JP7336153B2

JP7336153B2 - ヒドランゲノールを有効成分とする脂肪形成抑制用及び体脂肪減少用の組成物

Info

Publication number: JP7336153B2
Application number: JP2021529720A
Authority: JP
Inventors: ヒイ、ソン; ギョンシン、ユ; シンアン、ヘ; テイ、ギョン; ソクチョン、ギョン; ソンシン、チ; スハン、ヒ
Original assignee: Cosmax Bio Co Ltd
Current assignee: Cosmax Bio Co Ltd
Priority date: 2019-02-11
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2023-08-31
Anticipated expiration: 2039-09-27
Also published as: US20210228463A1; CN112533580A; JP2022508234A; CN112533580B; KR102173259B1; KR20200098042A; WO2020166779A1

Description

本発明は、肥満細胞において、脂肪の蓄積を減少させ、肥満を抑制し、体脂肪を減少させる組成物に係り、さらに具体的には、ヒドランゲノール（hydrangenol）は、ＰＰＡＲγ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma）発現量減少、脂肪細胞分化因子を減少させ、中性脂肪（triglyceride）の蓄積及び分泌を抑制させることにより、過度な栄養分の露出によって生ずる脂肪形成抑制及び体脂肪減少の組成物に関する。

肥満は、世界各国で迅速に増加するが、医学的に効果的な治療法がないという非常に深刻な疾患である。世界保健機構（ＷＨＯ）は、体脂肪指数（ＢＭＩ：body mass index）３０以上を肥満と規定したが、２０１４年基準で、全世界人口の１３％が肥満であるだけではなく、７４億人口中の２２億人が過体重や肥満と係わる健康問題を抱えているという研究結果が発表されている。

肥満は、遺伝的原因、または生活習慣上の原因による体内脂肪の過剰蓄積状態を言い、成人病、慢性退行性疾患のような疾病を誘発し、先進国の場合、総国民医療費の２～７％が、過体重及び肥満によって生じている。肥満から引き起こされうる社会的障害と、過多な脂肪蓄積によって生ずる高脂血症、高血圧、動脈硬化、糖尿病、脂肪肝のような二次的な合併症が問題になる。

２０１３年、世界保健機構（ＷＨＯ）において、肥満を２１世紀の新たな伝染病として明示することを始めとし、全世界が肥満との戦闘を宣布したにもかかわらず、世界の肥満人口は、急速に増加している。肥満防止のために、個々人の行動変化を誘導することは、複雑な産業情報化において、多忙な生活を営む個々人に完璧な代案になりえないという点において、抗肥満及び肥満治療の領域において、新たな問題が持ち上がっている。そして、肥満に係わる医学的・生物学的な基礎研究の発展にもかかわらず、現実的な肥満増加の事実は、この２要因間の乖離を示している。従って、さらにアプローチが容易であり、長期間、抗肥満効果を収めることができる食品類及び化粧品類の開発及び研究が要求されている実情である。

３Ｔ３－Ｌ１adipocyte（前駆脂肪細胞）は、分化過程において、多くの転写因子を活性化させ、脂肪を蓄積させることになるが、代表的な分化因子としては、Ｃ／ＥＢＰａ（ＣＣＡＡＴ／enhancer binding protein alpha）、及びそれによって誘導されるＰＰＡＲγ（peroxisome proliferator activated receptor gamma）がある。そのような上位因子の発現により、下位のさまざまなタンパク質が合成されるが、そのようなタンパク質は、身体に有害な中性脂肪（triglyceride）の合成及び保存の機能を促進させ、細胞内に多くの脂肪を蓄積させ、肥満を誘導することになる。

ヒドランゲノール（hydrangenol）は、アジサイ属（hydrangea）で発見される代表的な成分であり（日本公開特許ＪＰ－００２９９３４）、分子量は、２５６．２５ｇ／ｍｏｌであり、ＩＵＰＡＣ名は、８－ヒドロキシ－３－（４－ヒドロキシフェニル）－３，４－ジヒドロイソクロメン－１－オン（8-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-3,4-dihydroisochromen-1-one）である。また、その誘導体としては、（－）－ヒドランゲノール４’－Ｏ－グルコキシド((-)-hydrangenol 4’-O-glucoside）、（＋）－ヒドランゲノール４’－Ｏ－グルコキシド（(+)-hydrangenol 4’-O-glucoside）がある。その機能性としては、皮膚美白（日本公開特許ＪＰ－０００７５４６）、抗炎効果（Kim, H. J., et al., Hydrangenol inhibits lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in BV2 microglial cells by suppressing the NF-κB pathway and activating the Nrf2-mediated HO-1 pathway, International immunopharmacology v.35, pp. 61 - 69 , 2016 , 1567-5769）があると報告されている。

