TWI774055B - 蕎麥苗浸提液、其用於製備提高細胞抗氧化組合物及/或肝臟保健組合物的用途及其製備方法 - Google Patents

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Abstract

一種蕎麥苗浸提液的用途，其用於製備一組合物。此組合物具有下列一種或多種功能：提升細胞抗氧化活性、提升代謝活性、及提升細胞內穀胱甘肽（glutathione, GSH）的合成。

Description

蕎麥苗浸提液、其用於製備提高細胞抗氧化組合物及/或肝臟保健組合物的用途及其製備方法
本發明是有關蕎麥苗浸提液的用途，特別是關於蕎麥苗用於製備提高細胞抗氧化及/或肝臟保健組合物的用途。
自有機及天然的飲食概念興起後，生技公司及食品業者積極投入關於天然植物的相關產品之研發。為使植物相關產品對身體健康助益有科學驗證的基礎，植物的活性成分分析及功效評估成為產品開發的重點項目。
於眾多的天然植物中，蕎麥可以在貧瘠的酸性土壤中生長，不需要過多的養分。蕎麥常見的利用例如是製作蕎麥麵粉、釀酒或是做為茶飲料。若能開發蕎麥的其他功效，進一步有效的利用蕎麥，更是有益於全民的健康福祉。
在一實施例中，一種蕎麥苗浸提液的用途，用於製備提升細胞抗氧化活性的組合物。
在一實施例中，一種蕎麥苗浸提液的用途，其是用於製備肝臟保健的組合物。
在一些實施例中，蕎麥苗浸提液用以提升細胞抗氧化及代謝活性。
在一些實施例中，前述的蕎麥苗浸提液用以提升細胞內穀胱甘肽（glutathione, GSH）的合成。
在一些實施例中，前述的蕎麥苗浸提液是以溶劑浸提蕎麥苗而獲得，並且蕎麥苗為蕎麥種子發芽後生長6日至12日的幼苗。
在一些實施例中，前述的溶劑為水，溶劑與蕎麥苗的重量比為2-5:1，蕎麥苗的浸提溫度介在80度至90度之間，以及蕎麥苗的浸提時間為120分鐘。
在一些實施例中，前述的蕎麥苗浸提液為4.7°Bx至5.3°Bx。
在一些實施例中，前述的蕎麥苗浸提液的黃酮含量約為815 μg/mL。
在一些實施例中，前述的蕎麥苗浸提液包含下列生物活性物質中的至少一者：鳥苷（Guanosine）、牡荊素（Vitexin）、異牡荊素（Isovitexin）、芸香苷（Rutin）、異東方素（Isoorientin）及木犀草素8-C-葡萄糖苷（Luteolin-8-C -glucoside）。
在一些實施例中，前述的鳥苷用以提升細胞內穀胱甘肽（glutathione）的合成。
在一實施例中，一種蕎麥苗浸提液之製備方法，包括：將重量比2-5:1的水與一蕎麥苗在80度至90度的溫度下浸提60分鐘至180分鐘以得到一浸提原液；以及過濾浸提原液而得到一蕎麥苗浸提液。
在一些實施例中，用以浸提的蕎麥苗為蕎麥種子發芽後生長6日至12日的幼苗。
在一些實施例中，蕎麥苗浸提液之製備方法，更包括：減壓濃縮蕎麥苗浸提液至蕎麥苗浸提液的白利糖度值（Degrees Brix）為4.7至5.3（即4.7°Bx至5.3°Bx）以得到濃縮後的蕎麥苗浸提液。
在一些實施例中，前述的減壓濃步驟是於50℃至60℃進行。
在一些實施例中，濃縮後的蕎麥苗浸提液的總黃酮含量為815 μg/mL。
在一些實施例中，過濾後得到的蕎麥苗浸提液，包含下列生物活性物質中的至少一者：鳥苷（Guanosine）、牡荊素（Vitexin）、異牡荊素（Isovitexin）、芸香苷（Rutin）、異東方素（Isoorientin）及木犀草素8-C-葡萄糖苷（Luteolin-8-C -glucoside）。
綜上所述，在任一實施例中，蕎麥苗浸提液用於製備提高細胞抗氧化組合物及/或肝臟保健組合物的用途及蕎麥苗浸提液的製備方法，其適用於提供蕎麥苗浸提液或其組合物。其中，所提供的蕎麥苗浸提液或其組合物具有下列一種或多種功能：提升細胞抗氧化活性、提升代謝活性、及提升細胞內穀胱甘肽（glutathione, GSH）的合成。
關於本文中所使用之濃度符號「wt%」通常是指重量百分濃度，而濃度符號「vol%」通常是指體積百分濃度。關於本文中所提及的用語「浸提」是指將植物（固態）浸泡在溶劑（液態）中將植物中某些成分浸提出來的方法，並且用語「浸提液」則是指將植物（固態）浸泡在溶劑（液態）中將植物中某些成分浸提出來後所產生的汁液。應能明瞭的是，本文中所提及的用語「浸提」可與用語「萃取」可交互使用，以及本文中所提及的用語「生物活性物質」可與用語「化合物」可交互使用。
在一實施例中，一種蕎麥苗浸提液的用途，用於製備提升細胞抗氧化活性的組合物。
在一實施例中，一種蕎麥苗浸提液的用途，其是用於製備肝臟保健的組合物。
在一些實施例中，蕎麥苗浸提液用以提升細胞抗氧化及代謝活性。
在一些實施例中，蕎麥苗浸提液用以提升細胞內穀胱甘肽（glutathione, GSH）的合成。
在一些實施例中，蕎麥苗浸提液包含下列生物活性物質中的至少一者：鳥苷（Guanosine）、牡荊素（Vitexin）、異牡荊素（Isovitexin）、芸香苷（Rutin）、異東方素（Isoorientin）及木犀草素8-C-葡萄糖苷（Luteolin-8-C -glucoside）。
