KR100760999B1 - Ｐｐａｒ감마를 활성화하는 찔레버섯 추출물 및 이로부터분리된 클로로페린 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PPARγ를 활성화하는 찔레버섯 추출물 및 이로부터 분리된 클로로페린 화합물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 글루코스의 항상성을 조절하는 PPARγ의 활성을 증대시키는 작용이 우수하여 인슐린 저항증 및 당뇨병과 관련된 고혈당증 치료 및 예방을 위한 의약품, 기능성 식품, 또는 식품첨가물로서 유용한 찔레버섯(Phellinus ribis) 추출물과 이 추출물로부터 분리된 클로로페린(Chlorophellin) 화합물에 관한 것이다.

항당뇨, 찔레버섯(Phellinus ribis), 클로로페린(Chlorophellin), 인슐린 저항증, 당뇨병, 의약품, 식품

Description

ＰＰＡＲ감마를 활성화하는 찔레버섯 추출물 및 이로부터 분리된 클로로페린 화합물{Phellinus ribis extracts and chlorophellin compounds therefrom having PPARγ agonist activity}

도 1은 클로로페린 C의 결정구조를 나타낸 그림이다.

도 2는 찔레버섯 추출물과 클로로페린 A, B, C, D 화합물 각각에 대하여 PPARγ의 활성을 증대시키는 정도를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 PPARγ를 활성화하는 찔레버섯 추출물 및 이로부터 분리된 클로로페린 화합물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 글루코스의 항상성을 조절하는 PPARγ의 활성을 증대시키는 작용이 우수하여 인슐린 저항증 및 당뇨병과 관련된 고혈당증 치료 및 예방을 위한 의약품, 기능성 식품, 또는 식품첨가물로서 유용한 찔레버섯(Phellinus ribis) 추출물과 이 추출물로부터 분리된 클로로페린(Chlorophellins) 화합물에 관한 것이다.

경제발전과 생활양식의 변화로 우리 나라에서도 당뇨병이 점점 증가 추세에 있다. 당뇨병 유병율은 1970년에 약 1% 미만으로 추정되던 것이 2000년대로 들어서면서 5%에 이르고 있다. 연령별로는 40세 이후에 급증하여 60∼69세에서 가장 높게 나타나고 있다. 당뇨병은 인슐린이 부족하거나 작용이 안 되어 혈당이 높이 올라가는 질환이며 적극적으로 치료하지 않으면 만성 혈관성 합병증으로 진행하는 병이다. 당뇨병의 증가는 합병증 환자의 증가로 반영되며 이는 다시 의료비의 증가와 환자의 삶의 질 저하로 이어지므로 향후 합병증 예방 대책은 가장 중대한 문제가 될 것이다. 당뇨병 환자 중에서 특히 과식이나 운동부족과 같은 생활습관과 관련된 2형 당뇨병의 급속한 증가는 선진국보다 아시아 지역의 개발도상국가에서 더욱 현저할 것으로 예상된다. 최근 광범위한 연구 결과 당뇨병의 발생기전이 알려지고 있으며 2형 당뇨병의 경우 인슐린 분비 장애와 인슐린 저항이 관여되고, 1형의 경우에는 자가면역인자와 췌장 베타세포의 파괴가 관여하는 것으로 밝혀졌다. 당뇨병 발생기전은 근본적으로 유전인자와 환경인자로 귀결된다. 1형 당뇨병의 경우 조직적합형 항원(HLA) 유전자가 질환 감수성 유전자로 알려져 있으며, 2형 당뇨병 유전자의 경우 인슐린과 인슐린 수용체 유전자에서부터 후보유전자 발굴이 시작되었으며, 세포 내에서 인슐린 분비나 작용 그리고 신호전달에 관여하는 각종 물질의 유전자가 검색되고 있다.

