CN109527245A - 一种猪用复合益生菌制剂的制备方法 - Google Patents

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常卓
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朱晓静
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Abstract

本发明公开一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，具体为：以富微量元素酵母、枯草芽孢杆菌、乳酸肠球菌发酵培养液，按比例与复合维生素复配制粒、包衣，得到一种富含有机微量元素、维生素、活性酵母菌、活性枯草芽孢杆菌、活性乳酸肠球菌的功能性母仔猪专用益生菌制剂，本方法制得的复合益生菌制剂富含有母猪和仔猪需要的有机微量元素、微生物活菌、多种维生素，能够改善肠道平衡，提高免疫力，减少腹泻和便秘的发生，降低发病率，较单一的益生菌制剂效价高，作用明显，添加到饲料中，能够降低料肉比，提高饲料利用率，提高经济效益。

Description

一种猪用复合益生菌制剂的制备方法
技术领域
本发明涉及益生菌制剂的制备方法，具体涉及一种猪用复合益生菌制剂的制备方法。
背景技术
母猪和仔猪比较容易发生腹泻和便秘，益生菌是一种可以通过改善肠道微生物平衡，从而对母猪和仔猪产生有益作用的活菌，在饲料中添加益生菌制剂可以明显降低母猪和仔猪腹泻和便秘的发生率，提高了母猪的健康状况和母仔猪的免疫力。
母猪是生产生猪的核心，仔猪是生猪生产的基础，在母猪和仔猪生长过程中，需要添加硒、锌、铬、铁等各种微量元素，来提高母猪的繁殖性能、免疫力，以及仔猪的健康水平。目前，母猪和仔猪料中所添加的微量元素基本上都是无机微量元素，长期食用无机微量元素不仅不会增加母猪的繁殖性能、提高母、仔猪的免疫力，反而会降低母猪的生产年限，降低母仔猪的免疫力，而有机微量元素添加剂量少，生物效价高。因此，添加生物富集的有机微量元素是目前的发展趋势。
发明内容
本发明目的是提供一种富微量元素酵母、枯草芽孢杆菌、乳酸肠球菌的复合益生菌，按比例与复合维生素复配制粒、包衣，得到一种富含有机微量元素、维生素、活性酵母菌、活性枯草芽孢杆菌、活性乳酸肠球菌的功能性猪用益生菌制剂。
本发明的目的是由以下技术方案实现的：
一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，包括下列步骤：
(1)富微量元素酵母培养；
(2)枯草芽孢杆菌培养；
(3)乳酸肠球菌发酵培养；
(4)菌液分离；
(5)冷冻干燥制备复合菌粉；
(6)菌粉制粒；
(7)菌剂颗粒包衣。
进一步的，本发明目的还可以由以下技术方案实现：
一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，包括下列步骤：
(1)富微量元素酵母菌培养：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐培养，具体工艺如下：斜面菌种培养：将酿酒酵母菌种接种到添加有微量元素的麦芽汁固体斜面上进行培养，斜面菌种培养完成后，取斜面菌种培养的长势较好的富微量元素酵母菌落，接种于添加有微量元素的500ml一级种子发酵培养基中进行摇瓶发酵培养，得一级富微量元素种子液，将一级富微量元素种子液转接到含有微量元素的50L二级种子发酵培养基中进行发酵培养，得二级富微量元素种子培养液，将二级富微量元素种子培养液转接到含有微量元素的500L发酵罐培养基中进行发酵培养，得到富微量元素酵母发酵液；
(2)枯草芽孢杆菌培养：取冰箱中斜面保藏的枯草芽孢杆菌菌种，按照一级液体种子培养、二级液体种子培养、发酵罐培养的顺序扩大培养；取斜面保存的枯草芽孢杆菌，接种于500ml一级种子发酵培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵完成后得一级种子液；将一级种子液转入50L二级种子发酵培养基中进行发酵培养得到二级种子液；将二级种子液转接到300-600L发酵罐培养基中进行发酵罐培养，得到枯草芽孢杆菌发酵液；
(3)乳酸肠球菌发酵培养：取冰箱中保藏的乳酸肠球菌种，按照斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养、发酵罐培养的顺序扩大培养，斜面菌种培养：将乳酸肠球菌种接种到MRS培养基上进行斜面菌种培养，斜面菌种培养完成后，取斜面菌种培养的长势较好的菌落，接种于一级种子发酵培养基，进行摇瓶发酵培养，得到一级种子液，将一级种子液转入30L二级种子发酵培养基中进行二级发酵培养，得到二级种子液；将二级种子液转接到3000L发酵培养基中进行发酵罐培养，得到乳酸肠球菌发酵液；
