CN103652322A - 一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂，是由40-60％的嗜酸乳酸杆菌、15-20％的嗜淀粉乳酸杆菌、5-10％唾液乳酸杆菌、5-10％嗜热链球菌、5-10％多形拟杆菌和5-10％的葡萄糖经喷雾冷冻干燥复合形成。所有菌株均分离自猪肠道食糜。本发明中考虑了动物肠道的各个部分，将肠道前段产乳酸的乳酸菌与肠道后段分解纤维素和多糖的多形拟杆菌相结合，菌种间的配合比例与健康动物肠道中相应菌的组成相近，能更好地发挥彼此的优势，更好地促进动物的健康，提高饲料消化率，提高动物生产性能。

Description

一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂及其制备方法。

背景技术

健康动物肠道的各个部分都定殖着一种典型的微生物，并与动物形成有益的共生关系。由于集约化高密度养殖方式的出现，家畜对肠道菌群失衡相当敏感，从而导致对营养物质的消化和吸收能力降低，生长迟滞。为了克服这些困难，人们向动物饲粮中添加抗生素。事实也表明，这一做法在降低腹泄和促进生长方面相当有效。可是，有害微生物抗药性的产生对兽药抗生素的使用造成了严重的干扰，并且抗生素本身的效用也因此而降低，且存在残留问题及与人类致病菌产生交叉耐药性的风险，从而对人类健康造成潜在危害。抗生素抗药性从动物传递给人的可能性及消费者对此的警醒，使得禁止在饲料中使用抗生素及限制兽用抗生素的使用成为畜禽养殖的必然趋势。

基于以上原因，寻求一种更天然的饲用添加剂，即益生菌，则成为人们广泛关注的热点。早期关于酸乳产品对人类有益作用的研究发现，肠道微生物群落中最有益的部分为乳酸菌。乳酸菌在各种商品益生菌制剂中最为常见，其次为芽胞杆菌。

在动物的胃肠道中，由于环境pH值、渗透压、可发酵底物等因素的变化，菌群的分布呈现出明显的区域性(表1)。因而由单一菌株或单一菌株复合物组成的乳酸菌类产品很难在整个肠道中形成优势菌群。

表1.猪和禽胃肠道主要部位分布的主要菌群。

中国专利申请号：201010122147.X公开了一种由短乳酸杆菌(Lactobacillus brevis)、德氏乳酸杆菌(Delbrueckii subsp.Lactis)、干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳酸杆菌(Lactobacillus lactis)、戊糖乳酸杆菌(Lactobacilluspentosaces)、布氏乳酸杆菌、植物乳酸杆菌(Lactobacillusplantarum)和耐酸乳酸杆菌(Lactobacillus acetotolerans)复合经冷冻干燥制得的复合乳酸菌饲料添加剂。

以上方法仅是几种购买乳酸菌株的简单复合，菌株的最初来源很可能并不是动物肠道，因而不能确定这些菌株是否适应动物肠道环境。乳酸菌是动物肠道前段(十二指肠、空肠和回肠)的优势菌群，因而以上方法忽略了益生菌对动物肠道后段的作用，没有考虑动物的整个肠道。产品未经包被处理，不耐贮存、不耐高温。

综上所述，所有乳酸菌类饲料添加剂都是由单一菌株构成或由几个种属的单一菌株复合而成，因此添加到饲料中后不能全面覆盖动物的整个肠道，很难在复杂的动物肠道中形成优势菌群，发挥不出乳酸菌作为益生菌应有的效果。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明从动物肠道不同部位分离乳酸菌和多形拟杆菌菌株并进行培养，得到适应动物肠道不同部位环境的菌株，经喷雾急速冷冻干燥包被后，再复合形成能覆盖动物整个肠道的复合益生菌产品，从而克服现有产品菌株单一或覆盖位点不全面的缺点。