한편, 트리글리세라이드와 유리지방산이 많이 함유된 식이는 비만과 2형 당뇨, 심장질환, 고혈압 등의 대사 질환의 원인이 되고 있는 것으로 알려져 있다. 하지만 지방산이 갖는 양면성의 반대편에는 없어서는 안 될 중요한 역할을 하고 있다. 즉, 지방산은 트리글리세라이드로서 지방세포에 저장되는데, 이때 선천적으로 지방세포가 없는 지방이영양증(lipodystrophies) 환자들은 심각한 대사 질환인 인슐린 저항증(insulin resistence), 고혈당(hyperglycemia), 고지혈증(Hyperlipidemia) 등을 앓고 있다. 그러므로 지방세포와 지방산은 건강을 유지시키는데 있어서 필수적인 구성성분이라 할 수 있다. 지방세포의 연구는 많은 성과를 이루었으며, 그 중에서도 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor gamma)로서 알려진 핵 호르몬 수용체의 발견은 괄목할 만한 결과이다. PPARγ는 지방산에 의해 활성화되는 전사인자로 지방세포 분화와 기능에서 중요한 조절인자이다. 그러므로 PPARγ는 지방산 농도와 지방세포의 발현을 조절하는 역할을 하며, 지방세포의 발현과 지방 저장소의 형성에 있어서 필수요소이다. 또한 PPARγ는 글루코스의 항상성을 조절하는 역할을 하므로, PPARγ의 활성화제는 인슐린 저항증(insulin resistence) 및 2형 당뇨병과 관련된 고혈당증(hyperglycemia)을 치료하는 강력한 약물로 떠오르고 있다. PPARγ의 활성화는 근육에서 글루코스의 이용성을 증가시키고 간에서 글루코스의 합성을 저해하며, 대식세포로부터 콜레스테롤 유출을 증가시켜서 결국 인슐린 감작(insulin sensitization), 글루코스 저하, 트리글리세라이드 저하효과를 나타내어 2형 당뇨병을 치료한다. PPARγ의 활성화제가 인슐린 저항증(insulin resistence) 및 2형 당뇨병과 관련된 고혈당증(hyperglycemia)을 치료하는데 유효한 약효를 나타냄에 대해서는 이미 여러 문헌을 통해 밝혀진 바가 있다 [1) Mayerson A.B., Hundal R.S., Dufour S., Lebon V., Befroy D., Cline G.W., Enocksson S., Inzucchi S.E., Shulman G.I., Petersen K.F., "The effects of rosiglitazone on insulin sensitivity, lipolysis, and hepatic and skeletal muscle triglyceride content in patients with type 2 diabetes", Diabetes 51(3): 797-802, 2002 ; 2) Nolan J.J., Ludvik B., Beerdsen P., Joyce M., Olefsky J., "Improvement in glucose tolerance and insulin resistance in obese subjects treated with troglitazone", N. Engl. J. Med. 331(18): 1188-1193, 1994 ; 3) Olefsky J.M., "Treatment of insulin resistance with peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists", J. Clin. Invest. 106(4): 467-472, 2000 ; 4) Saltiel A.R., Olefsky J.M., "Thiazolidinediones in the treatment of insulin resistance and type II diabetes", Diabetes 45(12): 1661-1669, 1996 ; 5) Tan G.D., Fielding B.A., Currie J.M., Humphreys S.M., Desage M., Frayn K.N., Laville M., Vidal H., Karpe F., "The effects of rosiglitazone on fatty acid and triglyceride metabolism in type 2 diabetes", Diabetologia 48(1): 83-95, 2005].

최근 당뇨병의 치료를 위해 민간에서는 버섯에 대한 관심이 증가하고 있으며 영지, 표고, 송이버섯 등의 항 당뇨효과를 이용하여 이들 버섯 추출액을 건강 식품으로 판매하고 있으나 정확한 성분 및 함량분석이 미비한 상태이다. 또한 지금 까지의 항당뇨 치료제는 대부분 합성화합물로 많은 부작용이 문제가 되고 있어 천연물로부터의 치료제가 요구되고 있다.

수백만 년 동안 버섯은 바이러스와 박테리아 등의 침입자들을 막아내기 위해 체내에서 방어물질들을 생산하여, 체내의 독성물질을 해독시키면서 환경에 적응하여왔다. 지금까지 알려진 약용 버섯들로부터, 이들이 생산하는 2차 대사산물인 이른바 방어물질은 인류에게 수 천년동안 안전하면서도 효과적인 의약품으로 알려져 왔다. 특히 수 천 종에 이르는 버섯 균류들은 독특하며 다양한 화합물들을 생산하는 것으로 알려져 있어 신약개발을 위한 좋은 소재로 이용할 수 있을 것이다. 하지만 아직까지 버섯으로부터의 천연물 연구는 다른 미생물에 비해 저조한 편이어서 좋은 효과를 갖고 있지만 이용되지 않는 버섯의 종류는 굉장히 많을 것으로 추정된다.

버섯을 소재로 한 천연약물의 개발은 그 잠재성이 매우 클 것으로 기대된다.

이에, 본 발명자들은 인슐린 저항증과 2형 당뇨에 의한 대사질환을 극복하고자 PPARγ의 활성을 증대시키는 물질을 탐색하기 위하여 버섯, 약용식물 등 각종 천연물을 수집하여 조사하던 중, 찔레버섯(Phellinus ribis) 추출물이 PPARγ의 활성을 크게 증대시키는 것을 확인하였고, 그리고 찔레버섯 추출물로부터 우수한 PPARγ 활성화 물질의 분리, 정제, 화학구조의 결정, 생물활성 등을 통하여 폴리클로라이드계 방향족 화합물로서 클로로페린(chlorophellin) A, B, C 및 D를 분리하였다. 본 발명이 분리한 클로로페린 A, B, C 및 D 각각의 화합물에 대한 화학구조 및 이화학적 특성 등을 규명한 결과 지금까지 보고된 적이 없는 신규 화합물 에 해당됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 클로로페린 A, B, C 또는 D의 신규 화합물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 찔레버섯(Phellinus ribis) 추출물, 클로로페린 A, B, C 또는 D의 화합물이 유효성분으로 포함되어 있고, PPARγ 활성화제로 유용한 조성물을 제공하는데 다른 목적이 있다.

