CN112546058A - 促进胆固醇代谢的化合物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种化合物的新用途领域，特别是关于促进胆固醇代谢的化合物的用途。本发明提供一种组合物用于制备促进胆固醇代谢相关基因表现的医药品的用途，其中所述组合物包含一药学上可接受的载体，及一选自由拉里西诺醇4'‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷、腺苷、及其组合所组成群组的化合物。该胆固醇代谢相关基因包括SCARB1、APOA1、及LDLR。藉由促进该些基因表现，拉里西诺醇4'‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷及腺苷能降低个体因胆固醇代谢不良而罹患心血管疾病的风险。

Description

促进胆固醇代谢的化合物的用途
技术领域
本发明是关于一种化合物的新用途领域，特别是关于促进胆固醇代谢的化合物的用途。
背景技术
人体中的胆固醇代谢涉及多个器官，其中最重要器官是肝脏。依据先前研究，细胞的胆固醇含量由一种复杂的平衡所调节，其中涉及胆固醇的内源性合成，细胞对胆固醇的摄取，以及细胞内胆固醇自细胞被排出至血液。
胆固醇于血液中运输时是以胆固醇脂的形式与其他脂质和蛋白质一起包装在囊泡中。肠道将经由饮食摄入的胆固醇组装成乳糜微粒，这些微粒通过血液运输最终被肝脏吸收，肝脏也是人体内胆固醇合成的主要场所。肝脏将饮食中及新合成的胆固醇包装到低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)中，这些脂蛋白被分泌到血液中以运输到其他组织。该些组织的细胞通过LDL受体介导的内吞作用吸收LDL，从而获得并利用来自LDL的胆固醇。另一方面，高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)透过从周边组织中获取多余胆固醇并将其输送至肝脏来促进血管健康。在肝脏中，胆固醇被转化为胆汁酸并被排出体外。
胆固醇动态平衡对人类的健康至关重要。当胆固醇的代谢有缺陷，可成导致在血液中循环的胆固醇过多。例如，LDL受体的缺陷会减少细胞对LDL的摄取，从而使得LDL在血液中累积，导致胆固醇沉积在动脉壁，最终造成动脉粥样硬化和冠状动脉疾病。由于血中胆固醇水平与冠状动脉疾病间有着很强的负相关，血中胆固醇水平是临床上评估心血管疾病风险的重要指标。
有鉴于此，为降低个体因胆固醇代谢不良而罹患心血管疾病的风险，开发一种可促进胆固醇代谢的组合物，实有其必要。
发明内容
缘此，本发明的一目的在提供一种组合物用于制备促进胆固醇代谢相关基因表现的医药品的用途，其中该组合物包含一药学上可接受的载体，及一选自由拉里西诺醇4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、腺苷、及其组合所组成群组的化合物。
在本发明的一实施例中，该组合物调节的胆固醇代谢相关基因编码一低密度脂蛋白受体(LDLR)，且该化合物的浓度至少为50μg/mL。
本发明的另一目的在提供一种拉里西诺醇4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(lariciresinol 4'-O-β-D-glucopyranoside)用于制备促进胆固醇代谢相关基因表现的医药组合物的用途。
在本发明的一实施例中，该由拉里西诺醇4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷调节的胆固醇代谢相关基因编码一清除者受体B类1型(scavenger receptor class B member 1，SRB1)或一低密度脂蛋白受体(low-density lipoprotein(LDL)receptor，LDLR)。
在本发明的一实施例中，该医药组合物含有浓度至少为50μg/mL的拉里西诺醇4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
本发明的另一目的在提供一种腺苷(adenoside)用于制备促进胆固醇代谢相关基因表现的医药组合物的用途。
在本发明的一实施例中，该由腺苷调节的胆固醇代谢相关基因编码一低密度脂蛋白受体(LDLR)。
在本发明的一实施例中，该医药组合物含有浓度至少为50μg/mL的腺苷。
本文揭露施予有效量的拉里西诺醇4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷或腺苷能显著促进细胞内胆固醇代谢相关基因表现。因此，该二化合物可用于制备促进胆固醇代谢相关基因表现的组合物，其能降低个体因胆固醇代谢不良而罹患心血管疾病的风险，进而改善胆固醇代谢异常者或高胆固醇饮食者的心血管健康。该组合物可为粉末、颗粒、溶液、胶体或膏体，且可制成医药品、食品、饮品、或营养补充剂，藉由口服或其他方式给予一个体。
