TW202313087A - 秋姬李發酵物、其製作方法和其用途 - Google Patents

Abstract

一種秋姬李（ Prunus salicina）發酵物，其是由一秋姬李經一溶劑萃取後再經由一厭氧發酵而得。此外，此秋姬李發酵物還適用於製備美白、提升粒線體活性、減少肌膚斑的組合物。

Description

秋姬李發酵物、其製作方法和其用途

本發明關於一種秋姬李發酵物，特別是涉及一種秋姬李發酵物、其製作方法和其用於製備美白、提升粒線體活性及減少肌膚斑的用途。

自有機及/或天然的飲食概念興起後，生技公司及食品業者積極投入關於天然植物的相關產品的研發。為使植物相關產品對身體健康助益有科學驗證的基礎，植物的活性成分分析及功效評估成為產品開發的重點項目。

被譽為日本李王品種的秋姬李（ Prunus salicina），是由日本山梨縣所孕育出的新品種。秋姬李果實碩大，果皮鮮濃紅潤，果肉肥厚細密，味道濃甜且香氣濃郁。並且，因其透紅的外型，更被封為「日本李姬」。因此，生技公司及食品業者積極研究秋姬李的活性成分分析及功效評估並據以開發成為相關產品。

在一些實施例中，一種秋姬李（ Prunus salicina）發酵物是由一秋姬李經一溶劑萃取後再經由一厭氧發酵而得。

在一些實施例中，此厭氧發酵係以酵母菌及/或乳酸菌進行厭氧發酵。

在一些實施例中，一種秋姬李發酵物用於製備美白的組合物的用途。

在一些實施例中，此秋姬李發酵物具有減少黑色素及/或抑制黑色素生成的作用。

在一些實施例中，此秋姬李發酵物具有抑制酪胺酸酶活性的作用。

在一些實施例中，一種秋姬李發酵物用於製備提升粒線體活性的組合物的用途。

在一些實施例中，一種秋姬李發酵物用於製備減少肌膚色素斑的組合物的用途。

在一些實施例中，此色素斑為深層棕色斑、可見斑點或其組合。

在一些實施例中，前述的秋姬李發酵物包含2,5-呋喃二甲醇（2,5-bis-(hydroxymethyl)furane）、5-羥基糠酸（5-Hydroxymethyl-2-furonic acid）、反式-4-羥基環己烷羧酸（trans-4-Hydroxycyclohaxane carboxlic acid）、酪醇（Tyrosol）、6-羥基-6-(羥甲基)-2H-吡喃-3(6H)-酮（6-Hydroxy-6- (hydroxymethyl)-2H-pyran-3(6H)-one）、2-羥基-1-(5-(羥甲基)呋喃-2-基)丙烷-1-酮（2-hydroxy-1-(5-(hydroxymethyl)furan-2- yl)propan-1-one）或其組合。

在一些實施例中，一種秋姬李發酵物的製作方法，其包括以一溶劑萃取一秋姬李以得到一秋姬李萃取物、以及厭氧發酵秋姬李萃取物以得到秋姬李發酵物。

綜上，任一實施例的秋姬李發酵物，其能提升粒線體活性或提升膚況。換言之，任一實施例的秋姬李發酵物適用於製備提升粒線體活性或提升膚況的組合物。在一些實施例中，秋姬李發酵物或其所製得的組合物還具有下列一種或多種功能：美白、減少黑色素、抑制黑色素生成、抑制酪胺酸酶活性、減少肌膚棕色斑、及減少肌膚斑點。

以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。

於本文中，在提及含量時所使用的含量單位「%」通常是指重量百分比。

請參閱圖1。在一些實施例中，秋姬李（ Prunus salicina）發酵物是由是由一秋姬李經一溶劑萃取（步驟S10）後再經由一厭氧發酵（步驟S11）而得。

在一些實施例中，在萃取步驟（即步驟S10）中，進行萃取的秋姬李可為秋姬李的植株、根、莖、葉、或果實。在一些實施例中，進行萃取的秋姬李為秋姬李的去除種子的帶皮果實。

在一些實施例中，在萃取步驟（即步驟S10）中，進行萃取的秋姬李可為原材料（如，完整的去除種子的帶皮果實），或為經物理前處理而分解成碎片、顆粒或粉末等細小尺寸的型態。所採用的物理前處理可包括下列至少一種：粗碎、切碎、打碎、剪碎、搗碎、及研磨。

在一些實施例中，在萃取步驟（即步驟S10）中，進行萃取的秋姬李可為剛採收並收集的秋姬李、乾燥後的秋姬李或冷凍過的秋姬李。舉例來說，在萃取步驟（即步驟S10）中，利用溶劑對乾燥後的秋姬李進行萃取。

在一些實施例中，在萃取步驟（即步驟S10）中，進行萃取的溶劑可為水或酒精。在一些實施例中，在萃取步驟（即步驟S10）中，進行萃取的溶劑為水。

在一些實施例中，可先將秋姬李打碎成秋姬李顆粒，然後再以溶劑進行萃取。舉例來說，將秋姬李去子帶皮果實打碎成粒徑為12 mm以下的秋姬李顆粒，再將秋姬李顆粒以水進行萃取。

在一些實施例中，以溶劑於80-100℃下萃取秋姬李0.5-1小時以得到秋姬李萃取液，然後再加入菌種進行厭氧發酵來得到秋姬李發酵物。舉例來說，可將秋姬李（如粒徑12 mm以下的秋姬李顆粒）浸泡在95℃水中0.5小時，使秋姬李中的效性成分溶解至水中而得到秋姬李萃取液。

在一些實施例中，在萃取步驟（即步驟S10）中，溶劑與秋姬李的重量比為10-30：1-3。在一些實施例中，在萃取步驟（即步驟S10）中，溶劑與秋姬李的重量比為10：1。

在一些實施例中，在萃取完成後添加菌種之前，可先將秋姬李萃取液冷卻至室溫以得到冷卻的秋姬李萃取液，然後再殖入菌種。

在一些實施例中，秋姬李萃取液是在未移除萃取材料（即包含秋姬李）的情況下，進行厭氧發酵步驟（即步驟S11）。

在一些實施例中，厭氧發酵步驟（即步驟S11）係為在沒有持續供應氧氣的環境中進行發酵。在一些實施例中，在厭氧發酵步驟（即步驟S11）中，係以保鮮膜包覆發酵桶槽外身與蓋孔，阻隔外部空氣進入發酵桶槽內。

在一些實施例中，厭氧發酵步驟（即步驟S11）係加入複數菌種進行厭氧發酵5-10日以得到秋姬李發酵物。在一些實施例中，厭氧發酵步驟（即步驟S11）係加入複數菌種進行厭氧發酵2-6日以得到秋姬李發酵物。

在一些實施例中，此菌種為一酵母菌及/或一乳酸菌。在一些實施例中，此菌種為一酵母菌及一乳酸菌。

在一些實施例中，厭氧發酵步驟（即步驟S11）係為兩階段發酵。在一些實施例中，厭氧發酵步驟（即步驟S11）係於秋姬李萃取液中依序添加一酵母菌及一乳酸菌進行發酵。

請參閱圖2。在一些實施例中，厭氧發酵步驟（即步驟S11）係於秋姬李萃取液中添加酵母菌進行第一次發酵以得到第一初發酵液（步驟S111）後，再於第一初發酵液中添加乳酸菌進行第二次發酵以得到第二初發酵液（步驟S112）。

在一些實施例中，步驟S111係於秋姬李萃取液中殖入0.2%啤酒酵母（如，寄存編號 BCRC20271的啤酒酵母）並在28℃-37℃下發酵1-3天，以得到第一初發酵液。在一些實施例中 ，殖入啤酒酵母後的秋姬李萃取液係在30℃下發酵3天。

在一些實施例中，在步驟S111中，藉由添加酵母菌於秋姬李萃取液中，得以使秋姬李萃取液發酵而生成酒精，藉以有利於提取出秋姬李內的有效成份。

在一些實施例中，第一初發酵液的pH值≦4.0，且其糖度約為3.6°Bx（白利糖度，Degrees Brix）。在一些實施例中，第一初發酵液的pH值為3.95。

在一些實施例中，步驟S112係於第一初發酵液中殖入0.06%胚芽乳酸桿菌（如，寄存編號 BCRC910760的胚芽乳酸桿菌）並在28℃-37℃下發酵1-3天，以得到第二初發酵液。在一些實施例中，殖入胚芽乳酸桿菌後的第一初發酵液係在30℃下發酵3天。

在一些實施例中，在步驟S112中，藉由添加乳酸菌於第一初發酵液中，得以使第一初發酵液內的葡萄糖被消耗而降低糖度，並且產生乳酸而降低第一初發酵液的pH值。於此，降低第一初發酵液的pH值有利於進一步提取出秋姬李內的其他不同有效成分。