본 발명은 찔레버섯(Phellinus ribis) 추출물, 클로로페린 A, B, C 또는 D의 화합물을 유효성분으로 포함하는, 인슐린 저항증 및 당뇨병과 관련된 고혈당증 치료 및 예방을 위한 의약품, 기능성 식품, 또는 식품첨가물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

본 발명은 항당뇨 활성을 갖는 찔레버섯 추출물 및 이로부터 분리된 다음 화학식 1 내지 4로 표시되는 클로로페린 A, B, C 및 D 화합물을 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명이 특징으로 하는 찔레버섯 추출물과 이 추출물로부터 활성물질을 분리하기 위해서는 찔레버섯(Phellinus ribis) 속에 속하는 버섯자실체 및 균사체 배양액을 알콜류, 아세테이트류, 에테르류, 아세톤류, 탄화수소류 등 중에서 선택된 유기용매에 의하여 추출, 물의 분배, 컬럼 크로마토그라피 등 버섯성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 용이하게 얻을 수 있다. 조 추출물은 필요에 따라서 상법에 따라서 더욱 정제할 수 있다.
본 발명의 찔레버섯 추출물을 얻기 위한 방법으로서는 당 분야에서 널리 이용되고 있는 용매 추출법이 적용될 수 있고, 본 발명은 이러한 추출방법에 특별히 제한을 두지는 않는다. 일반적인 용매 추출법에 의하면, 추출에 사용되는 유기용매의 양은 버섯을 충분히 담지될 수 있는 양을 사용하는 것이 좋고, 그 양은 버섯의 건조중량 대비 1 내지 30 배 바람직하기로는 1 내지 10 배 정도 되는 양을 사용한다. 이러한 용매 추출방법은 당 분야에서 널리 이용되고 있는 공지 방법에 불과하다.

본 발명에 따른 찔레버섯 추출물과 이 추출물로부터 활성물질로서 클로로페린 화합물을 효율적으로 분리할 수 있는 바람직한 방법은 다음과 같다 : 1) 찔레버섯(Phellinus ribis)을 탄소수 1 내지 6의 지방족 알콜 및 탄소수 1 내지 10의 지방족 탄화수소 중에서 선택된 용매로 추출하는 과정; 2) 상기 용매 추출물을 헥산-에틸 아세테이트 용리액을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하는 과정; 3) 상기 용출액을 클로로포름-메탄올 용리액을 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피하는 과정; 및 4) 상기 용출액을 아세토나이트릴을 사용하여 분취용 고속 액체 크로마토그래피(preparative HPLC)를 실시하여, 체류시간 62분에서 다음 화학식 1로 표시되는 클로로페린 A를, 체류시간 38분에서 다음 화학식 2로 표시되는 클로로페린 B를, 체류시간 49분에서 다음 화학식 3으로 표시되는 클로로페린 C를, 체류시간 25분에서 다음 화학식 4로 표시되는 클로로페린 D를 각각 분리 수득하는 과정을 포함한다.

본 발명에서는 찔레버섯의 건조된 자실체를 사용한다. 즉 건조된 자실체를 분쇄기로 마쇄한 후 탄소수 1 내지 4의 저급 지방족 알콜 및 탄소수 1 내지 10 의 지방족 탄화수소 중에서 선택된 용매로 추출한다, 그런 다음, 헥산-에틸 아세테이트를 이용한 실리카겔 칼럼 크로마토그라피, 클로로포름-메탄올을 이용한 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 아세토나이트릴을 이용한 고성능 액체크로마토그라피(HPLC)를 순차적으로 실시하여 활성물질을 순수하게 분리 정제한다. 그 결과 기존에는 보고되지 않은 폴리클로라이드계 화합물로서 클로로페린 A, B, C 및 D를 각각 분리하였고, 분리된 화합물의 물리 화학적 특성과 화학구조를 규명하였다.

본 발명이 찔레꽃 추출물로부터 분리한 클로로페린 A, B, C 및 D 화합물에 대한 물리화학적 특성, 핵자기공명 스펙트럼 및 X선 결정 결과는 다음과 같다.

1) 클로로페린 A 화합물

① 성상 : 흰색의 분말

② 분자량 : 708

③ 분자식 : C₂₁H₁₀O₆Cl₁₀

④ 질량분석 스펙트럼 : HRFABMS m/z 707.7363 [M+H]⁺

⑤ 자외선흡수스펙트럼 : UV λ_max (MeOH)(logε) 226(4.61), 297(3.5) nm

⑥ 적외선흡수스펙트럼 : IR (KBr) νν_max 3450, 1420, 1460, 1200 cm^-1

⑦ 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (500MHz, CD₃OD) 3.85 (3H, s, Methoxyl, H-4-OCH₃), 3.93 (3H, s, Methoxyl, H-4'-OCH₃), 3.93 (3H, s, Methoxyl, H-4"-OCH₃)