其中，鳥苷可用以提升細胞內穀胱甘肽（glutathione）的合成。
在一些實施例中，鳥苷的結構式如下式1。
Figure 02_image001
式1
在一些實施例中，牡荊素的結構式如下式2。
Figure 02_image003
式2
在一些實施例中，異牡荊素的結構式如下式3。
Figure 02_image005
式3
在一些實施例中，芸香苷的結構式如下式4。
Figure 02_image007
式4
在一些實施例中，異東方素的結構式如下式5。
Figure 02_image009
式5
在一些實施例中，木犀草素8-C-葡萄糖苷的結構式如下式6。
Figure 02_image011
式6
在一些實施例中，蕎麥苗浸提液能由蕎麥（Fagopyrum esculentum）的幼苗（以下稱蕎麥苗）獲得。其中，蕎麥苗浸提液之製備方法，包括：以重量比2-5:1的水與蕎麥苗在80℃至90℃的溫度下浸提60分鐘至120分鐘以得到一浸提原液；以及過濾浸提原液而得到一蕎麥苗浸提液（即濾液）。
在浸提步驟的一些實施例中，蕎麥苗為蕎麥種子發芽後生長6日至12日的幼苗。在浸提步驟的一些實施例中，蕎麥苗較佳可為蕎麥種子發芽後生長9日的幼苗。在浸提步驟的一些實施例中，蕎麥苗可為苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）。在浸提步驟的一些實施例中，蕎麥苗可包括幼苗的子葉、幼苗的胚軸及幼苗的根。在浸提步驟的一些實施例中，水與蕎麥苗的重量比可為3:1。
在一些實施例中，前述的過濾步驟可為將前一步驟取得的浸提原液以400目數的濾網進行過濾，藉以去除細微固體。
在一些實施例中，蕎麥苗浸提液之製備方法可更包括：減壓濃縮蕎麥苗浸提液至蕎麥苗浸提液的白利糖度值（Degrees Brix, °Bx）為4.7至5.3以得到濃縮後的蕎麥苗浸提液（即濃縮液）。其中，減壓濃步驟可於50℃至60℃進行。
在一些實施例中，濃縮後的蕎麥苗浸提液的總黃酮含量可為815 μg/mL。
在一些實施例中，蕎麥苗浸提液可依實際需求為過濾步驟所得的濾液或減壓濃縮步驟所得的濃縮液。在一些實施例中，前述之組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有效含量的蕎麥苗浸提液。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地（parenterally）、口服地、或局部地（topically）投藥劑型。
在一些實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）或類似之物。在一些實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）或類似之物。在一些實施例中，注射品的投藥方式可為皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）或病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，前述之醫藥品可更包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在一些實施例中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS）、或含有醇的水性溶液（alcohol containing aqueous solution ）。
在一些實施例中，前述之組合物可為食用組合物。換言之，食用組合物包含特定含量的蕎麥苗浸提液。在一些實施例中，前述之食用組合物可為食品產品或食品添加物（food additive）。在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）或膳食補充品（dietary supplements）。
在一些實施例中，前述之食用組合物可以口服方式施予受體。其中，食用組合物的型態可為粉末、顆粒、溶液、膠體或膏體。
在一些實施例中，前述之組合物可為化妝品或保養品。換言之，化妝品或保養品包含特定含量的蕎麥苗浸提液。
在一些實施例中，前述之化妝品或保養品可為下列任一種型態：化妝水、凝膠、凍膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉餅、蜜粉、卸妝油、卸妝乳、洗面乳、沐浴乳、洗髮精、護髮乳、防曬乳、護手霜、指甲油、香水、精華液及面膜。在一些實施例中，前述之化妝品或保養品可視需要更包含外用品可接受成分。在一些實施例中，外用品可接受成分可例如為乳化劑、滲透促進劑、軟化劑、溶劑、賦型劑、抗氧化劑、或其組合。
例一：蕎麥苗浸提液的製備
實驗步驟：
1. 取得尚未發芽的苦蕎麥的種子（即生長0日）及苦蕎麥的種子發芽後生長3日、6日、9日、12日、15日及18日的蕎麥苗，總共七組原料。
