析可知，与感染对照组相比，复合微生态制剂预防组法氏囊相对指数均显著增加(P<0.05)，空白对照组和复合微生态制剂治疗组均一定程度高于感染对照组(P>0.05)。
由此可见，显示本发明复合微生态制剂可以提高染菌雏鸡抗病能力。
(3)雏鸡的病理组织学变化
在11d时，各组雏鸡的回肠、盲肠和肝脏变化如图2、图3、图4所示：
(1)回肠：感染对照组雏鸡盲肠的肠绒毛变短，肠绒毛排列不规则，绒毛间隙有大量淋巴细胞浸润，盲肠黏膜下层结缔组织疏松，血管瘀血；复合微生态制剂治疗组回肠黏膜固有层可见大量淋巴细胞浸润；复合微生态制剂预防组和空白对照组未出现明显病变。
(2)盲肠：感染对照组雏鸡盲肠出现大量淋巴细胞浸润，较多的固有层肠道黏膜脱落；复合微生态制剂治疗组有大量淋巴细胞浸润；其余组未出现明显的病变。
(3)肝脏：感染对照组雏鸡肝脏局灶性坏死，胞浆内出现大小不一的空泡，坏死灶内肝细胞核崩解，且伴有大量炎性细胞浸润；复合微生态制剂治疗组有少量淋巴细胞浸润；复合微生态制剂预防组和空白对照组未出现明显病变。
综上所述，与感染对照组相比，试验组雏鸡表现出更轻微的组织病变，且复合微生态制剂预防组几乎无明显病变。由此可见，本发明复合微生态制剂对染菌雏鸡病变组织有较好的修复作用。
(4)肠道微生物主要菌群检测
沙门氏菌、乳酸杆菌、大肠杆菌菌落对数均值(log10CFU·g-1)计数结果如下表所示：
组别 沙门氏菌 乳酸杆菌 大肠杆菌
A 7.79±0.13bc 8.03±0.09d 8.39±0.03b
B 8.46±0.09a 6.79±0.01f 8.74±0.09a
C 7.56±0.18cd 8.32±0.01b 7.86±0.01d
D 5.23±0.05e 9.47±0.03a 7.53±0.08e
由如上表格数据可知，与感染对照组相比，复合微生态制剂预防组和治疗组及空白对照组沙门氏菌数量均显著降低(P<0.05)，分别降低38.18％、10.64％，7.92％；与空白组相比，复合微生态制剂预防组沙门氏菌数量显著减少了32.86％(P<0.05)。
由此可见，复合微生态制剂预防组能够显著抑制肠道沙门氏菌生长，复合微生态制剂预防组比感染对照组沙门氏菌的数量减少3个数量级。
同时，与感染对照组相比，复合微生态制剂预防组和治疗组及空白对照组乳酸杆菌数量显著增加(P<0.05)，分别增加39.47％、22.53％，18.26％；与空白对照组相比，复合微生态制剂预防组和治疗组乳酸杆菌数量显著增加(P<0.05)，分别增加了17.93％、3.61％。
由此可见，复合微生态制剂能够显著促进肠道乳酸杆菌生长，复合微生态制剂预防组比感染对照组增加3个数量级，且比空白对照组和复合微生态制剂治疗组乳酸杆菌数量增长1个数量级。
与感染对照组相比，复合微生态制剂预防组和治疗组及空白对照组大肠杆菌数量均显著减少(P<0.05)，分别减少13.84％、10.07％，4.01％；与空白对照组相比，复合微生态制剂预防组和治疗组、大肠杆菌数量均显著减少(P<0.05)，分别减少10.25％、6.32％。
由此可见，本发明复合微生态制剂能够抑制肠道大肠杆菌生长，复合微生态制剂预防组比感染对照组大肠杆菌数量减少1个数量级。
综上所述，复合微生态制剂能够增加雏鸡肠道乳酸杆菌定植，从而抑制沙门氏菌和大肠杆菌生长，建立有益菌的优势菌群，维持雏鸡肠道内的微生态平衡。
(5)血常规指标和血清指标变化
(i)血常规指标对比
各试验组雏鸡11天红细胞总数、白细胞总数和血红蛋白含量如下表所示：
由如上表格内容可知，与感染对照组相比，复合微生态制剂预防组和治疗组红细胞数量分别显著增加了71.08％和51.21％(P<0.05)；复合微生态制剂预防组血红蛋白含量显著升高了63.21％(P<0.05)；复合微生态制剂预防组白细胞数量显著降低了63.40％(P<0.05)；同时，空白对照组和复合微生态制剂治疗组白细胞数量均不同程度低于感染对照组。复合微生态制剂预防组白细胞数量低于空白对照组，但无显著性差异(P>0.05)。
由此可见，本发明复合微生态制剂能够显著增加红细胞数量、血红蛋白含量，并显著降低白细胞数量，说明该复合微生态制剂能够显著提高细胞载氧能力，并减少机体炎症，进而提高了机体免疫能力。
(ii)血清指标对比
雏鸡11d血清部分代谢酶活力对比数据如下表所示：
由如上表格数据可知，与感染对照组相比，复合微生态制剂预防组和治疗组ALT、AST、CK活力均显著降低(P<0.05)；空白对照组与感染对照组相比ALT、AST活力显著降低(P<0.05)，但与试验组均无显著性差异(P>0.05)。