在一些實施例中，第二初發酵液的pH值≦3.5，且其糖度約為1.5°Bx。在一些實施例中，第二初發酵液的pH值為3.32。

在一些實施例中，於步驟S112後，可進一步將第二初發酵液過濾，以得到初發酵過濾液。在一些實施例中，以200目數的濾網過濾第二初發酵液，以得到初發酵過濾液。

在一些實施例中，還可將第二初發酵液或初發酵過濾液在55℃-65℃下進行減壓濃縮，以得到發酵濃縮液。在一些實施例中，減壓濃縮可在60℃下進行。

在一些實施例中，可將前述的初發酵過濾液或發酵濃縮液進行過濾而得到發酵原液。在一些實施例中，此過濾步驟可以200目數的濾網進行。

在一些實施例中，發酵原液的pH值≦3.5，且其糖度約為1.5°Bx。在一些實施例中，發酵原液的pH值為3.2。

在一些實施例中，可添加寡糖至發酵原液中來將發酵原液的糖度調整至24°Bx，進而得到糖度調整後發酵原液。在一些實施例中，寡糖係由3-10個單醣分子聚合而成的低聚糖。在一些實施例中，寡糖係為，但不限於，果寡糖、半乳寡糖、木寡糖或異麥芽寡糖。在一些實施例中，寡糖為含20%-50%異麥芽寡糖的寡糖溶液。

在一些實施例中，發酵原液還可進一步以醇類與水進行液相-液相分配萃取而得到醇類可溶部。在一些實施例中，醇類可為正丁醇，且此醇類可溶部為正丁醇可溶部。

在一些實施例中，正丁醇可溶部可進一步以醇類為沖提液進行分離而得到多種化合物。

應能理解的是，可依實際需求以厭氧發酵所得的第二初發酵液、初發酵過濾液、發酵濃縮液、發酵原液、糖度調整後發酵原液、醇類可溶部、分離得的化合物或其任意組合作為秋姬李發酵物。

在一些實施例中，前述的秋姬李發酵物包含2,5-呋喃二甲醇（2,5-bis-(hydroxymethyl)furane）、5-羥基糠酸（5-Hydroxymethyl-2-furonic acid）、反式-4-羥基環己烷羧酸（trans-4-Hydroxycyclohaxane carboxlic acid）、酪醇（Tyrosol）、6-羥基-6-(羥甲基)-2H-吡喃-3(6H)-酮（6-Hydroxy-6-(hydroxymethyl)-2H-pyran-3(6H)-one）、2-羥基-1-(5-(羥甲基)呋喃-2-基)丙烷-1-酮（2-hydroxy-1-(5-(hydroxymethyl)furan-2-yl)propan-1-one）或其組合。在一些實施例中，秋姬李發酵物可由2,5-呋喃二甲醇、5-羥基糠酸、反式-4-羥基環己烷羧酸、酪醇、6-羥基-6-(羥甲基)-2H-吡喃-3(6H)-酮及2-羥基-1-(5-(羥甲基)呋喃-2-基)丙烷-1-酮所構成。

在一些實施例中，前述的秋姬李發酵物具有美白的能力。換言之，秋姬李發酵物施予一個體時能美白此個體的肌膚。因此，秋姬李發酵物適用於製備美白的組合物。

在一些實施例中，秋姬李發酵物具有減少黑色素、抑制黑色素生成、抑制酪胺酸酶活性、或其任意組合等能力。換言之，秋姬李發酵物施予一個體時能減少黑色素、抑制黑色素生成、抑制酪胺酸酶活性、或其任意組合。因此，秋姬李發酵物適用於製備減少黑色素、抑制黑色素生成、抑制酪胺酸酶活性、或其任意組合的組合物。

在一些實施例中，前述的秋姬李發酵物具有提升粒線體活性的能力。換言之，秋姬李發酵物施予一個體時能提升此個體的粒線體活性。因此，秋姬李發酵物適用於製備提升粒線體活性的組合物。

在一些實施例中，前述的秋姬李發酵物具有減少肌膚棕色斑及/或減少肌膚斑點的能力。換言之，秋姬李發酵物施予一個體時能減少此個體肌膚的棕色斑及/或斑點。因此，秋姬李發酵物適用於製備減少肌膚棕色斑及/或減少肌膚斑點的組合物。

在一些實施例中，前述的個體可為人。

在一些實施例中，製備所得的組合物可為醫藥組合物、食品組合物、化妝品組合物或保養品組合物。

在一些實施例中，當前述的組合物為醫藥組合物時，此醫藥組合物包含有效含量的秋姬李發酵物。其中，此醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地（parenterally）、口服地（orally）、或局部地（topically）投藥劑型。

在一些實施例中，經腸道或口服地投藥劑型可為，但不限於，錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）或類似的物。

在一些實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品（injection）[例如，無菌的水性溶液（sterile aqueous solution）或分散液（dispersion）]、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）或類似的物。

在一些實施例中，注射品的投藥方式可為，但不限於，腹膜內注射（intraperitoneal injection）、皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）、肌肉內注射（intramuscular injection）、靜脈內注射（intravenous injection）或病灶內注射（intralesional injection）。

在一些實施例中，含有有效含量的秋姬李發酵物的醫藥組合物可進一步包含被廣泛地使用於藥物製造技術的醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似的物。關於選用的載劑的種類與數量是落在熟習此項技術的人士的專業素養與例行技術範疇內。其中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS）或含有醇的水性溶液（alcohol containing aqueous solution）。

在一些實施例中，含有有效含量的秋姬李發酵物的醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑（external preparation）。在一些實施例中，外部製劑包括，但不限於：乳劑（emulsion）、凝膠（gel）、軟膏（ointment）、乳霜（cream）、貼片（patch）、擦劑（liniment）、粉末（powder）、氣溶膠（aerosol）、噴霧（spray）、乳液（lotion）、乳漿（serum）、糊劑（paste）、泡沫（foam）、滴劑（drop）、懸浮液（suspension）、油膏（salve）以及繃帶（bandage）。

在一些實施例中，當前述的醫藥組合物為外部製劑時，此醫藥組合物可由有效含量的秋姬李發酵物與為熟習此項技藝者所詳知的一基底（base）相混合而製成。

在一些實施例中，此基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑（additives）：水、醇（alcohols）、甘醇（glycol）、碳氫化合物（hydrocarbons）[諸如石油膠（petroleum, jelly）以及白凡士林（white petrolatum）]、蠟（wax）[諸如石蠟（paraffin）以及黃蠟（yellow wax）]、保存劑（preserving agents）、抗氧化劑（antioxidants）、界面活性劑（surfactants）、吸收增強劑（absorption enhancers）、安定劑（stabilizing agents）、膠凝劑（gelling agents）[諸如卡波普®974P （carbopol®974P）、微結晶纖維素（microcrystalline cellulose）以及羧基甲基纖維素（carboxymethylcellulose）]、活性劑（active agents）、保濕劑（humectants）、氣味吸收劑（odor absorbers）、香料（fragrances）、pH調整劑（pH adjusting agents）、螯合劑（chelating agents）、乳化劑（emulsifiers）、閉塞劑（occlusive agents）、軟化劑（emollients）、增稠劑（thickeners）、助溶劑（solubilizing agents）、滲透增強劑（penetration enhancers）、抗刺激劑（anti-irritants）、著色劑（colorants）以及推進劑（propellants）等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術的人士的專業素養與例行技術範疇內。

在一些實施例中，當前述的組合物為食品組合物時，此食品組合物包含特定含量的秋姬李發酵物。其中，此食品組合物的型態可為粉末、顆粒、溶液、膠體或膏體。

在一些實施例中，含有秋姬李發酵物的食品組合物可為食品產品或食品添加物（food additive）。

在一些實施例中，含有秋姬李發酵物的食品產品可為飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）或膳食補充品（dietary supplements）等。在一些實施例中，含有秋姬李發酵物的食品產品可更包括一佐劑。舉例來說，佐劑可為麥芽糖糊精（Maltodextrin）、蘋果酸、蔗糖素、檸檬酸、水果香料、蜂蜜香料、甜菊糖苷或其組合等。關於選用的載劑的種類與數量是落在熟習此項技術的人士的專業素養與例行技術範疇內。

在一些實施例中，含有秋姬李發酵物的食品添加物可為調味料、甜味料、香料、pH值調整劑、乳化劑、著色料或穩定劑等。

在一些實施例中，當前述的組合物為化妝品組合物或保養品組合物。換言之，化妝品組合物或保養品組合物包含有效含量的秋姬李發酵物。

在一些實施例中，含有秋姬李發酵物的化妝品組合物或保養品組合物可為下列任一種型態：化妝水、凝膠、凍膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉餅、蜜粉、卸妝油、卸妝乳、洗面乳、沐浴乳、洗髮精、護髮乳、防曬乳、護手霜、指甲油、香水、精華液及面膜。

