CN103865904B - 一种含有益生菌的生长猪专用酶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有益生菌的生长猪专用酶及其制备方法，属于饲料酶制剂领域。所述含有益生菌的生长猪专用酶由以下重量份数的组分组成：中草药粉0.5-2份，木聚糖酶80-100份，蛋白酶20-30份，果胶酶10-20份，纤维素酶8-12份，地衣芽孢杆菌培养物20-30份，中温α-淀粉酶5-10份。其中地衣芽孢杆菌（Βacillus？licheniformis）β-10-25，保藏编号CCTCC？NO：M2013538。制备方法如下：地衣芽孢杆菌经发酵后通过过滤、浓缩、干燥获得的培养物与其他成分复配，所得复合酶能提高饲料转化率，降低饲料成本。

Description

一种含有益生菌的生长猪专用酶及其制备方法
技术领域
本发明属于酶制剂领域，具体涉及一种生长猪专用酶及其制造方法。
背景技术
饲料酶制剂是为了提高动物对饲料的消化、利用或改善动物体内的代谢效能而加入饲料中的酶类物质。目前可以在饲料中添加的酶制剂包括淀粉酶、α-半乳糖苷酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、麦芽糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶、植酸酶、蛋白酶、角蛋白酶、木聚糖酶等。由于饲料原料结构的复杂性，目前饲料工业生产中更多使用的是复合酶制剂。复合酶制剂是一种新型的饲料添加剂，在国外其应用始于20世纪70年代，而我国的饲料工业在20世纪90年代才开展酶制剂的应用。因此，加大对饲料复合剂的研究对于我国的养殖业发展具有非常重要的意义。
饲用酶种类繁多，在畜禽生产中均取得了相当好的效果。前苏联科学家在早期断奶仔猪日粮中添加淀粉糊精酶，使得日增重提高14.6%，碳水化合物消化率提高77.2%。据美国有关资料报道，Collier在早期断奶仔猪日粮中补充酶制剂（含蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶），结果实验组比对照组日增重提高了25%，饲料转化率提高了15.5%。西德学者曾多次进行育肥猪添加复合酶制剂的实验研究，在以大麦为主的日粮中，添加0.1%的复合酶制剂，结果为：实验组比对照组生长速度提高5.1%，饲料利用率提高4.1%。可见，饲料酶能显著提高畜禽对饲料的消化吸收，促进生长，降低饲料成本，并且作为一种绿色饲料添加剂，它的使用具有安全性，有利于畜牧业生产走上经济节约型的发展道路。
此外，科学实验证实了地衣芽孢杆菌具有促进畜禽生长，降低料重比；增加肠道有益菌数量，改善畜禽肠道微生态环境；预防和治疗肠道疾病，降低死亡率的作用。1989年，美国FDA和美国饲料控制官员协会公布了可以直接饲喂且一般认为是安全的微生物菌种名单，其中包括地衣芽孢杆菌。中华人民共和国农业部318号公告也把地衣芽孢杆菌列入了饲料添加剂目录。
目前，市场上针对饲料的复合酶多种多样，但是有的酶配比不合理，达不到应有的效果，导致畜禽生长缓慢，生产力低下；有的酶活性低，添加量大，导致饲养成本成本高。鉴于粮食的短缺是困扰我国饲料工业发展的主要因素，因此，要选择有利于节约粮食资源的畜牧业发展道路，提高饲料利用率，充分利用有限的粮食资源获得尽可能多的畜产品。
发明内容
本发明的目的在于针对上述缺陷提供一种配比合理，活性高且含有益生菌的生长猪专用酶及其制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种含有益生菌的生长猪专用酶，由以下重量份数的组分组成：中草药粉2-8份，木聚糖酶80-100份，蛋白酶20-30份，果胶酶10-20份，纤维素酶8-12份，地衣芽孢杆菌培养物20-30份，中温α-淀粉酶5-10份。
所述木聚糖酶、蛋白酶、果胶酶、纤维素酶和中温α-淀粉酶均为湖南鸿鹰翔生物工程股份有限公司或其他现有产品；
所述中草药粉的制备方法如下：
称取黄芪10-30份；党参10-18份；板蓝根10-15份；当归10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下混合获得中草药粉；
所述地衣芽孢杆菌培养物制备方法如下：
（1）种子培养
将地衣芽孢杆菌斜面菌种经三级摇瓶发酵剂一级种子罐发酵；
所述种子培养的培养基为：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl1％，pH4.5-7.0，121-123℃灭菌30-40min。
（2）发酵罐发酵
