CN102987055A - 一种复方包被乳酸菌产品及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种复方包被乳酸菌微囊产品及其制备方法。该包被乳酸菌微囊产品提高了乳酸菌的耐温稳定性。本发明提供的包被乳酸菌制备方法由发酵前置包被及发酵完成后包被两级复方包被工艺完成。前置包被是乳酸菌培养到对数期时，包被材质在菌体细胞表层敷着形成膜层，提高了乳酸菌在加工过程中的耐受性。后包被是发酵完成后的乳酸菌液经离心分离后的加入稳定保护剂，制粒成形，喷涂后包被材质，在乳酸菌微囊表层形成膜层。后包被材质采用的是肠溶性天然高分子材料。本明提供的乳酸菌即有优良的耐温稳定性又具有良好的肠溶缓释性。
Description
技术领域
本发明涉及一种复方包被乳酸菌，属于微生物饲料添加剂技术领域，涉及复方包被材料、菌体保护剂和乳酸菌组成的乳酸菌微囊产品及其制备方法。
背景技术
由于在畜禽养殖业和饲料中长期地、过量地和不合理地使用或滥用抗生素，出现了一系列问题，如引起动物体内菌群失调、紊乱或条件性致病菌异位转移、多重耐药性菌株产生，以及在畜禽产品(如肉、蛋、奶)中的残留和环境污染等，特别是抗生素相关性腹泻、耐药性腹泻，正严重危害着畜牧业的健康发展，导致用药无效或用药量增加，恶性循环。同时，由于广泛的耐药细菌引发的感染也是严重危害人类健康和安全的重大问题之一。为此，产业界都在积极探索和寻找抗生素替代品。微生态制剂作为绿色安全的饲料添加剂逐渐成为抗生素替代品的主力军。
乳酸菌是动物肠道中的长期定居者，以乳酸菌为主的兼性厌氧菌和厌氧菌占消化道总菌数的90％以上，在维持肠道菌群平衡方面发挥着重要作用，能够提高饲料转化率、促进动物生长、提高动物免疫功能。但由于乳酸菌的抗逆性差，活菌在保存、饲料制粒加工和通过胃肠时的不利环境时容易导致乳酸菌活性降低。对乳酸菌用耐高温高湿的材料进行微囊包被后，可以抵抗伺料加工过程中高温、高湿等不良环境的影响，同时包被材质属于肠溶性包被材质，能够防止胃酸的破坏。现有公开的专利中，由于所采用的包被材料和处理工艺限制，包被后的乳酸菌并不能耐受较高的温度，超过60℃的温度，失活非常严重，而目前饲料制粒加工温度都在75℃以上。使乳酸菌的实际运用受到很大的限制。同时，由于目前大部分已公开的专利都是采用冻干生产工艺，生产动力成本高，不利于规模化生产。
发明内容
本发明的目的在于：①解决现有技术制备的乳酸菌耐温稳定性差的问题，本发明制备的乳酸菌85℃耐温3分钟，存活率在90％以上。②降低现有公开专利中乳酸菌的生产动力成本，本发明无需采用冻干工艺，生产动力成本大大降低。
本发明的另一目的在于提供该乳酸菌的制备方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明提供的包被乳酸菌由发酵前置包被及发酵完成后包被两级复方包被工艺完成。前置包被是乳酸菌培养到对数期时，包被材质在菌体细胞表层敷着形成膜层，包被材质为海藻酸钠、液体石蜡、氯化钙、阿拉拍胶、明胶两种或多种混合物。后包被是发酵完成后的乳酸菌液经离心分离后的加入稳定保护剂，制粒成20-40目粒形，喷涂后包被材质，在乳酸菌微囊表层形成膜层。所用的稳定保护剂为甘油、玉米淀粉、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠中一种、两种或多种混合物。后包被材质为果胶、卡拉胶、玉米淀粉、羟丙基甲基纤维素中的一种、两种或多种混合物。
本发明所述的乳酸菌为粪肠球菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的一种。
