CN114507619B - 一种液态复合益生菌制剂、其制备方法以及其在改善腹泻和保肝护肝方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及益生菌技术领域，具体公开一种液态复合益生菌制剂、其制备方法以及其在改善腹泻和保肝护肝方面的应用。所述复合益生菌制剂，由植物乳杆菌LP45、植物乳杆菌植物亚种Zhang‑LL和副干酪乳杆菌KL1进行混合发酵得到。本发明提供的复合益生菌制剂可以在短时间内有效提升家禽的产蛋率和产蛋品质，有效改善家禽的腹泻症状，并能实现保护家禽肝脏的作用。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌技术领域，尤其涉及一种液态复合益生菌制剂、其制备方法以及其在改善腹泻和保肝护肝方面的应用。
背景技术
在家禽养殖中长通过添加抗生素来提高家禽的生产和抗病能力，这种滥用大量抗生素的家禽养殖方法是病菌耐药性形成的重要原因。因此，目前健康养殖多确鼓励使用微生态制剂来改善家禽肠道菌群平衡以及增强其消化吸收能力、进而提高饲料的转化率和养殖的效率，进而推动畜禽养殖业的健康发展，减少抗菌药的大量使用。且益生菌因具有安全有效和成本低廉的优势已在畜禽养殖业中越来越受到重视。因此，研发能有效提升家禽的产蛋品质、产蛋量以及抗病能力的益生菌产品势在必行。
目前虽出现了部分用于家禽养殖的益生菌产品，用于调节家禽的肠道吸收、菌群平衡，以及提升产蛋率、产蛋品质和免疫力，但是其需要长期使用，且能实现的抗病能力有限，无法起到立竿见影的效果。
发明内容
针对现有用于家禽养殖的益生菌微生态制剂存在的上述问题，本发明提供一种液态复合益生菌制剂、其制备方法以及其在改善腹泻和保肝护肝方面的应用，上述益生菌制剂可以在短时间内有效提升家禽的产蛋率和产蛋品质，有效改善家禽的腹泻症状，并能实现保护家禽肝脏的作用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种复合益生菌制剂，由植物乳杆菌(actobacillus plantarum)LP45、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1进行混合发酵得到；
所述植物乳杆菌(actobacillus plantarum)LP45的保藏号为CGMCCNo.8072；所述植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL的保藏号为CGMCC No.6936；所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1的保藏号为CGMCCNo.11533。
所述植物乳杆菌(actobacillus plantarum)LP45在公开号为CN103642716A，发明名称为“一种植物乳杆菌及其应用”的专利申请文本中已公开。
所述植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL在公开号为CN104531562A，发明名称为“一种植物乳杆菌植物亚种及其抗单增李斯特菌细菌素的制备方法”的专利申请文本中已公开。
所述副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1在公开号为“CN106635886A”，发明名称为“一种利用产胆盐水解酶的副干酪乳杆菌降低鸡蛋胆固醇的方法”的专利申请文本中已公开。
相对于现有技术，本发明提供的复合益生菌制剂中的植物乳杆菌LP45、植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL和副干酪乳杆菌KL1三种菌种进行混合发酵，可以产生丰富的代谢产物，其代谢产物中包括多种产胞外多糖，将其饲喂家禽能抗脂质过氧化，发挥降脂护肝，抑制脂肪肝形成，并有效降低肝脏炎症的产生。其代谢产物中还包括大量的糖类、有机酸、多种氨基酸、小分子肽类、胞外多糖等活性小分子物质，将该混合发酵产物用于饲喂家禽，可以增加肠道对饲料营养的消化吸收，有效提升家禽的产单量和产蛋品质。代谢产物中还包括胆盐水解酶，能有效调节血清胆固醇和甘油三酯水平，降低家禽蛋黄中的胆固醇含量。该混合发酵产物中还含有大量细菌素类抗菌肽，能有效抑制单增李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌等肠道致病菌，可预防和改善家禽腹泻，并提高小肠紧密连接蛋白的表达量，增强黏膜屏障功能，防治溃疡性结肠炎，还可以调节肠道菌群平衡，增加益生菌数量，减少有害菌数量，还能通过提高小肠绒腺比，增强机体消化吸收功能，促进生长，增强机体免疫力，修复肠道炎症损伤。