由此可见，本发明复合微生态制剂对肝脏和心脏组织细胞具有良好的保护作用，能够维持脏器正常功能。
(6)盲肠黏膜IgA含量变化
鸡白痢沙门氏菌攻毒前后经复合微生态制剂干预，雏鸡盲肠黏膜IgA分泌水平对照检测结果如下表所示：
组别 IgA/pg·mL-1
A 1156.55±31.83c
B 1069.87±90.98d
C 1321.50±58.61b
D 1594.25±56.00a
由如上表格数据可知，与感染对照组相比，复合微生态制剂预防组和治疗组、空白对照组IgA分泌水平均显著提高(P<0.05)，且复合微生态制剂预防组盲肠黏膜IgA分泌量最高，达到1595pg/mL，比感染对照组提高了49.01％。与空白对照组相比，复合微生态制剂预防组IgA分泌水平显著提高(P<0.05)，且提高了37.85％。
由此可见，本发明复合微生态制剂能够显著增强染菌雏鸡肠道黏膜免疫力，提高机体抗病能力，从而降低染菌雏鸡的死亡率。
(7)盲肠中细胞因子的表达
不同试验组雏鸡盲肠中TNFα、IFNγ、IL-4表达水平对照检测结果如下：
由如上表格数据可知，与感染对照组相比，试验组和空白对照组TNFα表达水平均显著降低(P<0.05)，其中，复合微生态制剂预防组TNFα表达水平显著降低了37.82％；复合微生态制剂预防组和空白对照组IFNγ表达水平分别显著降低了51.03％和56.05％(P<0.05)；复合微生态制剂预防组IL-4表达水平显著增加了107.82％(P<0.05)。与空白对照组相比，复合微生态制剂预防组IL-4表达水平显著增加了88.83％(P<0.05)。
由此可见，本发明复合微生态制剂可以显著抑制染菌雏鸡炎症反应，提高机体免疫力。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种复合微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括：
将植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL和副干酪乳杆菌KL1发酵培养所得发酵液分别进行离心后，得到对应的菌泥；
将两种菌泥分别与冻干保护剂混合后进行冻干处理，将所得冻干菌粉按一定质量比复配，得到复合微生态制剂；
其中，植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL冻干菌粉活菌数为(1～2)×1010CFU/mL；副干酪乳杆菌KL1冻干菌粉活菌数为(1～2)×1010CFU/mL；
植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL与副干酪乳杆菌KL1冻干菌粉复配的质量比为1:2～2:1；
优选的，植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL与副干酪乳杆菌KL1冻干菌粉复配的质量比为1:1。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL菌株和副干酪乳杆菌KL1菌株进行活化以及扩大培养后，再进行发酵培养的步骤。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述离心包括：将发酵液在低温条件下离心后，在无菌条件下弃去上清液，然后收集菌泥。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂包含脱脂乳粉和麦芽糊精的混合物。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冻干包括预冻和真空冷冻。
6.由权利要求1-5中任一项所述的制备方法所得到的复合微生态制剂。
7.权利要求6所述的复合微生态制剂在抗菌剂中的应用；优选的，所述抗菌剂为鸡白痢沙门氏菌抗菌剂。
8.权利要求1所述的复合微生态制剂在有效预防感染鸡白痢沙门氏菌病，改善家禽生长性能中的应用；优选的，所述家禽为雏鸡。
9.权利要求1所述的复合微生态制剂作为饲料添加剂的应用。
10.包含权利要求1所述的复合微生态制剂的饲料。
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