将一级种子罐发酵液以3%接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度35-45℃，搅拌速度200-300r/min，通风量（V/V）1:1-3,培养时间10-15h；然后将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35-45℃时恒温培养15-20h；此时，将一级种子罐发酵液以2%接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h；继续将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35-45℃时恒温培养10-15h；
所述发酵培养基组成为：麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β-葡聚糖2g，中草药粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值4.5-7.0，121℃灭菌20min；
所述发酵培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值3-7，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温15-30min，然后缓慢升温至90℃保温15-30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH3-7，121-123℃灭菌30-40min备用。
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30%；
PH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在3-7；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；
放罐标准：60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
（3）发酵液经孔径10-1000μm粗滤，然后于10-20℃循环超滤浓缩去除水分得固形物含量20-40%浓缩液；浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得地衣芽孢杆菌培养物。
所述地衣芽孢杆菌具体为地衣芽孢杆菌（Βacillus licheniformis）β-10-25。该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院），保藏号为CCTCC NO：M2013538。
该菌株为通过物理化学诱变获得，特点如下：
所述菌株在固体平板上菌落为白色，边缘不整齐，表面干燥不透明，镜检为革兰氏阳性细菌，细胞形态呈短杆状，芽孢中生，椭圆形，不膨大。
所述菌株生理生化特征：V-P试验（+），淀粉水解（+），酪素水解（+），明胶水解（+），硝酸盐还原（+），吲哚试验（-），利用柠檬酸盐（+），硝酸还原（+），甘露醇（+），木糖（+）。
所述地衣芽孢杆菌β-10-25是一株高产热稳定性β-葡聚糖酶的菌株，生产所得的β-葡聚糖酶酶活力高达8000-10000u/ml；在室温下保存6个月后酶活损失小于25%，4℃保存12个月后酶活损失小于20%；60℃条件下保存1h后仍能保持80%以上酶活，70℃条件下保存10min后保持20%以上酶活。比现有的β-葡聚糖酶酶活力高，热稳定性及储存稳定性均较高，特别适合饲料工业的需求。
优选的，一种含有益生菌的生长猪专用酶按如下重量份数组成：中草药粉5份，木聚糖酶90份，蛋白酶25份，果胶酶15份，纤维素酶10份，地衣芽孢杆菌培养物25份，中温α-淀粉酶8份。
所述生长猪专用酶适用于饲料加工厂和养殖场自配饲料，使用时应与饲料中的其它原料混合均匀。建议每吨全价料添加量为80-150g（饲料中小麦用量低于30%，添加量为100g/t，小麦用量超过30%，添加量为120-150g/t）。
有益效果：
本发明所添加的地衣芽孢杆菌培养物，与添加纯酶工艺相比不仅简化了酶的纯化工艺，而且在添加酶的同时加入大量益生菌——地衣芽胞杆菌。地衣芽胞杆菌的添加一方面能产生蛋白多肽类抗菌物质，拮抗肠道病原细菌，抑制需氧菌及兼性厌氧菌特别是大肠杆菌等病原菌的繁殖，一方面还能产生除β-葡聚糖酶外的多种酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及纤维素酶等，从而进一步提高畜禽对蛋白质和能量的利用率，促进动物生长。最后，地衣芽胞杆菌还具有增强动物免疫功能、抵御感染和改善动物生理状态的功能。本发明所添加地衣芽孢杆菌培养物中的β-葡聚糖酶酶活力高达8000-10000u/ml；该酶在60℃条件下保存1h后仍能保持80%以上酶活，70℃条件下保存10min后保持20%以上酶活；在室温下保存6个月后酶活损失小于25%，4℃保存12个月后酶活损失小于20%。比现有的β-葡聚糖酶酶活力高，酶作用最适pH值范围宽泛，热稳定性及储存稳定性均较高。相较于市售的生长猪专用酶，在同样的用量下本发明对饲料的酶解率更高，从而提高饲料转化率，降低饲料成本。（采用实施例3的具体数据）。
