CN113249233A

CN113249233A - 冠突散囊菌和菌剂及它们的应用

Info

Publication number: CN113249233A
Application number: CN202110728284.6A
Authority: CN
Inventors: 陈欣怡; 江俊杰; 郑晓卫; 丁子元; 陈博; 江玉华; 王璐燕; 郭元亨; 范佳硕; 杨鑫; 夏冰
Original assignee: Beijing Baiaoyinuo Biotechnology Co Ltd; Cofco Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing baiaoyinnuo Biotechnology Co., Ltd; COFCO Biotechnology (Beijing) Co., Ltd
Priority date: 2021-06-29
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2021-08-13
Anticipated expiration: 2041-06-29
Also published as: CN113249233B

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株冠突散囊菌和菌剂及它们的应用。该冠突散囊菌的保藏号为CGMCC No.19604。将本发明冠突散囊菌应用于植物提取液的发酵中，获得的发酵产品不仅安全，且相比于未发酵产品，其在抗氧化、减少皮肤斑痕和黑色素沉积、抗菌、抗紫外、抗过敏和抗炎上的效果得到了较大的提高。

Description

冠突散囊菌和菌剂及它们的应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株冠突散囊菌和菌剂及它们的应用。

背景技术

茶叶是一种天然、健康的饮品，具有较高的营养和药用价值。国内外研究发现，茶叶中的茶多酚类物质具有美白皮肤、延缓皮肤衰老等生理功能，是公认的天然抗氧化剂，占茶叶干重的20-30%。有紫外线“过滤器”之称的茶多酚，是皮肤的有效保护剂。茶多酚可预防人体内的自由基直接攻击生物分子或由其诱发的脂质氧化产物进一步交联生物分子而损伤皮肤。将茶叶提取物用于化妆水、膏、霜中，防止化妆品中的油脂酸败，并有收敛、抗氧化、消臭、抗菌、消炎作用，抑制黑色素形成的效果，还可以防止人体皮肤受到紫外线的各种伤害。

酒糟是酿酒或者酒精行业的副产物，它富含大量的营养物质如粗淀粉、粗纤维、粗蛋白、无氮浸出物、粗脂肪、氨基酸和各种维生素、微量元素、酶类等生物活性物质。每年各种白酒厂、啤酒厂、酒精厂等发酵企业，除了生产出千万吨的酒精类产品，同时会产生数倍的酒糟。这些酒糟数量巨大，而且营养成分丰富，但露天常温堆放很容易腐败变质，造成周边环境污染。利用酒糟提取活性成分研制化妆品是酒糟高值化综合利用的新方向。发酵提取物成为日系美妆产品都非常喜欢拿来做的宣传卖点。酒糟中提取的活性物质如抗氧化活性成分以及多种生物酶活性成分，具有极强的保湿、抗氧化和抗衰老作用。

随着我国葡萄产量的增长和葡萄加工业的极大发展，每年产生约占葡萄加工量25%的大量皮渣废弃物，其中，主要是葡萄皮、种子和果梗等，不仅污染环境，而且造成功能性成分和资源的浪费。研究表明，葡萄的多酚类化合物主要分布于葡萄籽和皮中，有花色苷类、白藜芦醇、单宁和原花青素等对保护心血管系统、清除自由基、抗氧化、抗突变、抗癌、抗辐射、促进细胞增殖等都有很好的生物学活性。葡萄色素属于天然花色苷类色素，安全、无毒且含有一定的营养成分，具有抗氧化和清除自由基的等作用，发酵产生的醋酸有利于脸部污垢去除,清洁脸部角质，使皮肤嫩滑,美白。如果将其运用到化妆品中，则蕴含着巨大的经济效益。

皮肤是人体最大的器官，直接与环境接触，有着保护机体的作用，是人体抵抗外界的第一道屏障。同时好的肌肤也反映着人的精气神与状态。现阶段快节奏的生活与空气污染等因素，正严重考验着皮肤。肌肤问题也在这些情况下不断暴露出来。大众在不断找寻能保养肌肤，改善肤质的产品，并且对产品的效果也有这很高的期望。

发明内容

为了实现上述目的，本发明提供了一株冠突散囊菌和菌剂及它们的应用。本发明将冠突散囊菌应用于植物提取液的发酵中，获得的发酵产品不仅安全，且相比于未发酵产品，其在抗氧化、减少皮肤斑痕和黑色素沉积、抗菌、抗紫外、抗过敏和抗炎上的效果得到了较大的提高。