以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明的特点及应用，而非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
图1显示HepG2细胞以本发明一实施例的苦荞麦种皮萃取物或其二次萃取物处理24小时后，相对于控制组细胞(不予处理)的SCARB1、APOA1、及LDLR基因的相对表现量；FT表示苦荞麦种皮萃取物，FTE表示乙酸乙酯层萃取物，FTB表示正丁醇层萃取物，FTW表示水层萃取物；
图2显示化合物FT-01的质谱图；
图3显示化合物FT-01的氢核磁共振(1H-NMR)光谱；
图4显示化合物FT-02的质谱图；
图5A显示化合物FT-02的1H-NMR光谱；
图5B显示化合物FT-02的碳核磁共振(13C-NMR)光谱；
图5C显示化合物FT-02的氢-氢关联性(correlation spectroscopy，COSY)光谱；
图5D显示化合物FT-02的碳-氢异核单量子相关(heteronuclear single quantumcorrelation，HSQC)光谱；
图5E显示化合物FT-02的碳-氢异核多键相关(heteronuclear multiple bondcorrelation，HMBC)光谱；
图6显示化合物FT-03的质谱图；
图7显示化合物FT-03的1H-NMR光谱；
图8显示HepG2细胞以化合物FT-01、FT-02、或FT-03处理24小时后，相对于控制组细胞(不予处理)的SCARB1、APOA1、及LDLR基因的相对表现量。
具体实施方式
本发明提供一种拉里西诺醇4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷或腺苷用于制备促进胆固醇代谢相关基因表现的医药组合物的用途。本发明亦提供一种包含一药学上可接受的载体，以及任一前述化合物或其组合的组合物用于制备促进胆固醇代谢相关基因表现的医药品的用途。以下实施例显示对肝细胞施予任一前述化合物或包含该些化合物的组合物，可以促进包括SCARB1、APOA1、及LDLR等基因的表现。
定义
除非另有说明，本文中所使用的「一」、「该」及类似用语应理解为包含单数及复数形式。
本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。
本文所述的苦荞麦(bitter buckwheat)是属于蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum)的食用植物，学名为Fagopyrum tataricum，又名鞑靼荞麦(Tartarybuckwheat)或绿色荞麦。相比同属的普通荞麦(Fagopyrum esculentum)，苦荞麦的味道更苦，含有更多芦丁(rutin)，但缺少水杨醛(salicylaldehyde)和萘(naphthalene)。苦荞麦与普通荞麦通常被视为谷物，但与属于禾本科(Poaceae)的常见谷物不同，因此它们与小麦无关。
本文所述的医药组合物或医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而制备成一适合于非经肠地道(parenterally)或口服地(orally)投药的剂型(dosage form)，其包括但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、粉末(sterile powder)、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)、细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似物。
本文所述的医药组合物可由非经肠道途径(parenteral routes)来投药，其包括但不限于：腹膜内注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneousinjection)、肌肉内注射(intramuscular injection)、及静脉内注射(intravenousinjection)。
本文所述的医药组合物可包含一广泛使用于药物制造技术的药学上可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)。该药学上可接受的载体可包含一或多种选自于由下列所构成的群组中的试剂：溶剂(solvent)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。该些试剂的选用与数量落在熟习此项技术者的专业素养与例行技术范畴内。
前述药学上可接受的载体包含一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normal saline)、磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)、含糖溶液、含醇水溶液(aqueous solution containing alcohol)、及它们的组合。