本发明中添加了中草药粉，其具有天然抗菌和增强免疫力的作用，可以有效的提高畜禽动物的抗应激能力、免疫功能以及抗病防御机能。另外，中草药粉中添加了具有抗热应激原作用的黄芩、板蓝根，使得本发明产品具有更好的稳定性和保存活性，较没有添加中草药粉的产品在长时间高温条件下的保存活性提高了15%。本发明配比合理，有效的补充了内源酶的不足，促进营养物质的消化吸收，提高了塑料利用率，节约了饲养成本。
具体实施方式
实施例1中草药粉的制备方法
一种中草药粉的制备方法如下：
称取黄芪25份；党参15份；板蓝根12份；当归12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下，混合获得中草药粉。
实施例2一种地衣芽孢杆菌培养物的制备方法
括如下步骤：
（1）液体种子扩大培养
①一级种子培养：将活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度40℃，培养时间10h；
②二级种子培养：将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
③三级种子培养：将二级种子以10%接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度40℃，培养时间12h；
④一级种子罐培养：将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度41℃，搅拌速度300rpm，通风量（V/V）1:1.5,罐压0.05Mpa,培养时间15h；
所述种子培养基重量组成为：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl1％，pH5.5，121℃灭菌35min。
（2）发酵罐发酵
将一级种子罐发酵液以3%接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度37℃，搅拌速度250r/min，通风量（V/V）1:1-3,培养时间12h；然后将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至37℃时恒温培养18h；此时，将一级种子罐发酵液以2%接种量追加接入发酵罐，恒温培养12h；继续将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至37℃时恒温培养12h；
所述发酵培养基组成为：麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β-葡聚糖2g，中草药粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值5.5，121℃灭菌20min；
所述发酵培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值5.5，加入中温淀粉酶（3u/g玉米粉）与高温淀粉酶（30u/g玉米粉），同时边搅拌边升温至70℃保温20min，然后缓慢升温至90℃保温20min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH5.5，121℃灭菌35min备用。
所述发酵培养基中的中草药粉组成和制备方法如下：
黄芪20份；党参5份；当归12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下混合获得中草药粉；
（3）发酵液经孔径500μm粗滤，然后于15℃循环超滤浓缩去除水分得固形物含量20%浓缩液；浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得地衣芽孢杆菌培养物。
实施例3一种饲用复合酶制剂的制备方法
一种含有益生菌的生长猪专用酶，由以下重量份数的酶制剂组成：
中草药粉2份，木聚糖酶90份，蛋白酶25份，果胶酶15份，纤维素酶10份，地衣芽孢杆菌培养物25份，中温α-淀粉酶8份。
中草药粉组成：黄芪10份；党参10份；板蓝根15份；当归15份。
按量取产自湖南鸿鹰翔生物工程股份有限公司或其他公司的木聚糖酶，蛋白酶，纤维素酶，中温α-淀粉酶，果胶酶，以及上述的中草药粉，实施例2所述的地衣芽孢杆菌培养物，于25℃条件下在混合机中搅拌均匀，搅拌时间为5分钟。搅拌均匀装箱后于常温或冷室中保存。
实施例4一种饲用复合酶制剂的制备方法
一种含有益生菌的生长猪专用酶，由以下重量份数的酶制剂组成：
中草药粉8份，木聚糖酶80份，蛋白酶20份，果胶酶10份，纤维素酶8份，地衣芽孢杆菌培养物30份，中温α-淀粉酶10份。
中草药粉组成：黄芪30份；党参18份；板蓝根10份；当归12份；
按上述配方取产自湖南鸿鹰翔生物工程股份有限公司的木聚糖酶，蛋白酶，纤维素酶，中温α-淀粉酶，果胶酶，以及上述的中草药粉，实施例2所述的地衣芽孢杆菌培养物，于25℃条件下在混合机中搅拌均匀，搅拌时间为5分钟。搅拌均匀装箱后于常温或冷室中保存。
