CN106497806A - 一种冠突散囊菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种冠突散囊菌株及其应用，冠突散囊菌株(Eurotium cristatum)于2016年的10月13日保藏于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13173；冠突散囊菌株是从茯砖茶中分离出的；冠突散囊菌株用于制备冠突散囊菌株微生物制剂。本发明的冠突散囊菌株微生物制剂具有抗氧化作用(具有清除DPPH自由基的作用、清楚超氧阴离子作用、具有还原作用)，抑菌作用(抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肠沙门氏菌)，以及抑制乙酰胆碱酯酶活性作用。

Description

一种冠突散囊菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种冠突散囊菌株及其应用，属于益生菌筛选技术领域。
背景技术
冠突散囊菌，俗称“金花”，在茯砖茶内部呈黄色闭囊壳，属于真菌界，曲霉科，是茯砖茶发花过程中产生的一种自然益生菌体。冠突散囊菌的命名很复杂，最初叫“灰绿曲菌”，后来又称“谢瓦氏曲菌”，再后来又改为“冠突散曲菌”，到了20世纪末才称作“冠突散囊菌”。冠突散囊菌外观看呈球形，黄色，在显微镜下观察，可以明显看到许多具小的子囊孢子和分生孢子，子囊孢子有两个明显的冠状突起，看起来像是双凸镜。分生孢子外形看起来像是椭球形，头部是灰绿色的，孢子外壁较粗糙，有刺状的突起。散囊菌属于茯砖茶中的优势菌株，菌株的发酵产物具有良好的抗氧化性，对乙酰胆碱酯酶具有较强的抑制作用，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肠沙门氏菌均有抑制作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，而提供一种冠突散囊菌株及其应用，从茯砖茶中分离出冠突散囊菌株。
本发明的冠突散囊菌株(Eurotium cristatum)于2016年的10月13日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13173。
本发明的冠突散囊菌株用于制备冠突散囊菌株微生物制剂。
本发明的冠突散囊菌株微生物制剂是通过下述方法制备而成的：
(1)制备孢子悬液：将冠突散囊菌株接种于试管中的斜面PDA固体培养基上，培养5-6天，待斜面上的菌落由白色变为淡黄色再变为灰褐色后说明孢子成熟；用生理盐水冲洗斜面制备孢子悬液，混匀10min后，调整孢子悬液使其孢子浓度为1×108CFU/mL后备用；
(2)发酵：将PDA液体培养基在三角瓶中进行分装，PDA液体培养基的装液量(培养基的体积占三角瓶容积的百分比)为10-50％；于121℃条件下灭菌20min；灭菌后冷却，放入提前紫外灭菌的无菌操作台中，取步骤(1)得到的GT-1菌株孢子悬液接种于发酵培养液中，接种量(孢子悬液的体积占发酵培养液体积的百分比)为0.5-2.5％；接种后，于恒温震荡培养箱中在25℃、160r/min下发酵9-15天，得到GT-1菌株的发酵液；
(3)粗提：将步骤(2)得到的GT-1菌株的发酵液过滤菌丝体，旋蒸液体的体积至原体积的1/10，然后向其中加入三倍体积的95％乙醇，沉淀大分子糖；12h后在5000r/min下离心10min，取上清液旋蒸并冷冻干燥，得到GT-1菌株发酵液粗提物，粗提物即为冠突散囊菌株微生物制剂。
上述技术方案中，步骤(1)中，所述的PDA固体培养基的制备方法为：马铃薯20g洗净切块，加入100ml蒸馏水煮沸20min，过滤取上清液并加水补足100mL；加入葡萄糖2g、蛋白胨0.5g、KH2PO4 0.3g、MgSO4·7H2O 0.25g、维生素B10.01g、琼脂2g，pH自然(不用调节)。