本发明还提供所述复合益生菌制剂的制备方法。该制备方法包括：将植物乳杆菌LP45发酵液、植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵液和副干酪乳杆菌KL1发酵液均接种到联合发酵培养液中进行混合发酵，得到混合发酵液，然后对混合发酵液进行高压均质，得到所述复合益生菌制剂。
相对于现有技术，本发明提供的复合益生菌制剂的制备方法发酵过程简单，通过将植物乳杆菌LP45发酵液、植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵液和副干酪乳杆菌KL1发酵液接种到联合发酵培养液中进行混合二次发酵，可以产生更加多样的代谢产物，对得到的混合发酵也进行高压均质，可以将菌体中的代谢产物充分释放，将其用于饲喂家禽，可以显著的提升家禽的肝脏的健康状况、降低肝脏炎症的风险、有效提升家禽的产蛋量和产蛋品质、改善家禽的腹泻状况。
优选的，所述植物乳杆菌LP45发酵液的制备方法为：将植物乳杆菌LP45的种子液按2-5％的接种体积接种到乳酸菌培养液中，在20℃-37℃下发酵培养4-6d得到。
优选的，所述植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵液的制备方法为：将植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL的种子液按2-5％的接种体积接种到乳酸菌培养液中，在20℃-37℃下发酵培养4-6d得到。
优选的，所述副干酪乳杆菌KL1发酵液的制备方法为：将副干酪乳杆菌KL1的种子液按2-5％的接种体积接种到乳酸菌培养液中，在20℃-37℃下发酵培养4-6d得到。
上述乳酸菌发酵液的具体配方按质量百分含量包括：蛋白胨0.9％-1.0％、牛肉膏0.45％-0.50％、酵母浸粉0.35％-0.40％、葡萄糖0.18％-0.22％、吐温-800.094％-0.100％、磷酸氢二钾0.18％-0.22％、乙酸钠0.45％-0.50％、柠檬酸三铵0.18％-0.20％、硫酸镁0.018％-0.020％、硫酸锰0.004％-0.006％、琼脂1.40％-1.50％、L-半胱氨酸盐酸盐4.7％-4.8％和余量的蒸馏水。
优选的，所述植物乳杆菌LP45发酵液中植物乳杆菌LP45的活菌数为106cfu/mL-108cfu/mL；所述混合发酵中，所述植物乳杆菌LP45发酵液的接种体积为2-5％。
优选的，所述植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵液中植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL的活菌数为106cfu/mL-108cfu/mL；所述混合发酵中，所述植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵液的接种体积为2-5％。
优选的，所述副干酪乳杆菌KL1发酵液中副干酪乳杆菌KL1的活菌数为106cfu/mL-108cfu/mL；所述混合发酵中，所述副干酪乳杆菌KL1发酵液的接种体积为2-5％。
优选的，所述联合发酵培养液的配方为：按质量百分含量包括：蛋白胨0.9％-1.0％、牛肉膏0.45％-0.50％、酵母浸粉0.35％-0.40％、葡萄糖0.18％-0.22％、吐温-800.09％-0.10％、磷酸氢二钾0.15％-0.20％、乙酸钠0.45％-0.50％、柠檬酸三铵0.18％-0.22％、硫酸镁0.018％-0.022％、硫酸锰0.004％-0.006％、琼脂1.40％-1.45％和余量的蒸馏水。