⑧ 탄소핵자기공명스펙트럼 : ppm (100MHz, CD₃OD) 136.5 (C-1), 139.1 (C-2), 116.1 (C-3), 146.4 (C-4), 61.2 (C-4-OCH₃), 116.1 (C-5), 139.1 (C-6), 146.6 (C-1'), 125.4 (C-2'). 127.8 (C-3'), 150.7 (C-4'), 60.9 (C-4'-OCH₃), 127.8 (C-5'), 125.4 (C-6'), 146.6 (C-1"), 125.4 (C-2"), 127.8 (C-3"), 150.7 (C-4"), 60.9 (C-4"-OCH₃), 127.8 (C-5"), 125.4 (C-6")

⑨ 화학구조 :

2) 클로로페린 B 화합물

① 성상 : 흰색의 분말

② 분자량 : 708

③ 분자식 : C₂₁H₁₀O₆Cl₁₀

④ 질량분석 스펙트럼 : HRFABMS m/z 707.7363 [M+H]⁺

⑤ 자외선흡수스펙트럼 : UV λ_max (MeOH)(logε) 226(4.61), 297(3.5) nm

⑥ 적외선흡수스펙트럼 : IR (KBr) ν_max 3450, 1420, 1460, 1200 cm^-1

⑦ 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (500MHz, CD₃OD) 3.91 (3H, s, Methoxyl, H-3-OCH₃), 3.89 (3H, s, Methoxyl, H-4'-OCH₃), 3.89 (3H, s, Methoxyl, H-4"-OCH₃)

⑧ 탄소핵자기공명스펙트럼 : ppm (100MHz, CD₃OD) 141.8 (C-1), 111.9 (C-2), 149.2 (C-3), 61.1 (C-3-OCH₃), 112.7 (C-4), 142.3 (C-5), 132.1 (C-6), 146.6 (C-1'), 125.1 (C-2'). 127.7 (C-3'), 150.7 (C-4'), 60.9 (C-4'-OCH₃), 127.7 (C-5'), 125.1 (C-6'), 146.4 (C-1"), 124.6 (C-2"), 127.5 (C-3"), 150.5 (C-4"), 60.9 (C-4"-OCH₃), 127.5 (C-5"), 124.6 (C-6")

⑨ 화학구조 :

3) 클로로페린 C 화합물

① 성상 : 흰색의 분말

② 분자량 : 708

③ 분자식 : C₂₁H₁₀O₆Cl₁₀

④ 질량분석 스펙트럼 : HRFABMS m/z 707.7363 [M+H]⁺

⑤ 자외선흡수스펙트럼 : UV λ_max (MeOH)(logε) 222 (4.6), 297 (3.6) nm

⑥ 적외선흡수스펙트럼 : IR (KBr) ν_max 3450, 1420, 1460, 1200 cm^-1

⑦ 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (500MHz, CD₃OD) 3.93 (3H, s, Methoxyl, H-4-OCH₃), 3.82 (3H, s, Methoxyl, H-4'-OCH₃), 3.82 (3H, s, Methoxyl, H-4"-OCH₃)

⑧ X선 결정 : 도 1 참조

⑨ 화학구조 :

4) 클로로페린 D 화합물

① 성상 : 흰색의 분말

② 분자량 : 484

③ 분자식 : C₁₄H₇O₄Cl₇

④ 질량분석 스펙트럼 : HRFABMS m/z 483.8166 [M+H]⁺

⑤ 자외선흡수스펙트럼 : UV λ_max (MeOH)(logε) 216 (4,37), 298 (3.18) nm

⑥ 적외선흡수스펙트럼 : IR (KBr) ν_max 3450, 1420, 1460, 1200 cm^-1

⑦ 수소핵자기공명스펙트럼 : ppm (500MHz, CD₃OD) 3.88 (3H, s, Methoxyl, H-4-OCH₃), 3.92 (3H, s, Methoxyl, H-4'-OCH₃)

⑧ 탄소핵자기공명스펙트럼 : ppm (100MHz, CD₃OD) 140.8 (C-1), 120.2 (C-2), 123.4 (C-3), 147.1 (C-4), 61.1 (C-4-OCH₃), 118.8 (C-5), 139.1 (C-6), 146.8 (C-1'), 125.5 (C-2'). 127.7 (C-3'), 150.7 (C-4'), 61.0 (C-OCH₃), 127.5 (C-5'), 125.5 (C-6')

⑨ 화학구조 :

한편, 본 발명에 따른 방법으로 얻어진 찔레버섯 추출물과 클로로페린 A, B, C 및 D의 화합물은 다음에서 기술하는 실시예에서도 확실하게 알 수 있는 것처럼 PPARγ의 활성을 증대시킴에 있어 대조 화합물인 로지글리타존(Rosiglitazone)에 유사한 강한 활성을 나타낼 뿐만 아니라 안전성도 지극히 높아 인슐린 저항증 및 당뇨병과 관련된 고혈당증 치료 및 예방을 위한 의약품, 기능성 식품, 또는 식품첨 가물로 유용하다.