しかし、ヒドランゲノールを有効成分とする脂肪形成抑制用及び体脂肪減少用の組成物の脂肪蓄積抑制に対するメカニズム研究がなされていない実情である。従って、本発明者たは、前記物質でもって、脂肪蓄積抑制に係わる直接の効能研究を行った。

それより、本発明者らは、前記従来技術の問題点を克服するために鋭意研究した結果、ヒドランゲノールの物質がＰＰＡＲγのような脂肪細胞分化因子を減少させ、中性脂肪の蓄積及び分泌を抑制することにより、脂肪形成抑制及び体脂肪減少を確認し、本発明を完成するに至った。

一様相は、ヒドランゲノール（hydrangenol）、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分とする肥満の予防または改善のための健康機能食品組成物を提供するものである。

他の様相は、ヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分とする肥満の予防または治療のための薬学的組成物を提供するものである。

さらに他の様相は、ヒドランゲノールを含むアジサイ抽出物を有効成分として含む肥満の予防または改善のための健康機能食品組成物を提供するものである。

さらに他の様相は、ヒドランゲノールを含むアジサイ抽出物を有効成分として含む肥満の予防または治療のための薬学的組成物を提供するものである。

さらに他の様相は、ヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分として含む代謝性疾患の予防用または改善用の健康機能食品組成物を提供するものである。

さらに他の様相は、ヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分として含む代謝性疾患の予防用または治療用の薬学的組成物を提供するものである。
さらに他の様相は、ヒドランゲノールを含むアジサイ抽出物を有効成分として含む代謝性疾患の予防または改善のための健康機能食品組成物を提供するものである。

さらに他の様相は、ヒドランゲノールを含むアジサイ抽出物を有効成分として含む代謝性疾患の予防または治療のための薬学的組成物を提供するものである。

さらに他の様相は、有効量のヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩を、それを必要とする個体に投与する段階を含む肥満または代謝性疾患を、予防、改善または治療する方法を提供するものである。

さらに他の様相は、ヒドランゲノールを含むアジサイ抽出物を、それを必要とする個体に投与する段階を含む肥満または代謝性疾患を、予防、改善または治療する方法を提供するものである。

さらに他の様相は、ヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩を、肥満または代謝性疾患の予防用、改善用または治療用の組成物製造に使用するための用途を提供するものである。

さらに他の様相は、ヒドランゲノールを含むアジサイ抽出物を、肥満または代謝性疾患の予防用、改善用または治療用の組成物製造に使用するための用途を提供するものである。

一様相は、ヒドランゲノール（hydrangenol）、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分とする肥満の予防または改善のための健康機能食品組成物を提供する。

一般的に体重が多いものの、肥満ではないとしても、筋肉が多い人は体重が多いために、体内に脂肪組織が過多である状態を「肥満（obesity）」と称する。用語「肥満」は、体脂肪が過度な状態を言い、臨床的には、体質量指数が、韓国の場合に２５、世界保健機構（ＷＨＯ）によれば、３０以上の場合を言う。一般的には、体重が正常値より多い場合を意味するが、体重が多くないにしても、身体構成成分において、体脂肪の比率が高い場合、肥満と診断し、成人でも小児でもいずれにおいても発病する疾患を言う。そのような肥満は、体重の増加だけではなく、過食・過飲及び過食症、高血圧、糖尿、増加した血漿インシュリン濃度、インシュリン耐性、高脂血症、代謝症侯群、インシュリン耐性症侯群、肥満関連胃食道逆流、動脈硬化症、過コレステロール血症、尿酸過多血症、背下部痛症、心臓肥大及び左心室肥大、脂肪異栄養症、非アルコール性脂肪肝炎、心血管疾患または、多嚢胞性卵巣症侯群のような肥満関連疾患を誘発しうるのである。従って、本発明による組成物を利用する場合、肥満だけではなく、前記肥満関連疾患の予防または治療も同時になされる、そのような肥満関連疾患の治療対象は、体重を減らそうとする欲求がある対象も含まれる。

用語「予防（prevention）」は、疾患、障害、またはその付随的症状の発病または再発を部分的または完全に遅延させたり防止したりするか、疾患または障害の獲得または再獲得を防ぐか、疾患または障害の獲得危険を低減させる方法を言う。例えば、前記予防は、本発明による組成物の投与により、肥満または肥満関連疾患、その障害または症状の発生を抑制または遅延させる全ての行為を言う。

用語「改善」とは、状態の緩和または治療と係わるパラメータ、例えば、症状の程度を少なくとも低減させる全ての行為を意味することができる。

前記「健康機能食品」は、健康補助の目的で、特定成分を原料にしたり、食品原料に入っている特定成分を抽出、濃縮、精製、混合したりするような方法で、製造、加工した食品を言い、前記成分により、生体防御、生体リズムの調節、疾病の防止や回復のような生体調節機能を、生体に対して十分に発揮するように設計されて加工された食品を言うものであり、前記健康食品用組成物は、肥満の予防、及び肥満関連疾患の回復などと係わる機能を遂行することができる。