因此，本发明第一方面提供一株冠突散囊菌（Eurotium cristatum），该冠突散囊菌的保藏号为CGMCC No.19604。

本发明第二方面提供一种菌剂，所述菌剂包含如上所述的冠突散囊菌（Eurotium cristatum）。

本发明第三方面提供如上所述的冠突散囊菌或如上所述的菌剂在制备发酵产品中的应用。

本发明第四方面提供一种植物提取液的发酵方法，该方法包括：将如上所述的冠突散囊菌的孢子或如上所述的菌剂接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵产物；

其中，所述发酵培养基含有植物提取液或为植物提取液；

其中，所述植物提取液选自黑茶提取液、绿茶提取液、酒糟提取液、葡萄籽提取液和葡萄皮提取液中的至少一种。

本发明第五方面提供如上所述的方法得到的发酵产品。

本发明第六方面提供如上所述的冠突散囊菌、如上所述的菌剂或如上所述的发酵产品在制备具有抗氧化、减少皮肤斑痕和黑色素沉积、抗菌、抗紫外、抗过敏和抗炎中的至少一种的产品中的应用。

通过本发明的技术方案，能够获得如下的有益效果：

本发明将冠突散囊菌应用于植物提取液的发酵中，得到发酵产物，能够抑制DPPH自由基、酪氨酸酶活性、金黄色葡萄球菌，以及抑制斑马鱼鱼胚体表黑色素的沉积、Tryptase的分泌，斑马鱼巨噬细胞和中性粒细胞在斑马鱼尾鳍伤口处聚集的数量减少，因此本发明发酵得到的发酵产物具有抗氧化、减少皮肤斑痕和黑色素沉积、抗菌、抗紫外、抗过敏和抗炎的功效，可用于制备有特殊功效的化妆品原料。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物保藏

本发明提供的冠突散囊菌（Eurotium cristatum），简称为BC 70008，于2020年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNo.19604，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所（缩写为CGMCC）。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，

图1为本发明提供的冠突散囊菌CGMCC No.19604的孢子囊与孢子；

图2为本发明提供的化妆品原料对鱼胚体表黑色素沉积的影响；

图3为在荧光显微镜下观察巨噬细胞和中性粒细胞在尾鳍伤口聚集情况。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供了一株冠突散囊菌（Eurotium cristatum），该冠突散囊菌的保藏号为CGMCC No.19604。

所述冠突散囊菌CGMCC No.19604的形态学特征为：菌落形态多呈圆形或椭圆形，个别为不规则形状。菌落边缘厚度较中央略低，培养2-3 d菌落为白色或淡黄色，边缘呈白色绒毛辐射状，中央呈黄色；培养4-5 d菌落边缘转为黄色或深黄色，中央呈深黄色或黑褐色，菌落颜色由边缘至中央呈同心圆状逐渐变深；培养6-7 d菌落呈黑褐色或橄榄色，且培养基被染成橄榄色或棕褐色。菌落结构致密，以闭囊壳为主，后期培养基背面呈深黄色或棕褐色。

所述冠突散囊菌CGMCC No.19604的ITS序列如SEQ ID NO:1所示，与NCBI中数据比对，与Eurotium cristatum有99%的同源性。

SEQ ID NO:1：

TAGGGGTGCGGGGTCTCTGGGTCACCTCCCATCCGTGTCTATCTGTACCCTGTTGCTTCGGCGTGGCCACGGCCCGCCGGAGACTAACATTTGAACGCTGTCTGAAGTTTGCAGTCTGAGTTTTTAGTTAAACAATCGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAATTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTTCCGTCCCTGGCAACGGGGACGGGCCCAAAAGGCAGTGGCGGCACCATGTCTGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCCCGTAGGTCCAGCTGGCAGCTAGCCTCGCAACCAATCTTTTTAACCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGAGGAA

冠突散囊菌俗称“金花”，属于散囊菌目发菌科散囊菌属的一种真菌，由子囊果和菌丝组成，营养要求低，可在马铃薯葡萄糖琼脂培养基、孟加拉红培养基生长，适应性强，能利用多种氮源、碳源。

本发明提供的冠突散囊菌（Eurotium cristatum）可在固体培养基上生长产生大量孢子。所述固体培养基可以为真菌培养常用的固体培养基，例如，PDA培养基（马铃薯180-220g、葡萄糖18-22g，琼脂15-20g，蒸馏水补至终体积1000mL，自然pH，121℃灭菌15-20min）。其在PDA培养基上培养的条件可以包括：温度为25-35℃，时间为3-7天。产生孢子后，可在培养基上加入无菌生理盐水，震荡使孢子混匀，得到孢子悬浮液，其浓度可达到10³-10⁹CFU/ml。