(4)菌液分离：将步骤(1)～(3)发酵完成的菌液，分别采用碟式离心机进行离心分离，转速6000-10000r/min，分别制得活菌浓浆；
(5)冷冻干燥制备复合菌粉：将步骤(4)所得活菌浓浆按比例混合均匀，将冷冻干燥保护液与混合活菌浓浆按比例混匀，进行冷冻干燥，制得益生菌冻干粉；
(6)菌粉制粒：将冻干后的菌粉与大豆蛋白粉、玉米淀粉、混合维生素粉按比例混合均匀，投入制粒机内进行制粒，得到粒径0.8-2.0mm的颗粒；
(7)菌剂颗粒包衣:将制得的颗粒置于流化床中进行肠溶包衣。
一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，所述的步骤(1)中的微量元素包括：Se2+、Zn2+、Cr3+、Fe2+，微量元素的添加浓度依次为：120-200ug/ml、600-1000ug/ml、100-260ug/ml、120-200ug/ml，其中，Se2+由亚硒酸盐提供，Zn2+由硫酸锌、氯化锌等锌盐提供，Cr3+由氯化铬、硫酸铬等铬盐提供，Fe2+由硫酸亚铁、氯化亚铁等亚铁提供。
一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，所述的步骤(1)中的斜面菌种培养温度为24-37℃，pH6.5，时间为15-40h；种子发酵培养基配方：含糖总量26-30％，总糖可以是麦芽汁、葡萄糖两种或者其中一种，培养条件为：pH 6.5、温度为24-37℃、时间为15-40h；发酵罐培养基配方为：麦芽汁5-8％、糖蜜为6-15％、pH6.5，微量元素采用流加方式，分批次加入，在24-37℃培养12-36小时。
一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，所述步骤(2)的种子发酵培养基配方：葡萄糖0.5％、淀粉2.5％、磷酸二氢钠0.2％、蛋白胨2.5％、酵母粉0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁：0.1％；发酵罐培养基配方：葡萄糖0.5-2.5％、淀粉1.5％、磷酸二氢钠0.2％、豆粕3.5％、破壁酵母0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.1％；
其中，一级种子培养条件：发酵温度为28-42℃、调节pH值6.8-7.2，搅拌转速140r/min，培养18-30h，二级种子培养条件：接种量1.0-1.5％、发酵温度28-42℃、pH7.2、搅拌转速在60-100r/min、培养14-20h，发酵罐培养条件：接种量1.0-1.5％、发酵温度28-42℃、pH7.2、搅拌转速在60-100r/min、培养20-32h。
一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，所述步骤(3)的发酵培养基配方为：糖2.0％、蛋白粉2.0％、酵母膏1％、硫酸镁0.6％、硫酸锰0.3％、柠檬酸二铵0.2％、醋酸钠0.5％、吐温80 0.1％、pH6.2～6.4；
其中，斜面菌种培养条件：35℃培养20-30h，一级液体种子培养条件：温度为26-40℃、pH 6.2-6.4，16-180r/min培养18-30h，二级液体种子培养条件：接种量0.5-1.5％、温度28-42℃、pH6.2-6.4，60-100r/min培养14-20h，发酵罐培养条件：接种量1.0-1.5％、温度28-42℃、pH7.2，60-100r/min培养20-32h。
一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，所述的步骤(5)中的活菌浓浆混合比例为：富微量元素酵母：乳酸肠球菌：枯草芽孢杆菌＝0.6-1.0:0.2-1.0:1.2-2.5；冷冻干燥保护液配方：100克纯净水中加入蔗糖5-15g、海藻糖15-30g、甘露醇1-5g、甘油2-5g制成冻干保护液，冷冻干燥保护液与混合活菌浓浆的比例为0.2-0.5:1。
一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，所述步骤(6)中的菌粉、蛋白粉、玉米淀粉、复合维生素粉的混合比例为1.0:0.2-0.8：0.2-0.5:1.5-4.0；
其中，复合维生素粉是由维生素E、β胡萝卜素、维生素B2、烟酸构成，添加比例为1：2.0:0.8:2.4。