一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂，是由40-60％的嗜酸乳酸杆菌、15-20％的嗜淀粉乳酸杆菌、5-10％唾液乳酸杆菌、5-10％嗜热链球菌、5-l0％多形拟杆菌和5-10％的葡萄糖经喷雾冷冻干燥复合形成。所有菌株均分离自猪肠道食糜。

一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂的制备方法：其特征在于，包括以下步骤：

A、动物肠道中嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌、嗜热链球菌和多形拟杆菌的分离、纯化与鉴定：

A1、样本的采集与稀释：无菌取猪空肠和盲肠内容物各1g，分别置于含有小玻璃珠的灭菌三角瓶内(50mL)，按1∶10(g∶V)的比例加入灭菌生理盐水，充分振荡30分钟，使其成为均匀的悬液，此悬液为第一个稀释度(10-1)，另取灭菌小试管若干，每支加入灭菌生理盐水4.5mL，取10-1稀释液0.5mL加入第二管混匀得第二稀释度(10-2)，依次类推作递减稀释，终稀释度为10-11；

A2、配制选择性培养基：

嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌和唾液乳酸杆菌的选择性培养基制备方法如下：酪朊水解物10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、柠檬酸二铵2g、吐温80 1.0mL、三水醋酸钠25g、磷酸二氢钾6g、七水硫酸镁0.58g、七水硫酸亚铁0.03g、四水硫酸猛0.15g、琼脂15g，调节pH至5.4，于121℃灭菌15min，倾注灭菌平皿，-4℃保存备用；

嗜热链球菌的选择性培养基制备方法如下：胰蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、牛肉浸膏5g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g、氯化钠5g、L-半胱氨酸盐酸盐0.3g、琼脂15g、蒸馏水1L、试剂A(不含抗生素的脱脂乳粉10％水溶液或脱脂牛奶100mL，经121℃灭菌5min)、试剂B(滤过除菌的2％氯化三苯四唑(TTC)水溶液)，将以上成分加热溶于1L蒸馏水中，调节pH至6.1，于121℃灭菌15min，冷却至约50℃，加入试剂A和试剂B，前者100mL，后者10mL，混匀后倾注灭菌平皿，-4℃保存备用；

多形拟杆菌的分离选用NBGT血琼脂培养基其制备方法如下：马肉浸液930mL、脙蛋白胨10g、酵母浸膏5g、葡萄糖1.5g、L-胱氨酸0.2g、L-半胱氨酸0.5g、牛磺胆酸钠1g、琼脂15g，将各固体成分加热溶化于马肉浸液中，调pH至7.8，于121℃灭菌15min。冷却至约50℃，每95mL，以无菌操作加入新霉素(2mg/mL水溶液)0.2mL，0.1％煌绿水溶液0.1mL和脱纤维马血5mL，混匀后倾注灭菌平皿，于-4℃下保存备用；

A3、接种：选择10-5、10-6和10-7三个稀释度进行接种，每个稀释度接种三个平皿，每个平皿接种100uL悬浊液，接种后用涂布器涂布均匀。

培养结束后于平皿中选择疑似菌落在相应的培养基上进行划线培养，以达到纯化菌种的目的，培养条件同上；

A4、鉴定：提取纯化后各菌株的DNA和16S rRNA进行碱基序列分析，并用BLAST软件包中的Clustal W程序与GeneBank中的碱基序列进行对比，DNA序列相似度大于70％且16S rRNA序列相似度大于90％时判定为该菌株；

B、扩大培养

B1、一次扩培：

一次扩培培养基制备方法如下：嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌和嗜热链球菌的扩培培养基配方如下：大豆蛋白胨50g、牛肉浸膏50g、酵母浸膏50g、葡萄糖200g、乳糖20g、鲜柑桔汁50mL(柑桔去皮后压榨过滤即得)，将以上组份溶解于1L去离子水中，于121℃条件下灭菌20min，冷却后-4℃保存备用；

