CN104000025A - 一种稳定化乳酸菌产品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种稳定化乳酸菌产品的制备方法，包括：步骤1)乳酸菌发酵液的制备，步骤2)包被材料的配制，步骤3)原位包被，步骤4)菌液分离，以及步骤5)包被处理。本发明将乳酸菌发酵后进行原位包被，提高乳酸菌的耐压和耐剪切力的能力，降低后处理对菌体的伤害，保持乳酸菌活性，采用先制备核心颗粒再将乳酸菌喷涂到核心颗粒上，制备乳酸菌颗粒，避免制粒过程中高温和压力对菌体活性的影响。采用复合材料对乳酸菌进行包被，可以保证菌体顺利通过动物的胃，在肠道酶的作用下崩解释放，发挥益生作用。
Description
技术领域
本发明属于饲料添加剂领域，具体地，涉及一种稳定化乳酸菌产品的制备方法。
背景技术
抗生素作为饲料添加剂长期使用(尤其是滥用)导致的毒性残留、耐药性等问题引起人们广泛的关注，世界各国的科学家努力寻求和开发无毒副作用的新型饲料添加剂。益生菌是最先被提出的新型饲料添加剂。与添加抗生素相比,使用效果相同,有时甚至更好而且无任何毒、副作用、不在体内残留、不引起耐药性,因而很快便成为人们关注的焦点。
随着绿色养殖的大力发展，微生态制剂在饲料和畜禽养殖业中得到广泛应用，其中，乳酸菌类微生态制剂是饲用微生态制剂中应用最广泛的一种，但是绝大多数乳酸菌采用冷冻干燥的方式生产，稳定性差，一方面储存温度升高和接触空气，其活性会大大降低，另一方面在饲料加工中其无法耐受高温、压力和剪切力，致使活性大大降低甚至死亡，严重影响了乳酸菌活菌制剂的效价。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明人进行了广泛深入的研究，最终完成本发明。
因此，本发明的目的是提供一种稳定化乳酸菌产品的制备方法，该方法解决了饲料用乳酸菌稳定性差的问题。
根据本发明的目的，提供了一种稳定化乳酸菌产品的制备方法，包括：
步骤1)：乳酸菌发酵液的制备：
将乳酸菌进行活化、培养，得到乳酸菌发酵液；
步骤2)：包被材料的配制：
2-1)原位包被材料的配制：配制1-2％(W/V)海藻酸钠水溶液和冰醋酸溶解的0.1-0.2％(W/V)壳聚糖溶液，备用；
2-2)后包被材料的配制：
将蓖麻油加0.2-0.5％乳化剂制成悬浊液，1-2％乙基纤维素和2-3％聚丙烯酸树脂Ⅱ号加95％乙醇制成溶液，将这两个溶液混合均匀，备用；
步骤3)：原位包被：
将步骤2-1)中制得的海藻酸钠水溶液加入到将步骤1)中制得的乳酸菌发酵液中，搅拌均匀，加入难溶性0.5-1％钙盐颗粒，搅拌均匀，形成悬浮液；按照3-2:1水油比将所述悬浮液加入到液体石蜡油中，搅拌乳化，形成油包水乳浊液；加入冰醋酸降低体系pH值，加入步骤2-1)中制得的壳聚糖溶液，继续反应，静置使微胶囊沉降；
步骤4)：菌液分离：
对步骤3)中制得的微胶囊进行离心分离，得到浓缩的微囊乳酸菌；
步骤5)：包被处理：
5-1)：核心材料的配制：将50-60重量份食用淀粉、20-30重量份微晶纤维素、5-10重量份明胶混合均匀，加水30-40重量份搅拌均匀，得到核心材料；
5-2)：菌液的制备：将步骤4)中制得的浓缩的微囊乳酸菌用0.8％生理盐水进行稀释，得到浓度为1010cfu/ml以上的微囊乳酸菌菌液；
5-3)：核心制粒：利用挤压制粒，将核心材料制成粒度20-40目的核心颗粒；
5-4)：乳酸菌喷涂和包被：将步骤5-3)的核心颗粒投入包衣机中，利用热空气进行干燥至水分含量为5％以下，将步骤5-2)的菌液利用包衣机的喷头均匀喷涂到核心颗粒上，使乳酸菌被吸附到核心颗粒中，然后将后包被材料均匀喷涂到含有乳酸菌的核心颗粒上，干燥至含水量为5％以下。