在一些實施例中，含有秋姬李發酵物的化妝品組合物或保養品組合物可視需要更包含外用品可接受成分。在一些實施例中，外用品可接受成分例如可為乳化劑、滲透促進劑、軟化劑、溶劑、賦型劑、抗氧化劑、或其組合。

下列範例中若無特別敘明，所進行的實驗步驟是在室溫（約25℃）且常壓（1 atm）下進行。

例一

A. 原料：

1. 乾燥後的秋姬李（ Prunus salicina）的帶皮果實（去除種子），產地：中國，以下簡稱「秋姬李果實」。

2. 二次水，又稱RO水（逆滲透；Reverse Osmosis）或二次蒸餾水，以下簡稱「水」。

3. 啤酒酵母，其購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心（BCRC）且具有寄存編號 BCRC20271。

4. 胚芽乳酸桿菌，其購自BCRC且具有寄存編號 BCRC910760。

5. 寡糖溶液，其為以水與異麥芽寡糖所配製成的20%-50%異麥芽寡糖溶液。

B. 製備流程：

1. 將秋姬李果實以粉碎機（型號：12 Speed Blender；廠牌：Osterizer）進行打碎，以形成粒徑12 mm以下的秋姬李顆粒。

2. 將水加熱至95℃後，投入秋姬李顆粒，並且使秋姬李顆粒於95℃的水中浸泡0.5小時，以形成秋姬李萃取液。於此，投入的秋姬李顆粒與水的重量比為1：10。

3. 於冷卻後的秋姬李萃取液（含有秋姬李）中殖入0.2%啤酒酵母，並在30℃下厭氧發酵3天，以得到第一初發酵液。第一初發酵液的pH值為3.95，且其糖度約為3.6°Bx。於此，厭氧發酵全程是在發酵桶槽內進行，並且厭氧發酵全程皆以保鮮膜包覆發酵桶槽外身與蓋孔，以阻隔外部空氣進入發酵桶槽內。

4. 於第一初發酵液中殖入0.06%胚芽乳酸桿菌，並在30℃下厭氧發酵3天，以得到第二初發酵液。第二初發酵液的pH值為3.32，且其糖度約為1.5°Bx。於此，厭氧發酵全程是在發酵桶槽內進行，並且厭氧發酵全程皆以保鮮膜包覆發酵桶槽外身與蓋孔，以阻隔外部空氣進入發酵桶槽內。

5. 將第二初發酵液以200目數的濾網進行過濾以得到初發酵過濾液。

6. 將濃縮機（型號：Rotavapor R-100；廠牌：BUCHI）溫度設定為60℃後，利用濃縮機對初發酵過濾液進行減壓濃縮而得到發酵濃縮液。

7. 將發酵濃縮液以200目數的濾網進行過濾以得到發酵原液。發酵原液的pH值為3.2，且其糖度約為1.5°Bx。

8. 於發酵原液中添加20%-50%異麥芽寡糖溶液以將發酵原液的糖度調整為24°Bx，以得到秋姬李發酵物A。

例二

A. 原料：

與例一所使用的原料皆相同。

B. 製備流程：

1. 將秋姬李果實以粉碎機進行打碎，以形成粒徑12 mm以下的秋姬李顆粒。

2. 將水加熱至95℃後，投入秋姬李顆粒，並且使秋姬李顆粒於95℃的水中浸泡0.5小時，以形成秋姬李萃取液。於此，投入的秋姬李顆粒與水的重量比為1：10。

3. 於冷卻後的秋姬李萃取液（含有秋姬李）中殖入0.2%啤酒酵母，並在30℃下發酵3天，以得到第一初發酵液。於此，發酵全程是在發酵桶槽內進行，但發酵全程皆未以保鮮膜包覆發酵桶槽外身與蓋孔。

4. 於第一初發酵液中殖入0.06%胚芽乳酸桿菌，並在30℃下發酵3天，以得到第二初發酵液。於此，發酵全程是在發酵桶槽內進行，但發酵全程皆未以保鮮膜包覆發酵桶槽外身與蓋孔。

5. 將第二初發酵液以200目數的濾網進行過濾以得到初發酵過濾液。

6. 將濃縮機（型號：Rotavapor R-100；廠牌：BUCHI）溫度設定為60℃後，利用濃縮機對初發酵過濾液進行減壓濃縮而得到發酵濃縮液。

7. 將發酵濃縮液以200目數的濾網進行過濾以得到發酵原液。

8. 於發酵原液中添加20%-50%異麥芽寡糖溶液以將發酵原液的糖度調整為24°Bx，以得到秋姬李發酵物B。

例三

秤取10.0 mg的沒食子酸（Gallic acid）置於10 mL容量瓶中，然後以水（H ₂O）定量至10 mL，以得到沒食子酸的儲備溶液（stock solution）（即含1000ppm的沒食子酸）。將沒食子酸的儲備溶液稀釋10倍，即100 μL沒食子酸的儲備溶液加900 μL的水，以得到100 μg/mL沒食子酸的初始溶液（即含100ppm的沒食子酸）。然後，依據下表一配製0 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、及100 μg/mL的沒食子酸的標準溶液，並分別取100 μL的各濃度的標準溶液至玻璃試管中。加入500 μL的福林酚試劑（Folin-Ciocalteu's phenol reagent，購自Merck）至各玻璃試管內與標準溶液混合均勻並靜置3分鐘後，再加入400 μL的7.5%碳酸鈉混合均勻後反應30分鐘以得到標準反應溶液。取200 μL的標準反應溶液至96孔板中，並測量其在750 nm下的吸光值，以獲得標準曲線。

表一

標準溶液 （μg/mL）	0	20	40	60	80	100
初始溶液（μL）	0	20	40	60	80	100
水（μL）	100	80	60	40	20	0

分別取例一所製得的秋姬李萃取液和秋姬李發酵物A，以及例二所製得的秋姬李發酵物B作為樣本。將各樣本以水稀釋10倍後取100 μL到離心管中。接著，加入500 μL的福林酚試劑至各玻璃試管中與樣本混合均勻並靜置3分鐘後，再加入400 μL的7.5%碳酸鈉混合均勻後反應30分鐘以得到待測反應溶液。將裝有待測反應溶液的玻璃試管進行震盪以確保無氣泡後，取200 μL的待測反應溶液至96孔板中，並測量待測反應溶液於750 nm下的吸光值。

接著，利用標準曲線與內插法將待測反應溶液的吸光值換算成總多酚（Polyphenol）含量，並回乘稀釋倍數以得到實際總多酚含量。

於此，可得到秋姬李萃取液的總多酚含量為95.4ppm（即為95.4 μg/mL），秋姬李發酵物B的總多酚含量為213.913ppm（即為213.913 μg/mL），以及秋姬李發酵物A的總多酚含量為283.47ppm（即為283.47 μg/mL），如圖3所示。由此可知，相較於發酵前（即秋姬李萃取液），經發酵後的秋姬李發酵物的總多酚含量明顯增加。其中，經微生物厭氧發酵後，可增加總多酚含量3倍（297%）。並且，經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物A的總多酚含量明顯多於經有氧發酵所得的秋姬李發酵物B。多酚類物質為富含於植物中的抗氧化物質，經文獻證實其可有效減少體內自由基的形成。由此可知，經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物能具有較高的總多酚含量，進而能提升個體的抗氧化活性。

例四

A. 材料與儀器：

1. 細胞株：小鼠黑色素瘤細胞，購自ATCC（American type culture collection），細胞編號6475，以下簡稱B16F10細胞。

2. 細胞培養基：DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，購自Gibco，產品編號12800017），添加10% FBS（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，產品編號10437-028）以及1%抗生素（購自Gibco，產品編號15240-062）。

3. 麴酸（Kojic acid），購自Sigma，產品編號K3125。

4. BSA的儲備溶液：以水及BSA（購自Sigma，產品編號A9647-100G）配製而成。

5. 細胞裂解試劑：以RIPA Lysis and Extraction Buffer（購自Thermo，產品編號89900）及PMSF（phenylmethylsulfonyl fluorid，購自Thermo，產品編號36978）配製而成。

6. 蛋白質測定試劑：以Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate（購自Bio-Rad，產品編號5000006）和其4倍體積的水稀釋配製而成。

7. 10 mM L-多巴（L-DOPA，3,4-二羥苯丙氨酸）：以9.8 mg L-多巴（購自Sigma，產品編號D9628-5G）和5 mL 0.1mM 磷酸鹽緩衝液（phosphate buffer，pH7.0，購自Gibco，產品編號14200-075）配製而成。

