CN105296591A - 一种用于检测食品中难培养型乳酸菌的培养基以及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测食品中难培养型乳酸菌的培养基以及检测方法，所述培养基的配方为：糖类物质10-40重量份，蛋白胨5-15重量份，酵母膏粉2-6重量份，牛肉膏粉5-15重量份，磷酸氢二钾1-3重量份，柠檬酸三铵1-3重量份，乙酸钠2.5-7.5重量份，硫酸镁0.1-0.3重量份，硫酸锰0.02-0.06重量份，吐温-80？0.5-1.5重量份，可溶性淀粉0.5-1.5重量份，产酸代谢促进因子0.2-2重量份(七水合硫酸亚铁和/或六水合氯化镍)，未受污染的样品过滤清液100-500重量份，补加蒸馏水至1000重量份，pH值调节为4-5.5；本发明提供的培养基能够更好地模拟微生物实际生长环境，同时由于添加了代谢促进因子，能实现固体难培养型乳酸菌的快速培养，通过该培养基的培养发酵能够更加简便、快速地判断腐败乳酸菌是否存在，从而实现对食品中难培养型乳酸菌的快速检测。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种用于检测食品中难培养型乳酸菌的培养基以及检测方法。
背景技术
乳酸菌是能够发酵碳水化合物，并产生大量乳酸的一类细菌的总称。目前，该类微生物因为产酸、合成乳酸菌素等特性，对提高食品保藏性、食品风味、营养附加值以及调节人体肠道菌群具有重要作用。越来越多的乳酸菌正被视为人体益生菌而得到广泛应用。但是实际环境中，诸如酒类饮料、畜禽水产品等食品因为污染乳酸菌，导致食品酸败、异味，感官品质严重劣化。因此，对于非特定乳酸菌发酵食品或灭菌后的食品环境，我们有必要对酸性、厌氧包装等适合乳酸菌生长的环境及食品基质进行乳酸菌风险监控。
目前，MRS、MC和莫匹罗星锂盐改良的MRS等培养基常用于乳酸菌的检测，一些分子生物学、免疫学方法则见于某些特定乳酸菌的检测。实际正常样品中，污染的潜在乳酸菌的浓度往往较低，因此无论哪种检测方法，均需对菌体进行培养富集，但是常见培养基难以模拟实际生长环境，缺乏必要的生长促进因子，导致一些特殊的乳酸菌，存在不能检出、固体培养基难以培养或检出周期较长等问题，例如利用MRS琼脂培养基监测啤酒中常污染的典型腐败乳酸菌Lactobacillusparacollinoides和Lactobacilluslindneri等，在固体培养基上很难生长，培养周期在10天以上，不利于该类微生物的风险控制。
目前也有利用液体培养基替代固体培养基进行食品中乳酸菌检测的方法，例如CN104278086A公开了一种发酵乳制品中乳酸菌的检测方法。该检测方法中，在培养阶段用到的是MRS培养基，其组分为：葡萄糖20重量份，牛肉膏20重量份,琼脂15重量份，蛋白胨10重量份，酵母提取物5重量份、乙酸钠5重量份、柠檬酸二铵2重量份，磷酸氢二钾2重量份，硫酸锰水合物0.8-1重量份，加蒸馏水至1L，加pH调节剂至pH为6.2-6.5，高压灭菌备用。CN102803504A公开了可用于检测样品中的产酸菌的方法。所述方法还提供对产气产酸菌的检测，其中用到的培养基为MRS培养基、APT培养基、胰蛋白胨葡萄糖牛肉浸膏培养基、胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏培养基、番茄汁琼脂和Kan重量份-Fun重量份培养基。虽然这些文献中采用了液体培养基，然而，其对于特定乳酸菌，例如啤酒中常污染的典型腐败乳酸菌Lactobacillusparacollinoides和Lactobacilluslindneri等，很难实现快速培养，从而很难被检出。