本发明上述的包被乳酸菌制备方法步骤如下：
(1)制备乳酸菌发酵液
①取1支斜面保存的菌体，接种到一级种子液体培养基中培养8±1h，得到一级摇瓶种子液。将一级种子液转接到二级种子培养基中，培养5-6h得到二级发酵液。
②前置包被材料制备：
囊材溶液的配制：阿拉拍胶(W/V)2～4％，海藻酸钠(W/V)1～2％加80℃温水，搅拌至完全溶解，121℃灭菌20min，备用；液体石蜡加入1％span80搅拌至混合均匀，121℃灭菌20min，备用；
固化剂的配制：氯化钙加水溶解，使氯化钙溶液浓度为0.1～0.3mol/L，121℃灭菌20min，备用；
乳酸菌微胶囊制备：将前述步骤①制备的二级发酵液注入到灭菌囊材溶液，至106cfu/ml左右密度，用高压空气，经无菌滤膜和喷头喷入无菌氯化钙溶液，搅拌固化，倾出上清液，得乳酸菌微胶囊溶液。
③发酵液的制备
将前述步骤②制备的乳酸菌微胶囊溶液按1-3％的移种量移种到发酵罐中，接种后罐温控制在38±1℃，pH6.5-6.7，搅拌转速在50-100rpm/min，培养10-12h得到乳酸菌发酵液。
(2)菌液分离
将前述步骤④制备的乳酸菌发酵液通过蠕动泵输送到高速管式离心机进行菌液分离，得到菌泥。
(3)微囊稳定化处理
制备菌悬液：将步骤(2)制备菌泥，活菌数在1011CFU/g以上。菌泥中加入2-4％甘油和20-35％水，搅拌混匀后得到菌悬液；
稳定剂材料制备：先将60-80％玉米淀粉、10-20％微晶纤维素混合均匀，再注入2-6％羧甲基纤维素钠液；
将制备好的稳定剂材料置于搅拌罐中，启动搅拌器，均匀注入菌悬液，搅拌转速50rpm/min，20min后加水调节物料湿度于32％-35％之间；得到微囊菌湿粉，待用。
(4)制粒
将步骤(3)制备的微囊菌湿粉投入制粒机内，调节粒度20-40目，得到乳酸菌20-40目粒形半成品，待用。
(5)复合包被
将步骤(4)制备的乳酸菌20-40目粒形半成品，投入至在旋流流化床制粒包衣机中进行干燥。干燥进风温度控制在65度以内，出风温度控制在32度以内。干燥时间50min-70min。
配制包被剂溶液：玉米淀粉1-3％、羟丙基甲基纤维素4-8％、果胶3-5％，卡拉胶3-5％混合液。
包被处理：启动侧喷包衣装置，进风温度控制在50-60度，雾化压力为0.1-0.2Mpa，将包被剂溶液以15-30ml/min速度分三个喷头喷向旋流状态的物料，在微粒物料中形成包衣膜层。经过30-60min得到20-60目乳酸菌微囊产品。
本发明的优点在于：
①本发明提供的乳酸菌采用发酵时同时进行前置包被的工艺，提高了菌体的耐受力，使发酵液可直接采用离心分离的后处理工艺，避免了加工过程中的菌活性损失。降低了生产动力成本。
②由于采用前置及后包被的复方包被生产工艺，包被配方采用植物分离蛋白与植物油的优选复合配方，使乳酸菌具有非常好的耐温稳定性。
③本发明所用包被材质以肠溶性天然高分子材料为主，菌体能在肠道准确崩解释放，定植并发挥效用。
具体实施方式
实施例1包被乳酸菌的制备
(1)制备乳酸菌发酵液
①一级种子液的制备：取1支斜面保存的菌体，接种到一级种子液体培养基中，接种后在37±0.5℃， 转速180rpm/min的摇床中培养8±1h，得到一级摇瓶种子液。
一级种子的培养基的配比(重量体积比W/V)方法如下：葡萄糖1-2％、大豆蛋白胨1-3％、酵母膏0.5-1％、氯化镁0.05-0.1％、氯化钠0.2-1％、碳酸钙0.2-0.5％，一级种子的装料量为40％，121℃灭菌30min，待用。