多形拟杆菌扩培培养基配方如下：酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨3g、脙蛋白胨10g、酵母浸膏5g、牛肉浸膏2.2g、葡萄糖3g、磷酸二氢钠2.5g、血清消化蛋白胨或消化血液13.5g、氯化钠3g、可溶性淀粉5g、L-半胱氨酸0.3g、硫乙醇酸纳0.3g，将以上组份溶解于1L去离子水中，调节pH至7.3，于121℃条件下灭菌15min，冷却后-4℃保存备用；

将一次扩培培养基分装于100mL培养瓶中，每瓶分装20mL，用接种丝挑取经鉴定后的嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌和嗜热链球菌菌落，分别接种到培养基中，在36℃下，一个大气压的90％氮气+10％二氧化碳环境中厌氧静置培养16-18h，待pH为3.8-4.5时，一次扩培完成。多形拟杆菌于37℃条件下，厌氧静置培养76h；

B2、二次扩培：二次扩培培养基制备方法如下：

嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌和嗜热链球菌的扩培培养基配方如下：大豆蛋白胨200g、棉籽糖20g、鲜柑桔汁100mL(柑桔去皮后压榨过滤即得)、氯化钠10g，将以上组份溶解于2L蒸馏水中，放置到容量为4L的小型发酵罐中，于121℃条件下灭菌20min备用；

多形拟杆菌二次扩培培养基配方如下：胰化酪蛋白胨150g、大豆蛋白胨50g、磷酸氢二钾25g、氯化钠50g、可溶性淀粉5g、L-半胱氨酸0.3g、硫乙醇酸纳0.3g，将以上组份溶解于1L去离子水中，调节pH至7.3，放置于2L的小型发酵罐中，于121℃条件下灭菌15min备用；

将各个菌株的一次扩培发酵液同时接种到二次扩培培养基中，乳酸菌在40℃温度下恒温厌氧静置培养12-14h，pH达3.8-4.5时完成二次扩培；多形拟杆菌在37℃下恒温厌氧静置培养48h后完成二次扩培；

B3、收集发酵菌泥：将二次扩培得到的发酵液无菌操作装入离心管中，25℃条件下，10000rpm/min离心5min，弃去上清液，所得离心沉淀物即为菌泥，用1％蛋白胨水溶液将菌泥重新悬浮成为悬浊液，且使细菌浓度约为109cfu/mL；

B4、喷雾急速冷凝法对各菌株进行微胶囊包被处理

B41、海藻酸盐混合物的制备：将海藻酸钠2％(w/v)、MRS肉汤5.5％(w/v)，甘油5％(w/v)、黄源胶0.26％(w/v)、吐温200.1％(w/v)和细菌悬浊液20％(w/v)加入一定量的蒸馏水中混匀即得；

B42、将以上混合物注入雾化器中雾化，雾化时空气压力为0.6kgf/cm2，液体压力为0.4kgf/cm2；

B43、雾化后的液体微滴用装有适量氯化钙溶液(0.5mo1/L)的收集槽中，收集过程中通过磁力搅拌器不轻轻搅拌氯化钙溶液；

B44、液体微滴在氯化钙溶液中硬化15min，然后用高密筛网过滤，并用蒸馏水洗涤两次，然后再转入壳聚糖乳酸溶液中(壳聚糖C0.8％(w/v)和乳酸1％(v/v))，轻轻搅拌15min使海藻酸盐微胶囊表面被均匀包被；

B45、再将B44处理后的微胶囊过滤并洗涤后，于-72℃冷冻干燥6h，然后于-75℃再干燥18h，干燥时压力设定为5.33Pa。

与现有技术相比本发明的有益效果为：

1、本发明中所有菌株均分离自猪肠道食糜，因而作为饲料添加剂对动物肠道有更好的适应性，效果更确切。

2、本发明中考虑了动物肠道的各个部分，将肠道前段产乳酸的乳酸菌与肠道后段分解纤维素和多糖的多形拟杆菌相结合，菌种间的配合比例与健康动物肠道中相应菌的组成相近，能更好地发挥彼此的优势，更好地促进动物的健康，提高饲料消化率，提高动物生产性能。