材料与方法
材料
自Thermo Fisher Scientific购买DMEM培养基(Gibco Dulbecco's modifiedEagle’s medium)、胎牛血清(Gibco fetal bovine serum，FBS)、青霉素/链霉素(Gibcopenicillin/streptomycin)、及磷酸缓冲盐溶液(Gibco PBS)。
溶剂是购自中国台湾默克公司，包括乙酸乙酯(ethyl acetate)、甲醇(methanol)、正丁醇(ethanol)、乙腈(acetonitrile)、丙酮(acetone)、二氯甲烷(dichloromethane)、氯仿-d1(氘化程度99.5％)、甲醇-d6(氘化程度99.5％)、重水(deuterium oxide，氘化程度>99.8％)、及二甲基亚砜-d6(dimethyl sulfoxide-d6，氘化程度>99.9％)。
化学分析仪器
化合物分离是利用管柱层析法(column chromatography)及薄层层析法(thinlayer chromatography，TLC)。中压液相层析(medium pressure liquid chromatography，MPLC)系统是
Figure BDA0002347463650000051
Rf+(Teledyne ISCO)；管柱填充材料是选用自Sephadex LH-20(Amersham Biosciences)、Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical)、Merck Kieselgel 60(40-63μm，Art.9385)、及Merck
Figure BDA0002347463650000052
RP-18(40-63μm，Art.0250)。高效液相层析(high performance liquid chromatography，HPLC)系统装配Hitachi L-2310系列帮浦、Hitachi L-2420紫外光-可见光侦测器(侦测波长为200nm至380nm)、及D-2000Elite资料处理软件；管柱是选用自分析级
Figure BDA0002347463650000053
HS C18(250×4.6mm，5μm；SUPELCO)与MightysilRP-18GP 250(250×4.6mm，5μm；Kanto Chemical)，以及半制备级
Figure BDA0002347463650000054
HS C18(250×10.0mm，5μm；SUPELCO)与制备级
Figure BDA0002347463650000055
HS C18(250×21.0mm，5μm；SUPELCO)。薄层层析片是涂覆硅胶60F254(0.25mm；Merck)或RP-18F254S(0.25mm；Merck)的铝片，其配合紫外灯UVP UVGL-25(波长为254nm及365nm)进行分析。
化合物的化学结构是以质谱法(mass spectrometry，MS)及核磁共振光谱法(nuclear magnetic resonance spectrometry，NMR)确定。具体而言，使用电喷洒离子化串联质谱(ESI-MS/MS)及二维离子阱串联傅里叶变换质谱(Bruker amaZon SL system及Thermo Scientific Orbitrap Elite system)；并使用400MHz Varian 400FT-NMR取得一维与二维NMR光谱，以四甲基硅烷(tetramethylsilane，TMS)作为内部标准品(δ＝0)。NMR光谱以δ表示化学位移(chemical shift)，单位为ppm；偶合常数(J)以Hz为单位；s表示单峰(singlet)，d表示二重峰(doublet)，d表示三重峰(triplet)，q表示四重峰(quartet)，p表示五重峰，m表示多重峰(multiplet)，brs表示宽峰。
细胞培养
以下实施例所用细胞是购自美国典型培养物保存中心(American Type CultureCollection，ATCC)的人类肝癌细胞株HepG2(ATCC HB-8065)。HepG2细胞在37℃、5％二氧化碳的条件下培养于添加10％FBS及1％青霉素/链霉素的DMEM培养基，以下称细胞培养基。
基因表现量分析
基于定量聚合酶链锁反应(quantitative polymerase chain reaction，简称qPCR)测定HepG2细胞中胆固醇代谢相关基因的表现量，其步骤简述如下。依据厂商使用说明，利用RNA萃取套组(RNA Extraction Kit；Geneaid)自细胞分离出核醣核酸(RNA)，于37℃下以反转录酶
Figure BDA0002347463650000061