8. 酵素免疫分析儀（ELISA reader），購自BioTek公司（美國）。

B. 試驗流程：

1. 將B16F10細胞以每孔1.5×10 ⁵個的密度，接種於含細胞培養基的6孔培養盤中，並在37 ℃下培養24小時。於此，B16F10細胞分為五個試驗組別，其分別為：空白組、麴酸組、實驗組A、實驗組B與實驗組C。各組進行三重複（意即各組各有三孔）。

2. 培養24小時後，將各組更換為實驗培養基，並於37℃下繼續培養48小時。其中，空白組的實驗培養基為不含樣品或麴酸的細胞培養基；麴酸組的實驗培養基為含有200 μg/mL的麴酸的細胞培養基，其中麴酸已被廣泛認知為具有降低黑色素生成效果的物質；實驗組A的實驗培養基為含有0.0625% (v/v) 的例一製得的秋姬李萃取液的細胞培養基；實驗組B的實驗培養基為含有0.5% (v/v) 的例二製得的秋姬李發酵物B的細胞培養基；以及實驗組C的實驗培養基為含有0.5% (v/v) 的例一製得的秋姬李發酵物A的細胞培養基。

3. 移除培養後的各組的實驗培養基，並以DPBS進行潤洗2次。

4. 於潤洗後，添加200ul 細胞裂解試劑至各孔中以裂解細胞，形成細胞裂解液。

5. 將各組離心試管離心使細胞沉澱。

6. 收集各組離心試管內的上清液以進行蛋白定量。

7. 標準曲線建立：依據下表二於96孔盤中配製0 mg/mL、0.15625 mg/mL、0.3125 mg/mL、0.625 mg/mL、1.25 mg/mL、及2.5 mg/mL的BSA的標準溶液。接著，加入200 μL的蛋白質測定試劑至各孔內與標準溶液混合均勻並靜置5分鐘以得到標準反應溶液，測量其在595 nm下的吸光值，以獲得標準曲線。

表二

標準溶液 （mg/mL）	0	0.15625	0.3125	0.625	1.25	2.5
BSA的儲備溶液（mL）	0	0.625	1.25	2.5	5	10
水（mL）	10	9.375	8.75	7.5	5	0

8. 各組上清液蛋白質定量：於96孔盤每孔中分別加入1 μL的步驟6所收集的各組離心試管內的上清液，並分別加入9 μL的水，混合均勻以得到各組的上清液蛋白質定量溶液。接著，加入200 μL的蛋白質測定試劑至各孔內與各組的樣品蛋白質定量溶液混合均勻並靜置5分鐘以得到待測反應溶液，測量其在595 nm下的吸光值。利用標準曲線與內插法將待測反應溶液的吸光值換算成蛋白質定量值。

9. 將含有10mg蛋白質定量值的各組離心試管內的上清液加到新的96孔盤的對應孔中，並於每孔加入細胞裂解試劑使每孔最終體積為100 μL（即，使各組的蛋白質濃度相同，皆為100 mg/mL）。

10. 於每孔加入10 μL 10 mM L-多巴，並於37℃下避光反應20分鐘以進行氧化反應。

11. 反應20分鐘後，利用酵素免疫分析儀測量每孔405 nm的吸光值（OD ₄₀₅值）。

C. 試驗結果：

所有組別的相對酪胺酸酶活性係依下列公式計算：相對酪胺酸酶活性（%）=（各組OD ₄₀₅值/空白組OD ₄₀₅值）×100%。

空白組與其他各組，以及實驗組B與實驗組C的試驗結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗（student t-test）統計分析得到。於圖式中，「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01，以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001；而於圖式中，「#」代表在與實驗組B比較下其p值小於0.05、「##」代表在與實驗組B比較下其p值小於0.01，以及「###」代表在與實驗組B比較下其p值小於0.001。

請參閱圖4。空白組未使用樣品或麴酸進行處理，因此空白組的試驗結果代表B16F10細胞在正常的生理代謝情況下的表現。於此，在設定空白組的相對酪胺酸酶活性為100%的情況下，麴酸組的相對酪胺酸酶活性為85.2%，實驗組A的相對酪胺酸酶活性為97.7%，實驗組B的相對酪胺酸酶活性為71.7%，而實驗組C的相對酪胺酸酶活性為60%。也就是說，相對於空白組，麴酸組的相對酪胺酸酶活性顯著降低約14.8%，實驗組A的相對酪胺酸酶活性降低約2.3%，實驗組B的相對酪胺酸酶活性顯著降低約28.3%，而實驗組C的相對酪胺酸酶活性顯著降低約40%。並且，相對於實驗組B，實驗組C亦顯著降低約11.7%的相對酪胺酸酶活性。

酪胺酸酶是生物體內黑色素合成的關鍵酵素， L-多巴在酪胺酸酶的作用下，會產生多巴醌（Dopaquinone）並進而形成黑色素。因此透過藉由黑色素的檢測，可評估酪胺酸酶活性，並評估黑色素細胞產生黑色素的能力。

由實驗結果可知，秋姬李萃取液、經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物A、以及經有氧發酵所得的秋姬李發酵物B皆能降低酪胺酸酶活性。而經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物A具有顯著降低酪胺酸酶活性的能力，且相較麴酸、秋姬李萃取液及經有氧發酵所得的秋姬李發酵物B優異。換言之，經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物能明顯降低酪胺酸酶活性，藉以抑制及/或減少黑色素的合成，進而有益於減少個體的黑色素以及提升個體皮膚的通透與亮白程度。

例五

A. 材料與儀器：

1. 細胞株：小鼠黑色素瘤細胞，購自ATCC，細胞編號6475，以下簡稱B16F10細胞。

2. 細胞培養基：DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，購自Gibco，產品編號12800017），添加10% FBS（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，產品編號10437-028）以及1%抗生素（購自Gibco，產品編號15240-062）。

3. 麴酸（Kojic acid），購自Sigma，產品編號K3125。

4. 1N NaOH：以水及NaOH（購自Sigma，產品編號221465）配製而成。

5. 胰蛋白酶：以10X胰蛋白酶（購自Thermo，產品編號15400-054）和其9倍體積的DPBS稀釋配製而成。即，將10X胰蛋白酶進行十倍稀釋。

6. 酵素免疫分析儀（ELISA reader），購自BioTek公司（美國）。

B. 試驗流程：

1. 將B16F10細胞以每孔1.5×10 ⁵個的密度，接種於每孔含2 mL的細胞培養基的6孔培養盤中，並在37 ℃下培養24小時。於此，B16F10細胞分為五個試驗組別，其分別為：空白組、麴酸組、實驗組A、實驗組B與實驗組C。各組進行三重複（意即各組各有三孔）。

2. 培養24小時後，將各組更換為2 mL實驗培養基，並於37℃下繼續培養48小時。其中，空白組的實驗培養基為不含樣品或麴酸的細胞培養基；麴酸組的實驗培養基為含有200 μg/mL的麴酸的細胞培養基，其中麴酸已被廣泛認知為具有降低黑色素生成效果的物質；實驗組A的實驗培養基為含有0.0625%(v/v) 的例一製得的秋姬李萃取液的細胞培養基；實驗組B的實驗培養基為含有0.5%(v/v) 的例二製得的秋姬李發酵物B的細胞培養基；以及實驗組C的實驗培養基為含有0.5%(v/v) 的例一製得的秋姬李發酵物A的細胞培養基。

3. 移除培養後的各組的實驗培養基，並以DPBS進行潤洗2次。

4. 於潤洗後，添加200 μL胰蛋白酶至各孔中反應3分鐘。反應後，添加細胞培養基以終止反應。而後收集各孔中的懸浮細胞與細胞培養基至對應的離心試管內。

5. 將各離心試管離心使細胞沉澱、移除各組離心試管內的上清液，再以DPBS清洗並懸浮沉澱細胞，然後反覆進行2次後，得到以200μL DPBS回溶的細胞懸浮液。

6. 將細胞懸浮液以液態氮冷凍約10秒後，置於室溫約30分鐘至完全解凍。

7. 完全解凍後，將離心試管離心。而後移除離心試管內的上清液後，加入120 μL 1N NaOH至各離心試管後，置於60℃的乾浴槽加熱1小時使黑色素溶出，以獲得各組的待檢測樣本。

8. 各組取100 μL各組的待檢測樣本至96孔培養盤，並利用酵素免疫分析儀測量每孔405 nm的吸光值（OD ₄₀₅值）。

C. 試驗結果：

所有組別的相對黑色素含量係依下列公式計算：相對黑色素含量（%）=（各組OD ₄₀₅值/空白組OD ₄₀₅值）×100%。

空白組與其他各組，以及實驗組B與實驗組C的試驗結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗（student t-test）統計分析得到。於圖式中，「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01，以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001；而於圖式中，「#」代表在與實驗組B比較下其p值小於0.05、「##」代表在與實驗組B比較下其p值小於0.01，以及「###」代表在與實驗組B比較下其p值小於0.001。