实施例5一种饲用复合酶制剂的制备方法
一种含有益生菌的生长猪专用酶，由以下重量份数的酶制剂组成：
中草药粉6份，木聚糖酶100份，蛋白酶30份，果胶酶20份，纤维素酶12份，地衣芽孢杆菌培养物20份，中温α-淀粉酶5份。
中草药粉组成：黄芪18份；党参14份；板蓝根13份；当归10份；
按上述配方取产自湖南鸿鹰翔生物工程股份有限公司的木聚糖酶，蛋白酶，纤维素酶，中温α-淀粉酶，果胶酶，以及上述的中草药粉，实施例2所述的地衣芽孢杆菌培养物，于25℃条件下在混合机中搅拌均匀，搅拌时间为5分钟。搅拌均匀装箱后于常温或冷室中保存。
实施例6效果对比实验
选取120头30Kg生长猪，按血统及性别无差异分为实验组和对照组，每组3个重复，每个重复20头猪。实验期为28天，实验组每吨饲料添加本实施例3所述复合酶制剂120g，对照组不添加复合酶制剂，于试验期的始末日早晨空腹称重，计算饲料日增重和料肉比,并对毛色进行打分。实验结果如下表所示：
对照组 试验组
平均日增重(g/d) 655.20 712.67
饲料/增重 2.45 2.16
毛色打分（10分制） 5.5 8.5
实施例5效果对比
选取120头生长猪，按体重、血统及性别无差异分为实验组和对照组，每组3个重复，每个重复20头猪。实验期为28天，实验组和对照组每吨饲料均添加复合酶制剂120g，实验组所用复合酶制剂为实施例3所述复合酶制剂，对照组所用复合酶制剂是为市售生长猪专用酶，于试验期的始末日早晨空腹称重，计算饲料转化率、日增重和料肉比。实验结果如下表所示：
对照组 试验组
平均日增重(g/d) 687.30 705.15
饲料/增重 2.35 2.21
毛色打分（10分制） 7.0 8.5
实施例7中草药粉对酶保存活性的影响
以实施例2中所述的制备方法获得的生长猪专用酶为样品1，以去除实施例2中所有的中草药粉的制备方法获得的生长猪专用酶为样品2，比较两种样品的保存活性。在45℃下保存上述样品18h，之后测定酶活，结果表明：样品1的残余酶活在72%以上，样品2的残余酶活保持在60%左右。

Claims (7)

1.一种含有益生菌的生长猪专用酶，其特征在于：由以下重量份数的组分组成：中草药粉2-8份，木聚糖酶80-100份，蛋白酶20-30份，果胶酶10-20份，纤维素酶8-12份，地衣芽孢杆菌培养物20-30份，中温α-淀粉酶5-10份；
所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Βacillus licheniformis)β-10-25，保藏编号为CCTCCNO：M 2013538；所述中草药粉的制备方法如下：
称取黄芪10-30份；党参10-18份；板蓝根10-15份；当归10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下混合获得中草药粉。
2.如权利要求1所述一种含有益生菌的生长猪专用酶，其特征在于，地衣芽孢杆菌培养物的制备方法，包括如下步骤：
地衣芽孢杆菌β-10-25经斜面菌种活化培养后进行一、二、三级液体种子和种子罐培养；将一级种子罐发酵液以3％接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度35-45℃，搅拌速度200-300r/min，通风量(V/V)1:1-3,培养时间10-15h；然后将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35-45℃时恒温培养15-20h；此时，将一级种子罐发酵液以2％接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h；继续将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35-45℃时恒温培养10-15h；
发酵液经孔径10-1000μm粗滤，然后于10-20℃循环超滤浓缩去除水分得固形物含量20-40％浓缩液；浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得地衣芽孢杆菌培养物。
3.如权利要求2所述的一种含有益生菌的生长猪专用酶，其特征在于；所述种子培养的培养基质量体积比组成为：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl 1％，pH4.5-7.0，121-123℃灭菌30-40min；
所述发酵培养基组成为：麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β-葡聚糖2g，中草药粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值4.5-7.0，121℃灭菌20min；