万岩松等研究了一种检测与鉴定啤酒腐败乳酸菌(LAB)的微菌落法。在该方法中，细菌细胞经聚碳酸酯膜过滤处理后，置于对啤酒腐败乳酸菌具有高度特异检测能力的ABD培养基中，经短期培养后，由活细胞形成的微菌落用羧基二乙酸荧光染色，利用μFinder检测系统计数。其中ABD培养基的组成为：MRS肉汤培养基粉末2.61重量份、乙酸钠0.5重量份、环乙酰亚胺15.0重量份、琼脂1000mL，调节最终pH值为5.0(参见万岩松等，“微菌落法快速检测与鉴定啤酒腐败乳酸菌”，啤酒科技，第3期，2010年3月10日)。张颖等研究了用改良MRS培养基检测啤酒中乳酸菌的方法，通过用补充麦芽糖和清酒的改良MRS培养基来检测啤酒中的乳酸菌，对生成的菌落进行观察和镜检，并通过KOH试验和过氧化氢酶试验进一步证实(参见张颖等，用改良MRS培养基检测啤酒中乳酸菌的方法，安徽大学学报(自然科学版)，1999年12月25日)。虽然这些文献中重点研究了啤酒中常污染的典型腐败乳酸菌，但并不能很好地模拟微生物实际生长环境，从而实现乳酸菌的较快地培养富集。
因此，如何采用液体培养基来模拟微生物的实际生长环境并实现难培养型乳酸菌的快速培养，从而快速、准确地判断出腐败乳酸菌是否存在已成为目前亟待解决的问题。
发明内容
为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种用于检测食品中难培养型乳酸菌的培养基及检测方法。本发明所提供的培养基能够更好地模拟微生物实际生长环境，同时添加了代谢促进因子，能够实现固体难培养型乳酸菌的快速培养，通过该培养基的培养发酵能够更加简便、快速地判断腐败乳酸菌是否存在，从而实现对食品中难培养型乳酸菌的快速检测。
为达此目的，本发明采用了以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于检测食品中难培养型乳酸菌的培养基，所述培养基配方为：
糖类物质10-40重量份，蛋白胨5-15重量份，酵母膏粉2-6重量份，牛肉膏粉5-15重量份，磷酸氢二钾1-3重量份，柠檬酸三铵1-3重量份，乙酸钠2.5-7.5重量份，硫酸镁0.1-0.3重量份，硫酸锰0.02-0.06重量份，吐温-800.5-1.5重量份，可溶性淀粉0.5-1.5重量份，产酸代谢促进因子0.2-2重量份(七水合硫酸亚铁或六水合氯化镍的一种或两种混合)，未受污染的样品过滤清液100-500重量份，补加蒸馏水至1000重量份，pH值调节为4-5.5。
本发明所述培养基中，所述未受污染的样品过滤清液指的是没有受污染的该样品过滤后的液体，比如说要检测料酒，所述未受污染的样品过滤清液就是指没有变质的料酒。
本发明通过在所述培养基中添加正常样品过滤清液，能够更好地模拟微生物实际生长环境；同时添加七水合硫酸亚铁或六水合氯化镍作为产酸代谢促进因子，从而有效实现难培养型乳酸菌的快速生长产酸，使检测时间至少缩短1倍以上。
本发明中所述糖类物质的添加量为10-40重量份，例如可以是10重量份、12重量份、13重量份、15重量份、16重量份、18重量份、20重量份、22重量份、25重量份、28重量份、30重量份、32重量份、35重量份、40重量份，优选为20-35重量份，进一步优选为30重量份。本发明中所述糖类物质可以是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或乳糖中的至少一种，在此不作特别限定。
本发明所述蛋白胨的添加量为5-15重量份，例如可以是5重量份、6重量份、8重量份、9重量份、10重量份、11重量份、12重量份、13重量份、14重量份、15重量份，优选为10-15重量份，进一步优选为10重量份。
本发明所述酵母膏粉的添加量为2-6重量份，例如可以是2重量份、2.1重量份、2.2重量份、2.3重量份、2.5重量份、2.8重量份、3重量份、3.2重量份、3.3重量份、3.5重量份、3.8重量份、4重量份、4.2重量份、4.5重量份、4.8重量份、4.9重量份、5重量份，优选为2-4重量份，进一步优选为4重量份。