一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，所述的步骤(7)中的流化床包衣条件为：温度80±5℃、雾化压力0.25mpa、肠溶包衣剂以45-60ml/min的速度喷向物料颗粒，经过10-30min得到猪用复合益生菌制剂。
一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，所述肠溶包衣剂的配方：100g水中加入柠檬酸三乙酯5％、单硬脂酸甘油酯2-20％、海藻酸钠2-8％、明胶2-7％、羧甲基纤维素钠4-8％。
本发明的有益效果
(1)本发明的猪用复合益生菌制剂将母猪和仔猪特需微量元素硒、锌、铬、铁通过酵母发酵，将无机微量元素生物转化为有机微量元素，提高了猪对微量元素的吸收效率，降低了补充无机微量元素的危害，在补充益生菌制剂的同时为母猪和仔猪提供了有机微量元素的补充。
(2)本发明的猪用复合益生菌制剂在制备过程中添加了多种复合维生素、微量元素，与益生菌协同作用，极大增强了益生菌的效用。
(3)本发明的猪用复合益生菌制剂经过制粒与包衣，易于保存。
(4)本发明的猪用复合益生菌制剂可以改善猪的肠道环境，提高饲料利用率，促进生长，提高免疫力、生产性能和繁殖能力，降低了生产成本。
(5)本发明的猪用复合益生菌制剂制备过程中使用冷冻干燥技术，极大地保存了各种菌的活性，活性高，用量少，作用明显。
(6)本发明的猪用复合益生菌制剂能够改善肠道健康菌群，防治猪的腹泻与便秘，改善了猪舍的环境卫生。
本发明提供的复合益生菌制剂富含母猪和仔猪需要的有机微量元素、微生物活菌、多种维生素。维生素能够提高母猪的免疫力和仔猪成活率，提高免疫力，提高产仔数，提高种猪繁殖性能、降低肉料比，提高饲料报酬、提高经济效益。同时，断奶仔猪添加维生素，可以提高仔猪免疫力，减少腹泻和便秘的发病率，提高饲料利用率，降低料肉比。本发明的复合益生菌制剂能够改善肠道平衡，提高免疫力，减少腹泻和便秘的发生，降低发病率，较单一的益生菌制剂效价高，作用明显。
附图说明
图1为本发明的流程图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段易于理解，下面结合附图并通过具体实施例，进一步详细阐述本发明。
实施例1：
一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，包括下列步骤：
(1)富微量元素酵母菌培养：
富微量元素酵母菌培养基的制备，斜面菌种培养基为麦芽汁固体斜面培养基，种子发酵培养培养基配方含糖量为26％的培养基，发酵罐培养基配方为：麦芽汁5％，糖蜜为8％的液体培养基，培养基中分别添加亚硒酸盐、硫酸锌、氯化锌、氯化铬、硫酸铬、硫酸亚铁、氯化亚铁(发酵培养基中的微量元素以流加的方式分批加入，避免抑制生长)，按照Se2+、Zn2+、Cr3+、Fe2+添加浓度分别为120ug/ml、800ug/ml、1500ug/ml、120ug/ml，制成富硒、富锌、富铬、富铁酵母培养基。
富微量元素酵母菌培养：按照斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐培养，将酿酒酵母菌种接种到添加有微量元素的麦芽汁固体斜面上，调节pH6.5,28℃，培养32h；斜面菌种培养完成后，取斜面菌种培养的长势较好的富微量元素酵母菌落，接种于1L培养瓶，培养瓶内含有500ml的添加有微量元素的一级液体种子培养基，调节pH6.5，控制温度28℃，培养35h，140r/min进行摇瓶发酵培养；发酵完成后得一级种子液，将一级种子液转接到100L二级液体种子发酵罐中，培养基含量为50L，调节pH6.5，控制温度28℃，培养16h，60-100r/min进行二级液体种子培养，发酵完成后得二级种子液，将二级种子液转接到1000L盛有500L培养基的发酵罐中，调节pH6.5，控制温度24-37℃，搅拌转速40-80r/min，进行发酵培养20h，得到酵母发酵液。
(2)枯草芽孢杆菌的培养：
取冰箱中斜面保藏的枯草芽孢杆菌菌种，按照一级液体种子培养、二级液体种子培养、发酵罐培养的顺序扩大培养，取斜面保存的枯草芽孢杆菌，接种于一级种子1L盛有500ml一级种子发酵培养基的培养瓶中，调节pH6.8-7.2，控制温度37℃，搅拌转速140r/min，进行摇瓶发酵培养20h；发酵完成后得一级种子液，将一级种子液转入含有50L二级种子发酵培养基的100L发酵罐中，接种量1.5％，发酵温度37℃，调节pH7.2，搅拌转速60r/min，培养16h得到二级种子液；将二级种子液转接到盛有300-600L发酵罐培养基的1000L发酵罐中，接种量1.5％，接种后，发酵温度37℃，pH7.2，搅拌转速在80r/min，培养24h，得到枯草芽孢杆菌发酵液，