3、本发明中给出了一种具有很强的分解纤维素和多糖的益生菌多形拟杆菌，其在猪肠道后段提供的营养物质能满足猪10-15％的维持能量需要，具有很大的经济价值。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂，是由40-60％的嗜酸乳酸杆菌、15-20％的嗜淀粉乳酸杆菌、5-10％唾液乳酸杆菌、5-10％嗜热链球菌、5-10％多形拟杆菌和5-10％的葡萄糖经喷雾冷冻干燥复合形成。

所有菌株均分离自猪肠道食糜。

一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂的制备方法：包括以下步骤：

A、动物肠道中嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌、嗜热链球菌和多形拟杆菌的分离、纯化与鉴定

A1、样本的采集与稀释：无菌取猪空肠和盲肠内容物各1g，分别置于含有小玻璃珠的灭菌三角瓶内(50mL)，按1∶10(g∶V)的比例加入灭菌生理盐水，充分振荡30分钟，使其成为均匀的悬液，此悬液为第一个稀释度(10-1)，另取灭菌小试管若干，每支加入灭菌生理盐水4.5mL，取10-1稀释液0.5mL加入第二管混匀得第二稀释度(10-2)，依次类推作递减稀释，终稀释度为10-11。

A2、配制选择性培养基：

嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌和唾液乳酸杆菌的选择性培养基(培养基1)制备方法如下：酪朊水解物10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、柠檬酸二铵2g、吐温801.0mL、三水醋酸钠25g、磷酸二氢钾6g、七水硫酸镁0.58g、七水硫酸亚铁0.03g、四水硫酸猛0.15g、琼脂15g，调节pH至5.4，于121℃灭菌15min，倾注灭菌平皿，-4℃保存备用。

嗜热链球菌的选择性培养基(培养基2)制备方法如下：胰蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、牛肉浸膏5g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g、氯化钠5g、L-半胱氨酸盐酸盐0.3g、琼脂15g、蒸馏水1L、试剂A(不合抗生素的脱脂乳粉10％水溶液或脱脂牛奶100mL，经121℃灭菌5min)、试剂B(滤过除菌的2％氯化三苯四唑(TTC)水溶液)。将以上成分加热溶于1L蒸馏水中，调节pH至6.1，于121℃灭菌15min，冷却至约50℃，加入试剂A和试剂B，前者100mL，后者10mL，混匀后倾注灭菌平皿，-4℃保存备用。

多形拟杆菌的分离选用NBGT血琼脂培养基(培养基3)，其制备方法如下：马肉浸液930mL、脙蛋白胨10g、酵母浸膏5g、葡萄糖1.5g、L-胱氨酸0.2g、L-半胱氨酸0.5g、牛磺胆酸钠1g、琼脂15g，将各固体成分加热溶化于马肉浸液中，调pH至7.8，于121℃灭菌15min。冷却至约50℃，每95mL，以无菌操作加入新霉素(2mg/mL水溶液)0.2mL，0.1％煌绿水溶液0.1mL和脱纤维马血5mL，混匀后倾注灭菌平皿，于-4℃下保存备用。

A3、接种：选择10-5、10-6和10-7三个稀释度进行接种，每个稀释度接种三个平皿，每个平皿接种100uL悬浊液，接种后用涂布器涂布均匀。具体为：空肠内容物只接种培养基1和培养基2，接种后于37℃恒温厌氧倒置培养48-72h；盲肠内容物接种培养基3，接种后于37℃恒温厌氧倒置培养76h。

培养结束后于平皿中选择疑似菌落在相应的培养基上进行划线培养，以达到纯化菌种的目的，培养条件同上。

A4、鉴定：提取纯化后各菌株的DNA和16S rRNA进行碱基序列分析，并用BLAST软件包中的Clustal W程序与GeneBank中的碱基序列进行对比，DNA序列相似度大于70％且16S rRNA序列相似度大于90％时判定为该菌株。