本发明所述牛肉膏粉的添加量为5-15重量份，例如可以是5重量份、6重量份、8重量份、9重量份、10重量份、11重量份、12重量份、13重量份、14重量份、15重量份，优选为10-15重量份，进一步优选为10重量份。
本发明所述磷酸氢二钾的添加量为1-3重量份，例如可以是1重量份、1.1重量份、1.2重量份、1.3重量份、1.5重量份、1.7重量份、1.8重量份、2重量份、2.2重量份、2.5重量份、2.6重量份、2.7重量份、2.8重量份、3重量份，优选为1-2重量份，进一步优选为2重量份。
本发明所述柠檬酸三铵的添加量为1-2重量份，例如可以是1重量份、1.1重量份、1.2重量份、1.3重量份、1.4重量份、1.5重量份、1.6重量份、1.7重量份、1.8重量份、1.9重量份、2重量份、2.2重量份、2.5重量份、2.6重量份、2.7重量份、2.8重量份、3重量份，优选为1-2重量份，进一步优选为2重量份。
本发明所述乙酸钠的添加量为2.5-7.5重量份，例如可以是2.5重量份、2.6重量份、2.7重量份、2.8重量份、2.9重量份、3重量份、3.2、3.5重量份、4重量份、4.5重量份、5重量份、5.5重量份、6重量份、6.5重量份、7重量份、7.5重量份，优选为2.5-5重量份，进一步优选为5重量份。
本发明所述硫酸镁的添加量为0.1-0.3重量份，例如可以是0.1重量份、0.12重量份、0.15重量份、0.18重量份、0.2重量份、0.22重量份、0.25重量份、0.26重量份、0.28重量份、0.3重量份，优选为0.1-0.2重量份，进一步优选为0.2重量份。
本发明所述硫酸镁的添加量为0.02-0.06重量份，例如可以是0.02重量份、0.025重量份、0.03重量份、0.035重量份、0.04重量份、0.045重量份、0.05重量份、0.055重量份、0.06重量份，优选为0.02-0.04重量份，进一步优选为0.04重量份。
本发明所述吐温-80的添加量为0.5-1.5重量份，例如可以是0.5重量份、0.55重量份、0.6重量份、0.65重量份、0.7重量份、0.75重量份、0.8重量份、0.85重量份、0.9重量份、1重量份、1.2重量份、1.3重量份、1.5重量份，优选为0.5-1重量份，进一步优选为1重量份。
本发明所述可溶性淀粉的添加量为0.5-1.5重量份，例如可以是0.5重量份、0.55重量份、0.6重量份、0.65重量份、0.7重量份、0.75重量份、0.8重量份、0.85重量份、0.9重量份、1重量份、1.2重量份、1.3重量份、1.5重量份，优选为0.5-1重量份，进一步优选为1重量份。
本发明所述产酸代谢促进因子的添加量为0.2-2重量份，例如可以是0.2、0.22、0.25、0.3、0.32、0.35、0.38、0.4、0.45、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.5、1.8、2，优选为0.2-0.5重量份，进一步优选为0.5重量份。本发明中所述产酸代谢促进因子可以是七水合硫酸亚铁或六水合氯化镍中的至少一种，在此不作特别限定。
本发明所述未受污染的样品过滤清液的添加量为100-500重量份，例如可以是100重量份、150重量份、200重量份、250重量份、300重量份、350重量份、400重量份、450重量份、500重量份。优选为200-400重量份，进一步优选为200重量份。
本发明所述pH值为4-5.5，例如可以是4、4.1、4.2、4.3、4.5、4.8、5、5.2、5.5，优选为4-5.2，进一步优选为4.2。
作为本发明进一步的改进，所述培养基的配方为：糖类物质20-35重量份，蛋白胨10-15重量份，酵母膏粉2-4重量份，牛肉膏粉5-10重量份，磷酸氢二钾1-2重量份，柠檬酸三铵1-2重量份，乙酸钠2.5-5重量份，硫酸镁0.1-0.2重量份，硫酸锰0.02-0.04重量份，吐温-800.5-1重量份，可溶性淀粉0.5-1重量份，产酸代谢促进因子0.2-0.5重量份(七水合硫酸亚铁或六水合氯化镍的一种或两种混合)，未受污染的样品过滤清液200-400重量份，补加蒸馏水至1000mL，pH值调节为4-5.2。