따라서, 본 발명은 찔레버섯 추출물, 클로로페린 A, B, C, D의 화합물이 유효성분으로 함유된 조성물과, 이 조성물을 의약품, 기능성 식품, 또는 식품첨가물로 사용하는 용도를 권리범위로 포함한다.

의약품으로 이용할 경우에는 본 발명에서 제시하는 화합물을 유효성분으로 하여, 상용되는 무기 또는 유기의 담체를 가하여, 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 경구투여제 혹은 비경구 투여제로 제제화 할 수 있다.

경구투여를 위한 제형으로서는 정제(錠劑), 환제(丸劑), 과립제(顆粒劑), 연·경 캡슐제, 산제, 세립제, 분제, 유탁제(乳濁濟), 시럽제, 펠렛제 등을 들 수가 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여용 제형으로 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

비경구투여를 위한 제형으로는 주사제, 점적제, 수액(輸液), 연고, 로션, 스프레이, 현탁제, 유제(乳劑), 유제(油濟), 좌제(坐劑) 등을 들 수가 있다. 본 발명의 유효성분을 제제화하기 위하여는 상법에 따라서 실시하면 용이하게 제제화할 수 있으며, 계면활성제, 부형제, 착색료, 향신료, 보존료, 안정제, 완충제, 현 탁제, 기타 상용하는 보조제를 적당히 물과 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제하여 사용하면 된다.

본 발명의 화합물을 이용하는 처방 복용량은 타입, 종, 나이, 몸무게, 성별 및 환자의 건강 상태 등의 다양한 인자, 치료되어야 할 상태의 심각성, 투여 경로, 환자의 신장 또는 간장의 기능 및 이용되는 화합물 또는 이들의 염을 고려하여 선택된다. 보통의 의사, 수의사 또는 임상의는 쉽게 상태의 진전을 막거나 대항, 예방하기 위하여 요구되는 약의 약학적 유효량을 결정하여 처방할 수 있을 것이다.

지시된 효과를 위하여 이용되는 본 발명의 경구 복용량은, 환자 몸무게 1 kg 당 하루에 약 0.01 내지 100 mg (mg/kg/day) 사이이며, 바람직하게는 약 0.01 내지 10 mg (mg/kg/day) 사이이며, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 5.0 mg/kg/day이 적절하다. 경구 투여를 위하여, 조성물은 치료되어야 할 환자에 대해 증상에 따른 복용량 조정을 위하여 활성 인자를 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100 및 500 mg 함유하는 타블렛 형태로 제공되는 것이 바람직하다. 약은 전형적으로 활성 인자를 약 0.01 mg 에서 약 500 mg 함유하며, 바람직하게는 약 1 mg 에서 약 100 mg의 활성 인자를 포함한다. 정맥 주사로는, 가장 바람직한 복용량은 지속적인 속도의 주입 동안에 0.1 에서 10 mg/kg/min 이다. 본 발명의 화합물은 하루 한번 복용될 수 있고, 또는 하루에 두 번, 세 번 또는 네 번으로 나누어 하루 복용량을 투여할 수 있다. 또한 바람직하게는 본 발명의 화합물은 적당한 비강 운반체를 이용하여 국부를 통해 비강 형태로 투여하거나, 잘 알려져 있는 경피성 피부 패치 형태를 이용하여 경피성 경로로 투여될 수 있다. 경피성 운반 시스템의 형태로 투여하기 위해서는, 복용량 투여는 당연히 복용량 처방을 통해 간헐적인 것보다 지속될 것이다.

이상에서 설명한 바와 같은 본 발명은 다음의 실시예 및 실험예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 찔레버섯(Phellinus ribis) 추출물의 제조

아래와 같은 통상의 용매 추출법에 의해 찔레버섯 추출물을 제조하였다.
즉, 음건, 세절한 찔레버섯 자실체 3 kg을 메탄올, 에탄올 또는 아세톤의 추출용매(20 L)에 각각 담그고, 실온에서 1일 동안 방치시켜 추출한 후에 여과하였다. 여과된 여액을 진공에서 감압하에 농축하여 찔레버섯 추출물(120 g)을 각각 얻었다.

실시예 2. 찔레버섯(Phellinus ribis) 유래 클로로페린 A 내지 D의 분리 및 정제.

찔레버섯(Phellinus ribis)은 재래시장에서 구입하여 동정하였으며 메탄올로 추출하여 분리, 정제용 시료로 사용하였다. 음건한 3 kg의 찔레버섯을 메탄올로 3회 추출한 후 추출물을 진공에서 감압하에 농축하고 농축물을 헥산으로 용매추출한 후 감압 하에서 농축하였다. 농축물을 헥산-에틸 아세테이트(50:1 → 1:1, v/v) 용매계를 사용하여 실리카겔 후레쉬 컬럼 크로마토그래피를 실시하고, 다시 한번 헥산-에틸 아세테이트(20:1 → 2:1, v/v) 용매계를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 행하였다. PPARγ를 활성화하는 분획을 농축하여 클로로포름-메탄올(1:2, v/v)의 용매로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 그리고 90% 아세토나이트릴 수용액을 사용하여 분취용 고속 액체 크로마토그래피(preparative HPLC)를 행하였으며, 체류시간(retention time) 62분에서 클 로로페린 A (13 mg)를, 체류시간(retention time) 38분에서 클로로페린 B (5 mg)를, 체류시간(retention time) 49분에서 클로로페린 C (8 mg)를, 체류시간(retention time) 25분에서 클로로페린 D (10 mg)를 각각 분리할 수 있었다. 각 화합물의 정제 후 클로로페린 A는 용매 속에서 클로로페린 B로 전환되는 것을 관찰할 수 있었다.