其中，获得的所述孢子悬浮液可以作为发酵菌种进行接种。

第二方面，本发明提供了一种菌剂，所述菌剂包含如上所述的冠突散囊菌（Eurotium cristatum）。

根据本发明，所述菌剂的形式可以不受特别的限制，比如可以为液体菌剂（例如，如上的孢子悬浮液）、半液体菌剂、浓缩菌剂、压缩菌剂或固体菌剂。

优选地，该菌剂含有所述冠突散囊菌的孢子。所述菌剂中孢子的数量可以在较宽的范围内选择，只要满足相关标准的要求即可，优选地，所述菌剂中孢子的含量在10³-10⁹CFU/g菌剂以上。

根据本发明，所述菌剂可以按照本领域常规的方法进行制备，根据本发明一种具体的实施方式，所述菌剂的制备方法包括：将如上所述的冠突散囊菌在PDA固体培养基上于25-35℃下进行培养3-7天，然后在培养基上加入无菌生理盐水，震荡使孢子混匀，得到孢子悬浮液，其浓度可达到10³-10⁹CFU/ml。所述孢子悬浮液可以直接作为菌剂使用，如果需要长期保存，可以按照本领域常规的方法将所得孢子制备成固体菌剂。

第三方面，本发明提供了如上所述的冠突散囊菌或如上所述的菌剂在制备发酵产品中的应用。

根据本发明，所述发酵产品优选为植物发酵产品，具体的，可以为发酵植物提取液所获得的产品。

其中，所述植物提取液的种类不受特别的限制，例如，可以包括但不限于黑茶提取液、绿茶提取液、酒糟提取液、葡萄籽提取液和葡萄皮提取液中的至少一种。

通过将如上所述的冠突散囊菌的孢子或如上所述的菌剂接种至植物提取液中进行发酵，可获得在抗氧化、减少皮肤斑痕和黑色素沉积、抗菌、抗紫外、抗过敏和抗炎中的至少一种上具有显著功效的产品。

第四方面，本发明提供了一种植物提取液的发酵方法，该方法包括：将如上所述的冠突散囊菌的孢子或如上所述的菌剂接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵产物；

其中，所述发酵培养基含有植物提取液或为植物提取液；

能够理解的是，所述提取液含有提取过程中产生的固体残渣，也即，提取结束后不需要固液分离。

根据本发明一种优选的实施方式，所述植物提取液为水提取液。所述水提取液的制备方法可以包括：将相应的植物原料按照一定的料液比，例如，以质量计，1-5:100，与水混合后，在20-100℃（优选50-100℃）的条件下进行提取10-60min。

其中，所述提取还可以在超声的条件下进行。

根据本发明一种优选的实施方式，所述植物提取液为黑茶提取液或绿茶提取液，其制备方法包括：以质量计，将黑茶或绿茶按照1-5:100的料液比与水混合后，在50-100℃的条件下进行提取10-60min。

根据本发明另一种优选的实施方式，所述植物提取液为酒糟提取液，其制备方法包括：将酒糟粉碎，然后以质量计，将粉碎后的酒糟按照1-5:100的料液比与水混合后，在50-100℃的条件下进行提取10-60min。

其中，所述酒糟可以为常规的酿酒或酒精行业得到的酒糟副产品，其含有粗淀粉、粗纤维、粗蛋白、无氮浸出物、粗脂肪、氨基酸和各种维生素、微量元素、酶类等生物活性物质。根据本发明一种优选的实施方式，所述酒糟含有4.6-14.8重量%的粗淀粉、10.0-10.2重量%的粗纤维、3.7-13.8重量%的粗蛋白、18.2-19.3重量%的无氮浸出物、0.9-3.5重量%的粗脂肪、5.6-12.8重量%的氨基酸，维生素1000-1500 mg/100g、微量元素1.0-2.5 mg/100g。

根据本发明另一种优选的实施方式，所述植物提取液为葡萄籽提取液和/或葡萄皮提取液，其制备方法包括：将葡萄籽和/或葡萄皮粉碎，然后以质量计，将粉碎后物料按照1-5:100的料液比与水混合后，在50-90℃的条件下超声提取10-60min。