优选的，所述混合发酵的温度为20℃-37℃，转速为30rpm-50rpm，时间为230-250h。
优选的，所述高压均值的压力为40MPa-50MPa。
本发明还提供了复合益生菌制剂在制备提升家禽肝脏健康的产品中的应用。
本发明提供了所述复合益生菌制剂在制备提升家禽产蛋量和产蛋品质的产品中的应用。
本发明提供了所述复合益生菌制剂在制备治疗家禽腹泻的产品中的应用。
附图说明
图1是本发明实施例2中试验组第1组和对照组第1组中的在不同的饲喂天数下所产鸡蛋的蛋壳平均厚度变化折线图；
图2是本发明实施例2中试验组第2组和对照组第2组中的在不同的饲喂天数下所产鸡蛋的蛋壳平均厚度变化折线图；
图3是本发明实施例2中试验组第3组和对照组第3组中的在不同的饲喂天数下所产鸡蛋的蛋壳平均厚度变化折线图；
图4是本发明实施例2中三组试验组和三组对照组在不同的饲喂天数下所产鸡蛋的蛋壳平均厚度变化折线图；
图5是本发明实施例2中饲喂过程中对照组粪便的照片；
图6是本发明实施例2中饲喂过程中试验组粪便的照片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种复合益生菌制剂，由保藏号为CGMCCNo.8072的植物乳杆菌(actobacillusplantarum)LP45、保藏号为CGMCC No.6936的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)Zhang-LL和保藏号为CGMCC No.11533的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1进行混合发酵得到。
上述复合益生菌制剂的制备方法为：
植物乳杆菌LP45发酵液的制备：将植物乳杆菌LP45的种子液按3％的接种体积接种到乳酸菌培养液中，在37℃下发酵培养5d得到，发酵液中植物乳杆菌LP45的活菌数为108cfu/mL；
植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵液的制备：将植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL的种子液按3％的接种体积接种到乳酸菌培养液中，在37℃下发酵培养5d得到，发酵液中植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL的活菌数为108cfu/mL；
副干酪乳杆菌KL1发酵液的制备：将副干酪乳杆菌KL1的种子液按3％的接种体积接种到乳酸菌培养液中，在37℃下发酵培养5d得到，发酵液中副干酪乳杆菌KL1的活菌数为108cfu/mL；
将制备得到的植物乳杆菌LP45发酵液、植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵液和副干酪乳杆菌KL1发酵液均按照3％的接种体积接种到联合发酵培养液中进行混合发酵，混合发酵的温度为37℃，时间为240h，得到混合发酵液，然后对混合发酵液进行高压均质(压力为40MPa)，菌体破裂，得到复合益生菌制剂。
其中，乳酸菌发酵液的具体配方按质量百分含量为：蛋白胨0.96％、牛肉膏0.48％、酵母浸粉0.38％、葡萄糖0.19％、吐温-80 0.096％、磷酸氢二钾0.19％、乙酸钠0.48％、柠檬酸三铵0.19％、硫酸镁0.019％、硫酸锰0.005％、琼脂1.43％、L-半胱氨酸盐酸盐4.78％和余量的蒸馏水。
联合发酵培养液的配方按质量百分含量为：蛋白胨0.96％、牛肉膏0.48％、酵母浸粉0.38％、葡萄糖0.19％、吐温-80 0.096％、磷酸氢二钾0.19％、乙酸钠0.48％、柠檬酸三铵0.19％、硫酸镁0.019％、硫酸锰0.005％、琼脂1.43％和余量的蒸馏水。
实施例2
选取304日龄健康海兰褐蛋鸡180只，随机分成6组，每组30只。其中三组为试验组，另外三组为对照组，均正常饲喂基础日粮(基础日粮的组成如表1所示、营养水平如表2所示)，并自由进水。其中试验组的饮用水中，按照1:1200的质量比例，将实施例1中制备得到的复合益生菌制剂加入水中。饲养试验35天，分别采集第7、14、21、28和35天的试验组鸡蛋和对照组鸡蛋，检测蛋壳厚度和产蛋量。
表1基础日粮的组成和营养水平