其中，种子发酵培养基配方：葡萄糖0.5％，淀粉2.5％，磷酸二氢钠0.2％，蛋白胨2.5％，酵母粉0.5％，硫酸锰0.02％，硫酸镁：0.1％。发酵罐培养基配方：葡萄糖2.0％，淀粉1.5％，磷酸二氢钠0.2％，豆粕3.5％，破壁酵母0.5％，硫酸锰0.02％，硫酸镁0.1％。
(3)乳酸肠球菌发酵培养：
取冰箱中保藏的乳酸肠球菌种，按照斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养、发酵罐培养的顺序扩大培养，将菌种接种到MRS斜面菌种培养基上，35℃培养24h，取斜面培养的乳酸肠球菌，接种于1L盛有300ml一级种子发酵培养基的一级种子瓶中，控制温度为35℃、pH 6.2，搅拌转速160r/min，进行摇瓶发酵培养26h，得到一级种子液，发酵完成后，将一级种子液转入含有30L二级种子发酵培养基的100L发酵罐中，接种量1.0％，发酵温度28-42℃，pH6.2，搅拌转速在100r/min，进行二级种子培养20h，得到二级种子液。将二级种子液转接到盛有3000L发酵罐培养基的10000L发酵罐中，接种量1.0％，发酵温度35℃，pH7.2，搅拌转速在80r/min，进行发酵培养22h，得到乳酸肠球菌发酵液。
其中，斜面菌种培养基为MRS培养基，发酵培养基的配方为：糖2.0％、蛋白粉2.0％、酵母膏1％、硫酸镁0.6％、硫酸锰0.3％、柠檬酸二铵0.2％、醋酸钠0.5％、吐温800.1％，调节pH6.2。
(4)菌液分离：
将发酵完成的菌液，分别采用碟式离心机进行离心分离，转速8000r/min，分别制得富微量元素酵母、乳酸肠球菌、枯草芽孢杆菌活性菌浓浆。
(5)冷冻干燥菌粉：
冷冻干燥保护液配制：每100克纯净水中加入蔗糖10g，海藻糖20g，甘露醇3g，甘油4g制成冻干保护液。
冷冻干燥制备复合菌粉：将分离后的富微量元素酵母、乳酸肠球菌、枯草芽孢杆菌活性菌浓浆，按照0.6:0.8:1.5的比例混合均匀，按照冷冻干燥保护液与菌液0.3:1的比例混合均匀，进行冷冻干燥，制得益生菌冻干粉。
(6)菌粉制粒：
复合维生素粉配制：将维生素E、β胡萝卜、素维生素B2、烟酸按照1：2:0.8:2.4比例进行复配，混合均匀。
将冻干后的菌粉与蛋白粉、玉米淀粉、复合维生素粉按照重量比1:0.4：0.5:2.5混合均匀，投入制粒机内进行制粒，得到粒径1.6mm的颗粒。
(7)菌剂颗粒包衣：
制备肠溶包衣剂：每100g水中加入柠檬酸三乙酯5％，单硬脂酸甘油酯10％，海藻酸钠6％，明胶6％，羧甲基纤维素钠6％，搅拌均匀，制成肠溶包衣剂。
将制得的颗粒置于流化床中进行肠溶包衣，控制温度82±1℃，雾化压力0.25mpa，包衣剂以50ml/min的速度喷向物料颗粒，经过20min得到猪用复合益生菌制剂。
实施例2：
一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，包括下列步骤：
(1)富微量元素酵母培养：
富微量元素酵母培养基的制备，斜面菌种培养基为麦芽汁固体斜面培养基，种子发酵培养培养基配方含糖量为30％的培养基，发酵罐培养基为配方：麦芽汁8％，糖蜜为12％的液体培养基，培养基中分别添加亚硒酸盐、硫酸锌、氯化锌、氯化铬、硫酸铬、硫酸亚铁、氯化亚铁(发酵培养基中的微量元素以流加的方式分批加入，避免抑制生长)，Se2+、Zn2 +、Cr3+、Fe2+添加浓度分别为180ug/ml、600ug/ml、200mg/l、180mg/kg；
富微量元素酵母菌培养：按照斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐种子培养→发酵罐培养，将酿酒酵母菌种接种到添加有微量元素的麦芽汁固体斜面上，调节pH6.5,32℃，培养36h；斜面菌种培养完成后，取斜面菌种培养的长势较好的富微量元素酵母菌落，接种于1L培养瓶，含有500ml的添加有微量元素的一级液体种子培养基中，调节pH6.5，控制温度32℃，培养34h，160r/min进行摇瓶发酵培养；发酵完成后得一级种子液，将一级种子液转接到100L二级种子发酵罐中，培养基含量为50L，调节pH6.5，控制温度32℃，培养24h，70r/min进行二级液体种子培养，发酵完成后得二级种子液，将二级种子液转接到1000L盛有500L的发酵罐培养基的发酵罐中，调节pH6.5，控制温度32℃，搅拌转速60r/min，进行发酵培养28h，得到酵母发酵液。
(2)枯草芽孢杆菌的培养：