B、扩大培养

B1、一次扩培：

一次扩培培养基制备方法如下：

嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌和嗜热链球菌的扩培培养基配方如下：大豆蛋白胨50g、牛肉浸膏50g、酵母浸膏50g、葡萄糖200g、乳糖20g、鲜柑桔汁50mL(柑桔去皮后压榨过滤即得)，将以上组份溶解于1L去离子水中，于121℃条件下灭菌20min，冷却后-4℃保存备用。

多形拟杆菌扩培培养基配方如下：酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨3g、脙蛋白胨10g、酵母浸膏5g、牛肉浸膏2.2g、葡萄糖3g、磷酸二氢钠2.5g、血清消化蛋白胨(或消化血液)13.5g、氯化钠3g、可溶性淀粉5g、L-半胱氨酸0.3g、硫乙醇酸纳0.3g，将以上组份溶解于1L去离子水中，调节pH至7.3，于121℃条件下灭菌15min，冷却后-4℃保存备用。

将一次扩培培养基分装于100mL培养瓶中，每瓶分装20mL，用接种丝挑取经鉴定后的嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌和嗜热链球菌菌落，分别接种到培养基中，在36℃下，一个大气压的90％氮气+10％二氧化碳环境中厌氧静置培养16-18h，待pH为3.8-4.5时，一次扩培完成。多形拟杆菌于37℃条件下，厌氧静置培养76h。

B2、二次扩培：二次扩培培养基制备方法如下：

嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌和嗜热链球菌的扩培培养基配方如下：大豆蛋白胨200g、棉籽糖20g、鲜柑桔汁100mL(柑桔去皮后压榨过滤即得)、氯化钠10g，将以上组份溶解于2L蒸馏水中，放置到容量为4L的小型发酵罐中，于121℃条件下灭菌20min备用。

多形拟杆菌二次扩培培养基配方如下：胰化酪蛋白胨150g、大豆蛋白胨50g、磷酸氢二钾25g、氯化钠50g、可溶性淀粉5g、L-半胱氨酸0.3g、硫乙醇酸纳0.3g，将以上组份溶解于1L去离子水中，调节pH至7.3，放置于2L的小型发酵罐中，于121℃条件下灭菌15min备用。

将各个菌株的一次扩培发酵液同时接种到二次扩培培养基中，乳酸菌在40℃温度下恒温厌氧静置培养12-14h，pH达3.8-4.5时完成二次扩培；多形拟杆菌在37℃下恒温厌氧静置培养48h后完成二次扩培。

B3、收集发酵菌泥：将二次扩培得到的发酵液无菌操作装入离心管中，25℃条件下，10000rpm/min离心5min，弃去上清液，所得离心沉淀物即为菌泥，用1％蛋白胨水溶液将菌泥重新悬浮成为悬浊液，且使细菌浓度约为109cfu/mL。

B4、喷雾急速冷凝法对各菌株进行微胶囊包被处理

B41、海藻酸盐混合物的制备：将海藻酸钠2％(w/v)、MRS肉汤5.5％(w/v)，甘油5％(w/v)、黄源胶0.26％(w/v)、吐温200.1％(w/v)和细菌悬浊液20％(w/v)加入一定量的蒸馏水中混匀即得。

B42、将以上混合物注入雾化器中雾化，雾化时空气压力为0.6kgf/cm2，液体压力为0.4kgf/cm2。

B43、雾化后的液体微滴用装有适量氯化钙溶液(0.5mol/L)的收集槽中，收集过程中通过磁力搅拌器不轻轻搅拌氯化钙溶液。

B44、液体微滴在氯化钙溶液中硬化15min，然后用高密筛网过滤，并用蒸馏水洗涤两次，然后再转入壳聚糖乳酸溶液中(壳聚糖C0.8％(w/v)和乳酸1％(v/v))，轻轻搅拌15min使海藻酸盐微胶囊表面被均匀包被。