优选地，在所述稳定化乳酸菌产品的制备方法中，步骤1)：乳酸菌发酵液的制备进一步包括：
1-1)乳酸菌一级种子液制备
将保存的乳酸菌菌种划线接种到斜面培养基，37℃培养活化12-24h、将活化好的菌种接种到液体培养基中，150-180r/min，37℃培养10-12h，得到乳酸菌一级种子液。
1-2)乳酸菌二级种子液制备
将一级种子液接种到液体培养基中，37℃、70r/min，罐压0.01Mpa，培养8h，得到乳酸菌二级种子液。
1-3)乳酸菌发酵生产
将二级种子液按接种到发酵培养基中，37℃、70r/min，罐压0.01Mpa，用氨水调节pH保持在5.8，培养16h，得到乳酸菌发酵液。
其中，液体培养基配方为
发酵培养基配方为
更优选地，
所述液体培养基配方为：
所述发酵培养基配方为：
优选地，在所述稳定化乳酸菌产品的制备方法中，步骤2)中：包被材料的配制：
2-1)原位包被材料的配制：配制1.5％(W/V)海藻酸钠水溶液和冰醋酸溶解的0.1％(W/V)壳聚糖溶液，备用；
2-2)后包被材料的配制：将蓖麻油加0.5％吐温80制成悬浊液，乙基纤维素和聚丙烯酸树脂Ⅱ号加95％乙醇制成溶液，将这两个溶液混合均匀，备用，制成的混合溶液中含有蓖麻油1％(W/V)，乙基纤维素1％(W/V)，聚丙烯酸树酯2％(W/V)；
优选地，在所述稳定化乳酸菌产品的制备方法中，步骤3)中：原位包被：
将步骤2-1)中制得的海藻酸钠水溶液加入到步骤1-3)中制得的乳酸菌发酵液中，搅拌均匀，加入难溶性0.5％钙盐颗粒，搅拌均匀，形成悬浮液；按照3:1水油比将所述悬浮液加入到含1％Span80液体石蜡油中，搅拌乳化，400r/min，15min，形成油包水乳浊液；加入0.002％冰醋酸降低体系pH值，加入步骤2-1)中制得的壳聚糖溶液，继续反应，静置使微胶囊沉降；
优选地，在所述稳定化乳酸菌产品的制备方法中，步骤4)中：菌液分离：
对步骤3)中制得的微胶囊乳酸菌进行离心分离，离心机转速5000r/min，得到浓缩的微囊乳酸菌；
优选地，在所述稳定化乳酸菌产品的制备方法中，步骤5)中：包被处理：
5-1)：核心材料的配制：将60重量份食用淀粉、30重量份微晶纤维素、10重量份明胶混合均匀，加水40重量份搅拌均匀，得到核心材料；
5-2)：菌液的制备：将步骤4)中制得的浓缩微囊乳酸菌0.8％用生理盐水进行稀释，得到浓度为1010cfu/ml以上的微囊乳酸菌菌液；
5-3)：核心制粒：利用挤压制粒，将核心材料制成粒度20-40目的核心颗粒；
5-4)：乳酸菌喷涂和包被：将步骤5-3)的核心颗粒投入包衣机中，利用90℃热空气进行干燥至水分含量为5％以下，降低空气温度至70℃，将步骤5-2)的菌液利用包衣机的喷头均匀喷涂到核心颗粒上，喷涂速度150ml/min，使乳酸菌被吸附到核心颗粒中，然后将后包被材料均匀喷涂到含有乳酸菌的核心颗粒上，喷涂速度100ml/min，70℃干燥至含水量为5％以下。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、乳酸菌发酵后进行原位包被，通过包被提高乳酸菌的耐压和耐剪切力的能力，由此降低后处理对菌体的伤害，保持乳酸菌活性，同时增大乳酸菌的密度，降低菌液分离的难度。
2、采用先制备核心颗粒再将乳酸菌喷涂到核心颗粒上，制备乳酸菌颗粒，避免制粒过程中高温和压力对菌体活性的影响。