取冰箱中斜面保藏的枯草芽孢杆菌菌种，按照一级液体种子培养、二级液体种子培养、发酵罐培养的顺序扩大培养，取斜面保存的枯草芽孢杆菌，接种于含有500ml一级种子发酵培养基的1L培养瓶中，调节pH7.0，控制温度36℃，搅拌转速140r/min，进行摇瓶发酵培养25h，发酵完成后得一级种子液；将一级种子液转入含有50L二级种子发酵培养基的100L发酵罐中，接种量1.5％，发酵温度36℃，调节pH7.2，搅拌转速在100r/min，培养18h得到二级种子液；将二级种子液转接到盛有300L发酵罐培养基的1000L发酵罐中，接种量1.5％，接种后，发酵温度36℃，pH7.2，搅拌转速在100r/min，培养22h，得到枯草芽孢杆菌发酵液。
其中，种子发酵培养基配方：葡萄糖0.5％、淀粉2.5％、磷酸二氢钠0.2％、蛋白胨2.5％、酵母粉0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁：0.1％；发酵液体培养基配方：葡萄糖2.5％，淀粉1.5％，磷酸二氢钠0.2％，豆粕3.5％，破壁酵母0.5％，硫酸锰0.02％，硫酸镁0.1％。
(3)乳酸肠球菌发酵培养：
取冰箱中保藏的乳酸肠球菌种，按照斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养、发酵罐培养的顺序扩大培养，将菌种接种到MRS斜面菌种培养基上，35℃培养20h，取斜面保存的乳酸肠球菌，接种于1L盛有300ml一级种子发酵培养基的一级种子瓶中，控制温度为33℃、pH6.4，搅拌转速170r/min，进行摇瓶发酵培养19h，得到一级种子液。发酵完成后，将一级种子液转入30L二级种子发酵培养基的100L发酵罐中，接种量0.5-1.5％，发酵温度33℃，pH6.4，搅拌转速在100r/min，进行二级种子培养18h，得到二级种子液。将二级种子液转接到盛有3000L发酵罐培养基的10000L发酵罐中，接种量1.0％，发酵温度33℃，pH7.2，搅拌转速在100r/min，进行发酵培养32h，得到乳酸肠球菌发酵液。
其中，斜面菌种培养基为MRS培养基，发酵培养基的配方为：糖2.0％、蛋白粉2.0％、酵母膏1％、硫酸镁0.6％、硫酸锰0.3％、柠檬酸二铵0.2％、醋酸钠0.5％、吐温800.1％，调节pH6.4。
(4)菌液分离：
将发酵完成的菌液，采用碟式离心机进行离心分离，转速6000r/min，制得富微量元素酵母、乳酸肠球菌、枯草芽孢杆菌活性菌浓浆。
(5)冷冻干燥菌粉：
冷冻干燥保护液配制：每100克纯净水中加入蔗糖5g，海藻糖15g，甘露醇5g，甘油5g制成冻干保护液。
冷冻干燥制备复合菌粉：将分离后的富微量元素酵母、乳酸肠球菌、枯草芽孢杆菌活性菌浓浆，按照0.6:0.2:2.5的比例混合均匀，按照冷冻干燥保护液与菌液0.5:1的比例混合均匀，进行冷冻干燥，制得益生菌冻干粉。
(6)菌粉制粒：
复合维生素粉配制：将维生素E、β胡萝卜、素维生素B2、烟酸按照1：2.0:0.8:2.4比例进行复配，混合均匀。
将冻干后的菌粉与蛋白粉、玉米淀粉、复合维生素粉按照重量比1.0:0.2：0.2:4.0混合均匀，投入制粒机内进行制粒，得到粒径0.8-2.0mm的颗粒。
(7)菌剂颗粒包衣：
制备肠溶包衣剂：每100g水中加入柠檬酸三乙酯5％，单硬脂酸甘油酯12％，海藻酸钠7％，明胶0.3％，羧甲基纤维素钠5％，搅拌均匀，制成肠溶包衣剂。
将制得的颗粒置于流化床中进行肠溶包衣，控制温度81±3℃，雾化压力0.25mpa，包衣剂以60ml/min的速度喷向物料颗粒，经过15min得到猪用复合益生菌制剂。
实施例3：
一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，包括下列步骤：
(1)富微量元素酵母培养：
富微量元素酵母培养基的制备，斜面菌种培养基为麦芽汁固体斜面培养基，种子发酵培养培养基配方含糖量为28％的培养基，发酵罐培养基的配方：麦芽汁5％，糖蜜为15％的液体培养基，培养基中分别添加亚硒酸盐、硫酸锌、氯化锌、氯化铬、硫酸铬、硫酸亚铁、氯化亚铁(发酵培养基中的微量元素以流加的方式分批加入，避免抑制生长)，按照Se2+、Zn2+、Cr3+、Fe2+添加浓度分别为170ug/ml、840ug/ml、190mg/l、190mg/kg，制成富硒、富锌、富铬、富铁酵母培养基。