B45、再将B44处理后的微胶囊过滤并洗涤后，于-72℃冷冻干燥6h，然后于-75℃再干燥18h，干燥时压力设定为5.33Pa。

本发明中所用的乳酸菌亦可以是动物来源的其它乳菌菌，包括短乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌、乳酸乳酸杆菌、布氏乳酸杆菌、植物乳酸杆菌、纤维二糖乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌、罗伊氏乳酸杆菌。本发明中的益生菌除了分离自猪的肠道外，亦可从家禽和牛羊马等其它家畜肠道中分离。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂，其特征在于：是由40-60％的嗜酸乳酸杆菌、15-20％的嗜淀粉乳酸杆菌、5-10％唾液乳酸杆菌、5-10％嗜热链球菌、5-10％多形拟杆菌和5-10％的葡萄糖经喷雾冷冻干燥复合形成。

2.根据权利要求1所述的含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂，其特征在于：所有菌株均分离自猪肠道食糜。

3.一种含乳酸菌的复合益生菌饲料添加剂的制备方法：其特征在于，包括以下步骤：

A、动物肠道中嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌、嗜热链球菌和多形拟杆菌的分离、纯化与鉴定：

A1、样本的采集与稀释：

无菌取猪空肠和盲肠内容物各1g，分别置于含有小玻璃珠的灭菌三角瓶内(50mL)，按1∶10(g∶V)的比例加入灭菌生理盐水，充分振荡30分钟，使其成为均匀的悬液，此悬液为第一个稀释度(10-1)，另取灭菌小试管若干，每支加入灭菌生理盐水4.5mL，取10-1稀释液0.5mL加入第二管混匀得第二稀释度(10-2)，依次类推作递减稀释，终稀释度为10-11；

A2、配制选择性培养基：

嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌和唾液乳酸杆菌的选择性培养基制备方法如下：酪朊水解物10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、柠檬酸二铵2g、吐温801.0mL、三水醋酸钠25g、磷酸二氢钾6g、七水硫酸镁0.58g、七水硫酸亚铁0.03g、四水硫酸猛0.15g、琼脂15g，调节pH至5.4，于121℃灭菌15min，倾注灭菌平皿，-4℃保存备用；

嗜热链球菌的选择性培养基制备方法如下：胰蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、牛肉浸膏5g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g、氯化钠5g、L-半胱氨酸盐酸盐0.3g、琼脂15g、蒸馏水1L、试剂A、试剂B，将以上成分加热溶于1L蒸馏水中，调节pH至6.1，于121℃灭菌15min，冷却至约50℃，加入试剂A和试剂B，前者100mL，后者10mL，混匀后倾注灭菌平皿，-4℃保存备用；

多形拟杆菌的分离选用NBGT血琼脂培养基其制备方法如下：马肉浸液930mL、脙蛋白胨10g、酵母浸膏5g、葡萄糖1.5g、L-胱氨酸0.2g、L-半胱氨酸0.5g、牛磺胆酸钠1g、琼脂15g，将各固体成分加热溶化于马肉浸液中，调pH至7.8，于121℃灭菌15min。冷却至约50℃，每95mL，以无菌操作加入新霉素(2mg/mL水溶液)0.2mL，0.1％煌绿水溶液0.1mL和脱纤维马血5mL，混匀后倾注灭菌平皿，于-4℃下保存备用；

A3、接种：

选择10-5、10-6和10-7三个稀释度进行接种，每个稀释度接种三个平皿，每个平皿接种100uL悬浊液，接种后用涂布器涂布均匀。

培养结束后于平皿中选择疑似菌落在相应的培养基上进行划线培养，以达到纯化菌种的目的，培养条件同上；

A4、鉴定：

提取纯化后各菌株的DNA和16S rRNA进行碱基序列分析，并用BLAST软件包中的Clustal W程序与GeneBank中的碱基序列进行对比，DNA序列相似度大于70％且16S rRNA序列相似度大于90％时判定为该菌株；