②二级发酵液的制备：将一级种子液转接到二级种子培养基中，接种量为1-5％，接种后罐温控制在38±0.5℃，转速在60-100rpm/min，培养5-6h得到二级发酵液。
二级种子的培养基的配比(重量体积比W/V)方法如下：葡萄糖2-3％、大豆蛋白胨1-3％、酵母膏0.5-1％、氯化镁0.08-0.15％、硫酸锰0.03-0.09％、氯化钠0.2-1％、碳酸钙0.2-0.7％、消泡剂0.05‰，二级种子罐的装料量为40％，自然pH值为5.6-5.8，调节pH值至7.0±0.2，121℃灭菌30min，待用。
③发酵包被液预处理：
囊材溶液的配制：阿拉拍胶(W/V)2～4％，海藻酸钠(W/V)1～2％加80℃温水，搅拌至完全溶解，121℃灭菌20min，备用；液体石蜡加入1％span80搅拌至混合均匀，121℃灭菌20min，备用；
固化剂的配制：氯化钙加水溶解，使氯化钙溶液浓度为0.1～0.3mol/L，121℃灭菌20min，备用；
乳酸菌微胶囊制备：将前述步骤②制备的二级发酵液注入到灭菌囊材溶液，至106cfu/ml左右密度，用高压空气，经无菌滤膜和喷头喷入无菌氯化钙溶液，搅拌固化，倾出上清液，得乳酸菌微胶囊溶液。
④发酵液的制备
将前述步骤③制备的乳酸菌微胶囊溶液按1-3％的移种量移种到发酵罐中，接种后罐温控制在38±1℃，pH6.5-6.7，搅拌转速在50-100rpm/min，培养10-12h得到乳酸菌发酵液。
发酵罐培养基的配比(重量体积比W/V)方法如下：红糖1～5％、酵母膏0.1～0.5％、大豆蛋白胨0.5～1％、硫酸铵0.5～1％、碳酸钙0.1～0.5％、氯化钠0.1-1％、消泡剂0.05‰，发酵罐装料量为70％，121℃灭菌30min，待用。
(2)菌液分离
将前述步骤④制备的乳酸菌发酵液通过蠕动泵输送到高速管式离心机进行菌液分离，得到菌泥。
(3)微囊稳定化处理
制备菌悬液：将步骤(2)制备菌泥，活菌数在1011CFU/g以上。菌泥中加入2-4％甘油和20-35％水，搅拌混匀后得到菌悬液；
稳定剂材料制备：先将60-80％玉米淀粉、10-20％微晶纤维素混合均匀，再注入2-6％羧甲基纤维素钠液；
将制备好的稳定剂材料置于搅拌罐中，启动搅拌器，均匀注入菌悬液，搅拌转速50rpm/min，20min后加水调节物料湿度于32％-35％之间；得到微囊菌湿粉，待用。
(4)制粒
将步骤(3)制备的微囊菌湿粉投入制粒机内，调节粒度20-40目，得到乳酸菌20-40目粒形半成品，待用。
(5)复合包被
将步骤(4)制备的乳酸菌20-40目粒形半成品，投入至在旋流流化床制粒包衣机中进行干燥。干燥进风温度控制在65度以内，出风温度控制在32度以内。干燥时间50min-70min。
配制包被剂溶液：玉米淀粉1-3％、羟丙基甲基纤维素4-8％、果胶3-5％，卡拉胶3-5％混合液。
包被处理：启动侧喷包衣装置，进风温度控制在50-60度，雾化压力为0.1-0.2Mpa，将包被剂溶液以15-30ml/min速度分三个喷头喷向旋流状态的物料，在微粒物料中形成包衣膜层。经过30-60min得到20-60目乳酸菌微囊产品。
实施例2包被乳酸菌耐胃酸测定
胃酸对微囊化包被乳酸菌乳酸菌存活率的影响如表1所示。食物在畜禽动物胃里的停留时间一般为1-2小时，本试验人工模拟胃液环境，当胃液的ph值为4，经过120分钟，乳酸菌的存活率为95％；当胃液的ph值为3，经过120分钟，乳酸菌的存活率为86％；当胃液的ph值为2、经过120分钟，乳酸菌的存活率仍为83％。
表1胃酸对微囊化包被乳酸菌存活率的影响