富微量元素酵母菌培养：按照斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐培养，将酿酒酵母菌种接种到添加有微量元素的麦芽汁固体斜面上，调节pH6.5,温度30℃，培养23h；斜面菌种培养完成后，取斜面菌种培养的长势较好的富微量元素酵母菌落，接种于含有500ml的添加有微量元素的一级液体种子培养基的1L培养瓶中，调节pH6.5，控制温度30℃，培养25h，150r/min进行摇瓶发酵培养；发酵完成后得一级种子液，将一级种子液转接到培养基含量为50L的100L发酵罐中，调节pH6.5，控制温度30℃，培养27h，90r/min进行二级液体种子培养，发酵完成后得二级种子液，将二级种子液转接到盛有500L的发酵罐培养基的1000L发酵罐中，调节pH6.5，控制温度30℃，搅拌转速75r/min，进行发酵培养28h，得到酵母发酵液。
(2)枯草芽孢杆菌的培养：
取冰箱中斜面保藏的枯草芽孢杆菌菌种，按照一级液体种子培养、二级液体种子培养、发酵罐培养的顺序扩大培养，取斜面保存的枯草芽孢杆菌，接种于盛有500ml一级种子发酵培养基的1L培养瓶中，调节pH7.2，控制温度31℃，搅拌转速140r/min，进行摇瓶发酵培养29h；发酵完成后得一级种子液，将一级种子液转入含有50L二级种子发酵培养基的100L发酵罐中，接种量1.2％，发酵温度31℃，调节pH7.2，搅拌转速在85r/min，培养18h得到二级种子液；将二级种子液转接到盛有500L三级发酵培养基的1000L发酵罐中，接种量1.2％，接种后，发酵温度31℃，pH7.2，搅拌转速在85r/m，培养32h，得到枯草芽孢杆菌发酵液。
其中，种子发酵培养基配方：葡萄糖0.5％，淀粉2.5％，磷酸二氢钠0.2％，蛋白胨2.5％，酵母粉0.5％，硫酸锰0.02％，硫酸镁：0.1％。发酵罐培养基配方：葡萄糖1.6％，淀粉1.5％，磷酸二氢钠0.2％，豆粕3.5％，破壁酵母0.5％，硫酸锰0.02％，硫酸镁0.1％。
(3)乳酸肠球菌发酵培养：
取冰箱中保藏的乳酸肠球菌种，按照斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养、发酵罐培养的顺序扩大培养，将菌种接种到MRS斜面菌种培养基上，35℃培养27h，取斜面保存的乳酸肠球菌，接种于1L盛有300ml一级种子发酵培养基的一级种子瓶中，控制温度为37℃、调节pH值6.2，搅拌转速160r/min，进行摇瓶发酵培养20h，得到一级种子液，发酵完成后，将一级种子液转入30L二级种子发酵培养基的100L发酵罐中，接种量1.3％，发酵温度37℃，pH6.2，搅拌转速在75r/min，进行二级种子培养19h，得到二级种子液；将二级种子液转接到盛有3000L发酵罐培养基的10000L发酵罐中，接种量1.3％，发酵温度37℃，pH7.2，搅拌转速在95r/min，进行发酵培养21h，得到乳酸肠球菌发酵液。
其中，斜面菌种培养基为MRS培养基，发酵培养基的配方为：糖2.0％，蛋白粉2.0％，酵母膏1％，硫酸镁0.6％，硫酸锰0.3％，柠檬酸二铵0.2％，醋酸钠0.5％，吐温800.1％，调节pH6.2。
(4)菌液分离：
将发酵完成的菌液，采用碟式离心机进行离心分离，转速9000r/min，制得富微量元素酵母、乳酸肠球菌、枯草芽孢杆菌活性菌浓浆。
(5)冷冻干燥菌粉：
冷冻干燥保护液配制：每100克纯净水中加入蔗糖15g，海藻糖30g，甘露醇1g，甘油2g制成冻干保护液。
冷冻干燥制备复合菌粉：将分离后的富微量元素酵母、乳酸肠球菌、枯草芽孢杆菌活性菌浓浆，按照0.3:0.6:1.2的比例混合均匀，按照冷冻干燥保护液与菌液0.4:1的比例混合均匀，进行冷冻干燥，制得益生菌冻干粉。
(6)菌粉制粒：
复合维生素粉配制：将维生素E、β胡萝卜、素维生素B2、烟酸按照1:2.0:0.8:2.4比例进行复配，混合均匀。
将冻干后的菌粉与蛋白粉、玉米淀粉、复合维生素粉按照重量比1.0:0.8:0.3:1.5混合均匀，投入制粒机内进行制粒，得到粒径1.2mm的颗粒。
(7)菌剂颗粒包衣：
制备肠溶包衣剂：每100g水中加入柠檬酸三乙酯5％，单硬脂酸甘油酯2％，海藻酸钠2％，明胶0.8％，羧甲基纤维素钠8％，搅拌均匀，制成肠溶包衣剂。
将制得的颗粒置于流化床中进行肠溶包衣，控制温度83±2℃，雾化压力0.25mpa，包衣剂以45ml/min的速度喷向物料颗粒，经过30min得到猪用复合益生菌制剂。
对比实施例4：
采用实施例1-3的方法制备获得相应的猪用复合益生菌制剂，进行母猪繁殖性能试验。选择健康状况良好、胎次一样的未孕母猪50头，分成5组，每组10头。受精前30天即开始按照每吨饲料80g添加猪用复合益生菌制剂，进行喂养试验，观察受精、妊娠期、哺乳期的繁殖性能，试验结果见表1。
其中，组1为空白对照组，组2为仅添加相同剂量枯草芽孢杆菌、乳酸肠球菌和复合维生素组，组3为仅添加相同剂量富微量元素酵母菌和复合维生素组，组4为仅添加相同剂量枯草芽孢杆菌、乳酸肠球菌、富微量元素酵母菌粉组，组5为添加相同剂量实施例1制得的本技术产品，组6为添加相同剂量实施例2制得的本技术产品，组7为添加相同剂量实施例3制得的本技术产品。