根据本发明，所述发酵的条件可以为常规的发酵条件，优选的，所述发酵的条件包括：温度为10-45℃，优选为30-40℃，时间为24-120h，优选为60-80h。

根据本发明，冠突散囊菌的孢子的接种量可以在较宽的范围内选择，优选的，以10³-10⁹CFU/ml的孢子浓度的悬浮液计，接种总量为1-5体积%。

根据本发明，优选的，该方法还包括将所述发酵产物进行固液分离，获得液相，然后对所述液相依次进行脱色和灭菌。

其中，所述固液分离可以按照常规的操作进行，例如，过滤、离心、静置等。根据本发明一种优选的实施方式，在3000-10000g下将获得发酵液进行离心3-10min，获得上清液，即为所述液相。

根据本发明，所述脱色的方法不受特别的限制，根据本发明一种优选的实施方式，所述脱色为树脂脱色，进一步优选的，添加上清液1-5重量%的树脂脱色24-120h。

其中，所述树脂可以为常规的具有脱色功能的树脂，优选的，所述树脂为ab-8树脂，其可以购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司。

根据本发明，所述灭菌的方法不受特别的限制，作为一个原则，尽可能的保留体系中的活性成分，因此，优选的，所述灭菌为过滤灭菌，例如，过0.1-0.3μm的滤膜。

第四方面，本发明提供了如上所述的方法得到的发酵产品。

由此，本发明还提供了一种化妆品原料，其含有如上所述的发酵产品、防腐剂和保湿剂。

其中，所述保湿剂可以为化妆品领域中常规使用的保湿剂，例如，可以为乙基己基甘油，其含量优选为发酵产品的0.01-1重量%。

其中，所述防腐剂可以为化妆品领域中常规使用的防腐剂，例如，可以为苯氧乙醇，其含量优选为发酵产品的0.1-1重量%。

第五方面，本发明提供了如上所述的冠突散囊菌、如上所述的菌剂或如上所述的发酵产品在制备具有抗氧化、减少皮肤斑痕和黑色素沉积、抗菌、抗紫外、抗过敏和抗炎中的至少一种的产品中的应用。

根据本发明，所述产品可以为保健品、药品或化妆品。

优选的，所述产品为化妆品，其可以包括但不限于柔肤水、乳液、精华液、面霜、膏。

按照功效分，本发明所制备的所述化妆品可以为美白护肤品、抗氧化护肤品、抗菌护肤品、抗炎护肤品、抗敏护肤品及抗紫外护肤品。

在所述产品中，如上所述的发酵产品的添加量可以为1-30重量%，优选1-20重量%。能够理解的是，根据预定产品的不同，所述产品中还含有相应的添加剂、稳定剂、赋形剂等等。

实施例

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下面通过具体较佳实施例结合附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中，除非特别说明，所用试剂、培养基均为市售商品，所用方法均为常规方法。

实施例中使用的PDA固体培养基为：马铃薯 200g、葡萄糖 20g，琼脂 15-20g，蒸馏水补至终体积1000mL，自然pH，121℃灭菌15-20min；

实施例中使用的LB固体培养基为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、琼脂15-20g，蒸馏水补至终体积1000mL，调节pH至7，121℃灭菌15-20min。

制备例1

用于说明茶叶提取液的制备

黑茶和绿茶分别以3重量%的比例加入水中，90℃水中浸泡45 min，分别获得黑茶和绿茶提取液。

制备例2

用于说明酒糟提取液的制备

酒糟粉碎后，以4重量%的比例加入水中，60℃加热60 min，获得酒糟提取液。

酒糟营养成分包括：粗蛋白含量8.42-9.70 g/100 g、粗脂肪含量2.50-2.90 g/100 g、粗纤维含量3.50-4.18 g/100 g、粗灰分含量2.50-3.24 g/100 g、无氮浸出物含量16.07 -25.80g/100 g、淀粉含量9.19-13.67 g/100 g和水分含量65.19 g/100 g。

制备例3

用于说明葡萄皮渣提取液的制备

葡萄皮渣（葡萄籽和葡萄皮）粉碎后，以5重量%的比例加入水中，90℃超声浸提30min，获得葡萄皮渣提取物。

制备例4

用于说明冠突散囊菌CGMCC NO. 19604孢子悬液制备

冠突散囊菌CGMCC NO. 19604在25-35℃PDA平板培养7d，显微镜观察其孢子囊和孢子（如图1所示），加入无菌生理盐水，振荡使孢子混匀，调整孢子悬液浓度为1×10⁸CFU/mL。