试验表明本发明制备的微囊化包被乳酸菌具有较好的耐胃酸能力，可以通过动物的胃并保持菌种的数量和活力，能够应用于畜禽动物的生产。
实施例3包被乳酸菌耐胆盐测定
胆盐对微囊化包被乳酸菌存活率的影响如表2所示。由表2可见，随着胆盐浓度的升高，时间的延长，乳酸菌的存活率不断降低，当胆盐浓度0.3％、经过3小时后乳酸菌的存活率为89％，当胆盐浓度0.5％，经过3小时后乳酸菌的存活率仍为85％。
表2胆盐对微囊化乳酸菌存活率的影响
实施例4包被乳酸菌肠溶性测定
将本发明制备的微囊化包被乳酸菌在模拟肠液中进行溶解试验，观测乳酸菌包衣层的溶解情况，结果见表3。
表3微囊化包被乳酸菌在模拟肠液溶解试验
| 处理时间 | 5min | 15min | 30min |
| 实施例1 | 溶解30％ | 溶解80％ | 完全崩解 |
| 实施例2 | 溶解25％ | 溶解75％ | 完全崩解 |
[0072]
| 实施例3 | 溶解30％ | 溶解85％ | 完全崩解 |
表3结果表明，本发明制备的微囊化包被乳酸菌有非常好的肠溶性，真正能够在肠道快速溶解释放。
实施例5包被乳酸菌常温贮存测试
将实施例1中制备的包被乳酸菌在常温下贮存，测定乳酸菌存活的结果见表4。
表4常温贮存条件下包被乳酸菌的存活率(％)
| 贮存时间 | 7天 | 15天 | 30天 | 60天 | 90天 | 180天 |
| 实施例1 | 100 | 98 | 95 | 91 | 88 | 82 |
| 实施例2 | 100 | 96 | 94 | 90 | 85 | 80 |
| 实施例3 | 100 | 97 | 93 | 90 | 86 | 81 |
由表4的检测结果可知，包被乳酸菌在常温下的稳定性非常好，乳酸菌的存活率180天后仍大于80％。
实施例6包被乳酸菌耐温测试
高温、高湿对微囊化乳酸菌存活率的影响如表5所示。本试验人工模拟高温制粒的高温及高温高湿环境，以考察微囊化乳酸菌对高温高湿环境的耐受性。研究表明经过90℃高温、2分钟，乳酸菌的存活率为95％，经过90℃高温高湿、60秒，乳酸菌的存活率仍为80％。
表5高温、高湿对微囊化乳酸菌存活率的影响
| 处理 | 处理时间 | 处理前活菌含量Cfu/g | 处理后活菌含量Cfu/g | 存活率 |
| 80℃高温 | 2min | 1.03×1010 | 1.01×1010 | 98％ |
| 85℃高温 | 2min | 1.03×1010 | 0.99×1010 | 96％ |
| 90℃高温 | 2min | 1.03×1010 | 0.98×1010 | 95％ |
| 80℃高温高湿 | 60s | 1.03×1010 | 0.93×1010 | 90％ |
| 85℃高温高湿 | 60s | 1.03×1010 | 0.88×1010 | 85％ |
| 90℃高温高湿 | 60s | 1.03×1010 | 0.82×1010 | 80％ |
实施例7耐受饲料制粒加工测试
乳酸菌在制作粉料、颗粒料时，饲料加工的调制温度一般在65～90℃，饲用乳酸菌必须具备一定的耐高温或耐高温高湿能力，才能耐受饲料加工。将实施例1中制备的包被乳酸菌投入到制粒前的粉料中进行均匀混合，经过85℃高温、60秒的制粒后，取制粒后的颗粒料进行乳酸菌的活性检测，检测结果见表6：
表6微囊化包被乳酸菌经85℃高温、180秒的制粒活性检测结果
| 制粒前活性Cfu/g | 制粒后活性Cfu/g | 存活率 | |
| 实施例1 | 2.5×1010 | 2.2×1010 | 88％ |
| 实施例2 | 2.5×1010 | 2.3×1010 | 92％ |