表1母猪繁殖性能试验
结果分析，由表1可以看出：
1、母猪的妊娠前期、妊娠期、哺乳期添加了复合益生菌制剂的组别(组2、组3、组4、组5)母猪的繁殖性能和健康指标各个指标均优于对照组1；
2、由实施例组5、组6、组7与组2、组3、组4对比发现：实施例组的各项指标均优于只添加两种制得的益生菌制剂的组2、组3、组4，说明富微量元素酵母、乳酸肠球菌+枯草芽孢杆菌、复合维生素三者具有协同增效的作用，三种同时添加制成的复合益生菌制剂，效用最高。
3、本技术产品的益生菌制剂能够显著提高母猪的采食量，产仔数、健仔数，提高母猪在妊娠前期、妊娠期、哺乳期的免疫力，减少母猪的便秘和腹泻，同时哺乳期的仔猪发病率也降低明显。
对比实施例5：
采用实施例1-3的方法制备获得相应的猪用复合益生菌制剂，进行断奶仔猪生长性能试验。选择健康状况良好、胎次相同的断奶仔猪100头，随机分成分成4组，每组50头、公猪母猪个25头。相同条件下饲喂试验，对照组饲喂断奶仔猪基础饲料，实验1组在每吨饲料中添加80g实施例1制备的复合益生菌制剂，实验2组在每吨饲料中添加80g实施例2制备的复合益生菌制剂，实验3组在每吨饲料中添加80g实施例3制备的复合益生菌制剂饲喂30天，观察皮毛色泽、状态等外在表现，记录体重、采食量、腹泻率、发病率等生长性能数据，见表2。
表2断奶仔猪生长性能试验
试验过程中，试验组1、组2、组3仔猪皮毛色泽光亮，健康状况良好，由表2数据可以看出：相较于对照组仔猪，添加复合益生菌制剂组日增重明显，料肉比降低，腹泻率、发病率明显降低。
最后，还需要注意的是，以上所列举的仅是本发明的若干具体实施例。本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)富微量元素酵母培养；
(2)枯草芽孢杆菌培养；
(3)乳酸肠球菌发酵培养；
(4)菌液分离；
(5)冷冻干燥制备复合菌粉；
(6)菌粉制粒；
(7)菌剂颗粒包衣。
2.如权利要求1所述的一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)富微量元素酵母菌培养：斜面菌种培养→一级液体种子培养→二级液体种子培养→发酵罐培养，具体工艺如下：斜面菌种培养：将酿酒酵母菌种接种到添加有微量元素的麦芽汁固体斜面上进行培养，斜面菌种培养完成后，取斜面菌种培养的长势较好的富微量元素酵母菌落，接种于添加有微量元素的500ml一级种子发酵培养基中进行摇瓶发酵培养，得一级富微量元素种子液，将一级富微量元素种子液转接到含有微量元素的50L二级种子发酵培养基中进行发酵培养，得二级富微量元素种子培养液，将二级富微量元素种子培养液转接到含有微量元素的500L发酵罐培养基中进行发酵培养，得到富微量元素酵母发酵液；
(2)枯草芽孢杆菌培养：取冰箱中斜面保藏的枯草芽孢杆菌菌种，按照一级液体种子培养、二级液体种子培养、发酵罐培养的顺序扩大培养；取斜面保存的枯草芽孢杆菌，接种于500ml一级种子发酵培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵完成后得一级种子液；将一级种子液转入50L二级种子发酵培养基中进行发酵培养得到二级种子液；将二级种子液转接到300-600L发酵罐培养基中进行发酵罐培养，得到枯草芽孢杆菌发酵液；
(3)乳酸肠球菌发酵培养：取冰箱中保藏的乳酸肠球菌种，按照斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养、发酵罐培养的顺序扩大培养，斜面菌种培养：将乳酸肠球菌种接种到MRS培养基上进行斜面菌种培养，斜面菌种培养完成后，取斜面菌种培养的长势较好的菌落，接种于一级种子发酵培养基，进行摇瓶发酵培养，得到一级种子液，将一级种子液转入30L二级种子发酵培养基中进行二级发酵培养，得到二级种子液；将二级种子液转接到3000L发酵培养基中进行发酵罐培养，得到乳酸肠球菌发酵液；
(4)菌液分离：将步骤(1)～(3)发酵完成的菌液，分别采用碟式离心机进行离心分离，转速6000-10000r/min，分别制得活菌浓浆；
(5)冷冻干燥制备复合菌粉：将步骤(4)所得活菌浓浆按比例混合均匀，将冷冻干燥保护液与混合活菌浓浆按比例混匀，进行冷冻干燥，制得益生菌冻干粉；
(6)菌粉制粒：将冻干后的菌粉与大豆蛋白粉、玉米淀粉、混合维生素粉按比例混合均匀，投入制粒机内进行制粒，得到粒径0.8-2.0mm的颗粒；
(7)菌剂颗粒包衣:将制得的颗粒置于流化床中进行肠溶包衣。