B、扩大培养

B1、一次扩培：

一次扩培培养基制备方法如下：嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌和嗜热链球菌的扩培培养基配方如下：大豆蛋白胨50

g、牛肉浸膏50g、酵母浸膏50g、葡萄糖200g、乳糖20g、鲜柑桔汁50mL，将以上组份溶解于1L去离子水中，于121℃条件下灭菌20min，冷却后-4℃保存备用；

多形拟杆菌扩培培养基配方如下：酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨3g、脙蛋白胨10g、酵母浸膏5g、牛肉浸膏2.2g、葡萄糖3g、磷酸二氢钠2.5g、血清消化蛋白胨或消化血液13.5g、氯化钠3g、可溶性淀粉5g、L-半胱氨酸0.3g、硫乙醇酸纳0.3g，将以上组份溶解于1L去离子水中，调节pH至7.3，于121℃条件下灭菌15min，冷却后-4℃保存备用；

将一次扩培培养基分装于100mL培养瓶中，每瓶分装20mL，用接种丝挑取经鉴定后的嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌和嗜热链球菌菌落，分别接种到培养基中，在36℃下，一个大气压的90％氮气+10％二氧化碳环境中厌氧静置培养16-18h，待pH为3.8-4.5时，一次扩培完成。多形拟杆菌于37℃条件下，厌氧静置培养76h；

B2、二次扩培：二次扩培培养基制备方法如下：

嗜酸乳酸杆菌、嗜淀粉乳酸杆菌、唾液乳酸杆菌和嗜热链球菌的扩培培养基配方如下：大豆蛋白胨200g、棉籽糖20g、鲜柑桔汁100mL、氯化钠10g，将以上组份溶解于2L蒸馏水中，放置到容量为4L的小型发酵罐中，于121℃条件下灭菌20min备用；

多形拟杆菌二次扩培培养基配方如下：胰化酪蛋白胨150g、大豆蛋白胨50g、磷酸氢二钾25g、氯化钠50g、可溶性淀粉5g、L-半胱氨酸0.3g、硫乙醇酸纳0.3g，将以上组份溶解于1L去离子水中，调节pH至7.3，放置于2L的小型发酵罐中，于121℃条件下灭菌15min备用；

将各个菌株的一次扩培发酵液同时接种到二次扩培培养基中，乳酸菌在40℃温度下恒温厌氧静置培养12-14h，pH达3.8-4.5时完成二次扩培；多形拟杆菌在37℃下恒温厌氧静置培养48h后完成二次扩培；

B3、收集发酵菌泥：

将二次扩培得到的发酵液无菌操作装入离心管中，25℃条件下，10000rpm/min离心5min，弃去上清液，所得离心沉淀物即为菌泥，用1％蛋白胨水溶液将菌泥重新悬浮成为悬浊液，且使细菌浓度约为109cfu/mL；

B4、喷雾急速冷凝法对各菌株进行微胶囊包被处理

B41、海藻酸盐混合物的制备：将海藻酸钠2％(w/v)、MRS肉汤5.5％(w/v)，甘油5％(w/v)、黄源胶0.26％(w/v)、吐温200.1％(w/v)和细菌悬浊液20％(w/v)加入一定量的蒸馏水中混匀即得；

B42、将以上混合物注入雾化器中雾化，雾化时空气压力为0.6kgf/cm2，液体压力为0.4kgf/cm2；

B43、雾化后的液体微滴用装有适量氯化钙溶液(0.5mol/L)的收集槽中，收集过程中通过磁力搅拌器不轻轻搅拌氯化钙溶液；

B44、液体微滴在氯化钙溶液中硬化15min，然后用高密筛网过滤，并用蒸馏水洗涤两次，然后再转入壳聚糖乳酸溶液中，轻轻搅拌15min使海藻酸盐微胶囊表面被均匀包被；

B45、再将B44处理后的微胶囊过滤并洗涤后，于-72℃冷冻干燥6h，然后于-75℃再干燥18h，干燥时压力设定为5.33Pa。