請參閱圖5。空白組未使用樣品或麴酸進行處理，因此空白組的試驗結果代表B16F10細胞在正常的生理代謝情況下的表現。於此，在設定空白組的相對黑色素含量為100%的情況下，實驗組A的相對黑色素含量為107.3%，實驗組B的相對黑色素含量為104.7%，而實驗組C的相對黑色素含量為87.9%。也就是說，相對於空白組，實驗組A的相對黑色素含量提升約7.3%，實驗組B的相對黑色素含量提升約4.7%，而實驗組C的相對黑色素含量顯著降低約12.1%。並且，相對於實驗組B，實驗組C的相對黑色素含量亦顯著降低約16.8%。

由此可知，秋姬李萃取液及經有氧發酵所得的秋姬李發酵物B皆無法降低B16F10細胞的黑色素含量，反而提升B16F10細胞的黑色素含量。而經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物A具有顯著降低黑色素含量的能力，且相較秋姬李萃取液及經有氧發酵所得的秋姬李發酵物B優異。換言之，經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物能減少黑色素及/或抑制黑色素生成，藉以減少個體的黑色素，進而提升個體皮膚的通透與亮白程度。

例六

A. 材料與儀器：

1. 細胞株：人類皮膚纖維母細胞，購自BCRC（Bioresource Collection and Research Center，生物資源保存及研究中心），細胞編號60153，以下簡稱CCD-966SK細胞。

2. 細胞培養基：MEM（Minimum essential medium，購自Gibco，產品編號11095080），添加10% FBS（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，產品編號10437-028）、1% 青黴素-鏈黴素（購自Gibco，產品編號15140122）、1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco，產品編號11360-070）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，購自Sigma，產品編號S5761-500G）以及0.1 mM非必需氨基酸（non-essential amino acids，購自Gibco，產品編號11140050）。

3. 胰蛋白酶：以10X胰蛋白酶（購自Gibco，產品編號15400-054）和其9倍體積的DPBS稀釋配製而成。

4. Assay buffer：以10X Assay buffer（MitoScreen Flow Cytometry Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit中的試劑，購自BD，產品編號BDB551302）和其9倍體積的DPBS稀釋配製而成，並置於恆溫水浴槽使其溫度維持於 37℃。

5. JC-1 作用試劑：以130 μL DMSO（購自ECHO，產品編號DA1101-000000-72EC）溶解JC-1 dye（MitoScreen Flow Cytometry Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit中的試劑，購自BD，產品編號BDB551302）以形成JC-1的儲存溶液。接著，再以JC-1的儲存溶液和其99倍體積的Assay buffer稀釋配製而成。

6. 流式細胞儀，購自BD。

B. 試驗流程：

1. 將CCD-966SK細胞以每孔1×10 ⁵個的密度，接種於每孔含2 mL的細胞培養基的6孔培養盤中，並在37 ℃下培養24小時。於此，CCD-966SK細胞分為四個試驗組別，其分別為：空白組、實驗組A、實驗組B與實驗組C。各組進行三重複（意即各組各有三孔）。

2. 培養24小時後，將各組更換為實驗培養基，並於37℃下繼續培養24小時。其中，空白組的實驗培養基為不含樣品的細胞培養基；實驗組A的實驗培養基為含有0.0625%(v/v) 的例一製得的秋姬李萃取液的細胞培養基；實驗組B的實驗培養基為含有0.5%(v/v) 的例二製得的秋姬李發酵物B的細胞培養基；以及實驗組C的實驗培養基為含有0.5%(v/v) 的例一製得的秋姬李發酵物A的細胞培養基。

3. 移除培養後的各組的實驗培養基，並以DPBS進行潤洗2次。

4. 於潤洗後，添加200 μL胰蛋白酶至各孔中反應5分鐘。反應後，添加細胞培養基以終止反應。而後收集各孔中的懸浮細胞與細胞培養基至對應的離心試管內，將各離心試管離心使細胞沉澱。

5. 移除各組離心試管內的上清液，並以DPBS清洗沉澱細胞2次後，再以100μL JC-1 作用試劑重新懸浮細胞，混合均勻並避光作用15分鐘。

6. 作用後，將各組離心試管離心並移除上清液，再以Assay buffer清洗沉澱細胞2次。

7. 於清洗後，於各組離心試管中添加500μL DPBS重新懸浮細胞以形成細胞懸浮液。

8. 將流式細胞儀的激發光設定為488 nm，散射光設定為527 nm（FITC）及590 nm（PE）後，利用流式細胞儀檢測各組的綠色（527 nm（FITC））螢光訊號以及紅色（590 nm（PE））螢光訊號。

C. 試驗結果：

所有組別的相對粒線體活性係依下列公式計算：相對粒線體活性（%）=（各組紅色螢光訊號值/空白組紅色螢光訊號值）×100%。

空白組與其他各組的試驗結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗（student t-test）統計分析得到。於圖式中，「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01，以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。

請參閱圖6。空白組未使用樣品進行處理，因此空白組的試驗結果代表CCD-966SK細胞在正常的生理代謝情況下的表現。於此，在設定空白組的相對粒線體活性為100%的情況下，實驗組A的相對粒線體活性為126.9%，實驗組B的相對粒線體活性為120.95%，而實驗組C的相對粒線體活性為145.76%。也就是說，相對於空白組，實驗組A的相對粒線體活性顯著提升約26.9%，實驗組B的相對粒線體活性顯著提升約20.95%，而實驗組C的相對粒線體活性顯著提升約45.76%。

由此可知，秋姬李萃取液、經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物A、以及經有氧發酵所得的秋姬李發酵物B皆能明顯提升粒線體活性。而經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物A具有顯著提升粒線體活性的能力，且相較秋姬李萃取液及經有氧發酵所得的秋姬李發酵物B優異。粒線體是細胞的發電機，扮演能量傳遞的重要角色，當其活性越高，代表細胞生理活動越旺盛。換言之，經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物能提升粒線體活性，藉以提升細胞生理活動、並且調控細胞凋亡與老化。

例七

A. 材料與儀器：

1. 細胞株：人類皮膚纖維母細胞，購自BCRC（Bioresource Collection and Research Center，生物資源保存及研究中心），細胞編號60153，以下簡稱CCD-966SK細胞。

2. 細胞培養基：MEM（Minimum essential medium，購自Thermo，產品編號61100061），添加10% FBS（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，產品編號10437-028）、1% 青黴素-鏈黴素（購自Gibco，產品編號15140122）、1 mM 丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco，產品編號11360-070）、1.5 g/L 碳酸氫鈉（sodium bicarbonate，購自Sigma，產品編號S5761-500G）以及0.1 mM非必需氨基酸（non-essential amino acids，購自Gibco，產品編號11140050）。

3. Assay buffer：以10X Assay buffer（MitoScreen Flow Cytometry Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit中的試劑，購自BD，產品編號BDB551302）和其9倍體積的DPBS稀釋配製而成，並置於恆溫水浴槽使其溫度維持於 37℃。

4. JC-1 作用試劑：以130 μL DMSO（購自ECHO，產品編號DA1101-000000-72EC）溶解JC-1 dye（MitoScreen Flow Cytometry Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit中的試劑，購自BD，產品編號BDB551302）以形成JC-1的儲存溶液。接著，再以JC-1的儲存溶液和其99倍體積的Assay buffer稀釋配製而成。

5. Hoechst染劑，購自Thermo，產品編號D 33342。

6. 顯微鏡，購自ZEISS，產品編號Axio Vert A1。

B. 試驗流程：

1. 將CCD-966SK細胞以每孔1×10 ⁴個的密度，接種於每孔含0.5 mL的細胞培養基的24孔培養盤中，並在37 ℃下培養24小時。於此，CCD-966SK細胞分為四個試驗組別，其分別為：空白組、實驗組A、實驗組B與實驗組C。各組進行三重複（意即各組各有三孔）。

2. 培養24小時後，將各組更換為實驗培養基，並於37℃下繼續培養24小時。其中，空白組的實驗培養基為不含樣品的細胞培養基；實驗組A的實驗培養基為含有0.0625%(v/v) 的例一製得的秋姬李萃取液的細胞培養基；實驗組B的實驗培養基為含有0.5%(v/v) 的例二製得的秋姬李發酵物B的細胞培養基；以及實驗組C的實驗培養基為含有0.5%(v/v) 的例一製得的秋姬李發酵物A的細胞培養基。