실시예 3. 클로로페린 A 내지 D의 물리 화학적 특성

화합물 클로로페린 A 내지 D는 흰색 분말로 얻어졌으며, 이들 화합물들은 디메틸 설폭사이드, 클로로포름, 헥산, 에틸 아세테이트 등에 잘 용해되는 반면, 메탄올, 물 등에는 난용이었다. 또한 모두 298, 220 nm 부근에서 자외선 흡수 피크를 나타내었다. 클로로페린 A, B 및 C는 모두 708의 분자량과 [M]⁺, [M+2]⁺, [M+4]⁺, [M+6]⁺의 상대적 세기가 각각 62, 100, 86, 58로 Cl 10개가 존재하고 있는 것을 알았다. 클로로페린 D의 분자량은 484 이었고, [M]⁺, [M+2]⁺, [M+4]⁺, [M+6]⁺의 상대적 세기가 각각 46, 100, 98, 56, 18인 것으로 Cl 7개가 포함되어 있는 것을 확인하였다. 분자식은 고분해능 FAB-mass 실험에 의하여 클로로페린 A, B 및 C는 C₂₁H₁₀O₆Cl₁₀, 클로로페린 D는 C₁₄H₇O₄Cl₇ 으로 결정되었다. 적외선 흡수 스펙트럼을 측정한 결과 각 화합물 공히 3400 cm^-1 부근에서 수산기, 1420 cm^-1 부근에서 방향족 C=C에 기인하는 흡수 밴드가 관찰되었다.

실시예 4. 클로로페린 A, B, C 및 D의 화학 구조

클로로페린 A, B, C 및 D의 화학 구조는 물리화학적 특성과 병행하여 ¹H, ¹³C NMR을 비롯한 1차원 NMR 및 HMBC 등을 비롯한 2차원 NMR 실험에 의하여 결정되었다. 클로로페린 A, B, C 및 D는 특징적인 질량 스펙트럼의 결과로서 폴리클로리네이티드 화합물로 추정할 수 있었다.

클로로페린 A는 ¹H, ¹³C NMR 스펙트럼 결과, 클로로페린 D보다 메톡시기가 1개 더 있고, 탄소가 6개 산소가 1개 더 존재하고 있는 것으로 보아 두개의 에테르 결합으로 벤젠고리 3개가 결합되어 있는 화합물로 추정되었다. 그리고 10개의 탄소 피크만이 관찰되어 이 화합물은 대칭을 이루고 있을 것으로 추정하였다. HMBC 결과 δ 3.85의 메톡시 프로톤은 146.4의 탄소와 장거리에 걸친 상관도(long-range correlation)를 나타내고 대칭으로서 두 개의 메톡시 프로톤을 나타내는 δ 3.93은 δ 150.7과 서로 연결되어 있는 것을 알 수 있었다. 이외에 탄소 피크의 적분치로부터 본 화합물은 대칭 화합물인 3,5-디클로로-4-메톡시-2-(2',3',5',6'-테트라클로로-4'-메톡시페녹시)-6-(2",3",5",6"-테트라클로로-4"-메톡시페녹시)페놀로 동정되었다.

클로로페린 B는 ¹H 스펙트럼과 질량 스펙트럼으로부터 클로로페린 A와 분자량과 분자식이 같은 비슷한 구조로 추정되나 화합물의 ¹³C NMR 스펙트럼이 대칭을 이루지 못하는 것을 알 수 있었다. 탄소의 δ 124.6, 125.1, 127.5, 127.7에서의 상대적인 피크가 크게 나타나므로 대칭이 되는 두 개의 벤젠고리가 존재하는 것과 분자식과 클로로페린 A와의 비교로부터 에테르 결합이 두 곳에 존재함을 확인 할 수 있었다. HMBC 결과 δ 3.91의 메톡시 프로톤은 δ 149.2의 탄소와 장거리에 걸친 상관도를 나타내고 δ 3.893은 δ 150.5와 δ 3.892는 δ 150.7의 탄소와 서로 연결되어 있는 것을 알 수 있었으며 이상의 결과로부터 화학구조를 규명할 수 있었다.