3、采用复合材料对乳酸菌进行包被，可以保证菌体顺利通过动物的胃，在肠道酶的作用下崩解释放，发挥益生作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明加以进一步说明，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。但这些实施例并不意味着对本发明加以任何限制。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求书中包括的变通和修改。
实施例
以下实施例所用的设备和材料信息如下：
试验设备
发酵罐 石家庄冀能化工设备有限公司
混合机 常州孟河制药设备有限公司
流化床干燥机 常州佳发干燥设备有限公司
超净工作台 哈尔滨东联设备有限公司
生化培养箱 哈尔滨东联设备有限公司
试验试剂
食用淀粉 秦皇岛鹏远淀粉有限公司
微晶纤维素 山东曲阜圣仁制药有限公司
聚丙烯酸树脂Ⅱ号 珠海嘉成生物科技有限公司
海藻酸钠 青岛鹰飞化工有限公司
壳聚糖 浙江澳兴生物科技有限公司
乙基纤维素 广州市佳信行化工科技有限公司
制备实施例
本实施例提供稳定化乳酸菌产品的制备方法，包括如下步骤：
步骤1)：乳酸菌发酵液的制备
1-1)乳酸菌一级种子液制备
取斜面保存的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，划线接种到斜面培养基，37℃培养活化24h，将活化的菌种接种到三角瓶液体培养基中，150r/min震荡培养12h，得到一级种子液。
1-2)乳酸菌二级种子液制备
将一级种子液按1％的接种量接种到种子罐液体培养基中，37℃、70r/min，罐压0.01Mpa，培养8h，得到二级种子液。
1-3)乳酸菌发酵生产
将二级种子液按0.5％的接种量接种到发酵罐发酵培养基中，37℃、70r/min，罐压0.01Mpa，用氨水调节pH保持在5.8，培养20h得到乳酸菌发酵液。
液体培养基配方为：
发酵培养基配方为：
步骤2)：包被材料配制
2-1)原位包被材料的配制
1.5％(W/V)海藻酸钠加85℃的温水，搅拌溶解，冷却静置12h备用。
0.1％(W/V)壳聚糖加冰醋酸搅拌溶解，备用。
2-2)后包被材料的配制
将10g蓖麻油加0.5％吐温80制备悬浊液，10g乙基纤维素和20g聚丙烯酸树脂Ⅱ号加95％乙醇制成溶液，将这两个溶液混合均匀备用，混合溶液中含有蓖麻油1％，乙基纤维素1％，聚丙烯酸树酯2％。
步骤3)原位包被
按将步骤2中的海藻酸钠溶液加到乳酸菌发酵液中，搅拌均匀，加入难溶性钙盐颗粒，搅拌均匀，形成悬浮液。按照3:1水油比将此悬浮液加入到含1％Span80的液体石蜡油中，搅拌乳化(15min，400r/min)，形成油包水乳浊液；降低体系pH值，加入壳聚糖溶液，继续反应20min，静置使微胶囊沉降。
步骤4)：菌液分离
利用碟片离心机进行分离，5000r/min，得到浓缩的微囊乳酸菌。
步骤5)：包被处理
5-1)：核心材料的配制
先用60％食用淀粉、30％微晶纤维素、10％明胶混合均匀，加水40％搅拌均匀。
5-2)：菌液的制备
将1.4得到的浓缩菌液用0.8％的生理盐水进行稀释，得到浓度1010cfu/ml以上的微囊乳酸菌菌液。
5-3)：核心制粒
利用挤压制粒，调整模板孔径，将核心颗粒制成粒度20-40目的核心颗粒。
5-4)：乳酸菌喷涂及包被
将步骤5-3)的核心颗粒投入包衣机中，利用90℃热空气进行干燥至水分含量为5％以下，降低空气温度至70℃，将5-2)的菌液利用包衣机的喷头均匀喷涂到核心颗粒上，喷涂速度150ml/min，乳酸菌被吸附到核心颗粒中，然后将后包被材料均匀喷涂到含有乳酸菌的核心颗粒上，喷涂速度100ml/min，70℃干燥至含水量为5％以下。
试验实施例：包被乳酸产品菌性能试验
下面通过实验验证本发明所制备的稳定化乳酸菌产品的各项性能，实验所得数据如下表1-5所示。