3. 移除培養後的各組的實驗培養基，並以DPBS進行潤洗1次。

4. 於潤洗後，添加300μL JC-1 作用試劑並輕微搖晃以確保孔盤底部皆有JC-1 作用試劑覆蓋後，避光靜置 15 分鐘。

5. 避光靜置後，移除各組的JC-1 作用試劑，並以DPBS進行潤洗1次。

6. 於潤洗後，添加Hoechst染劑（1:20000 稀釋），並避光染色5分鐘。

7. 於避光染色後，移除各組的Hoechst染劑，並添加500μL細胞培養基，以維持細胞在拍攝過程中的健康狀態。

8. 利用顯微鏡拍攝各組的染色結果。其中，於染色結果中，紅色螢光係代表正常的粒線體的訊號；綠色螢光係代表細胞凋亡的粒線體的訊號；而藍色螢光係代表細胞核的訊號。

C. 試驗結果：

請參閱圖7。空白組的綠色螢光比例明顯高於紅色螢光。相對於空白組，實驗組A的綠色螢光比例明顯下降，紅色螢光比例明顯上升，其表示秋姬李萃取液能明顯提升粒線體活性，即明顯減少細胞凋亡。相對於空白組，實驗組B的綠色螢光與紅色螢光比例近似於空白組，然其綠色螢光強度明顯下降，其表示經有氧發酵所得的秋姬李發酵物B能些微提升粒線體活性，即些微減少細胞凋亡。相對於空白組，實驗組C的綠色螢光比例明顯下降，紅色螢光比例明顯上升，其表示經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物A能明顯提升粒線體活性，即明顯減少細胞凋亡。

由此可知，秋姬李萃取液、經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物A、以及經有氧發酵所得的秋姬李發酵物B皆能提升粒線體活性。而經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物A具有顯著提升粒線體活性的能力，且相較秋姬李萃取液及經有氧發酵所得的秋姬李發酵物B優異。粒線體是細胞的發電機，扮演能量傳遞的重要角色，當其活性越高，代表細胞生理活動越旺盛。換言之，經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物能提升粒線體活性，藉以提升細胞生理活動、並且調控細胞凋亡與老化。

例八

A. 試驗流程：

令12位欲美白或提升膚況的20至55歲受試者每日飲用一瓶50 mL試驗飲品（其含有6 mL的使用例一所製得的秋姬李發酵物A，其餘為水和甜味劑），連續飲用8週（即56日）。

受試者於開始飲用前（臉部已清潔，第0週）及飲用56日（臉部已清潔，第8週）後，進行肌膚檢測。肌膚檢測為依據不同檢測項目，使用對應的儀器及測量方式，紀錄臉部肌膚的數值、並拍攝使用前及使用後的照片。肌膚檢測項目有肌膚斑點（skin spot）及肌膚棕色斑（skin brown spot）。並且，於使用前及使用後進行檢測時，受試者所在的測試區域的溫度與濕度為一致，以減少外界的溫濕度等因素會對肌膚所造成的影響。

肌膚斑點係使用購自美國Canfield scientific公司的VISIA高階數位膚質檢測儀（VISIA Complexion Analysis System）對受試者在飲用試驗飲品前，以及飲用56日後的面部肌膚進行檢測。此檢測儀係透過可見光（白光）拍攝高解析度的肌膚圖像，並以內建軟體根據肉眼可見的色素斑點數量與面積進行分析以得到可代表皮膚的斑點狀況的一數值（以下稱肌膚斑點程度值）。並且，得到的肌膚斑點程度值越高，說明肌膚斑點程度越高。然後，再以下列公式計算出相對肌膚斑點程度：相對肌膚斑點程度（%）=（各組肌膚斑點程度值 /使用前肌膚斑點程度值）×100%。

肌膚棕色斑係使用購自美國Canfield scientific公司的VISIA高階數位膚質檢測儀（VISIA Complexion Analysis System）對受試者在飲用試驗飲品前，以及飲用56日後的面部肌膚進行檢測。此檢測儀係透過RBX偏振光技術進行臉部肌膚拍攝，偵測肉眼不可見的真皮層黑色素斑以得到可代表皮膚的棕色斑狀況的一數值（以下稱肌膚棕色斑程度值）。並且，得到的肌膚棕色斑程度值越高，說明肌膚棕色斑程度越高。然後，再以下列公式計算出相對肌膚棕色斑程度：相對肌膚棕色斑程度（%）=（各組肌膚棕色斑程度值 /使用前肌膚棕色斑程度值）×100%。

B. 試驗結果：

1. 關於「肌膚斑點」的檢測結果

參照圖8。將12位受試者第0週的肌膚斑點程度值視為100%的相對肌膚斑點程度。此時，在第8週（即持續飲用試驗飲品8週後），其平均相對肌膚斑點程度為96.4%。換言之，相較於飲用試驗飲品前（第0週），持續飲用8週含有秋姬李發酵物A的試驗飲品後可使此些受試者的相對肌膚斑點程度減少3.6%，並且改善人數比率達66.7%（8位）。由此可知，經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物確實可減少肌膚斑點或淡化可見斑點，並改善受試者肌膚狀況，進而提升肌膚質感。

2. 關於「肌膚棕色斑」的檢測結果

參照圖9。將12位受試者第0週的肌膚棕色斑程度值視為100%的相對肌膚棕色斑程度。此時，在第8週（即持續飲用試驗飲品8週後），其平均相對肌膚棕色斑程度為93.3%。換言之，相較於飲用試驗飲品前（第0週），持續飲用8週含秋姬李發酵物A的試驗飲品後可使此些受試者的相對肌膚棕色斑程度減少6.7%，並且改善人數比率達66.7%（8位）。由此可知，經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物確實可減少肌膚棕色斑或深層班，並改善受試者肌膚狀況，進而提升肌膚質感。

例九

A. 材料與儀器：

1. 高解析液相層析質譜儀：串連超高效液相層析儀 （Ultimate 3000 HPLC, Thermo Fisher Scientific）與高解析度軌道式離子阱質譜儀（Q-EXACTIVE System with Ion Max Source，Thermo Fisher Scientific）測定，單位為 m/z。

2. 高效能液相層析儀（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）： Hitachi chromaster 5260系列；沖提溶劑輸送係Hitachi chromaster 5110；管柱恆溫裝置Hitachi chromaster 5310；光二極體陣列偵測器(Diode Array Detector, DAD)係Hitachi chromaster 5430，偵測波長為210 nm。

3. HPLC分析管柱：Mightysil RP-18 GP 250（Kanto，250 x 4.6 mm，5μm）。

4. 管柱層析（Column Chromatography）填充材料：

(1) 大孔樹脂：Diaion HP-20，購自三菱化學公司，日本。

(2) 正相矽膠：Merck Kieselgel 60，40-63 um，購自默克，德國，產品編號Art. 9385。

(3) 逆相矽膠：Merck LiChroprep® RP-18，40-63 um，購自默克，德國，產品編號Art. 0250。

5. 溶劑（solvent）：甲醇（methanol），購自默克台灣。

6. 聚偏氟乙烯薄膜過濾（Polyvinylidene fluoride membrane filters，PVDF），孔徑0.22微米，購自Millipore，美國。

7. 樣品：(1)例一所製得的秋姬李萃取液，以及(2)例一所製得的秋姬李發酵物A。

B. HPLC分析流程：

1. 秋姬李萃取液及秋姬李發酵物A，係以聚偏氟乙烯薄膜過濾進行過濾。為了將秋姬李萃取液及秋姬李發酵物A的脂溶性成分與水溶性成分分離，以正丁醇為溶劑，將例一所製得的秋姬李萃取液及秋姬李發酵物A進行液相-液相分配萃取，分別得到秋姬李萃取液的正丁醇可溶部（脂溶性成分）和秋姬李萃取液的水可溶部（水溶性成分），以及秋姬李發酵物A的正丁醇可溶部和秋姬李發酵物A的水可溶部。

2. 使用HPLC對各樣品的組分進行分析，以得到各樣品的指紋圖譜。於此，以甲醇（A）與水（B）為溶劑，額外添加0.1%甲酸，並設定流速為1 mL/min。沖提條件：0分鐘時，甲醇（A）: 水（B）＝2:98；10分鐘時，A:B＝2:98；40分鐘時，A:B＝70:30；50分鐘時，A:B＝100:0；60分鐘時，A:B＝100:0。其中，樣品為秋姬李萃取液樣品（包含秋姬李萃取液的正丁醇可溶部和秋姬李萃取液的水可溶部）以及秋姬李發酵物A樣品（包含秋姬李發酵物A的正丁醇可溶部和秋姬李發酵物A的水可溶部），並且樣品濃度皆為50 mg/mL，注射量為10 μL。其中，於HPLC分析時，管柱溫度為40 ℃。

C. HPLC分析結果：

請參閱圖10。秋姬李萃取液的HPLC指紋圖譜較無明顯波鋒，且峰度較低。而相對於秋姬李萃取液，秋姬李發酵物A的HPLC指紋圖譜有較多明顯波鋒（波鋒02-S、01、03、05、08、04、06、07以及09），且峰度較高。也就是說，相對於秋姬李萃取液，經由微生物厭氧發酵所得的秋姬李發酵物得以大幅增加其所含有的化合物，甚至是具有秋姬李萃取液所未含有的化合物。