2. 將前一步驟取得的原料以水在85℃的溫度下浸提120分鐘以得到各組含有固體的浸提原液。其中，水與原料的重量比為3:1。
3. 將前一步驟取得的七組浸提原液，各組浸提原液以400目數的濾網進行過濾，去除細微固體，得到各組蕎麥苗浸提液。
4. 將前一步驟取得的七組蕎麥苗浸提液，以濃縮機（廠牌：BUCHI-Rotavapor R-100）於55℃下進行減壓濃縮至蕎麥苗浸提液的白利糖度值（Degrees Brix, °Bx）為5，以得到各組濃縮後的蕎麥苗浸提液。
後文將以尚未發芽的種子為原料所獲得的濃縮後的蕎麥苗浸提液稱為浸提液1、以生長3日的蕎麥苗為原料所獲得的濃縮後的蕎麥苗浸提液稱為浸提液2、以生長6日的蕎麥苗為原料所獲得的濃縮後的蕎麥苗浸提液稱為浸提液3、以生長9日的蕎麥苗為原料所獲得的濃縮後的蕎麥苗浸提液稱為浸提液4、以生長12日的蕎麥苗為原料所獲得的濃縮後的蕎麥苗浸提液稱為浸提液5、以生長15日的蕎麥苗為原料所獲得的濃縮後的蕎麥苗浸提液稱為浸提液6以及以生長18日的蕎麥苗為原料所獲得的濃縮後的蕎麥苗浸提液稱為浸提液7。
例二、蕎麥苗浸提液的成分分析
取例一得到的浸提液1至浸提液7，以液相色譜法-質譜聯用（Liquid chromatography–mass spectrometry, LC-MS）技術分析浸提液1至浸提液7的指紋圖譜。
（一）、指紋圖譜分析。
實驗步驟：
1. 將例一得到的浸提液1至浸提液7，濃縮去除溶劑後得到固體1至7。將固體1至7分別以水作為溶劑，配置成為10毫克/毫升（mg/mL）的樣品1至樣品7，總共7個樣本。
2. 前一步驟的各個樣品取10μL，以高效能液相層析儀（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）（所用管柱為Mightysil RP-18 GP 250, 250 × 10mm, 5 μm, 購自日本關東化學公司）進行分析。其中，高效能液相層析儀的幫浦系統為Hitachi L-2310 series、偵測器型號為Hitachi L-2420 UV-VIS，而資料處理軟體為D-2000 Elite。
於本步驟中，流動相之流速控制為1 mL/min，且偵測波長設定為280 nm，並進行梯度沖提。流動相的梯度變化如下表一所示：流動相A為0.1 vol%的甲酸（配置於水中）、流動相B為0.1vol%的甲酸（配置於甲醇中）。
表一
沖提時間（分鐘） 流動相A（%） 流動相B（%）
0 98 2
10 98 2
40 30 70
50 0 100
60 0 100
62 98 2
70 98 2
實驗結果：
浸提液1至浸提液7之HPLC指紋圖譜顯示於圖1中。請參閱圖1，浸提液3至浸提液5的指紋圖譜在時間點A、B、C、D、E、F以及G的位置存在明顯波峰。以資料處理軟體積分計算計算圖1中時間點A、B、C、D、E、F以及G的各波峰的面積。接著，根據所得到的波峰面積，計算其最大波鋒面基與最小波峰面積的比值，而各樣品之計算結果如下表二所示。參照圖1及表二，浸提液3至浸提液5在時間點A、B、C、D、E、F以及G所分離之生長代謝產物（後方略稱代謝產物）明顯高於其他浸提液（即存在明顯波峰）。其中，浸提液4（即以蕎麥種子發芽後生長9天的蕎麥苗做為原料取得的蕎麥苗浸提液），於時間點A、D、F及G處所分離之代謝產物的含量，相較於以蕎麥種子發芽後生長其他天數做為原料取得的蕎麥苗浸提液，具有最高值（即波峰的峰值最高）。並且，浸提液4於時間點B、C、E處所分離出的代謝產物，其含量只少於浸提液5（以蕎麥種子發芽後生長12天的蕎麥苗為原料所得到的蕎麥苗萃取液）。因此，可以得知，以蕎麥種子發芽後生長6天至12天之蕎麥苗為原料所取得的蕎麥苗浸提液具有高含量的代謝產物，並且以蕎麥種子發芽後生長9天之蕎麥苗為原料所取得的蕎麥苗浸提液，相較於以蕎麥種子發芽後生長其他天數之蕎麥苗為原料取得的蕎麥苗浸提液，具有較高含量的代謝產物。
表二
  A E G F D C B
浸提液1 1.01 1.00 1.00 - - - -
浸提液2 1.95 1.80 1.89 1.38 1.37 1.39 1.46
浸提液3 3.20 6.33 8.82 16.47 10.98 15.35 46.49
浸提液4 3.25 8.04 11.99 23.54 15.27 21.47 54.69
浸提液5 2.63 8.78 12.69 21.46 15.74 20.29 21.21
浸提液6 1.29 1.43 1.49 1.20 1.14 1.16 1.31
浸提液7 1.00 1.26 1.28 1.00 1.00 1.00 1.00
（二）、代謝產物分析
將前述實驗（一）中時間點A、C、D、E、F及G處的所收集得的分離液以核磁共振光譜儀（Nuclear Magnetic Resonance spectrometer, NMR）（型號： Ascend  400 MHz,Bruker Co ）進行分析以分別得到生物活性物質01至生物活性物質06的氫譜圖，如圖2至圖7所示。接著，以所得的氫譜圖確定各生物活性物質的化學結構及化學名稱，如下表三。分離純化出的生物活性物質之代號、其氫譜圖及化學名稱的對應關係顯示於下列表三。