对比制备例1

用于说明CICC NO.2099（参比菌株）孢子悬液制备

冠突散囊菌CICC NO.2099在25-35℃PDA平板培养7d，加入无菌生理盐水，振荡使孢子混匀，调整孢子悬液浓度为1×10⁸CFU/mL。

实施例1

含有冠突散囊菌CGMCC NO. 19604发酵黑茶提取物的化妆品原料的制备

冠突散囊菌CGMCC NO. 19604孢子悬液以2体积%接种量接种于制备例1制备的黑茶提取液中发酵3天，8000×g离心10 min取上清后，添加1重量%树脂ab-8（西安蓝晓科技新材料股份有限公司）脱色2天，0.22μm细菌过滤器灭菌，加0.5重量%苯氧乙醇和0.07重量%乙基己基甘油，所得液体即为原料。

实施例2

含有冠突散囊菌CGMCC NO. 19604发酵绿茶提取物的化妆品原料的制备

冠突散囊菌CGMCC NO. 19604孢子悬液以2体积%接种量接种于制备例1制备的绿茶提取液中发酵3天，8000×g离心10 min取上清后，添加1%树脂ab-8（西安蓝晓科技新材料股份有限公司）脱色2天，0.22μm细菌过滤器灭菌，加0.5重量%苯氧乙醇和0.07重量%乙基己基甘油，所得液体即为原料。

实施例3

含有冠突散囊菌CGMCC NO. 19604发酵酒糟提取物的化妆品原料的制备

冠突散囊菌CGMCC NO. 19604孢子悬液以2体积%接种量接种于制备例2制备的酒糟提取液中发酵3天，5000×g离心10 min取上清后，添加1.5%树脂ab-8（西安蓝晓科技新材料股份有限公司）脱色2天，0.22μm细菌过滤器灭菌，加0.5重量%苯氧乙醇和0.07重量%乙基己基甘油，所得液体即为原料。

实施例4

含有冠突散囊菌CGMCC NO. 19604发酵葡萄皮渣提取物的化妆品原料的制备

冠突散囊菌CGMCC NO. 19604孢子悬液以2体积%接种量分别接种于制备例3制备的葡萄皮渣提取液中发酵3天，5000×g离心10 min取上清后，添加2%树脂ab-8（西安蓝晓科技新材料股份有限公司）脱色2天，0.22μm细菌过滤器灭菌，加0.5重量%苯氧乙醇和0.07重量%乙基己基甘油，所得液体即为原料。

对比例1-4

用于说明含有参比菌株的发酵植物提取液的化妆品原料的制备

分别按照实施例1-4的方法进行化妆品原料的制备，分别获得含有参比菌株的发酵黑茶提取物的化妆品原料的制备（对比例1）、含有参比菌株的发酵绿茶提取物的化妆品原料的制备（对比例2）、含有参比菌株的发酵酒糟提取物的化妆品原料的制备（对比例3）、含有参比菌株的发酵葡萄皮渣提取物的化妆品原料的制备（对比例4）。

测试例1

上述实施例1-2和对比例1-2中化妆品原料的茶多酚含量的检测

溶液配置：酒石酸亚铁溶液的配制：称取硫酸亚铁1.0 g、酒石酸钾钠5.0 g、加水溶解并溶至1 L。pH 7.5磷酸盐缓冲液配制：a液：1/15moL/L磷酸氢二钠溶液：称取23.877 g加水溶解并稀至1 L。b 液：1/15moL/L 的磷酸二氢钾液：称取经110℃烘干的磷酸二氢钾9.078 g，加水溶解1 L。取a液85 mL和b液15 mL混匀，即待pH 7.5缓冲液。

准确吸取上述试液及黑茶、绿茶发酵液1 mL 于25 mL容量瓶中，加水4 mL，加酒石酸亚铁溶液5 mL，充分混匀后，用pH 7.5缓冲液稀至刻度；以试剂空白液作为参比液，于540nm波长处，测定试液吸光度A。

计算公式：

茶多酚含量（mg/mL）=A×1.957×2

式中；A—试样的吸光度；

1.957—用10 mm比色杯，当吸光度等于0.5时，每毫升茶汤中含茶多酚相当于1.957 mg。

茶多酚检测结果显示（如表1所示），黑茶提取物的茶多酚含量为12.29 mg/mL，绿茶提取物的茶多酚含量为11.04 mg/mL，冠突散囊菌发酵黑茶提取物的茶多酚含量为19.14mg/mL，冠突散囊菌发酵绿茶提取物的茶多酚含量为20.59mg/mL，结果发现经冠突散囊菌发酵后的茶叶发酵液茶多酚含量较未发酵提取物茶多酚含量高。参比菌株发酵虽然相较于未发酵的提取物中茶多酚的含量有所提高，但明显不如本申请的冠突散囊菌发酵结果。