由此可知，經厭氧發酵所得的秋姬李發酵物相對於秋姬李萃取液具有更加豐富且多元化的化合物組成。

例十

A. 材料與儀器：

1. 核磁共振光譜儀（Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer，NMR）：1D與2D光譜使用Ascend 400 MHz，Bruker Co.，Germany，以δ表示化學位移（chemical shift），單位為 ppm。

2. 高解析液相層析質譜儀：串連超高效液相層析儀 （Ultimate 3000 HPLC, Thermo Fisher Scientific）與高解析度軌道式離子阱質譜儀（Q-EXACTIVE System with Ion Max Source，Thermo Fisher Scientific）測定，單位為 m/z。

3. 中壓液相層析儀（Medium pressure liquid chromatography，MPLC）：CombiFlash® Rf+，Teledyne ISCO，Lincoln，NE。

4. 高效能液相層析儀（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）： Hitachi chromaster 5260系列；沖提溶劑輸送係Hitachi chromaster 5110；管柱恆溫裝置Hitachi chromaster 5310；光二極體陣列偵測器(Diode Array Detector, DAD)係Hitachi chromaster 5430，偵測波長為210 nm。

5. HPLC分析管柱：Mightysil RP-18 GP 250（Kanto，250 x 4.6 mm，5μm）。

6. HPLC分離管柱：Luna® 5μm C18(2) 100 Å（250 x 10 mm），購自Phenomenex，美國。

7. 管柱層析（Column Chromatography）填充材料：

(1) 大孔樹脂：Diaion HP-20，購自三菱化學公司，日本。

(2) 正相矽膠：Merck Kieselgel 60，40-63 um，購自默克，德國，產品編號Art. 9385。

(3) 逆相矽膠：Merck LiChroprep® RP-18，40-63 um，購自默克，德國，產品編號Art. 0250。

8. 薄層色層分析（Thin-Layer Chromatography）：

(1) TLC鋁片：薄層層析片，塗覆矽膠60 F ₂₅₄（0.25 mm），購自默克，德國。

(2) TLC鋁片：薄層層析片，塗覆RP-18 F _254-S（0.25 mm），購自默克，德國。

9. 紫外光燈（UV Lamp）：UVP UVGL-25，波長為 254 nm及365 nm。

10. 溶劑（solvent）：正己烷（n-hexane）、乙酸乙酯（ethyl acetate）、丙酮（acetone）、甲醇（methanol）、乙醇（ethanol）、乙腈（acetonitrile）、氯仿-d1（氘化程度99.5%）、甲醇-d4（氘化程度99.5%）、重水（deuterium oxide，氘化程度＞99.8％）、以及二甲基亞碸-d6（氘化程度＞99.9%），皆購自默克台灣。

11. 樣品：例一所製得的秋姬李發酵物A。

B. 化合物分離與結構鑑定流程：

1. 為了將秋姬李發酵物的脂溶性成分與水溶性成分分離，以正丁醇為溶劑，將5 L例一所製得的秋姬李發酵物A進行液相-液相分配萃取，得到12.6 g正丁醇可溶部（脂溶性成分）以及101.9 g水可溶部（水溶性成分）。

2. 功效化合物分離純化過程中，係依據生物活性導引分離方法（Bioassay guided fractionation）；並且，以降低黑色素細胞的黑色素的功效，做為分層及其後續細分離部的選擇依據。

3. 12.6 g正丁醇可溶部繼續以Diaion HP-20大孔樹脂管柱層析（column chromatography）分離法進行初步分離，依序以純水、純水-甲醇體積比1:1、甲醇為沖提液，得到3個分離部（以下稱BUF1分離部、BUF2分離部以及BUF3分離部）。

4. 取BUF1分離部並以逆向-中壓液相層析儀（RP-MPLC）對BUF1分離部進行再分離，以得到多種沖提物。於此，沖提液由水至甲醇線性沖提，沖提時間60分鐘，流速每分鐘10毫升。後續利用薄層色層分析（TLC鋁片：薄層層析片，塗覆矽膠60 F254（0.25 mm），購自默克，德國）合併相似結果的沖提物，而得到3個次分離部（以下稱BUF1-1分離部、BUF1-2分離部以及BUF1-3分離部）。

5. 將BUF1-2分離部經逆相-高效率液相層析純化（甲醇/水=1/9），而得到二化合物TCI-GSF-01與TCI-GSF-03。經氫-核磁共振光譜（1H-NMR）分析其化學結構後，經文獻比對確認化合物TCI-GSF-01為2,5-呋喃二甲醇（2,5-bis-(hydroxymethyl)furane），如圖11所示；以及，化合物TCI-GSF-03為5-羥基糠酸（5-Hydroxymethyl-2-furonic acid），如圖12所示。

6. 另取BUF-2分離部並以逆向-中壓液相層析儀（RP-MPLC）對BUF-2分離部進行再分離，以得到多種沖提物。於此，沖提液由水至甲醇線性沖提，沖提時間100分鐘，流速每分鐘10毫升。後續利用薄層色層分析（TLC鋁片：薄層層析片，塗覆RP-18 F254-S（0.25 mm），購自默克，德國）合併相似結果的沖提物，而得到6個次分離部（以下稱BUF2-1分離部、BUF2-2分離部、BUF2-3分離部、BUF2-4分離部、BUF2-5分離部以及BUF2-6分離部）。

7. 將BU2-2分離部經逆向-HPLC純化（甲醇/水=3/17），而得到化合物TCI-GSF-05。經氫-核磁共振光譜（1H-NMR）與碳-核磁共振光譜（13C-NMR）分析其化學結構後，經文獻比對確認化合物TCI-GSF-05為6-羥基-6-(羥甲基)-2H-吡喃-3(6H)-酮（6-hydroxy-6- (hydroxymethyl)-2H-pyran-3(6H)-one），如圖14至圖15所示。

8. 將BU2-3分離部經逆向-HPLC純化（甲醇/水=1/4），而得到化合物TCI-GSF-04。經氫-核磁共振光譜（1H-NMR）分析其化學結構後，經文獻比對確認化合物TCI-GSF-04為反式-4-羥基環己烷羧酸（trans-4-hydroxycyclohaxane carboxlic acid），如圖13所示。

9. 將BUF2-4分離部經逆向-HPLC純化（甲醇/水=1/3），而得到化合物TCI-GSF-07。經氫-核磁共振光譜（1H-NMR）分析其化學結構後，經文獻比對確認化合物TCI-GSF-07為酪醇（tyrosol），如圖16所示。

10. 將BUF2-5分離部經逆向-HPLC純化（甲醇/水=3/7），而得到化合物TCI-GSF-09。經氫-核磁共振光譜（1H-NMR）與碳-核磁共振光譜（13C-NMR）分析其化學結構後，經文獻比對確認化合物TCI-GSF-09為2-羥基-1-(5-(羥甲基)呋喃-2-基)丙烷-1-酮（2-hydroxy-1-(5-(hydroxymethyl)furan-2-yl)propan-1-one），如圖17至圖18所示。

前述化合物的名稱及化學結構式如下表三所示。

表三

化合物	名稱	化學結構式
TCI-GSF-01	2,5-呋喃二甲醇	式(I)
TCI-GSF-03	5-羥基糠酸	式(II)
TCI-GSF-04	反式-4-羥基環己烷羧酸	式(III)
TCI-GSF-05	6-羥基-6-(羥甲基)-2H-吡喃-3(6H)-酮	式(IV)
TCI-GSF-07	酪醇	式(V)
TCI-GSF-09	2-羥基-1-(5-(羥甲基)呋喃-2-基)丙烷-1-酮	式(VI)

例十一

A. 材料與儀器：

1. 細胞株：小鼠黑色素瘤細胞，購自ATCC，細胞編號6475，以下簡稱B16F10細胞。

2. 細胞培養基：DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，購自Gibco，產品編號12800017），添加10% FBS（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，產品編號10437-028）以及1%抗生素（購自Gibco，產品編號15240-062）。

3. 麴酸（Kojic acid），購自Sigma，產品編號K3125。

4. 1N NaOH：以水及NaOH（購自Sigma，產品編號221465）配製而成。

5. 胰蛋白酶：以10X胰蛋白酶（購自Thermo，產品編號15400-054）和其9倍體積的DPBS稀釋配製而成。即，將10X胰蛋白酶進行十倍稀釋。

6. 酵素免疫分析儀（ELISA reader），購自BioTek公司（美國）。

B. 試驗流程：

1. 將B16F10細胞以每孔1.5×10 ⁵個的密度，接種於含細胞培養基的6孔培養盤中，並在37 ℃下培養24小時。於此，B16F10細胞分為八個試驗組別，其分別為：空白組、麴酸組、化合物01組、化合物03組、化合物04組、化合物05組、化合物07組與化合物09組。各組進行三重複（意即各組各有三孔）。