表三
  時間點 成分名稱 化學結構 圖式
生物活性物質01 A 鳥苷
Figure 02_image001
         		 圖2
生物活性物質02 E 牡荊素
Figure 02_image003
         		 圖3
生物活性物質03 G 異牡荊素
Figure 02_image005
       		 圖4
生物活性物質04 F 芸香苷
Figure 02_image007
             		 圖5
生物活性物質05 D 異東方素
Figure 02_image009
       		 圖6
生物活性物質06 C 木犀草素8-C-葡萄糖苷
Figure 02_image011
         		 圖7
例三：總黃酮量測定
於此，以芸香素（rutin）當量作為總黃酮相對含量的表示。以芸香素（購自ChromaDex）與水配置0μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、1000μg/mL及1200μg/mL的芸香素標準溶液。接著，針對每一試管，從試管中分別取200μL之芸香素標準溶液至另一新試管，再於此些新試管內加入200μL之5 wt%檸檬酸鈉水溶液，混合均勻後靜置反應6分鐘。接著，再加入200μL之10 wt%硝酸鋁水溶液（廠牌：Alfa Aesar 12360），混合均勻後靜置反應6分鐘，再加入2 mL之4 wt%氫氧化鈉水溶液（廠牌：Macron 7708-10），使其混合均勻。最後再加入1.4 mL的水於此試管中並混合均勻得到反應液，取試管中200μL反應液至96孔反應盤中，以ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酵素結合免疫吸附法）讀取儀（廠牌：Thermo Fisher Scientific）於500 nm的波長下偵測吸光值。將不同濃度的芸香素標準溶液依相同方式所測得之吸光值繪製成檢量線。
將例1中所得到浸提液1及浸提液4分別以水，依其體積做10倍稀釋後，取200μL到試管中。接著，加入200μL的5 wt%檸檬酸鈉水溶液，混合均勻後靜置反應6分鐘。接著，加入200μL的10 wt%硝酸鋁水溶液，混合均勻後靜置反應6分鐘，再加入2 mL的4 wt%氫氧化鈉水溶液，使其混合均勻。最後再加入1.4 mL的水於試管中並混合均勻得到反應液，取試管中200μL反應液至96孔反應盤中，以ELISA讀取儀於500 nm的波長下偵測吸光值。
接著，利用檢量線將稀釋後的浸提液4的吸光值計算成稀釋前的浸提液4的總黃酮含量。於此，可計算出例1中所得到的浸提液4的總黃酮含量約為815 μg/mL，以及例1中所得到的萃取液1的總黃酮含量約為432 μg/mL。
例四：細胞試驗-肝臟細胞抗氧化
實驗將會分為實驗組1（添加例一所獲得的浸提液1，且經雙氧水處理的組別）、實驗組2（添加例一所獲得的浸提液4，且經雙氧水處理的組別）、控制組（未添加任何浸提液，亦無經雙氧水處理組別）、以及對照組（未添加任何浸提液，但經雙氧水處理的組別）四組進行。
實驗步驟：
1.將人類肝癌細胞HepG2（以下簡稱HepG2細胞）（購自美國典型培養物保藏中心ATCC；Cat. HB-8065）以每孔2×105 個的方式，接種於每孔含2 ml培養基之6孔培養盤中。
其中，細胞培養基：含10 vol%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（購自Gibco，Cat.10437-028）及1 vol%青黴素/鏈黴素（購自Gibco，Cat. 15140122）的DMEM（購自GIBCO公司，Cat. 11965-092）。
2. 將上述培養盤置於37℃下，培養24小時。
3. 移除培養盤的各孔中的細胞培養基。
4. 各組加入實驗培養基並將各組細胞於37℃下反應1小時。其中各組的實驗培養基如下： 實驗組1：每孔加入2mL的含1mg/ml的浸提液1的細胞培養基。 實驗組2：每孔加入2mL的含1mg/ml的浸提液4的細胞培養基。 控制組：每孔加入2 mL的細胞培養基（不含浸提液4）。 對照組：每孔加入2 mL的細胞培養基（不含任何浸提液）。
5. 各組添加含有濃度5μg/ml的DCFH-DA溶液之2μL細胞培養基於每孔中，使DCFH-DA處理細胞15分鐘。於處理後，實驗組與控制組加入1mM的雙氧水（H2 O2 ）（購自Sigma），然後各組再於37℃下培養1小時。
其中，5μg/ml的DCFH-DA溶液是將二氯二氫螢光素二乙酸酯（2,7-dichloro-dihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA；購自Sigma；Cat. SI-D6883-50MG）溶於二甲基亞碸（dimethyl sulfoxide，DMSO，購自Sigma，Cat. D2650）以配製成。