表1 发酵与未发酵的茶叶提取物的茶多酚含量

测试例2

上述实施例1-2和对比例1-2化妆品原料的儿茶素(EGCG)含量的检测

制备液相色谱流动相：流动相A：分别将90mL乙腈、20mL乙酸、2mLEDTA加入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀；流动相B：分别将800mL乙腈、20mL乙酸、2mLEDTA加入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。

色谱条件：流动相流速：1mL/min；柱温：35℃；紫外检测器：检测波长为278nm；梯度条件：100%A相保持10min，15min内由100%A相转为68%A相和32%B相，然后68%A相和32%B相保持10min，最后100%A相进行洗脱。

样品处理：发酵茶叶提取物稀释25倍后经0.22μm细菌过滤器过滤。

待流速和柱温稳定后，进行空白运行。准确吸取10μL混合标准系列工作液注射入HPLC。在相同的色谱条件下注射10μL测试液。测试液以峰面积定量。

EGCG检测结果显示（如表2所示），黑茶提取物的EGCG含量为1.021mg/mL，绿茶提取物的EGCG含量为0.914mg/mL，冠突散囊菌发酵黑茶提取物的EGCG含量为1.956mg/mL，冠突散囊菌发酵绿茶提取物的EGCG含量为1.110mg/mL，结果发现经冠突散囊菌发酵后的茶叶发酵液茶多酚含量较未发酵提取物EGCG含量高。参比菌株发酵虽然相较于未发酵的提取物中茶多酚的含量有所提高，但明显不如本申请的冠突散囊菌发酵结果。

表2发酵与未发酵的茶叶提取物的儿茶素(EGCG)含量

测试例3

上述实施例1-2和对比例1-2中化妆品原料的抑菌效果

将金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）在LB培养基划线培养，挑取单菌落至LB液体培养基中培养，30℃培养，转速180rpm，得到指示菌种子液。

将2%琼脂倒入平皿中，形成2-4mm的底板，待其凝固后，将无菌牛津杯等间距的放入平板中，含0.75%琼脂的LB培养基冷却至50-55℃时，将指示菌以0.5v/v%比例加入含0.75%琼脂的LB固体培养基中，摇匀，倾注至已放置好牛津杯的平皿中，厚度为牛津杯的一半为宜，待其凝固后，取出牛津杯，将200μL发酵植物提取物加入至孔中，以未发酵的作为空白。抑制率计算公式如下，结果如表3所示。

抑制率（%）=

表3 冠突散囊菌对金黄色葡萄球菌的抑制效果

由表3可以看出，本发明的冠突散囊菌发酵植物提取液之后能够赋予其对金黄色葡萄球菌的抑制效果。

测试例4

上述实施例1-4和对比例1-4化妆品原料的抗氧化活性

用无水乙醇溶解DPPH配制浓度为0.1mg/mL的溶液，冷藏避光保存，用50%乙醇溶解配制浓度为12.5mg/mL的溶液，作为阳性对照。

稀释200倍的供试液及阳性对照VC葡糖苷各100μL加入至96孔板中，再加入100μLDPPH溶液，空白对照为孔中加入100μL DPPH溶液和100μL无水乙醇，为了扣除本底颜色对实验的干扰，待溶液加入完毕后，避光反应30min后于517nm波长下用酶标仪检测其吸光度，溶剂空白加DPPH后的吸光度为 A₀，溶剂空白加无水乙醇后的吸光度为A₀ ^’,供试品加 DPPH后的吸光度为A₁，供试品加无水乙醇后的吸光度为 A₁ ^’，按以下公式计算各供试品对DPPH自由基的清除能力，结果如表4所示。

DPPH清除率(%) =

冠突散囊菌发酵后黑茶、绿茶、酒糟、葡萄皮渣提取物的DPPH自由基清除率较未发酵的高，未发酵黑茶、绿茶、酒糟、葡萄皮渣提取物DPPH自由基清除率为81.152%、80.12%、66.68%、88.36%，冠突散囊菌发酵黑茶、绿茶、酒糟、葡萄皮渣提取物的发酵液DPPH自由基清除率为92.65%、95.31%、75.52%、97.11%，VC葡糖苷DPPH自由基清除率为92.04%。参比菌株发酵虽然相较于未发酵的提取物DPPH自由基清除率有所提高，但明显不如本申请的冠突散囊菌发酵结果。