作为本发明进一步的改进，所述培养基的配方为：葡萄糖20重量份，麦芽糖15重量份，蛋白胨10重量份，酵母膏粉4重量份，牛肉膏粉10重量份，磷酸氢二钾2重量份，柠檬酸三铵2重量份，乙酸钠5重量份，硫酸镁0.2重量份，硫酸锰0.04重量份，吐温-801重量份，可溶性淀粉1重量份，七水合硫酸亚铁0.3重量份，六水合氯化镍0.2重量份，未受污染的样品过滤清液200重量份，补加蒸馏水至1000mL，pH值调节为4.2。
作为本发明进一步的改进，所述培养基的配方为：葡萄糖10重量份，乳糖20重量份，蛋白胨10重量份，酵母膏粉4.0重量份，牛肉膏粉5重量份，磷酸氢二钾2重量份，柠檬酸三铵1重量份，乙酸钠5重量份，硫酸镁0.1重量份，硫酸锰0.04重量份，吐温-801重量份，可溶性淀粉1重量份，七水合硫酸亚铁0.3重量份，六水合氯化镍0.2重量份，未受污染的样品过滤清液400重量份，补加蒸馏水至1000mL，pH值调节为5。
第二方面，本发明还提供了一种食品中难培养型乳酸菌的检测方法，所述方法采用如第一方面所述的培养基进行检测。
本发明中，所述食品中难培养型乳酸菌的检测方法，包括以下步骤：
将待测样品的原液接种于含有如第一方面所述培养基的发酵管中，在30±1℃条件下培养2-5天后，根据发酵液总酸(以乳酸计)值增幅是否大于0.20g/100mL，定性判断是否存在乳酸菌污染风险。
作为本发明进一步的改进，所述方法包括以下步骤：
(1)待测样品的原液的制备：将液体待测样品经过滤除杂后备用；或将固体或半固体待测样品，按照1重量份样品加1-2重量份水搅拌均质，过滤除杂后备用；
(2)配制总体积为1L的培养基：糖类物质10-40重量份，蛋白胨5-15重量份，酵母膏粉2-6重量份，牛肉膏粉5-15重量份，磷酸氢二钾1-3重量份，柠檬酸三铵1-3重量份，乙酸钠2.5-7.5重量份，硫酸镁0.1-0.3重量份，硫酸锰0.02-0.06重量份，吐温-800.5-1.5重量份，可溶性淀粉0.5-1.5重量份，产酸代谢促进因子0.2-2重量份(七水合硫酸亚铁或六水合氯化镍的一种或两种混合)，未受污染的样品过滤清液200-400重量份，补加蒸馏水至1000mL，加热煮沸溶解，pH值调节为4-5.5；
(3)分装灭菌：将所述培养基分装10重量份于试管中，灭菌条件为115℃，15min；
(4)将待测样品的原液接种于含有所述培养基的发酵管中，在30±1℃条件下培养2-5天后，以乳酸计，根据发酵液总酸值增幅是否大于0.20g/100mL，定性判断是否存在乳酸菌污染风险。
本发明中，在调节培养基时，若pH＜4.0，可滴加1mol/L的NaOH调节pH，直至pH值范围：4.0-5.5；若pH＞5.5，则用1mol/L的HCl调节pH，直至pH值范围：4.0-5.5。
若检测样品含热敏性或易挥发等关键性不稳定物质时，则检测样品过滤提取液应采用孔径为0.20-0.45μm滤膜除菌，临用前与培养基其它成分混合，再调节至适宜pH后使用。
第三方面，本发明还提供了如第一方面所述的培养基在检测食品中难培养型乳酸菌的用途。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明所述的培养基能够更好地模拟微生物实际生长环境，同时添加了七水合硫酸亚铁或六水合氯化镍等产酸代谢促进因子，从而有效实现难培养型乳酸菌的快速生长产酸，使检测时间至少缩短1倍以上。
(2)本发明通过采用特殊的液体发酵培养基检测乳酸菌产酸的方法能够简便、较快速地判断腐败乳酸菌是否存在，与GB4789.35-2010规定的乳酸菌总数的检测方法相比，检测时间可以缩短至少2倍，大大提高了检出速率，而且未出现假阳性。