上述技术方案中，步骤(1)中，所述的孢子悬液制备完成后立即发酵，避免孢子失活。
上述技术方案中，步骤(2)中，所述的孢子悬液的装液量优选为13％。
上述技术方案中，步骤(2)中，所述的孢子悬液的接种量优选为2.2％。
上述技术方案中，步骤(2)中，所述的发酵时间优选为9天。
上述技术方案中，步骤(2)中，所述的PDA液体培养基的制备方法为：马铃薯20g洗净切块，加入100ml蒸馏水煮沸20min，过滤取上清液并加水补足100mL；加入碳源2g、氮源0.2g、KH2PO4 0.05g、MgSO4·7H2O 0.1g。
所述的碳源为麦芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖或果糖中的任意一种，优选为麦芽糖；
所述的氮源为硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、酵母膏或蛋白胨中的任意一种，优选为酵母膏。
本发明提供一种冠突散囊菌株微生物制剂在制备抗氧化方面的药物、食品或保健品方面的应用。
本发明提供一种冠突散囊菌株微生物制剂在制备抗老年痴呆方面的药物、食品或保健品方面的应用。
本发明的冠突散囊菌株微生物制剂具有抗氧化作用(具有清除DPPH自由基的作用、清楚超氧阴离子作用、具有还原作用)，抑菌作用(抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肠沙门氏菌)，以及抑制乙酰胆碱酯酶活性作用。
附图说明
图1：冠突散囊菌株PCR产物的电泳图；
图2：发酵液中的碳源种类对冠突散囊菌株微生物制剂清除DPPH自由基的影响；
图3：发酵液中的氮源种类对冠突散囊菌株微生物制剂清除DPPH自由基的影响；
图4：发酵时间对冠突散囊菌株微生物制剂清除DPPH自由基的影响；
图5：装液量对冠突散囊菌株微生物制剂清除DPPH自由基的影响；
图6：接种量对冠突散囊菌株微生物制剂清除DPPH自由基的影响；
图7：冠突散囊菌株微生物制剂清除DPPH自由基的效果；
图8：冠突散囊菌株微生物制剂清除超氧阴离子的效果；
图9：冠突散囊菌株微生物制剂的还原力；
图10：冠突散囊菌株微生物制剂的抑制乙酰胆碱酯酶的效果。
具体实施方式
以下对本发明技术方案的具体实施方式详细描述，但本发明并不限于以下描述内容：
实施例1：冠突散囊菌株的筛选与鉴定
本发明的冠突散囊菌株分离于茯砖茶，包括以下步骤：
(1)初筛：
在无菌条件下，将茯砖茶上的金花闭囊壳接种到PDA固体培养基上，在30℃培养箱中培养至菌落生长为黄色时，挑取菌株进行PDA平板划线；待菌株进入生长旺盛期，重复操作3次，直至菌株得到初步纯化；挑取平板上的金黄色单菌落，接种到PDA固体培养平板上，继续培养直至菌落生长成黄色，得到目标菌株；
所述的PDA固体培养基的制备方法为：马铃薯20g洗净切块，加入100ml蒸馏水煮沸20min，过滤取上清液并加水补足100mL；加入葡萄糖2g、蛋白胨0.5g、KH2PO4 0.3g、MgSO4·7H2O 0.25g、维生素B10.01g、琼脂2g，pH自然(不用调节)。
(2)复筛：
挑取步骤(1)中的目标菌株的黄色闭囊壳，放入装有100mL灭菌生理盐水与玻璃珠的锥形瓶中，轻轻摇动锥形瓶，使菌液均匀，并进行10倍梯度稀释；取10-3—10-6稀释倍数的稀释液分别涂布到PDA培养基上，30℃条件下培养箱静置培养3d，观察菌落情况，选取长有2个单菌落的平板，得到的菌落即为冠突散囊菌株(简称GT-1)的目标单菌落。