| 基础日粮组成 | 质量份数 |
| 玉米 | 620 |
| 强化豆粕 | 240 |
| 石粉 | 80 |
| 植物油 | 10 |
| 预混料 | 50 |
| 总计 | 1000 |
表2营养组成
| 营养水平 | |
| 代谢能 | 2680MJ/Kg |
| 粗蛋白 | 15.71％(质量比) |
| 蛋氨酸 | 0.3％(质量比) |
饲养管理：
试验前对周边环境、鸡舍、用具进行消毒处理。采用铁笼三层笼养，试验组和对照组各选取3个固定点进行鸡蛋取样。鸡笼均采用红外线加热装置自动控温，试验期内保持16h/d恒定光照和机械通风制度，24℃恒定不变。试验期内每天人工清粪一次。每天观察鸡群精神状态。
鸡群蛋壳厚度的检测：
分别取鸡蛋的大头、小头、中间部分的蛋壳，用镊子剔除内壳膜，用蛋壳厚度测定仪分别测其厚度，再三个部分检测值的值平均，得到每个蛋壳的检测厚度值，再计算试验组检测的所有鸡蛋的蛋壳厚度的平均值，以及对照组所有鸡蛋的蛋壳厚度的平均值，用平均数做蛋壳厚度变化折线图，得到的折线图如图1-4所示。
产蛋率的检测：
分别统计试验组和对照组每组每天的产蛋数量，然后分别计算产蛋率，产蛋率(％)＝产蛋枚数/家禽只数。
蛋壳厚度和产蛋率的检测值如表3所示。
表3蛋壳厚度和产蛋率
由表3中的检测数据可知，与对照组相比，试验组第14、21、28和35天所产的鸡蛋蛋壳厚度高，蛋壳质量更好，不易破碎，且产蛋率提高13％。
鸡群腹泻情况的检测：
实验开始前对鸡群的鸡粪进行拍照，实验中每天对鸡粪进行拍照，观察鸡群粪便的情况和变化。
在饲喂的第10天，对照部分鸡开始出现粪便变稀和腹泻的情况，其粪便情况如图5所示。而试验组在饲喂观察的35天，其粪便均保持正常，未出现腹泻的情况，其粪便情况如图6所示。
肝脏检测：
从连续饲喂35天的试验组鸡群和对照组鸡群中分别随机选取30只鸡，试验组每组10只，对照组每组10只。进行解剖，摘取肝脏，并选取肝脏的同一位置进行切片检测。
试验组30只鸡中，肝脏切片中均显示细胞核分布均匀、肝脏健康；而对照组的30只鸡中，其中50％以上的肝脏切片中都有不同程度淋巴细胞聚集，存在不同程度的炎症情况。说明试验组饲喂的复合益生菌制剂可以有效保护鸡的肝脏，降低肝脏炎症的发生。
实施例3
一种复合益生菌制剂，由保藏号为CGMCCNo.8072的植物乳杆菌(actobacillusplantarum)LP45、保藏号为CGMCC No.6936的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)Zhang-LL和保藏号为CGMCC No.11533的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1进行混合发酵得到。
上述复合益生菌制剂的制备方法为：
植物乳杆菌LP45发酵液的制备：将植物乳杆菌LP45的种子液按2％的接种体积接种到乳酸菌培养液中，在20℃下发酵培养6d得到，发酵液中植物乳杆菌LP45的活菌数为106cfu/mL；
植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵液的制备：将植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL的种子液按2％的接种体积接种到乳酸菌培养液中，在20℃下发酵培养6d得到，发酵液中植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL的活菌数为106cfu/mL；
副干酪乳杆菌KL1发酵液的制备：将副干酪乳杆菌KL1的种子液按2％的接种体积接种到乳酸菌培养液中，在20℃下发酵培养6d得到，发酵液中副干酪乳杆菌KL1的活菌数为106cfu/mL；
将制备得到的植物乳杆菌LP45发酵液、植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵液和副干酪乳杆菌KL1发酵液均按照2％的接种体积接种到联合发酵培养液中进行混合发酵，混合发酵的温度为20℃，时间为230h，得到混合发酵液，然后对混合发酵液进行高压均质(压力为45MPa)，使菌体破裂，得到复合益生菌制剂。