所述发酵培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节pH值3-7，加入中温淀粉酶，酶活为3u/g玉米粉，高温淀粉酶，酶活为30u/g玉米粉，同时边搅拌边升温至70℃保温15-30min，然后缓慢升温至90℃保温15-30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH3-7，121-123℃灭菌30-40min备用。
4.如权利要求3所述的一种含有益生菌的生长猪专用酶，所述发酵培养基中的中草药粉组成和制备方法如下：黄芪20份；党参5份；当归12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下混合获得中草药粉。
5.一种制备如权利要求1-4所述的含有益生菌的生长猪专用酶的方法，包括如下步骤：
按照原料组成将中草药粉，木聚糖酶，蛋白酶，果胶酶，纤维素酶，地衣芽孢杆菌培养物，中温α-淀粉酶混合均匀即可；
所述木聚糖酶，蛋白酶，果胶酶，纤维素酶，中温α-淀粉酶为湖南鸿鹰翔生物工程股份有限公司或其他现有产品；
所述中草药粉的制备方法如下：
称取黄芪10-30份；党参10-18份；板蓝根10-15份；当归10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下混合获得中草药粉剂；
所述地衣芽孢杆菌培养物的制备方法如下：
(1)种子培养
将地衣芽孢杆菌β-10-25斜面菌种经三级摇瓶发酵剂一级种子罐发酵；
所述种子培养的培养基质量体积比组成为：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl 1％，pH4.5-7.0，121-123℃灭菌30-40min；
(2)发酵罐发酵
将一级种子罐发酵液以3％接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度35-45℃，搅拌速度200-300r/min，通风量(V/V)1:1-3,培养时间10-15h；然后将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35-45℃时恒温培养15-20h；此时，将一级种子罐发酵液以2％接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h；继续将1L经过121℃灭菌20min，温度为10℃的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35-45℃时恒温培养10-15h；
所述发酵培养基组成为：麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β-葡聚糖2g，中草药粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水l000mL，pH值4.5-7.0，121℃灭菌20min；
所述发酵培养基的调配方法为：按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节pH值3-7，加入中温淀粉酶，酶活为3u/g玉米粉，高温淀粉酶，酶活为30u/g玉米粉，同时边搅拌边升温至70℃保温15-30min，然后缓慢升温至90℃保温15-30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH3-7，121-123℃灭菌30-40min备用；
溶解氧控制：通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30％；
pH控制：通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在3-7；
补料控制：当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml；
放罐标准：60-80％菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢；
(3)发酵液经孔径10-1000μm粗滤，然后于10-20℃循环超滤浓缩去除水分得固形物含量20-40％浓缩液；浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得地衣芽孢杆菌培养物。
6.如权利要求1所述的一种含有益生菌的生长猪专用酶，其特征在于：由以下重量份数的组分组成：中草药粉5份，木聚糖酶90份，蛋白酶25份，果胶酶15份，纤维素酶10份，地衣芽孢杆菌培养物25份，中温α-淀粉酶8份。
7.如权利要求1所述的一种含有益生菌的生长猪专用酶在畜禽饲养中的应用。
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