对GT-1菌株进行形态分析：GT-1菌株为边远较为整齐的圆形菌落，培养初期，菌落为白色菌丝，随着时间的增加，3天后菌落逐渐慢慢变为淡黄色；最终成熟后菌落的边缘为淡黄色，越往内部颜色越深，呈淡褐色，菌落中心部位为褐色；菌落背面无脊无褶，呈深褐色。GT-1菌落由菌丝体及子囊果构成，子囊果呈球形，内部含有孢子，孢子呈球状。GT-1菌落的菌落形态与已发现的散囊菌非常相似。GT-1菌株的电泳图如图1所示。
经18SrDNA序列测定可知，本发明的GT-1菌株为冠突散囊菌株(Eurotiumcristatum)，于2016年的10月13日保藏于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13173。
实施例2：发酵液中的碳源种类对冠突散囊菌株微生物制剂清除DPPH自由基的影响
是通过下述方法制备而成的：
(1)制备孢子悬液：将冠突散囊菌株接种于试管中的斜面PDA固体培养基上，培养5-6天，待斜面上的菌落由白色变为淡黄色再变为灰褐色后说明孢子成熟；用生理盐水冲洗斜面制备孢子悬液，混匀10min后，调整孢子悬液使其孢子浓度为1×108CFU/mL后立即发酵，避免孢子失活；
PDA固体培养基的制备方法为：马铃薯20g洗净切块，加入100ml蒸馏水煮沸20min，过滤取上清液并加水补足100mL；加入葡萄糖2g、蛋白胨0.5g、KH2PO4 0.3g、MgSO4·7H2O0.25g、维生素B10.01g、琼脂2g，pH自然(不用调节)。
(2)发酵：将PDA液体培养基在三角瓶中进行分装，PDA液体培养基的装液量为40％；于121℃条件下灭菌20min；灭菌后冷却，放入提前紫外灭菌的无菌操作台中，取步骤(1)得到的GT-1菌株孢子悬液接种于发酵培养液中，接种量为2％；接种后，于恒温震荡培养箱中在25℃、160r/min下发酵9天，得到GT-1菌株的发酵液；
所述的PDA液体培养基的制备方法为：马铃薯20g洗净切块，加入100ml蒸馏水煮沸20min，过滤取上清液并加水补足100mL；加入碳源2g、蛋白胨0.2g、KH2PO4 0.05g、MgSO4·7H2O 0.1g。
碳源分别为麦芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖，进行单因素实验，各处理3个重复；
(3)粗提：将步骤(2)得到的GT-1菌株的发酵液过滤菌丝体，旋蒸液体的体积至原体积的1/10，然后向其中加入三倍体积的95％乙醇，沉淀大分子糖；12h后在5000r/min下离心10min，取上清液旋蒸并冷冻干燥，得到GT-1菌株发酵液粗提物，粗提物即为冠突散囊菌株微生物制剂。
分别测量不同碳源的粗提物清除DPPH自由基的作用：将GT-1菌株发酵液粗提物冻干粉配置成2.5mg/mL的溶液，测定其抗氧化性。实验设对照管、样品管、样参管。向对照管和样品管中分别加入2.4mL 0.1mMDPPH，样参管中加入2.4mL无水乙醇，样品管和样参管分别加入0.5mL的样品，用样品的浸提试剂将各管补充至4mL。将各管充分混匀后，在黑暗处放置30min后测A517。
DPPH自由基清除率(％)＝[1-(A对照-A样品)/A对照]×100％
结果如图2所示：发酵培养液中碳源的选择，对发酵液活性物物质DPPH自由基清除率有很大的影响。依次以麦芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖为碳源培养后发现，麦芽糖为碳源的培养液对DPPH自由基清除率显著高于其他组，达到93.1％。
实施例3：发酵液中的氮源种类对冠突散囊菌株微生物制剂清除DPPH自由基的影响
方法步骤与实施例2基本相同，所不同的是，步骤(2)中，碳源为麦芽糖，而氮源分别为硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、酵母膏、蛋白胨，进行单因素实验，各处理3个重复；结果如图3所示：以酵母膏为氮源的发酵液中菌株生长良好，呈规则的球形，且DPPH自由基清除率显著高于其他组别，清除率达到95.3％。以氯化铵、硫酸铵、酵母膏为氮源时发酵液粗提物对DPPH自由基清除率普遍在80％左右，且差异不显著。