前記「健康機能食品組成物」は、当該技術分野に公知されている一般的な健康機能食品の剤形にも製剤化される。例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、懸濁液、乳剤、シロップ剤、沈剤、液剤、エキス剤のような一般的な剤形にも製造され、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンディ類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、ゼリー、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤のような任意健康食品形態にも製造される。前記健康食品製剤化のために、食品学的に許容可能な担体または添加剤を使用することができ、製造する剤形の製造に、当該技術分野において使用可能なものとして公知されている任意の担体または添加剤が利用されうる。前記添加剤として、各種栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含んでもよい。それ以外にも、天然果物ジュース飲料、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含んでもよい。そのような添加剤成分は、独立的してまたは組み合わせて使用することができ、添加剤の比率は、組成物総重量を基準に、０．００１ないし５重量％、具体的には、０．０１ないし３重量％でもある。

前記健康食品組成物中の前記ヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩の含量は、使用目的（予防または改善）によっても適して決定される。一般的には、全体食品重量の０．０１ないし１５重量％で含まれ、飲料として製造される場合、１００ｍＬを基準に、０．０２ないし１０ｇ、具体的には、０．３ないし１ｇの比率で含まれるのである。

前記飲料は、前記組成物以外の他の成分をさらに含み、一般的には、飲料に使用される多様な香味剤または天然炭水化物などをさらに含んでもよい。前記天然炭水化物としては、単糖類（例：ブドウ糖、果糖など）、二糖類（例：マルトース、スクロースなど）、多糖類（例：デキストリン、シクロデキストリンなど）のような一般的な糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールのような糖アルコールが含有されうる。また、香味剤として、天然香味剤（例：タウマチン、ステビア抽出物など）及び合成香味剤（例：サッカリン、アスパルテームなど）を含んでもよい。前記天然炭水化物の比率は、飲料１００ｍＬ当たり、一般的には、約１ないし２０ｇ、具体的には、約５ないし１２ｇでも含有される。

一具体例において、前記ヒドランゲノールは、下記化学式１によっても表示される。

一具体例において、前記ヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩は、脂肪形成を抑制したり、体脂肪を減少させたりするものでもある。

一具体例において、前記ヒドランゲノールは、アジサイ抽出物から分離されたものでもある。

他の様相は、ヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分とする肥満の予防または治療のための薬学的組成物を提供する。

用語「薬学的組成物」は、対象体への投与時、いくつかの有利な効果を付与する分子または化合物を称しうる。該有利な効果は、診断的決定を可能にするもの；疾病、症状、障害または病態の改善；疾病、症状、障害または疾患の発病の低減または予防；及び一般的に、疾病、症状、障害または病態の対応を含んでもよい。

前記薬学的組成物は、臨床投与時、非経口で投与が可能であり、一般的な医薬品製剤の形態でも使用される。非経口投与は、直腸、静脈、腹膜、筋肉、動脈、経皮、鼻腔（nasal）、吸入、眼球及び皮下のような経口以外の投与経路を介する投与を意味しうる。本発明の前記薬学的組成物を医薬品として使用する場合、追加して、同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含んでもよい。

前記活性成分を個体内に伝達することができる薬学的活性成分の種類は、抗癌剤、造影剤（染料）、ホルモン剤、抗ホルモン剤、ビタミン剤、カルシウム剤、無機質製剤、糖類剤、有機酸製剤、タンパク質アミノ酸製剤、解毒剤、酵素製剤、代謝性製剤、糖尿併用剤、組織復活溶薬、クロロフィル製剤、色素製剤、腫瘍溶薬、腫瘍治療剤、放射性医薬品、組織細胞診断剤、組織細胞治療剤、抗生物質製剤、抗ウイルス剤、複合抗生物質製剤、化学療法剤、ワクチン、毒素、トキソイド、抗毒素、レプトスピラ血清、血液製剤、生物学的製剤、陣痛剤、免疫原性分子、抗ヒスタミン剤、アレルギー用薬、非特異性免疫源製剤、麻酔剤、覚醒剤、精神神経溶剤、低分子化合物、核酸、アプタマー、アンチセンス核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ｓｉＲＮＡ及びマイクロＲＮＡなどを含んでもよい。

前記薬学的組成物を製剤化する場合には、普通に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤のような希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁液剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されうる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（Witepsol）、マクロゴール、ツイン（Tween）６１、カカオ脂、リウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用されうる。