2. 培養24小時後，將各組更換為實驗培養基，並於37℃下繼續培養48小時。其中，空白組的實驗培養基為不含樣品或麴酸的細胞培養基；麴酸組的實驗培養基為含有200 μg/mL的麴酸的細胞培養基，其中麴酸已被廣泛認知為具有降低黑色素生成效果的物質；化合物01組的實驗培養基為含有100 μM 的例九分離所得的化合物TCI-GSF-01的細胞培養基；化合物03組的實驗培養基為含有100 μM 的例九分離所得的化合物TCI-GSF-03的細胞培養基；化合物04組的實驗培養基為含有100 μM 的例九分離所得的化合物TCI-GSF-04的細胞培養基；化合物05組的實驗培養基為含有100 μM 的例九分離所得的化合物TCI-GSF-05的細胞培養基；化合物07組的實驗培養基為含有100 μM 的例九分離所得的化合物TCI-GSF-07的細胞培養基；以及化合物09組的實驗培養基為含有100 μM 的例九分離所得的化合物TCI-GSF-09的細胞培養基。

3. 移除培養後的各組的實驗培養基，並以DPBS進行潤洗2次。

4. 於潤洗後，添加200 μL胰蛋白酶至各孔中反應3分鐘。反應後，添加細胞培養基以終止反應。而後收集各孔中的懸浮細胞與細胞培養基至對應的離心試管內。

5. 將各離心試管離心使細胞沉澱、移除各組離心試管內的上清液，再以DPBS清洗並懸浮沉澱細胞，然後反覆進行2次後，得到以200μL DPBS回溶的細胞懸浮液。

6. 將細胞懸浮液以液態氮冷凍約10秒後，置於室溫約30分鐘至完全解凍。

7. 完全解凍後，將離心試管離心。而後移除離心試管內的上清液後，加入120 μL 1N NaOH至各離心試管後，置於60℃的乾浴槽加熱1小時使黑色素溶出，以獲得各組的待檢測樣本。

8. 各組取100 μL各組的待檢測樣本至96孔培養盤，並利用酵素免疫分析儀測量每孔405 nm的吸光值（OD ₄₀₅值）。

C. 試驗結果：

所有組別的相對黑色素含量係依下列公式計算：相對黑色素含量（%）=（各組OD ₄₀₅值/空白組OD ₄₀₅值）×100%。

空白組與其他各組的試驗結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗統計分析得到。於圖式中，「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01，以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。

請參閱圖19。空白組未使用樣品或麴酸進行處理，因此空白組的試驗結果代表B16F10細胞在正常的生理代謝情況下的表現。於此，在設定空白組的相對黑色素含量為100%的情況下，麴酸組的相對黑色素含量為82.5%，化合物01組的相對黑色素含量為53.5%，化合物03組的相對黑色素含量為85.7%，化合物04組的相對黑色素含量為80.6%，化合物05組的相對黑色素含量為61.6%，化合物07組的相對黑色素含量為83.3%，而化合物09組的相對黑色素含量為86.1%。也就是說，相對於空白組，麴酸組的相對黑色素含量顯著降低約17.5%，化合物01組的相對黑色素含量顯著降低約46.5%，化合物03組的相對黑色素含量顯著降低約14.3%，化合物04組的相對黑色素含量顯著降低約19.4%，化合物05組的相對黑色素含量顯著降低約38.4%，化合物07組的相對黑色素含量顯著降低約16.7%，而化合物09組的相對黑色素含量顯著降低約13.9%。

由此可知，化合物TCI-GSF-01、TCI-GSF-03、TCI-GSF-04、TCI-GSF-05、TCI-GSF-07及TCI-GSF-09皆能顯著降低黑色素。其中，化合物TCI-GSF-01相較其他化合物，具有較為優異的降低黑色素含量的能力。換言之，秋姬李發酵物所包含的2,5-呋喃二甲醇（2,5-bis-(hydroxymethyl)furane）、5-羥基糠酸（5-Hydroxymethyl-2-furonic acid）、反式-4-羥基環己烷羧酸（trans-4-Hydroxycyclohaxane carboxlic acid）、酪醇（Tyrosol）、6-羥基-6-(羥甲基)-2H-吡喃-3(6H)-酮（6-Hydroxy-6-(hydroxymethyl)-2H-pyran-3(6H)-one）和2-羥基-1-(5-(羥甲基)呋喃-2-基)丙烷-1-酮（2-hydroxy-1-(5-(hydroxymethyl)furan-2-yl)propan-1-one）皆具有減少黑色素及/或抑制黑色素生成的能力，藉以有益於減少個體的黑色素，進而提升個體皮膚的通透與亮白程度。

綜上，任一實施例的秋姬李發酵物，其能提升粒線體活性或提升膚況。換言之，任一實施例的秋姬李發酵物適用於製備提升粒線體活性或提升膚況的組合物。在一些實施例中，秋姬李發酵物或其所製得的組合物還具有下列一種或多種功能：美白、減少黑色素、抑制黑色素生成、抑制酪胺酸酶活性、減少肌膚棕色斑、及減少肌膚斑點。

S10:步驟 S11:步驟 S111:步驟 S112:步驟

圖1是一實施例的秋姬李發酵物的製作方法的流程圖。 圖2是圖1中步驟S11的一實施例的流程圖。 圖3是秋姬李萃取液、秋姬李好氧發酵物及秋姬李發酵物的總多酚含量檢測結果的柱狀圖。 圖4是相對酪胺酸酶活性的細胞實驗結果的柱狀圖。 圖5是相對黑色素含量的細胞實驗結果的柱狀圖A。 圖6是相對粒線體活性的細胞實驗結果的柱狀圖。 圖7是粒線體活性的細胞實驗結果的螢光染色圖。 圖8是第0週及第8週的相對肌膚斑點程度的人體實驗結果的柱狀圖。 圖9是第0週及第8週的相對肌膚棕色斑程度的人體實驗結果的柱狀圖。 圖10是秋姬李萃取液及秋姬李發酵物的HPLC指紋圖譜。 圖11是TCI-GSF-01的氫-核磁共振光譜圖譜。 圖12是TCI-GSF-03的氫-核磁共振光譜圖譜。 圖13是TCI-GSF-04的氫-核磁共振光譜圖譜。 圖14是TCI-GSF-05的氫-核磁共振光譜圖譜。 圖15是TCI-GSF-05的碳-核磁共振光譜圖譜。 圖16是TCI-GSF-07的氫-核磁共振光譜圖譜。 圖17是TCI-GSF-09的氫-核磁共振光譜圖譜。 圖18是TCI-GSF-09的碳-核磁共振光譜圖譜。 圖19是相對黑色素含量的細胞實驗結果的柱狀圖B。

Claims (12)

1. 一種秋姬李（ Prunus salicina）發酵物，其中該秋姬李發酵物是由一秋姬李經一溶劑萃取後再經由一厭氧發酵而得。
2. 如請求項1所述的秋姬李發酵物，其中該厭氧發酵係以酵母菌及/或乳酸菌進行厭氧發酵。
3. 如請求項1所述的秋姬李發酵物，其中該秋姬李發酵物包含2,5-呋喃二甲醇、5-羥基糠酸、反式-4-羥基環己烷羧酸、酪醇、6-羥基-6-(羥甲基)-2H-吡喃-3(6H)-酮、2-羥基-1-(5-(羥甲基)呋喃-2-基)丙烷-1-酮或其組合。
4. 一種如請求項1所述的秋姬李發酵物用於製備美白的組合物的用途。
5. 如請求項4所述的用途，其中該秋姬李發酵物具有減少黑色素及/或抑制黑色素生成的作用。
6. 如請求項4所述的用途，其中該秋姬李發酵物具有抑制酪胺酸酶活性的作用。
7. 一種如請求項1所述的秋姬李發酵物用於製備提升粒線體活性的組合物的用途。
8. 一種如請求項1所述的秋姬李發酵物用於製備減少肌膚色素斑的組合物的用途。
9. 如請求項8所述的用途，其中該色素斑為深層棕色斑、可見斑點或其組合。
10. 如請求項4至8中任一項所述的用途，其中該秋姬李發酵物包含2,5-呋喃二甲醇、5-羥基糠酸、反式-4-羥基環己烷羧酸、酪醇、6-羥基-6-(羥甲基)-2H-吡喃-3(6H)-酮、2-羥基-1-(5-(羥甲基)呋喃-2-基)丙烷-1-酮或其組合。
11. 一種秋姬李發酵物的製作方法，包括： 以一溶劑萃取一秋姬李以得到一秋姬李萃取物；以及 厭氧發酵該秋姬李萃取物以得到該秋姬李發酵物。
12. 如請求項11所述的製作方法，其中該厭氧發酵係以酵母菌及/或乳酸菌進行厭氧發酵。

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