3.如权利要求1或2任一项所述的一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的微量元素包括：Se2+、Zn2+、Cr3+、Fe2+，微量元素的添加浓度依次为：120-200ug/ml、600-1000ug/ml、100-260ug/ml、120-200ug/ml，其中，Se2+由亚硒酸盐提供，Zn2+由硫酸锌、氯化锌等锌盐提供，Cr3+由氯化铬、硫酸铬等铬盐提供，Fe2+由硫酸亚铁、氯化亚铁等亚铁提供。
4.如权利要求2或3任一项所述的一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的斜面菌种培养温度为24-37℃，pH6.5，时间为15-40h；种子发酵培养基配方：含糖总量26-30％，总糖可以是麦芽汁、葡萄糖两种或者其中一种，培养条件为：pH6.5、温度为24-37℃、时间为15-40h；发酵罐培养基配方为：麦芽汁5-8％、糖蜜为6-15％、pH6.5，微量元素采用流加方式，分批次加入，在24-37℃培养12-36小时。
5.如权利要求2所述的一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的种子发酵培养基配方：葡萄糖0.5％、淀粉2.5％、磷酸二氢钠0.2％、蛋白胨2.5％、酵母粉0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁：0.1％；发酵罐培养基配方：葡萄糖0.5-2.5％、淀粉1.5％、磷酸二氢钠0.2％、豆粕3.5％、破壁酵母0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.1％；
其中，一级种子培养条件：发酵温度为28-42℃、调节pH值6.8-7.2，搅拌转速140r/min，培养18-30h，二级种子培养条件：接种量1.0-1.5％、发酵温度28-42℃、pH7.2、搅拌转速在60-100r/min、培养14-20h，发酵罐培养条件：接种量1.0-1.5％、发酵温度28-42℃、pH7.2、搅拌转速在60-100r/min、培养20-32h。
6.如权利要求2所述的一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)的发酵培养基配方为：糖2.0％、蛋白粉2.0％、酵母膏1％、硫酸镁0.6％、硫酸锰0.3％、柠檬酸二铵0.2％、醋酸钠0.5％、吐温80 0.1％、pH6.2～6.4；
其中，斜面菌种培养条件：35℃培养20-30h，一级液体种子培养条件：温度为26-40℃、pH 6.2-6.4，16-180r/min培养18-30h，二级液体种子培养条件：接种量0.5-1.5％、温度28-42℃、pH6.2-6.4，60-100r/min培养14-20h，发酵罐培养条件：接种量1.0-1.5％、温度28-42℃、pH7.2，60-100r/min培养20-32h。
7.如权利要求2所述的一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤(5)中的活菌浓浆混合比例为：富微量元素酵母：乳酸肠球菌：枯草芽孢杆菌＝0.6-1.0:0.2-1.0:1.2-2.5；冷冻干燥保护液配方：100克纯净水中加入蔗糖5-15g、海藻糖15-30g、甘露醇1-5g、甘油2-5g制成冻干保护液，冷冻干燥保护液与混合活菌浓浆的比例为0.2-0.5:1。
8.如权利要求2所述的一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中的菌粉、蛋白粉、玉米淀粉、复合维生素粉的混合比例为1.0:0.2-0.8：0.2-0.5:1.5-4.0；
其中，复合维生素粉是由维生素E、β胡萝卜素、维生素B2、烟酸构成，添加比例为1：2.0:0.8:2.4。
9.如权利要求2所述的一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤(7)中的流化床包衣条件为：温度80±5℃、雾化压力0.25mpa、肠溶包衣剂以45-60ml/min的速度喷向物料颗粒，经过10-30min得到猪用复合益生菌制剂。
10.如权利要求9所述的一种猪用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于，肠溶包衣剂的配方：100g水中加入柠檬酸三乙酯5％、单硬脂酸甘油酯2-20％、海藻酸钠2-8％、明胶2-7％、羧甲基纤维素钠4-8％。
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