1.包被乳酸菌耐胃酸性能实验
表1.包被乳酸菌耐胃酸性能
经过不同pH不同时间的处理后，本发明所得的包被乳酸菌存留率均在80％以上，由此可见，乳酸菌经本发明所公开的方法包被处理后具有很好的耐胃酸能力，可以经过动物的胃到达肠道发挥作用。
2.包被乳酸菌耐胆盐性能实验
表2.包被乳酸菌耐胆盐性能
经过不同胆盐浓度和不同时间的处理后，本发明所得的包被乳酸菌存留率均在80％以上，由此可见，乳酸菌经本发明所公开的方法包被处理后具有很好的耐胆盐能力，可以在动物的肠道发挥作用。
3.包被乳酸菌存储稳定性实验
表3.存储稳定性
| 15天 | 30天 | 60天 | 120天 | 180 | |
| 试验一 | 100％ | 97.2％ | 94.8％ | 90.6％ | 84.2％ |
| 试验二 | 100％ | 96.5％ | 90.5％ | 88.1％ | 80.2％ |
| 试验三 | 100％ | 97.8％ | 93.1％ | 89.2％ | 81.3％ |
由上表可知，本发明的包被乳酸菌常温下在阴凉(20℃以下)干燥、避光保存6个月存留率在80％以上。
4.包被乳酸菌的耐高温性能实验
表4.包被乳酸菌的耐高温性能
| 处理温度℃ | 处理前活菌数 | 处理后活菌数 | 存留率％ |
| 80 | 2.31×1010 | 2.19×1010 | 94.8％ |
| 85 | 2.31×1010 | 2.09×1010 | 90.5％ |
| 90 | 2.31×1010 | 2.15×1010 | 93.1％ |
由上表可知，利用烘箱或水浴锅对乳酸菌样品直接加热，加热时间5min，本发明的包被乳酸菌存留率达到90％以上。
5.包被乳酸菌的饲料制粒存活率实验
调制器出口物料温度为60～65℃，环模出口颗粒料温度为70～75℃。蒸汽压力为0.43～0.46MPa，制粒结果如下表5所示：
表5包被乳酸菌的饲料制粒存活率
由上表可知，经过本发明包被处理的乳酸菌进行制粒实验，乳酸菌存活率达到50％以上。
Claims (7)
1.一种稳定化乳酸菌产品的制备方法，包括：
步骤1)：乳酸菌发酵液的制备：
将乳酸菌进行活化、培养，得到乳酸菌发酵液；
步骤2)：包被材料的配制：
2-1)原位包被材料的配制：配制1-2％(W/V)海藻酸钠水溶液和冰醋酸溶解的0.1-0.2％(W/V)壳聚糖溶液，备用；
2-2)后包被材料的配制：
将蓖麻油加0.2-0.5％乳化剂制成悬浊液，1-2％乙基纤维素和2-3％聚丙烯酸树脂Ⅱ号加95％乙醇制成溶液，将这两个溶液混合均匀，备用；
步骤3)：原位包被：
将步骤2-1)中制得的海藻酸钠水溶液加入到将步骤1)中制得的乳酸菌发酵液中，搅拌均匀，加入难溶性0.5-1％钙盐颗粒，搅拌均匀，形成悬浮液；按照3-2:1水油比将所述悬浮液加入到液体石蜡油中，搅拌乳化，形成油包水乳浊液；加入冰醋酸降低体系pH值，加入步骤2-1)中制得的壳聚糖溶液，继续反应，静置使微胶囊沉降；
步骤4)：菌液分离：
对步骤3)中制得的微胶囊进行离心分离，得到浓缩的微囊乳酸菌；
步骤5)：包被处理：
5-1)：核心材料的配制：将50-60重量份食用淀粉、20-30重量份微晶纤维素、5-10重量份明胶混合均匀，加水30-40重量份搅拌均匀，得到核心材料；
5-2)：菌液的制备：将步骤4)中制得的浓缩的微囊乳酸菌用0.8％生理盐水进行稀释，得到浓度为1010cfu/ml以上的微囊乳酸菌菌液；
5-3)：核心制粒：利用挤压制粒，将核心材料制成粒度20-40目的核心颗粒；