6. 各組每孔以1 mL的1XPBS（磷酸緩衝鹽溶液）（購自Gibco，Cat. 14200-075）溶液潤洗1次。
7. 各組加入將200 μL的胰蛋白酶（購自Sigma；Cat.59427C）加至每孔中並在暗處反應5分鐘，並於反應後於各孔中添加0.6mL的細胞培養基。
8. 將各組的各孔的細胞與細胞培養基個別收集至對應的15mL離心試管內，並將含有細胞與細胞培養基之離心試管以400 xg離心5分鐘。
9. 各組離心後，各組移除上清液，並以PBS溶液回溶細胞沉澱物為細胞懸浮液。各組細胞懸浮液再次以400 xg離心10分鐘。
10. 各組離心後，各組再次移除上清液，並再次以1XPBS溶液回溶細胞沉澱物為待測細胞液。
11. 使用流式細胞儀（廠牌Beckman；購自BD Accuri）偵測各孔的待測細胞液中DCFH-DA的螢光信號。進行螢光偵測之激發波長為450 nm-490 nm，放射波長為510 nm-550 nm。由於DCFH-DA進入細胞後會先被水解為DCFH（二氯二氫螢光素），再被活性氧物質氧化為可發出綠色螢光的DCF（二氯螢光素），經DCFH-DA處理之細胞的螢光強度可反映細胞內活性氧物質含量，並藉此得知細胞內活性氧物質高度表現的細胞數佔原細胞數的比例。因實驗係進行二重複，故將各組的二重複實驗之量測結果平均以得平均值，然後以控制組的平均值為100%之相對ROS的生成量，將對照組與實驗組的平均值換算為相對ROS的生成量，如圖8所示。
實驗結果：
請參照圖8，由控制組、對照組的結果可知，在經過雙氧水處理後，對照組具有高ROS表現（高螢光表現）的細胞比例大幅增加，顯示藍光照射確實會導致細胞內產生活性氧物質，進而對人類肝癌細胞（HepG2細胞）產生後續傷害。
其中，對照組的ROS產生量約為控制組的12.54倍，而實驗組1的ROS產生量約為控制組的4.41倍、實驗組2的ROS產生量約為控制組的4.37倍。由此可見，當細胞經過浸提液1及浸提液4處理後，與對照組相比，實驗組能顯著降低ROS的產生。意即，蕎麥苗浸提液可有效減少活性氧物質在細胞內的產生或累積，可作為一種活性氧物質清除劑，並且蕎麥苗浸提液可透過降低細胞內活性氧物質含量，減少細胞受到氧化傷害，在此，尤其是以浸提液4的效果最佳。
例五：細胞試驗-GSH含量檢測
實驗將會分為實驗組1（添加例一所得的浸提液1）、實驗組2（添加例一所得的浸提液4）以及控制組（未添加任何蕎麥苗浸提液）。
實驗步驟：
1.將人類肝癌細胞HepG2（以下簡稱HepG2細胞）（購自美國典型培養物保藏中心ATCC；Cat. HB-8065）以每孔2×105 個的方式，接種於每孔含2 mL的細胞培養基之6孔培養盤中。
其中，細胞培養基：將最低限度培養基（minimum essential medium，MEM，購自Gibco）添加額外成分使其含有10 vol%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，購自Gibco；Cat.10437-028）、1 mM丙酮酸鈉（sodium pyruvate，購自Gibco）、1.5 g/L碳酸氫鈉（sodium bicarbonate）（購自Gibco）以及0.1mM的非必需胺基酸（non-essential amino acids）（購自Gibco）。
2. 各組別於37℃下，培養24小時。其中，各組別於培養前先處理如下： 實驗組1：每孔加入2 mg/ml的浸提液1。 實驗組2：每孔加入含2 mg/ml的浸提液4。 控制組：未添加任何浸提液。
3.收集各組各孔中的細胞。具體來說，各組以1 mL的1XPBS（磷酸緩衝鹽溶液）（購自Gibco；Cat. 14200-075）溶液潤洗1次後，加入將200 μL的胰蛋白酶（購自Sigma；Cat.59427C）加至每孔中並在暗處反應5分鐘，並於反應後於各孔中添加0.6mL的細胞培養基，並將各組的各孔的細胞與細胞培養基個別收集至對應的離心試管內。
4. 各組以PBS溶液潤洗1次。具體來說，將各離心試管以400 xg離心5分，離心後移除上清液，加入PBS溶液回溶後再以400 xg離心5分，並於離心後移除上清液，以得到細胞沉澱物。
5. 各組以PBS溶液回溶細胞沉澱物為細胞懸浮液。
6. 將GSH偵測染劑（購自abcam，型號Ab112132）購買取得後體積稀釋1000倍以得到GSH偵測溶液，各組別以GSH偵測溶液染色15分鐘。
7. 各組以PBS溶液潤洗1次。具體來說，將各組以400 xg離心5分，離心後移除上清液，加入PBS溶液回溶後再以400 xg離心5分，並於離心後移除上清液，以得到細胞沉澱物。
8. 各組以200 μL的PBS溶液回溶細胞沉澱物為待測細胞液。