클로로페린 C는 NMR 결과로는 구조를 결정할 수 없었다. 따라서 X선 결정을 행하여 구조를 완성하였다. 클로로페린 C의 단결정은 메탄올-클로로포름의 용매로 실온에서 얻어졌다. X선 결정한 결과, 클로로페린 C는 디아릴카테콜 에테르 골격으로 구성되어 있으며 3개의 벤젠고리에 3개 또는 4개의 Cl 원소와 한 개의 메톡시기가 치환된 2,3,5-트리클로로-4-메톡시-6-[2,3,5-트리클로로-4-메톡시-6-(2,3,5,6-테트라클로로-4-메톡시페녹시)페녹시]페놀로 화학구조를 규명하였다.

클로로페린 D의 ¹H NMR 에서 δ 3.92, 3.88으로부터 메톡시 피크를 관찰할 수 있었고, ¹³C NMR에서는 δ 61.0, 61.1에서 메톡시기의 탄소, δ 123∼150에서 방향족 환에서 유래된 탄소 피크를 확인하였고, 양편의 인접 탄소에 있는 산소의 영향으로 고 자장으로 이동된 탄소인 δ 118을 확인 할 수 있었다. 위의 결과로 방향족 환에 Cl 7개와 메톡시기 2개, 나머지에는 하이드록시기가 치환되고 2개의 방향족환이 에테르 결합된 구조임을 알 수 있었다. 이외의 물리화학적 특성에 의하여 본 화합물은 2,3,5-트리클로로-4-메톡시-6-(2',3',5',6'-테트라클로로-4'-메톡시페녹시)페놀로 결정되었고, 화합물 데이터 베이스 검색한 결과 신규 화합물인 것으로 확인되었다.

한편, 본 발명은 찔레버섯 추출물 또는 이로부터 분리된 클로로페린 화합물을 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 포함하는 바, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 비경구 및 경구로 투여될 수 있으며, 하기의 제제예에서는 약학적 조성물을 경구투여용 제형으로서 시럽제 또는 정제로 제조한 예와 비경구투여용 제형으로 주사제를 제조한 예를 예시하고는 있지만, 그밖에도 당 분야에서 널리 알려진 일반적 부형제를 사용한 공지의 제형 형태로 제제화하는 것도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

또한, 본 발명에 따른 찔레버섯 추출물 또는 이로부터 분리된 클로로페린 화합물은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 다음은 본 발명에 따른 찔레버섯 추출물 또는 이로부터 분리된 클로로페린 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

제제예 1. 시럽제 제조

본 발명의 찔레버섯 추출물 또는 이로부터 분리된 클로로페린 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로서 2 %(중량/부피)로 함유하는 시럽제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

유효성분(2 g), 사카린(0.4 g), 당(25.4 g)을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린(8.0 g), 사카린(0.4 g), 향미료(0.04 g), 에탄올(4.0 g) 및 소르브산(0.4 g)을 혼합하고, 여기에 증류수를 첨가하여 전체 용량이 100 mL가 되게 하였다. 상기 클로로페린 화합물은 기타 다른 형태의 약학적으로 허용되는 그의 염으로도 대체 사용할 수 있다.

제제예 2. 정제 제조

본 발명의 찔레버섯 추출물 또는 이로부터 분리된 클로로페린 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로서 15 mg이 함유된 정제는 하기와 같은 방법으로 제조한다.

유효성분(250 g)을 락토오스(175.9 g), 감자전분(180 g) 및 콜로이드성 규산(32 g)과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분(160 g), 활석(50 g) 및 스테아린산 마그네슘(5 g)을 첨가해서 얻은 혼합물을 타정하여 정제로 만들었다.

제제예 3. 주사액제의 제조

본 발명의 찔레버섯 추출물 또는 이로부터 분리된 클로로페린 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로서 10 mg을 함유하는 주사액제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

유효성분(1 g), 염화나트륨(0.6 g) 및 아스코르브산(0.1 g)을 증류수에 용해시켜서 100 mL 용액을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

제제예 4. 음료의 제조

본 발명의 찔레버섯 추출물 또는 이로부터 분리된 클로로페린 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 그의 염이 0.1 g을 함유하는 음료는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

유효성분(0.1 g), 비타민 C(15 g), 분말비타민 E(7.5 g), 젓산철(5.75 g), 산화아연(3.5 g), 니코틴산 아미드(3.5 g), 비타민 A(0.2 g), 비타민 B₁(0.25 g) 및 비타민 B₂(0.3 g), 전분(18.0 g) 및 물 적량을 혼합하여 건강음료를 제조하였다.

또한, 본 발명에 따른 찔레버섯 추출물 또는 이로부터 분리된 클로로페린 화합물 각각에 대하여, PPARγ를 활성하는 정도를 알아보기 위해 하기와 같은 실험예를 실시하였다.