实施例4：发酵时间对冠突散囊菌株微生物制剂清除DPPH自由基的影响
方法步骤与实施例2基本相同，所不同的是，步骤(2)中，发酵培养液中的碳源为麦芽糖、氮源为酵母膏；对发酵时间进行单因素实验，发酵时间分别为3、6、9、12、15d，各处理3个重复；结果如图4所示：随着发酵天数的增加，发酵液粗提物对DPPH自由基清除率也相应的增加，在第6天后菌体量迅速增加，DPPH自由基清除率迅速增加，这与菌株生长状态相吻合。发酵粗提物的DPPH自由基清除率在第9天时达到最高，达到90.9％，之后随着发酵时间的延长，DPPH自由基清除逐渐下降。
实施例5：装液量对冠突散囊菌株微生物制剂清除DPPH自由基的影响
方法步骤与实施例2基本相同，所不同的是，步骤(2)中，发酵培养液中的碳源为麦芽糖、氮源为酵母膏，发酵时间为9天，对装液量进行单因素实验，装液量分别为10％、20％、30％、40％、50％，各处理3个重复；由图5可知，随着装液量的增加，发酵液粗提物对DPPH自由基清除率反而相应的减小，装液量为10％的时候，发酵粗提物的DPPH自由基清除率达到90.8％，之后随着发酵时间的延长，DPPH自由基清除逐渐下降。分析可能是由于装液量低的时候，培养液中溶解的氧气较多，利于抗氧化活性物质的产生所致。
实施例6：接种量对冠突散囊菌株微生物制剂清除DPPH自由基的影响
方法步骤与实施例2基本相同，所不同的是，步骤(2)中，发酵培养液中的碳源为麦芽糖、氮源为酵母膏，发酵时间为9天，装液量为10％；对接种量进行单因素实验，接种量分别为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％，各处理3个重复；由图6可知，随着接种量的增加，发酵液粗提物对DPPH自由基清除率出现先增后降的趋势，接种量为2％的时候，发酵粗提物的DPPH自由基清除率达到90％，之后随着接种量的增加，DPPH自由基清除下降。
实施例7：制备冠突散囊菌株微生物制剂
以实施例2-6的实验结果为参考，根据正交试验要求，以发酵时间、装液量、接种量3个因素，设计3因素3水平正交组合，正交表和结果表如下所示：
表1：正交表
表2：正交试验结果表
由上述表1和2可知，在三个单因素对结果的影响顺序为装液量＞接种量＞发酵时间，数据得出的最优发酵条件为发酵时间9天、装液量13％、接种量2.2％，在此发酵条件下发酵产物对DPPH自由基的清除率为91.8％。经验证试验得，最优条件下发酵产物DPPH自由基的清除率达到92.9％。
表3：试验结果方差分析
因素 偏差平方和 自由度 F比 Fα(α＝0.05) 显著性
发酵时间(d) 7.762 2 3.179 19.000
装液量(％) 109.262 2 44.743 19.000 *
接种量(％) 46.549 2 19.062 19.000 *
误差 2.44 2
注：*表示差异显著。
由表3可知，装液量与接种量对GT-1菌株发酵液提取物清除DPPH自由基影响显著，发酵时间对实验结果影响不显著。
按照正交实验得到的最佳条件制备冠突散囊菌株微生物制剂，方法步骤与实施例2基本相同，所不同的是，步骤(2)中，发酵培养液中的碳源为麦芽糖、氮源为酵母膏，发酵时间为9天，装液量为13％，接种量为2.2％，最终得到冠突散囊菌株微生物制剂。
应用实施例一：实施例7得到的冠突散囊菌株微生物制剂的抗氧化作用
(1)对DPPH自由基清除效果
DPPH自由基由于结构较为稳定，因此可以在环境中稳定存在，在体外抗氧化试验中一般选取其为实验底物进行抗氧化研究。DPPH溶于乙醇中显紫色，在A517nm处有吸收峰。当与自由基清除剂接触后紫色会消退，在A517nm处吸收减小，吸光度减小的程度与清除剂的清除能力呈数量关系，清除能力越强吸光值越小。