9. 使用流式細胞儀（Beckman；BD Accuri）偵測各組的待測細胞液中的非螢光綠染料（non-fluorescent Green Dye）的螢光信號。進行螢光偵測之激發波長為490 nm，放射波長為520 nm。
實驗結果：
請參閱圖9所示，若控制組作為100%之穀胱甘肽（glutathione, GSH）生成量，將實驗組1與實驗組2相對控制組的穀胱甘肽生成量換算顯示於圖9，可見實驗組1的穀胱甘肽生成量相較控制組成長34%、實驗組2的穀胱甘肽生成量相較控制組成長93%。意即，0日與9日蕎麥苗浸提液可促進肝細胞內的穀胱甘肽生成，其中又以9日蕎麥苗浸提液促進穀胱甘肽生成的效果又好於0日蕎麥苗浸提液。
穀胱甘肽是由由麩胺酸、半胱胺酸及甘胺酸所組成的三胜肽，其硫醇基（G-SH）易與自由基結合，具有抗氧化的功能。由例五可見，9日蕎麥苗浸提液能提升肝細胞內的穀胱甘肽的生成量，具有良好的抗氧化效果。
例六：還原力試驗
還原力的測定其主要原理是將赤血鹽［K3 Fe(CN)6 ］還原成黃血鹽［K4 Fe(CN)6 ］（如下式7），黃血鹽再利用Fe3 ＋ 形成普魯士藍（如下式8），藉由700nm處吸光值的變化來檢測還原力的大小，吸光值愈高表示還原力愈強。
K3 Fe(CN)6 ＋檢體→K4 Fe(CN)6 ＋檢體-oxide 　          式7
Fe3 ＋ ＋K4 Fe(CN)6 →Fe4 ［Fe(CN)6 ］3 （普魯士藍）      式8
配置溶液：
配置磷酸鹽緩衝溶液：秤取1.34g的無水磷酸二氫鈉（NaH2 PO4 ）（廠牌：J.T.Baker 3828-01）、1.26g的磷酸氫二鈉（Na2 HPO4 ）（廠牌：Sigma 04270）置於定量瓶中，然後以純水（H2 O）溶解並定量至100mL。
配置1 vol%赤血鹽溶液：秤取1 g赤血鹽（K3 Fe(CN)）置於定量瓶中，然後以純水（H2 O）溶解並定量至100mL。（需避光保存，保存期限兩周且保存於4℃的環境）。
配置10 vol%三氯醋酸（Trichloroacetic acid, TCA）溶液：秤取10g的三氯醋酸（CCl3 COOH）置於定量瓶中，然後以純水（H2 O）溶解並定量至100mL。
配置0.1 vol%的氯化鐵（FeCl3 ）溶液：秤取0.1g的氯化鐵置於定量瓶中，然後以純水（H2 O）溶解並定量至100mL。（需避光保存，當日配置且保存於4℃的環境）
配置1 mg/mL的維他命C（Vit C）溶液：秤取10 mg的L-抗壞血酸（L-Ascorbic acid）置於定量瓶中，然後以純水（H2 O）溶解並定量至10mL。（需當日配置）
實驗步驟：
取1 mg/mL的維他命C溶液1mL置於定量瓶中，然後添加水（H2 O）並定量至10mL，以得到100 μg/mL維他命C溶液。
以100 μg/ml維他命C溶液於玻璃試管中分別配製0μg/mL、20μg/mL、40 μg/mL、60μg/mL、80μg/mL及100μg/mL的標準溶液，配製方式如表四所示。
表四
100 μg/mL 維他命C溶液(μL) 水 (μL) 標準溶液(μg/mL)
0 100 0
10 90 10
20 80 20
40 60 40
60 40 60
80 20 80
100 0 100
接著，取250μL的各濃度的標準溶液（即檢體）於不同試管中，各試管加入250 μL的磷酸鹽緩衝溶液，並以漩渦（vortex）震盪使溶液均勻混合。接著，各試管再加入250 μL的赤血鹽溶液（1vol%），並以漩渦（vortex）震盪使溶液均勻混合。接著，各試管於50℃水浴20分鐘。接著，各試管再加入250 μL的三氯醋酸溶液（10 vol%），並以漩渦（vortex）震盪使溶液均勻混合。接著，以3000 g離心10分鐘。接著，各試管取30 μL的上清液加入300μL的純水，再加入120 μL的氯化鐵溶液（0.1 vol%），並以漩渦（vortex）震盪使溶液均勻混合後反應10分鐘以得到反應液。取200μL的反應液至96孔反應盤中，以ELISA讀取儀（廠牌：Thermo Fisher Scientific）於700 nm的波長下偵測吸光值。將六種不同濃度的維他命C溶液依相同方式所測得之吸光值，繪製成檢量線。
取例一所獲得的浸提液1（即檢體）與例一所獲得的浸提液4（即檢體）各250μL於不同試管中，各試管加入250 μL的磷酸鹽緩衝溶液，並以漩渦（vortex）震盪使溶液均勻混合。接著，各試管加入250 μL的赤血鹽溶液（1vol%），並以漩渦（vortex）震盪使溶液均勻混合。接著，各試管於50℃水浴20分鐘。接著，各試管加入250 μL的三氯醋酸溶液（10 vol%），並以漩渦（vortex）震盪使溶液均勻混合。接著，各試管以3000 g離心10分鐘。接著，各試管取30 μL的上清液加入300μL的水，再加入120 μL的氯化鐵溶液（0.1 vol%），並以漩渦（vortex）震盪使溶液均勻混合後反應10分鐘以得到反應液。取試管中200μL反應液至96孔反應盤中，以ELISA讀取儀於700 nm的波長下偵測吸光值。
實驗結果:
請參閱圖10所示，利用檢量線將稀釋後的9日蕎麥苗浸提液與0日蕎麥苗浸提液的吸光值換算成對應維他命C含量所產生的還原力。於此可知，稀釋前的0日蕎麥苗浸提液（即例1中所得到的浸提液1）的還原力相當於含量約為437μg/mL的維他命C（L-Ascorbic Acid Sodium Salt）的還原力，稀釋前的9日蕎麥苗浸提液（即例1中所得到的浸提液4）的還原力相當於含量約為1752μg/mL的維他命C的還原力，因此，可推得浸提液4的還原力明顯高於浸提液1，即相對於未發芽的種子，以生長9日的蕎麥苗為原料所得的蕎麥苗萃取液具有較強的還原力。
例七：細胞試驗-GSH含量檢測
於此，是以例二實驗（一）中浸提液4於時間點A、C、D、E、F及G所收集得的分離液去除溶劑後得到六種生物活性物質（如下表五）進行細胞試驗。
表五
  時間點 成分名稱
生物活性物質01 A 鳥苷
生物活性物質02 E 牡荊素
生物活性物質03 G 異牡荊素
生物活性物質04 F 芸香苷
生物活性物質05 D 異東方素
生物活性物質06 C 木犀草素8-C-葡萄糖苷
實驗將會分為實驗組1（添加生物活性物質01）、實驗組2（添加生物活性物質02）、實驗組3（添加生物活性物質03）、實驗組4（添加生物活性物質04）、實驗組5（添加生物活性物質05）、實驗組6（添加生物活性物質06）以及控制組（未添加生物活性物質）。
實驗步驟：
1.將人類肝癌細胞HepG2（以下簡稱HepG2細胞）（購自美國典型培養物保藏中心ATCC；Cat. HB-8065）以每孔2×105 個的方式，接種於每孔含2 mL的細胞培養基之6孔培養盤中。
其中，細胞培養基：含10 vol%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（購自Gibco，Cat.10437-028）及1 vol%青黴素/鏈黴素（購自Gibco，Cat. 15140122）的DMEM（購自GIBCO公司，Cat. 11965-092）。
2. 各組別於37℃下，培養24小時。其中，各組別於培養前先處理處理如下： 實驗組1：每孔加入2 mg/ml的生物活性物質01。 實驗組2：每孔加入2 mg/ml的生物活性物質02。 實驗組3：每孔加入2 mg/ml的生物活性物質03。 實驗組4：每孔加入含2 mg/ml的生物活性物質04。 實驗組5：每孔加入2 mg/ml的生物活性物質05。 實驗組6：每孔加入2 mg/ml的生物活性物質06。 控制組：每孔不加入任何生物活性物質，即單純只有2mL的細胞培養基。
3.收集各組各孔中的細胞。具體來說，各組以1 mL的1XPBS（磷酸緩衝鹽溶液）（購自Gibco；Cat. 14200-075）溶液潤洗1次後，加入將200 μL的胰蛋白酶（購自Sigma；Cat.59427C）加至每孔中並在暗處反應5分鐘，並於反應後於各孔中添加0.6mL的細胞培養基，並將各組的各孔的細胞與細胞培養基個別收集至對應的離心試管內。
4. 各組以PBS溶液潤洗1次。具體來說，將各組以400 xg離心5分，離心後移除上清液，加入PBS溶液回溶後再以400 xg離心5分，並於離心後移除上清液，以得到細胞沉澱物。
5. 各組以PBS溶液回溶細胞沉澱物為細胞懸浮液。
6. 將GSH偵測染劑（購自abcam，型號Ab112132）購買取得後體積稀釋1000倍以得到GSH偵測溶液，各組別以GSH偵測溶液染色15分鐘。
7. 各組以PBS溶液潤洗1次。具體來說，將各組以400 xg離心5分，離心後移除上清液，加入PBS溶液回溶後再以400 xg離心5分，並於離心後移除上清液，以得到細胞沉澱物。
8. 各組以200 μL 的PBS溶液回溶細胞沉澱物為待測細胞液。
9. 使用流式細胞儀（Beckman；BD Accuri）偵測各組的待測細胞液中的非螢光綠染料（non-fluorescent Green Dye）的螢光信號。進行螢光偵測之激發波長為490 nm，放射波長為520 nm。
實驗結果：
請參閱圖11，其中經過生物活性物質01（鳥苷）處理的HepG2細胞，其穀胱甘肽的生成量是控制組的1.6倍；經過生物活性物質02（牡荊素）處理的HepG2細胞，其穀胱甘肽（glutathione, GSH）的生成量是控制組的0.6倍；經過生物活性物質03（異牡荊素）處理的HepG2細胞，其穀胱甘肽的生成量是控制組的0.4倍；經過生物活性物質04（芸香苷）處理的HepG2細胞，其穀胱甘肽的生成量是控制組的0.6倍；經過生物活性物質05（異東方素）處理的肝細胞，其穀胱甘肽的生成量是控制組的0.6倍；經過生物活性物質06（木犀草素8-C-葡萄糖苷）處理的HepG2細胞，其穀胱甘肽的生成量是控制組的0.4倍。
穀胱甘肽是由由麩胺酸、半胱胺酸及甘胺酸所組成的三胜肽，其硫醇基（G-SH）易與自由基結合，具有抗氧化的功能。由圖11可見，由浸提液4分離出的生物活性物質01能提升肝細胞內的穀胱甘肽的生成量，因而具有良好的抗氧化效果。