(3)本发明所述的培养基及检测方法可用于非特定乳酸菌发酵或商业无菌的食品因乳酸菌污染等变质问题的快速检测，具有广泛的应用价值。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1：
检测成品酱油：样品1、样品2中腐败乳酸菌的存在
(1)培养基组成成分：
葡萄糖20g，麦芽糖15g，蛋白胨10g，酵母膏粉4g，牛肉膏粉10g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，吐温-801g，可溶性淀粉1g，七水合硫酸亚铁0.5g，未受污染的酱油过滤清液100mL，蒸馏水900mL，调节pH值为5.0，分装10mL于无菌试管中，115℃，15min灭菌。
(2)接种、培养、检测
待测样品摇匀后，每个样品接种4管，每管分别接种1mL。随机取其中2管测定总酸(以乳酸计)，取其平均值作为总酸初始值X0，每个稀释度剩余的2管于30±1℃培养。培养3天后，对剩余2管测定总酸(以乳酸计)，取其平均值作为培养后总酸值X1，计算培养前后的总酸变化值ΔX。同时以GB4789.35-2010规定的乳酸菌总数的检测方法作为对照。
(3)结果如表1-2所示，其中表1为本实施例的检测方法得到的检测结果，表2为以重量份B4789.35-2010规定的乳酸菌总数的检测方法得到的检测结果。
表1
| 样品 | X0/g·100mL-1 | X1/g·100mL-1 | ΔX/g·100mL-1 | 结果判定 |
| 样品1 | 0.39 | 0.64 | 0.25 | ΔX＞0.20，乳酸菌阳性 |
| 样品2 | 0.34 | 0.40 | 0.06 | ΔX＜0.20，乳酸菌阴性 |
表2
| 培养时间 | 2天 | 4天 | 6天 | 8天 | 结果判定 |
| 样品1 | ＜1.0×103 | ＜1.0×103 | ＜1.0×103 | 2.3×104 | 乳酸菌阳性 |
| 样品2 | ＜1 | ＜1 | ＜1 | ＜1 | 乳酸菌阴性 |
注：乳酸菌菌落总数单位：CFU/mL
通过表1、表2可以看出，采用实施例1的检测方法对疑似变质的酱油中的腐败乳酸菌的检出较GB4789.35-2010提供的方法要快，检测时间从6-8天可以缩短至3天，检出速率提高了至少2倍，同时对于阴性样品，采用实施例1的检测方法得到的结果与GB4789.35-2010提供的方法结果一致，未出现假阴性的情况。
实施例2：
检测成品蚝油：样品1、样品2中腐败乳酸菌的存在
(1)培养基组成成分：
葡萄糖10g，蔗糖20g，蛋白胨10g，酵母膏粉4g，牛肉膏粉5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵1g，乙酸钠5g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.04g，吐温-801g，可溶性淀粉1g，六水合氯化镍0.2g，未受污染的蚝油与水(1:1)稀释过滤清液200mL，蒸馏水800mL，煮沸，调节pH值为4.5，分装10mL于无菌试管中，115℃，15min灭菌。
(2)接种、培养、检测
待测样品摇匀后，每个样品接种4管，每管分别接种1mL。随机取其中2管测定总酸(以乳酸计)，取其平均值作为总酸初始值X0，每个稀释度剩余的2管于30±1℃培养。培养3天后，对剩余2管测定总酸(以乳酸计)，取其平均值作为培养后总酸值X1，计算培养前后的总酸变化值ΔX。同时以GB4789.35-2010规定的乳酸菌总数的检测方法作为对照。
(3)结果如表3-4所示，其中表3为本实施例的检测方法得到的检测结果，表4为以GB4789.35-2010规定的乳酸菌总数的检测方法得到的检测结果。
表3
| 样品 | X0/g·100mL-1 | X1/g·100mL-1 | ΔX/g·100mL-1 | 结果判定 |