表4发酵与未发酵的植物提取物的DPPH自由基清除率

测试例5

上述实施例1-4和对比例1-4化妆品原料的抑制斑痕和色素沉积的效果

在酪氨酸酶反应生成黑色素的过程中，酪氨酸酶的催化作用主要发生在酪氨酸转化为多巴以及多巴转化为多巴醌这两个反应中。多巴醌是一有色物质，可以用分光光度计(475 nm)测定。准确吸取稀释200倍的水提物 1 m L，酪氨酸酶液（100U/ml） 0.5 m L，加pH=6.0 的磷酸缓冲液至 4 m L，于室温下静置 10 min。加入 0.015 mol/L 多巴溶液 1 mL混匀，静置 10 min。以 p H=6.0 的磷酸缓冲液为参比，在 475 nm 处测定吸光度。以熊果苷和VC葡糖苷作为阳性对照，每个样品做 3 个平行样，抑制率计算公式如下，结果如表5所示。

抑制率=

其中，A 为有酪氨酸酶但没有水提物；B 为无酪氨酸酶液也无水提物；C 为既有酪氨酸酶液也有水提物；D 为有水提物但没有酪氨酸酶。

结果发现，经发酵过的植物提取物酪氨酸酶抑制率更高，未发酵黑茶、绿茶、酒糟、葡萄皮渣提取物酪氨酸酶抑制率分别为76.11%、80.75%、60.66%、68.64%，冠突散囊菌发酵黑茶、绿茶、酒糟、葡萄皮渣提取物的发酵液酪氨酸酶抑制率分别为85.65%、89.31%、84.27%、83.55%，熊果苷和VC葡糖苷酪氨酸酶抑制率分别为94.52%、72.24%。参比菌株发酵虽然相较于未发酵的提取物酪氨酸酶抑制率有所提高，但明显不如本申请的冠突散囊菌发酵结果。

表5发酵与未发酵的植物提取物的酪氨酸酶抑制率

此外，将性成熟斑马鱼雌雄分缸饲养于斑马鱼养殖单元中。暴露实验开始前一天将雌雄以1:2配对，自然交配产卵。选用6孔细胞培养板，每孔放入鱼胚20枚，实验重复三组。设置样品1实验浓度为0.5、1.0和2.0重量%，以熊果苷为阳性对照，设置实验浓度为0.5、1.0和2.0mg/ml，另设空白对照组。每孔分别加入测试样品溶液、阳性对照溶液和空白对照溶液5.0ml。鱼加入实验溶液前，和孵育至48、72 hpf时，在体式显微镜下观察斑马鱼胚胎的黑色素沉积情况，并拍照记录（如图2）。与空白对照相比，样品1在1.0和2.0重量%浓度下实验至48和72h时对鱼胚体表黑色素的沉积具有较好的抑制作用。且48h时抑制效果好于72h。

测试例6

上述实施例1-4和对比例1-4化妆品原料的抗过敏和抗炎的效果

将性成熟斑马鱼雌雄分缸饲养于斑马鱼养殖单元中。暴露实验开始前一天将雌雄以1:2配对，自然交配产卵。

I. 抗过敏试验中，

1）挑选发育正常3 dpf (days post-fertilization) 的鱼胚置于96孔板中，每孔5尾，加入受试样品溶液，同时设置阳性对照组(色甘酸钠溶液)；模型对照组(Compound 48/80)、空白对照组(养殖水)和溶剂调零组（未加鱼胚）；每组3个复孔；

2）分别加入100 .0μL蒸馏水，28 ℃孵育1 h后，加入Compound 48/80，28 ℃继续孵育1 h

3）每孔取100.0μL溶液置于0.5 ml 离心管中，同时加入BAPNA，置于38 ℃孵育1 h后，酶标仪检测吸光值（OD405值），Tryptase表达水平和Tryptase抑制率计算方法如下：

Tryptase表达水平(%)=

Tryptase抑制率=

抗过敏实验结果表6和表7所示。

表6发酵与未发酵的植物提取物的tryptase表达水平的影响

表7发酵与未发酵的植物提取物的tryptase的抑制效果

样品在0.125、0.25、0.5、1.0和2.0%实验浓度下，对鱼胚Tryptase的分泌与抑制均具有较为明显的效果。

II. 巨噬细胞和中性粒细胞聚集试验中，

1）挑选发育至3 dpf (days post fertilization)的健康斑马鱼Tg(corola:eGFP)置于6孔细胞培养板中，20条/孔，加入受试样品溶液处理1 h，以斑马鱼系统养殖水为空白对照组。