5-4)：乳酸菌喷涂和包被：将步骤5-3)的核心颗粒投入包衣机中，利用热空气进行干燥至水分含量为5％以下，将步骤5-2)的菌液利用包衣机的喷头均匀喷涂到核心颗粒上，使乳酸菌被吸附到核心颗粒中，然后将后包被材料均匀喷涂到含有乳酸菌的核心颗粒上，干燥至含水量为5％以下。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中乳酸菌发酵液的制备进一步包括：
1-1)乳酸菌一级种子液制备
将保存的乳酸菌菌种划线接种到斜面培养基，37℃培养活化12-24h、将活化好的菌种接种到液体培养基中，150-180r/min，37℃培养10-12h，得到乳酸菌一级种子液。
1-2)乳酸菌二级种子液制备
将一级种子液接种到液体培养基中，37℃、70r/min，罐压0.01Mpa，培养8h，得到乳酸菌二级种子液。
1-3)乳酸菌发酵生产
将二级种子液按接种到发酵培养基中，37℃、70r/min，罐压0.01Mpa，用氨水调节pH保持在5.8，培养16h，得到乳酸菌发酵液。
其中，液体培养基配方为
发酵培养基配方为
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述液体培养基配方为：
所述发酵培养基配方为：
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中包被材料的配制过程为：
2-1)原位包被材料的配制：配制1.5％(W/V)海藻酸钠水溶液和冰醋酸溶解的0.1％(W/V)壳聚糖溶液，备用；
2-2)后包被材料的配制：将蓖麻油加0.5％吐温80制成悬浊液，乙基纤维素和聚丙烯酸树脂Ⅱ号加95％乙醇制成溶液，将这两个溶液混合均匀，备用，制成的混合溶液中含有蓖麻油1％(W/V)，乙基纤维素1％(W/V)，聚丙烯酸树酯2％(W/V)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)的原位包被的过程为：
将步骤2-1)中制得的海藻酸钠水溶液加入到步骤1-3)中制得的乳酸菌发酵液中，搅拌均匀，加入难溶性0.5％钙盐颗粒，搅拌均匀，形成悬浮液；按照3:1水油比将所述悬浮液加入到含1％Span80液体石蜡油中，搅拌乳化，400r/min，15min，形成油包水乳浊液；加入0.002％冰醋酸降低体系pH值，加入步骤2-1)中制得的壳聚糖溶液，继续反应，静置使微胶囊沉降。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中的菌液分离过程为：
对步骤3)中制得的微胶囊乳酸菌进行离心分离，离心机转速5000r/min，得到浓缩的微囊乳酸菌。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中的包被处理过程为：
5-1)：核心材料的配制：将60重量份食用淀粉、30重量份微晶纤维素、10重量份明胶混合均匀，加水40重量份搅拌均匀，得到核心材料；
5-2)：菌液的制备：将步骤4)中制得的浓缩微囊乳酸菌0.8％用生理盐水进行稀释，得到浓度为1010cfu/ml以上的微囊乳酸菌菌液；
5-3)：核心制粒：利用挤压制粒，将核心材料制成粒度20-40目的核心颗粒；
5-4)：乳酸菌喷涂和包被：将步骤5-3)的核心颗粒投入包衣机中，利用90℃热空气进行干燥至水分含量为5％以下，降低空气温度至70℃，将步骤5-2)的菌液利用包衣机的喷头均匀喷涂到核心颗粒上，喷涂速度150ml/min，使乳酸菌被吸附到核心颗粒中，然后将后包被材料均匀喷涂到含有乳酸菌的核心颗粒上，喷涂速度100ml/min，70℃干燥至含水量为5％以下。
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