| 样品1 | 0.78 | 1.05 | 0.27 | ΔX＞0.20，乳酸菌阳性 |
| 样品2 | 0.84 | 0.92 | 0.08 | ΔX＜0.20，乳酸菌阴性 |
表4
| 培养时间 | 2天 | 4天 | 6天 | 8天 | 结果判定 |
| 样品1 | ＜1.0×102 | ＜1.0×102 | ＜1.0×102 | 6.1×103 | 乳酸菌阳性 |
| 样品2 | ＜1.0 | ＜1.0 | ＜1.0 | ＜1.0 | 乳酸菌阴性 |
注：乳酸菌菌落总数单位：CFU/mL
蚝油中腐败乳酸菌属难培养的一类乳酸菌，本发明方案对疑似变质的蚝油中的腐败乳酸菌的检出较GB4789.35-2010提供的方法要快，检出速率较国标方法提高了近两倍，同时对阴性样品，本发明方案检测结果与国标法一致，未出现假阴性情况。
实施例3
检测啤酒：样品1、样品2中腐败乳酸菌的存在
(1)培养基组成成分：
葡萄糖10g，乳糖20g，蛋白胨10g，酵母膏粉4g，牛肉膏粉10g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸三铵2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.04g，吐温-801g，可溶性淀粉0.5g，七水合硫酸亚铁0.5g，六水合氯化镍0.5g，蒸馏水600mL，煮沸，115℃，15min灭菌。
将未受污染的啤酒过滤清液400mL用孔径0.22μm滤膜除菌后加入上述已灭菌培养基中，调节pH值为5.5，分装10mL于无菌试管中。
(2)接种、培养、检测
待测样品摇匀后，每个样品接种4管，每管分别接种1mL。随机取其中2管测定总酸(以乳酸计)，取其平均值作为总酸初始值X0，每个稀释度剩余的2管于30±1℃培养。培养4天后，对剩余2管测定总酸(以乳酸计)，取其平均值作为培养后总酸值X1，计算培养前后的总酸变化值ΔX。同时以GB4789.35-2010规定的乳酸菌总数的检测方法作为对照。
(3)结果如表5-6所示，其中表5为本实施例的检测方法得到的检测结果，表6为以GB4789.35-2010规定的乳酸菌总数的检测方法得到的检测结果。
表5
| 样品 | X0/g·100mL-1 | X1/g·100mL-1 | ΔX/g·100mL-1 | 结果判定 |
| 样品1 | 0.28 | 0.55 | 0.27 | ΔX＞0.20，乳酸菌阳性 |
| 样品2 | 0.29 | 0.33 | 0.04 | ΔX＜0.20，乳酸菌阴性 |
表6
| 培养时间 | 2天 | 4天 | 6天 | 8天 | 10天 | 12天 | 结果判定 |
| 样品1 | ＜1.0×102 | ＜1.0×102 | ＜1.0×102 | ＜1.0×102 | ＜1.0×102 | 5.2×103 | 乳酸菌阳性 |
| 样品2 | ＜1 | ＜1 | ＜1 | ＜1 | ＜1 | ＜1 | 乳酸菌阴性 |
注：乳酸菌菌落总数单位：CFU/mL
通过表5、表6可以看出，采用本实施例的检测方法对疑似变质的啤酒中的腐败乳酸菌的检出较GB4789.35-2010提供的方法要快，检测时间从10-12天可以缩短至4天，检出速率提高了2倍以上，同时对于阴性样品，采用实施例3的检测方法得到的结果与GB4789.35-2010提供的方法结果一致，未出现假阴性的情况。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (8)
1.一种用于检测食品中难培养型乳酸菌的培养基，其特征在于，所述培养基的配方为：