试管中预先加入DPPH的乙醇溶液2.4mL后加入样品0.5mL，混合均匀。用蒸馏水补充反应体系至4mL，室温暗处反应0.5h，之后测定A517nm吸光值。
DPPH自由基清除率(％)＝[1-(A对照-A样品)/A对照]×100％
(2)对超氧阴离子清除效果
采用邻苯三酚自氧化方法测定，碱性条件下邻苯三酚能迅速自氧化释放超氧阴离子，在A316nm处有最大吸收峰。
实验用4支试管，编号1、2、3、4，每支加入5mLTris-Hcl，1、2号加入50μL蒸馏水，2、3号加入50μL样品，充分混匀于25℃条件下反应20min；1、4号加入10mM盐酸40μL，2号加入25mM邻苯三酚40μL，计时30s后，3号加入25mM邻苯三酚40μL,3min后向2号加入50μLDTT，3min30s后1、3、4号加入50μLDTT，室温反应15min后出的吸光值。
超氧阴离子自由基清除率(％)＝(A2-A3+A4)/A2×100％
(3)还原力测定
采用铁氰化钾还原测定法测定，反应体系中，样品提供电子使Fe3+还原为Fe2+，根据700nm处吸光值的变化可以得知Fe3+含量的变化，即可反映出体系中还原反应进行的程度。
试管中依次加入1mL样品、0.2mL0.2mol/L的磷酸缓冲液、0.5mL1％铁氰化钾，混匀后50℃水浴20min，加入1mL10％TCA混匀，5000r/min离心10min取1.5mL上清液，加入0.2mL1％FeCl3以及3mL蒸馏水，静置5min，蒸馏水为空白对照，测定吸光值。
结果如图7、8、9所示，由图7可知：随着提取物浓度的增加其对DPPH自由基的清除率也随之上升。当发酵提取物浓度逐渐达到1.5mg/mL后，清除速率逐渐放缓，当发酵液提取物的浓度达到2.5mg/mL时，其DPPH自由基清除率达到了93.9％，其IC50值为0.78mg/mL。由图8可知：随着发酵液提取物浓度的增加其对超氧阴离子自由基的清除率也随之上升。当发酵液提取物的浓50mg/mL时，其对超氧阴离子自由基的清除率达到了95.0％，其IC50值为10.70mg/mL。由图9可知：发酵液提取物具有很强的还原性，随着发酵液提取物浓度的增加其还原力越强。当发酵液提取物浓度为3mg/mL时，其还原力为0.98。
应用实施例二：实施例7得到的冠突散囊菌株微生物制剂的抑制乙酰胆碱酯酶的效果
用DMSO将提取物配置成不同浓度的溶液，对其抑制乙酰胆碱酯酶活性进行测定。取4支试管分别编号1、2、3、4，分别添加pH8.0的磷酸缓冲液2950μL、2880μL、2880μL、2950μL，之后分别加入AchI20μL，DTNB100μL混匀；之后向1、2号中加入、DMSO100μL，3、4号中加入待测样品100μL，2、3号中加入70μL乙酰胆碱酯酶，混匀；37℃水浴4min20s后分别添加40％SDS100μL，测定A412nm。
AchE抑制率(％)＝[A2-(A3-A4)/A2]×100
结果如图10所示：GT-1发酵液提取物对乙酰胆碱酯酶的清除效果随着提取物浓度的增加而增强，当浓度增加到20mg/mL之后，其增长速率趋于缓和。当发酵液提取物浓度达到40mg/mL时，其对乙酰胆碱酯酶的清除率达到92.2％，其IC50值为14.17mg/mL。
应用实施例三：实施例7得到的冠突散囊菌株微生物制剂的抑菌的效果
供试菌株的活化:将保藏的供试菌株划线接种到LB琼脂斜面，37℃培养24h后4℃冰箱储存。
菌液制备：无菌条件下，挑取一环活化菌种接种于LB肉汤中，37℃恒温摇床培养12h。用生理盐水对菌液进行稀释，使菌悬液细菌数量为106-108cfu/mL。