III Reverse Transcriptase(Invitrogen)将2000ng RNA反转录为cDNA。其后，利用qPCR套组(KAPA CYBR FAST qPCR Kit(2X)；KAPA Biosystems)以及目标基因与作为内部对照的甘油醛3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase)基因GAPDH的引物对(表1)在PCR反应仪(Step One Plus Real-Time PCRsystem；Applied Biosystems)对前述cDNA进行qPCR，并分析PCR产物的解链曲线(meltingcurve)。
表1
Figure BDA0002347463650000071
最终，使用2-ΔΔCT方法测定目标基因的相对表现量。该方法以GAPDH基因的循环阈值(CT)作为内部对照的参考基因的循环阈值，按照以下公式计算相对倍数变化：
ΔCT＝实验组或控制组的目标基因的CT-内部对照的CT
ΔΔCT＝实验组的ΔCT-控制组的ΔCT
倍数变化＝2-ΔΔCt平均值
数据表示为平均值±标准偏差(SD)。统计分析是使用Excel软件中的STDEV函数计算各基因相对表现量的标准偏差，并以单尾学生t检定(TTEST)判定数据间差异在统计上的显著性。
实施例1
制备具降胆固醇活性的化合物
为取得具降胆固醇活性的化合物，首先制备一苦荞麦种皮萃取物。简言之，先洗净及干燥苦荞麦全谷的外壳，即苦荞麦种皮，及使用粉碎机将其粉碎。其次，以水为溶剂对苦荞麦种皮粉碎物进行萃取。该溶剂与该苦荞麦种皮粉碎物混合的重量比范围为15：1至10：1。萃取温度为介于70℃至90℃。本实施例中萃取时间为1至2小时。
为移除残余固体物，经上述萃取步骤所得的苦荞麦种皮萃取物冷却至室温后，可进一步以400目(mesh)滤网过滤而获得一上清液。该上清液可进一步在40℃至60℃进行减压浓缩而获得一浓缩产物(FT)。
其后，自该苦荞麦种皮萃取物中进一步分离出富含降胆固醇活性成分的二次萃取物，其步骤简述如下。首先，藉由乙酸乙酯与水等比例(体积比1：1)液相分配的方式萃取10L苦荞麦种皮萃取物三次。将所得乙酸乙酯层萃取液合并，再经减压浓缩干燥可获得一乙酸乙酯层萃取物(FTE)约1.9g。余下水层萃取液以正丁醇与水等比例(体积比1：1)液相分配方式萃取三次。所得正丁醇层萃取液及水层萃取液分别合并，再经减压浓缩干燥可得到一正丁醇层萃取物(FTB)约11.5g及一水层萃取物(FTW)约75.0g。
为评估降胆固醇作用，对人类肝癌细胞株HepG2施以含20μg/mL前述苦荞麦种皮萃取物、乙酸乙酯层萃取物、正丁醇层萃取物、或水层萃取物的2mL细胞培养基，或者仅用细胞培养基处理细胞(控制组)。各组细胞于37℃培养24小时后用于基因表现量分析，目标基因包括编码清除者受体B类1型(SRB1)的SCARB1基因、编码载脂蛋白A1(apolipoprotein A1，ApoA1)的APOA1基因、及编码低密度脂蛋白受体(LDLR)的LDLR基因。
以上述三基因作为胆固醇代谢指标基因的原因在于，SRB1是肝细胞摄取高密度脂蛋白(HDL)所需的受体，其存在有助于来自周边组织的胆固醇透过HDL进入肝细胞被代谢；ApoA1是HDL的主要构成蛋白之一，其生成有利HDL形成，因此促进胆固醇被HDL运送至肝细胞以被进一步代谢；LDLR是低密度脂蛋白(LDL)的受体，其存在有助于肝细胞及其他细胞摄取血液中的LDL以减少血中胆固醇累积。
图1显示前述各组HepG2细胞中各目标基因的相对表现量；图中***及***分别表示相比控制组为p<0.05、p<0.01及p<0.001。依据图1，相比控制组，施予苦荞麦种皮萃取物(FT)只能提升HepG2细胞的LDLR基因的表现；施予乙酸乙酯层萃取物显著减少SCARB1、APOA1、及LDLR基因的表现；但正丁醇层萃取物(FTB)的处理增加SCARB1、APOA1、及LDLR基因的表现分别约18％、23％、及60％，且水层萃取物(FTW)的处理增加SCARB1、APOA1、及LDLR基因的表现分别约119％、51％、及56％。
因此，依据生物活性导引分离方法(bioassay guided fractionation)进一步自该正丁醇层萃取物及水层萃取物中分离出降胆固醇活性成分。使用填充Sephadex LH-20的管柱及甲醇冲提液，对正丁醇层萃取物(约11.5g)进行管柱层析，分离得到6个划分层(分别标记为BF1至BF6)。其后，以二氯甲烷与甲醇依体积比7:1的混合液为冲提液，对BF2划分层进行硅胶管柱层析，所得流出液再经薄层层析片分离，可得到10个划分层(分别标记为BF2-1至BF2-10)。BF2-5划分层以水与甲醇的混合液在中压液相层析系统进行极性渐减冲提，所得流出液再经薄层层析片分离，可得到6个划分层(分别标记为BF2-5-1至BF2-5-6)。BF2-5-6划分层进一步以甲醇与水依体积比3:7的混合液作为移动相进行高效液相层析(使用C18管柱)，可分离得化合物FT-02约8.0mg。
此外，使用填充Diaion HP-20的管柱及水与甲醇渐减极性梯度混合的冲提液，对水层萃取物(约75.0g)进行管柱层析，分离得到6个划分层(分别标记为WF1至WF6)。其后，WF2划分层以甲醇再结晶法得到化合物FT-01约200mg。以二氯甲烷与甲醇依体积比7:1的混合液为冲提液，对WF2划分层于再结晶后的母液进行硅胶管柱层析，可分离得化合物FT-03约5.0mg。