其中，乳酸菌发酵液的具体配方按质量百分含量为：蛋白胨0.9％、牛肉膏0.45％、酵母浸粉0.35％、葡萄糖0.18％、吐温-80 0.094％、磷酸氢二钾0.18％、乙酸钠0.45％、柠檬酸三铵0.18％、硫酸镁0.018％、硫酸锰0.004％、琼脂1.40％、L-半胱氨酸盐酸盐4.7％和余量的蒸馏水
联合发酵培养液的配方按质量百分含量为：蛋白胨0.9％、牛肉膏0.45％、酵母浸粉0.35％、葡萄糖0.18％、吐温-80 0.09％、磷酸氢二钾0.15％、乙酸钠0.45％、柠檬酸三铵0.18％、硫酸镁0.018％、硫酸锰0.004％、琼脂1.40％和余量的蒸馏水。
实施例4
一种复合益生菌制剂，由保藏号为CGMCCNo.8072的植物乳杆菌(actobacillusplantarum)LP45、保藏号为CGMCC No.6936的植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillusplantarum subsp.plantarum)Zhang-LL和保藏号为CGMCC No.11533的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1进行混合发酵得到。
上述复合益生菌制剂的制备方法为：
植物乳杆菌LP45发酵液的制备：将植物乳杆菌LP45的种子液按5％的接种体积接种到乳酸菌培养液中，在30℃下发酵培养4d得到，发酵液中植物乳杆菌LP45的活菌数为107cfu/mL；
植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵液的制备：将植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL的种子液按5％的接种体积接种到乳酸菌培养液中，在30℃下发酵培养4d得到，发酵液中植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL的活菌数为107cfu/mL；
副干酪乳杆菌KL1发酵液的制备：将副干酪乳杆菌KL1的种子液按5％的接种体积接种到乳酸菌培养液中，在30℃下发酵培养4d得到，发酵液中副干酪乳杆菌KL1的活菌数为107cfu/mL；
将制备得到的植物乳杆菌LP45发酵液、植物乳杆菌植物亚种Zhang-LL发酵液和副干酪乳杆菌KL1发酵液均按照5％的接种体积接种到联合发酵培养液中进行混合发酵，混合发酵的温度为30℃，时间为250h，得到混合发酵液，然后对混合发酵液进行高压均质(压力为50MPa)，使菌体破裂，得到复合益生菌制剂。
其中，乳酸菌发酵液的具体配方按质量百分含量为：蛋白胨1.0％、牛肉膏0.50％、酵母浸粉0.40％、葡萄糖0.22％、吐温-80 0.100％、磷酸氢二钾0.22％、乙酸钠0.50％、柠檬酸三铵0.20％、硫酸镁0.020％、硫酸锰0.006％、琼脂1.50％、L-半胱氨酸盐酸盐4.8％和余量的蒸馏水。
联合发酵培养液的配方按质量百分含量为：蛋白胨1.0％、牛肉膏0.50％、酵母浸粉0.40％、葡萄糖0.22％、吐温-80 0.10％、磷酸氢二钾0.20％、乙酸钠0.50％、柠檬酸三铵0.22％、硫酸镁0.022％、硫酸锰0.006％、琼脂1.45％和余量的蒸馏水。
利用实施例3和实施例4中的得到的复合益生菌制剂进行实施例2中的饲喂试验，检测的试验组的蛋壳厚度35天可分别达到0.49和0.50，产蛋率分别提升13％和12％；粪便和护肝情况均与实施例1相当。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种复合益生菌制剂在制备提升家禽产蛋量和产蛋品质的产品中的应用，其特征在于：所述复合益生菌制剂由植物乳杆菌(actobacillus plantarum)LP45、植物乳杆菌植物亚种(Lactobacillus plantarum subsp.plantarum)Zhang-LL和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)KL1进行混合发酵得到；
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