綜上所述，在任一實施例中，蕎麥苗浸提液用於製備提高細胞抗氧化組合物及/或肝臟保健組合物的用途及蕎麥苗浸提液的製備方法，其適用於提供蕎麥苗浸提液或其組合物。其中，所提供的蕎麥苗浸提液或其組合物具有下列一種或多種功能：提升細胞抗氧化活性、提升代謝活性、及提升細胞內穀胱甘肽（glutathione, GSH）的合成。
A,B,C,D,E,F,G:時間點
圖1是以蕎麥種子發芽後生長0、3、6、9、12、15、18天的蕎麥苗為原料所得的蕎麥苗浸提液的HPLC指紋圖譜。 圖2是生物活性物質01的氫譜圖。 圖3是生物活性物質02的氫譜圖。 圖4是生物活性物質03的氫譜圖。 圖5是生物活性物質04的氫譜圖。 圖6是生物活性物質05的氫譜圖。 圖7是生物活性物質06的氫譜圖。 圖8是控制組、對照組、實驗組1及實驗組2的ROS的相對產生量的實驗結果圖。 圖9是控制組、實驗組1及實驗組2之穀胱甘肽（glutathione）的相對產生量的實驗結果圖。 圖10是蕎麥苗浸提液的還原力的實驗結果圖。 圖11是控制組、實驗組1、實驗組2、實驗組3、實驗組4、實驗組5及實驗組6之穀胱甘肽（glutathione）的相對產生量的實驗結果圖。

Claims (16)

  1. 一種蕎麥苗浸提液的用途，用於製備提升細胞抗氧化活性的組合物，其中該蕎麥苗浸提液是以水浸提一蕎麥苗而獲得，該蕎麥苗為蕎麥種子發芽後生長9日至12日之幼苗，該蕎麥苗的浸提溫度介在80℃至90℃之間，以及該蕎麥苗的浸提時間為120分鐘。
  2. 一種蕎麥苗浸提液的用途，其是用於製備肝臟保健的組合物，其中該蕎麥苗浸提液是以水浸提一蕎麥苗而獲得，該蕎麥苗為蕎麥種子發芽後生長9日至12日之幼苗，該蕎麥苗的浸提溫度介在80℃至90℃之間，以及該蕎麥苗的浸提時間為120分鐘。
  3. 如請求項2的蕎麥苗浸提液的用途，其中該蕎麥苗浸提液用以提升細胞抗氧化及代謝活性。
  4. 如請求項3的蕎麥苗浸提液的用途，其中該蕎麥苗浸提液用以提升細胞內穀胱甘肽(glutathione,GSH)的合成。
  5. 如請求項1或2所述的蕎麥苗浸提液的用途，其中該溶劑與該蕎麥苗的重量比為2：1至5：1。
  6. 如請求項5所述的蕎麥苗浸提液的用途，其中該蕎麥苗浸提液為4.7°Bx至5.3°Bx。
  7. 如請求項5所述的蕎麥苗浸提液的用途，其中該蕎麥苗浸提液的黃酮含量為815μg/mL。
  8. 如請求項1或2所述的蕎麥苗浸提液的用途，其中該蕎麥苗浸提液包含下列生物活性物質中的至少一者：鳥苷(Guanosine)、牡荊 素(Vitexin)、異牡荊素(Isovitexin)、芸香苷(Rutin)、異東方素(Isoorientin)及木犀草素8-C-葡萄糖苷(Luteolin-8-C-glucoside)。
  9. 如請求項8所述的蕎麥苗浸提液的用途，其中該鳥苷用以提升細胞內穀胱甘肽(glutathione,GSH)的合成。
  10. 一種蕎麥苗浸提液的製備方法，包括：將水與一蕎麥苗在80℃至90℃的溫度下浸提60分鐘至180分鐘以得到一浸提原液，其中該水與該蕎麥苗的重量比為2：1至5：1，其中該蕎麥苗浸提液是以水浸提該蕎麥苗而獲得，該蕎麥苗為蕎麥種子發芽後生長9日至12日之幼苗；以及過濾該浸提原液而得到一蕎麥苗浸提液。
  11. 如請求項10所述的製備方法，更包括：減壓濃縮該蕎麥苗浸提液至該蕎麥苗浸提液為4.7°Bx至5.3°Bx以得到濃縮後的該蕎麥苗浸提液。
  12. 如請求項10所述的製備方法，其中該減壓濃縮步驟是於50℃至60℃進行。
  13. 如請求項10所述的製備方法，其中濃縮後的該蕎麥苗浸提液的總黃酮含量為815μg/mL。
  14. 如請求項10所述的製備方法，其中該蕎麥苗浸提液包含下列生物活性物質中的至少一者：鳥苷(Guanosine)、牡荊素(Vitexin)、異牡荊素(Isovitexin)、芸香苷(Rutin)、異東方素(Isoorientin)及木犀草素8-C-葡萄糖苷(Luteolin-8-C-glucoside)。
  15. 如請求項14所述的製備方法，其中該鳥苷用以提升細胞內穀胱甘肽(glutathione,GSH)的合成。
  16. 一種蕎麥苗浸提液，包含下列生物活性物質中的至少一者：鳥苷(Guanosine)、牡荊素(Vitexin)、異牡荊素(Isovitexin)、芸香苷(Rutin)、異東方素(Isoorientin)及木犀草素8-C-葡萄糖苷(Luteolin-8-C-glucoside)，其中該蕎麥苗浸提液是以水浸提一蕎麥苗而獲得，該蕎麥苗為蕎麥種子發芽後生長9日至12日之幼苗，該蕎麥苗的浸提溫度介在80℃至90℃之間，以及該蕎麥苗的浸提時間為120分鐘。
TW109131204A 2019-09-10 2020-09-10 蕎麥苗浸提液、其用於製備提高細胞抗氧化組合物及/或肝臟保健組合物的用途及其製備方法 TWI774055B (zh)

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