打孔法抑菌:吸取制备好的菌悬液0.1mL加入到灭菌平板中，之后向平板中倾注适量的LB琼脂培养基，充分混匀，等待完全凝固后，用打孔器打孔。吸取10μL样品，滴入孔中，37℃倒置培养8-12h，采用十字交叉法测定抑菌圈直径，重复3次试验。结果如表4所示：
表4 GT-1菌株发酵液提取物的抑菌效果
注：同列中相同上标代表数值间差异不显著，不同上标代表数值间差异显著(p＜0.05)
由表可知，GT-1菌株发酵液提取物具有一定的抑菌效果，其抑菌效果随着发酵液提取物浓度的增加而增加。
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种冠突散囊菌株(Eurotium cristatum)GT-1，其保藏编号为CGMCCNo.13173。
2.一种权利要求1所述的冠突散囊菌株在制备冠突散囊菌株微生物制剂方方面的应用。
3.一种冠突散囊菌株微生物制剂，是以权利要求1所述的冠突散囊菌株为菌种，通过以下步骤制备得到的：
(1)制备孢子悬液：将冠突散囊菌株接种于试管中的斜面PDA固体培养基上，培养5-6天，待斜面上的菌落由白色变为淡黄色再变为灰褐色后说明孢子成熟；用生理盐水冲洗斜面制备孢子悬液，混匀10min后，调整孢子悬液使其孢子浓度为1×108CFU/mL后备用；
(2)发酵：将PDA液体培养基在三角瓶中进行分装，PDA液体培养基的装液量为10-50％；于121℃条件下灭菌20min；灭菌后冷却，放入提前紫外灭菌的无菌操作台中，取步骤(1)得到的GT-1菌株孢子悬液接种于发酵培养液中，接种量为0.5-2.5％；接种后，于恒温震荡培养箱中在25℃、160r/min下发酵9-15天，得到GT-1菌株的发酵液；
(3)粗提：将步骤(2)得到的GT-1菌株的发酵液过滤菌丝体，旋蒸液体的体积至原体积的1/10，然后向其中加入三倍体积的95％乙醇，沉淀大分子糖；12h后在5000r/min下离心10min，取上清液旋蒸并冷冻干燥，得到GT-1菌株发酵液粗提物，粗提物即为冠突散囊菌株微生物制剂。
4.根据权利要求3所述的冠突散囊菌株微生物制剂，其特征在于，步骤(1)中，所述的PDA固体培养基的制备方法为：马铃薯20g洗净切块，加入100ml蒸馏水煮沸20min，过滤取上清液并加水补足100mL；加入葡萄糖2g、蛋白胨0.5g、KH2PO4 0.3g、MgSO4·7H2O 0.25g、维生素B1 0.01g、琼脂2g，pH自然。
5.根据权利要求3所述的冠突散囊菌株微生物制剂，其特征在于，步骤(1)中，所述的孢子悬液制备完成后立即发酵，避免孢子失活。
6.根据权利要求3所述的冠突散囊菌株微生物制剂，其特征在于，步骤(2)中，所述的孢子悬液的装液量为13％；所述的孢子悬液的接种量为2.2％；所述的发酵时间为9天。
7.根据权利要求3所述的冠突散囊菌株微生物制剂，其特征在于，步骤(2)中，所述的PDA液体培养基的制备方法为：马铃薯20g洗净切块，加入100ml蒸馏水煮沸20min，过滤取上清液并加水补足100mL；加入碳源2g、氮源0.2g、KH2PO4 0.05g、MgSO4·7H2O 0.1g；
所述的碳源为麦芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖或果糖中的任意一种，优选为麦芽糖；
所述的氮源为硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、酵母膏或蛋白胨中的任意一种，优选为酵母膏。
8.根据权利要求7所述的冠突散囊菌株微生物制剂，其特征在于，所述的碳源为麦芽糖，所述的氮源酵母膏。
9.权利要求3所述的突散囊菌株微生物制剂在制备抗氧化方面的药物、食品或保健品方面的应用。
10.权利要求3所述的冠突散囊菌株微生物制剂在制备抗老年痴呆方面的药物、食品或保健品方面的应用。
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