化合物FT-01、FT-02、及FT-03的化学结构是以质谱法及核磁共振光谱法(NMR)确定。图2及图3分别显示FT-01的质谱图及核磁共振光谱；图4及图5A-5E分别显示FT-02的质谱图及核磁共振光谱；图6及图7分别显示FT-03的质谱图及核磁共振光谱。依据图2-3判定化合物FT-01是芦丁(rutin)；依据图4及5A-5E判定化合物FT-02是拉里西诺醇4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(lariciresinol 4'-O-β-D-glucopyranoside)；依据图6-7判定化合物FT-03是腺苷(adenoside)。下表2显示各该化合物的结构。
表2
Figure BDA0002347463650000101
实施例2
化合物降胆固醇活性的验证
为验证化合物FT-01、FT-02、及FT-03调节胆固醇代谢相关基因表现的效果，对人类肝癌细胞株HepG2施以含50μg/mL该三种化合物任一者的2mL细胞培养基，或者仅用细胞培养基处理细胞(控制组)。各组细胞于37℃培养24小时后用于基因表现量分析，目标基因包括SCARB1、APOA1、及LDLR基因。
图8显示前述各组HepG2细胞中各目标基因的相对表现量；图中***及***分别表示相比控制组为p<0.05、p<0.01及p<0.001。依据图8，相比控制组，施予FT-01(即芦丁)无法提升SCARB1、APOA1、及LDLR基因的表现。相对地，施予FT-02(即拉里西诺醇4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)显著提升SCARB1及LDLR基因的表现分别约34％及127％。此外，FT-03(即腺苷)的处理亦显著增加LDLR基因的表现约135％。此结果验证FT-02及FT-03促进胆固醇代谢相关基因表现的效果。
综上所述，本发明揭露施予有效量的拉里西诺醇4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷及腺苷能显著促进细胞内胆固醇代谢相关基因表现。因此，该二化合物可用于制备促进胆固醇代谢相关基因表现的组合物，其能降低个体因胆固醇代谢不良而罹患心血管疾病的风险，进而改善胆固醇代谢异常者或高胆固醇饮食者的心血管健康。该组合物可为粉末、颗粒、溶液、胶体或膏体，且可制成医药品、食品、饮品、或营养补充剂，藉由口服或其他方式给予一个体。
Figure IDA0002347463700000011
Figure IDA0002347463700000021
Figure IDA0002347463700000031
Figure IDA0002347463700000041

Claims (10)

1.一种组合物用于制备促进胆固醇代谢相关基因表现的医药品的用途，其中所述组合物包含一药学上可接受的载体，及一选自由拉里西诺醇4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、腺苷、及其组合所组成群组的化合物。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述胆固醇代谢相关基因编码一低密度脂蛋白受体。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述化合物的浓度至少为50μg/mL。
4.一种拉里西诺醇4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷用于制备促进胆固醇代谢相关基因表现的医药组合物的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述胆固醇代谢相关基因编码一清除者受体B类1型。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述胆固醇代谢相关基因编码一低密度脂蛋白受体。
7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述拉里西诺醇4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的浓度为至少50μg/mL。
8.一种腺苷用于制备促进胆固醇代谢相关基因表现的医药组合物的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述胆固醇代谢相关基因编码一低密度脂蛋白受体。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述腺苷的浓度至少为50μg/mL。
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