2）在体视显微镜下用手术刀将斑马鱼尾鳍切断，再置于6孔细胞培养板中，加入受试样品溶液，在培养箱中孵育。

3）孵育6 h后，将斑马鱼麻醉，在荧光显微镜下观察巨噬细胞和中性粒细胞在尾鳍伤口聚集情况并拍照，结果如图3所示（冠突散囊菌发酵黑茶）。

4）统计细胞数量，结果如表8所示。

表8 对巨噬细胞和中性粒细胞在斑马鱼尾鳍伤口处聚集的影响

样品在0.125、0.25、0.5、1.0和2.0%时斑马鱼巨噬细胞和中性粒细胞在斑马鱼尾鳍伤口处聚集的数量分别为18.2 ±1.9、17.7 ±2.0、15.9 ±3.2、16.6 ± 2.5和15.5±3.2（*P < 0.05）；在2.0%浓度时具有显著性差异。与空白对照和参比菌株相比，样品在2.0%时对斑马鱼巨噬细胞和中性粒细胞在斑马鱼尾鳍伤口处的聚集效果具有显著性差异影响。

实验例

包含上述实施例的化妆品原料用于乳类、精华类、膏霜类化妆品制备

A组分：鲸蜡醇、甘油、PEG-75硬脂酸酯、鲸蜡醇聚醚-20和硬脂醇聚醚-20共3.5重量%，植物甾醇油酸酯 1重量%，角鲨烷 3重量%，生育酚0.5重量%，聚二甲基硅氧烷3重量%，油茶籽油 1重量%，羟苯丙酯0.03重量%；

B组分：甘油 3重量%，1，3-丁二醇 2重量%，羟苯甲酯0.2重量%，EDTA 二钠 0.05重量%，卡波姆 0.15重量%，Hyasource Care Max透明质酸钠0.05重量%，去离子水 94.55重量%；

C组分：本发明所述的冠突散囊菌发酵物 1%（其制备方法同实施例1至4）；

D组分：精氨酸和香精,适量（1-2滴/100克）。

一种包含上述实施例的化妆品原料用于乳类、精华类、膏霜类化妆品制备的方法：

1)把Hyasource Care Max 透明质酸钠、卡波姆充分溶解至均匀；

2)称取A相加热至80℃，搅拌至完全溶解；

3)B相全部物料充分溶解，加热至80℃，搅拌均匀；

4)A缓慢加入B，边加入边搅拌，均质5分钟；

5)搅拌降温，母液低于50℃时依次加入C、D相；

6)降温、陈化、灌装，得到目标化妆品。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京百奥茵诺生物科技有限公司

中粮生物科技股份有限公司

<120> 冠突散囊菌和菌剂及它们的应用

<130> YSI68694COF

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 525

<212> DNA

<213> Eurotium cristatum

<400> 1

taggggtgcg gggtctctgg gtcacctccc atccgtgtct atctgtaccc tgttgcttcg 60

gcgtggccac ggcccgccgg agactaacat ttgaacgctg tctgaagttt gcagtctgag 120

tttttagtta aacaatcgtt aaaactttca acaacggatc tcttggttcc ggcatcgatg 180

aagaacgcag cgaaatgcga taattaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgagtc 240

tttgaacgca cattgcgccc cctggtattc cggggggcat gcctgtccga gcgtcattgc 300

tgccctcaag cacggcttgt gtgttgggct tccgtccctg gcaacgggga cgggcccaaa 360

aggcagtggc ggcaccatgt ctggtcctcg agcgtatggg gctttgtcac ccgctcccgt 420

aggtccagct ggcagctagc ctcgcaacca atctttttaa ccaggttgac ctcggatcag 480

gtagggatac ccgctgaact taagcatatc aataagccgg aggaa 525

Claims

1.一株冠突散囊菌（Eurotium cristatum），其特征在于，该冠突散囊菌的保藏号为CGMCC No.19604。

2.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含权利要求1所述的冠突散囊菌（Eurotium cristatum）的孢子。

3.权利要求1所述的冠突散囊菌或权利要求2所述的菌剂在制备发酵产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述发酵产品为发酵植物提取液所获得的产品；

5.一种植物提取液的发酵方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述的冠突散囊菌的孢子或权利要求2所述的菌剂接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵产物；

其中，所述发酵培养基含有植物提取液或为植物提取液；

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述植物提取液为植物的水提取物。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述发酵的条件包括：温度为10-45℃，时间为24-120h。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其中，该方法还包括将所述发酵产物进行固液分离，获得液相，然后对所述液相依次进行脱色和灭菌。

9.权利要求5-8中任意一项所述的方法得到的发酵产品。

10.权利要求1所述的冠突散囊菌、权利要求2所述的菌剂或权利要求9所述的发酵产品在制备具有抗氧化、减少皮肤斑痕和黑色素沉积、抗菌、抗紫外、抗过敏和抗炎中的至少一种的产品中的应用。