| 实施例3 | 2.5×109 | 2.4×109 | 96％ |
本试验结果表明经过经过85℃高温、60秒的制粒后，微囊化包被乳酸菌的存活率仍在88％以上。
Claims (4)
1.一种复方包被乳酸菌的制备方法，其特征在于包被乳酸菌制备工艺步骤如下：
(1)制备乳酸菌发酵液
①取1支斜面保存的菌体，接种到一级种子液体培养基中培养8±1h，得到一级摇瓶种子液。将一级种子液转接到二级种子培养基中，培养5-6h得到二级发酵液；
②前置包被材料制备：
囊材溶液的配制：阿拉拍胶(W/V)2～4％，海藻酸钠(W/V)1～2％加80℃温水，搅拌至完全溶解，121℃灭菌20min，备用；液体石蜡加入1％span80搅拌至混合均匀，121℃灭菌20min，备用；
固化剂的配制：氯化钙加水溶解，使氯化钙溶液浓度为0.1～0.3mol/L，121℃灭菌20min，备用；
乳酸菌微胶囊制备：将前述步骤①制备的二级发酵液注入到灭菌囊材溶液，至106cfu/ml左右密度，用高压空气，经无菌滤膜和喷头喷入无菌氯化钙溶液，搅拌固化，倾出上清液，得乳酸菌微胶囊溶液；
③发酵液的制备
将前述步骤②制备的乳酸菌微胶囊溶液按1-3％的移种量移种到发酵罐中，接种后罐温控制在38±1℃，pH6.5-6.7，搅拌转速在50-100rpm/min，培养10-12h得到乳酸菌发酵液；
(2)菌液分离
将前述步骤④制备的乳酸菌发酵液通过蠕动泵输送到高速管式离心机进行菌液分离，得到菌泥；
(3)微囊稳定化处理
制备菌悬液：将步骤(2)制备菌泥，活菌数在1011CFU/g以上。菌泥中加入2-4％甘油和20-35％水，搅拌混匀后得到菌悬液；
稳定剂材料制备：先将60-80％玉米淀粉、10-20％微晶纤维素混合均匀，再注入2-6％羧甲基纤维素钠液；
将制备好的稳定剂材料置于搅拌罐中，启动搅拌器，均匀注入菌悬液，搅拌转速50rpm/min，20min后加水调节物料湿度于32％-35％之间；得到微囊菌湿粉，待用；
(4)制粒
将步骤(3)制备的微囊菌湿粉投入制粒机内，调节粒度20-40目，得到乳酸菌20-40目粒形半成品，待用；
(5)复合包被
将步骤(4)制备的乳酸菌20-40目粒形半成品，投入至在旋流流化床制粒包衣机中进行干燥。干燥进风温度控制在65度以内，出风温度控制在32度以内。干燥时间50min-70min；
配制包被剂溶液：玉米淀粉1-3％、羟丙基甲基纤维素4-8％、果胶3-5％，卡拉胶3-5％混合液；
包被处理：启动侧喷包衣装置，进风温度控制在50-60度，雾化压力为0.1-0.2Mpa，将包被剂溶液以15-30ml/min速度分三个喷头喷向旋流状态的物料，在微粒物料中形成包衣膜层。经过30-60min得到20-60目乳酸菌微囊产品。
2.根据权利要求1所述，其特征在于乳酸菌包被工艺由发酵前置包被及发酵完成后包被两级复方包被工艺完成。
3.根据权利要求1所述，其特征在于前置包被材质为海藻酸钠、液体石蜡、氯化钙、阿拉拍胶、明胶两种或多种混合物。乳酸菌稳定保护剂为甘油、玉米淀粉、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠中一种、两种或多种混合物。后包被材质为果胶、卡拉胶、玉米淀粉、羟丙基甲基纤维素中的一种、两种或多种混合物。
4.根据权利要求1所述，其特征在于所述的乳酸菌为粪肠球菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌中的一种
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