糖类物质10-40重量份，蛋白胨5-15重量份，酵母膏粉2-6重量份，牛肉膏粉5-15重量份，磷酸氢二钾1-3重量份，柠檬酸三铵1-3重量份，乙酸钠2.5-7.5重量份，硫酸镁0.1-0.3重量份，硫酸锰0.02-0.06重量份，吐温-800.5-1.5重量份，可溶性淀粉0.5-1.5重量份，产酸代谢促进因子0.2-2重量份，未受污染的样品过滤清液100-500重量份，补加蒸馏水至1000重量份，pH值调节为4-5.5。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基的配方为：
糖类物质20-35重量份，蛋白胨10-15重量份，酵母膏粉2-4重量份，牛肉膏粉5-10重量份，磷酸氢二钾1-2重量份，柠檬酸三铵1-2重量份，乙酸钠2.5-5重量份，硫酸镁0.1-0.2重量份，硫酸锰0.02-0.04重量份，吐温-800.5-1重量份，可溶性淀粉0.5-1重量份，产酸代谢促进因子0.2-0.5重量份，未受污染的样品过滤清液200-400重量份，补加蒸馏水至1000重量份，pH值调节为4-5.2。
3.如权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述培养基的配方为：
葡萄糖20重量份，麦芽糖15重量份，蛋白胨10重量份，酵母膏粉4重量份，牛肉膏粉10重量份，磷酸氢二钾2重量份，柠檬酸三铵2重量份，乙酸钠5重量份，硫酸镁0.2重量份，硫酸锰0.04重量份，吐温-801重量份，可溶性淀粉1重量份，七水合硫酸亚铁0.3重量份，六水合氯化镍0.2重量份，未受污染的样品过滤清液200重量份，补加蒸馏水至1000重量份，pH值调节为4.2。
4.如权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述培养基的配方为：
葡萄糖10重量份，乳糖20重量份，蛋白胨10重量份，酵母膏粉4重量份，牛肉膏粉5重量份，磷酸氢二钾2重量份，柠檬酸三铵1重量份，乙酸钠5重量份，硫酸镁0.1重量份，硫酸锰0.04重量份，吐温-801重量份，可溶性淀粉1重量份，七水合硫酸亚铁0.3重量份，六水合氯化镍0.2重量份，未受污染的样品过滤清液400重量份，补加蒸馏水至1000重量份，pH值调节为5。
5.一种食品中难培养型乳酸菌的检测方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求1-4任一项所述的培养基进行检测。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将待测样品的原液接种于含有所述培养基的发酵管中，在30±1℃条件下培养2-5天后，以乳酸计，根据发酵液总酸值增幅是否大于0.20g/100mL，定性判断是否存在乳酸菌污染风险。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)待测样品的原液的制备：将液体待测样品经过滤除杂后备用；或将固体或半固体待测样品，按照1重量份样品加1-2重量份水搅拌均质，过滤除杂后备用；
(2)配制总体积为1L的培养基：糖类物质10-40重量份，蛋白胨5-15重量份，酵母膏粉2-6重量份，牛肉膏粉5-15重量份，磷酸氢二钾1-3重量份，柠檬酸三铵1-3重量份，乙酸钠2.5-7.5重量份，硫酸镁0.1-0.3重量份，硫酸锰0.02-0.06重量份，吐温-800.5-1.5重量份，可溶性淀粉0.5-1.5重量份，产酸代谢促进因子0.2-2重量份，未受污染的样品过滤清液100-500重量份，补加蒸馏水至1000重量份，加热煮沸溶解，pH值调节为4-5.5；
(3)分装灭菌：将所述培养基分装10重量份于试管中，灭菌条件为115℃，15min；
(4)将待测样品的原液接种于含有所述培养基的发酵管中，在30±1℃条件下培养2-5天后，以乳酸计，根据发酵液总酸值增幅是否大于0.20g/100mL，定性判断是否存在乳酸菌污染风险。
8.如权利要求1-4任一项所述的培养基在检测食品中难培养型乳酸菌的用途。
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