실험예. PPARγ의 활성 측정

찔레버섯의 추출물과 클로로페린 A, B, C, D 화합물에 대한 PPARγ 활성화 활성 측정방법은 다음과 같다. 인간 PPARγ(아미노산 176∼477)의 리간드 결합 영역을 포함하는 플라스미드 pFA-GAL4-PPAR 키메라 발현 구조체는 pFA-CMV 벡터로 준비하였다. pFR-Luc (Gal4-UAS-Luciferase) 구조체는 Stratagene 회사로부터 구입하였다. NIH-3T3 세포는 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; 10% 소혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신 함유)에서 보관하면서 사용하였다. 상기에 의하여 만들어진 pFA-GAL4-PPAR, pFR-Luc와 pSV-β-갈락토시다제 발현벡터(500 ng)를 지닌 NIH-3T3 세포들을 사용하여 활성을 측정하였다. 24시간의 세포 배양 후 각 시료를 농도별로 처리하였다. 시료를 처리한 후 16시간 후에 세포 분해산물을 이용하여 루시퍼레이즈(Luciferase)와 β-갈락토시다제 활성 정도를 휘도계(luminometer)와 분광 광도계(spectrophotometer)를 사용하여 각각 측정하였다. 양성 대조 화합물로는 당뇨병 치료제로서 잘 알려져 있는 로지글리타존(rosiglitazone)을 사용하였고, 활성 값은 로지글리타존(rosiglitazone)과의 비교치로 나타내었다.

도 2에는 찔레버섯의 메탄올 추출물, 클로로페린 A, B, C, D 화합물 각각의 PPARγ의 활성을 증대시키는 정도를 로지글리타존(rosiglitazone)에 대한 상대적인 활성치로 나타내었다. 본 실험결과에 의하면, 찔레버섯 추출물 즉, 메탄올, 에탄올과 같은 알콜류, 헥산과 같은 탄화수소류 등의 유기용매로 추출하여 얻어진 추출물은 일반적으로 로지글리타존(rosiglitazone)에 대증하거나 또는 이 보다 더 PPARγ의 활성을 증대시킴을 알 수 있었다. 그리고, 벤젠고리를 2개 함유하고 있는 클로로페린 D 화합물은 30 μM, 벤젠고리를 3개 함유하고 있는 클로로페린 A, B, C 화합물과는 서로 상이한 결과를 나타내었다. 그 중에서 클로로페린 C가 가장 강력한 활성을 나타냄을 알았다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 찔레버섯의 유기용매 추출물과 이로부터 분리된 클로로페린 A, B, C, D 화합물은 PPARγ의 활성을 증대시키는 작용이 우수하므로 인슐린 저항증 및 당뇨병과 관련된 고혈당증 치료 및 예방을 위한 의약품, 기능성 식품, 또는 식품첨가물로서 유용하다.

또한 본 발명에 의하여 본 발명에서 명시한 신규 폴리클로라이드계 화합물 클로로페린 A, B, C, D의 화학구조를 밝혔으므로 이것을 화학 수식하거나 각종 개변을 가하거나 하여 종래에는 없었던 신규한 폴리클로라이드계 화합물을 새롭게 얻을 수 있다.

Claims (9)

1. 다음 화학식 1로 표시되는 클로로페린 A.

   [화학식 1]

   
2. 다음 화학식 2로 표시되는 클로로페린 B.

   [화학식 2]

   
3. 삭제
4. 다음 화학식 4로 표시되는 클로로페린 D.

   [화학식 4]

   
5. 1) 찔레버섯(Phellinus ribis)을 탄소수 1 내지 4의 지방족 알콜 및 탄소수 1 내지 10 의 지방족 탄화수소 중에서 선택된 용매로 추출하는 과정;

   2) 상기 용매 추출물을 헥산-에틸 아세테이트 용리액을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하는 과정;

   3) 상기 2)과정에서 얻어진 용출액을 클로로포름-메탄올 용리액을 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피하는 과정; 및

   4) 상기 3)과정에서 얻어진 용출액을 아세토나이트릴을 사용하여 분취용 고속 액체 크로마토그래피(preparative HPLC)를 실시하여, 체류시간 62분에서 다음 화학식 1로 표시되는 클로로페린 A를, 체류시간 38분에서 다음 화학식 2로 표시되는 클로로페린 B를, 체류시간 49분에서 다음 화학식 3으로 표시되는 클로로페린 C를, 체류시간 25분에서 다음 화학식 4로 표시되는 클로로페린 D를 각각 분리 수득하는 과정;

   을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 찔레버섯으로부터 활성물질인 클로로페린 화합물의 분리방법.

   
6. 탄소수 1 내지 4의 지방족 알콜 및 탄소수 1 내지 10 의 지방족 탄화수소 중에서 선택된 용매로 추출하여 얻은 찔레버섯(Phellinus ribis) 추출물이 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 인슐린 저항증 및 당뇨병 치료 및 예방용 약학 조성물.
7. 다음 화학식 1 내지 4 중에서 선택된 어느 한 화합물 또는 이들의 혼합물이 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 인슐린 저항증 및 당뇨병 치료 및 예방용 약학 조성물.

   
8. 상기 청구항 6 또는 7항의 조성물을 이용하여 제조된 인슐린 저항증 및 당뇨병과 관련된 고혈당증 치료 및 예방용 약제.
9. 상기 청구항 6 또는 7항의 조성물을 이용하여 제조된 인슐린 저항증 및 당뇨병의 예방 및 개선용 식품.

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