また、前記薬学的組成物は、生理食塩水または有機溶媒のように、薬剤として許容されたさまざまな伝達体（carrier）と混合されて使用され、安定性や吸水性を向上させるために、グルコース・スクロースまたはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸（ascorbic acid）またはグルタチオン（glutathione）のような抗酸化剤（antioxidants）、キレート化剤（chelating agents）、低分子タンパク質、または他の安定化剤（stabilizers）が薬剤としても使用される。

さらに他の様相は、ヒドランゲノールを含むアジサイ抽出物を有効成分として含む肥満の予防または改善のための健康機能食品組成物を提供する。

一具体例において、前記アジサイ抽出物は、水、Ｃ_１－Ｃ_４アルコール、またはそれらの混合溶媒によって抽出されたものでもある。

一具体例において、前記アジサイ抽出物は、熱水抽出物であるものでもある。

前記抽出物は、親水性溶媒（hydrophilic solvent）、例えば、アルコール、水、またはその組み合わせによって抽出されたものでもある。前記アルコールは、Ｃ１ないしＣ１０の１以上の－ＯＨ基を有する化合物でもある。前記アルコールは、Ｃ_１－Ｃ_６アルコール、Ｃ_３－Ｃ_６多価アルコールでもある。前記アルコールは、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ｎ－ペンタノール、ｎ－ヘキサノール、またはそれらの混合物でもある。前記溶媒は、例えば、水とアルコールとの混合物、すなわち、アルコール水溶液でもある。該アルコール水溶液のアルコール濃度は、１ないし１００％（ｗ／ｗ）、例えば、１ないし９９．５％（ｗ／ｗ）、１０ないし１００％（ｗ／ｗ）、２０ないし１００％（ｗ／ｗ）、３０ないし１００％（ｗ／ｗ）、４０ないし１００％（ｗ／ｗ）、５０ないし１００％（ｗ／ｗ）、６０ないし１００％（ｗ／ｗ）、７０ないし１００％（ｗ／ｗ）、７５ないし１００％（ｗ／ｗ）、６０ないし９０％（ｗ／ｗ）、６０ないし８０％（ｗ／ｗ）、６５ないし７５％（ｗ／ｗ）、または７０％（ｗ／ｗ）でもある。前記アルコール水溶液は、メタノール水溶液、エタノール水溶液またはブタノール水溶液でもある。

前記抽出物は、加温抽出、加圧抽出、超音波抽出、熱水抽出、還流冷却抽出、亜臨界抽出または超臨界抽出のように、当業技術分野で一般的な方法によって抽出されたものでもある。

前記抽出物は、組成物総重量に対し、０．００１重量％ないし８０重量％、例えば、０．０１重量％ないし６０重量％、０．０１重量％ないし４０重量％、０．０１重量％ないし３０重量％、０．０１重量％ないし２０重量％、０．０１重量％ないし１０重量％、０．０１重量％ないし５重量％、０．０５重量％ないし６０重量％、０．０５重量％ないし４０重量％、０．０５重量％ないし３０重量％、０．０５重量％ないし２０重量％、０．０５重量％ないし１０重量％、０．０５重量％ないし５重量％、０．１重量％ないし６０重量％、０．１重量％ないし４０重量％、０．１重量％ないし３０重量％、０．１重量％ないし２０重量％、０．１重量％ないし１０重量％、または０．１重量％ないし５重量％でも含まれる。

さらに他の様相は、ヒドランゲノールを含むアジサイ抽出物を有効成分として含む肥満の予防または治療のための薬学的組成物を提供する。

さらに他の様相は、ヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分として含む代謝性疾患の予防用または改善用の健康機能食品組成物を提供する。

該代謝性疾患は、例えば、肥満、脂肪肝、糖尿病、高脂血症、高血圧、高コレステロール症、高ＬＤＬコレステロール症、心血管疾患、動脈硬化症及び冠状動脈疾患などが含まれ、一具体例において、前記代謝性疾患は、高脂血症、高コレステロール血症、糖尿病または異常脂質血症でもある。

さらに他の様相は、ヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分として含む代謝性疾患の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。

一具体例において、前記代謝性疾患は、高脂血症、高コレステロール血症、糖尿病または異常脂質血症でもある。

さらに他の様相は、ヒドランゲノールを含むアジサイ抽出物を有効成分として含む代謝性疾患の予防または改善のための健康機能食品組成物を提供する。

さらに他の様相は、ヒドランゲノールを含むアジサイ抽出物を有効成分として含む代謝性疾患の予防または治療のための薬学的組成物を提供する。

さらに他の様相は、有効量のヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩を、それを必要とする個体に投与する段階を含む肥満または代謝性疾患を、予防、改善または治療する方法を提供する。

前記個体は、哺乳動物でもある。前記哺乳動物は、ヒト、犬、猫、牛、山羊、または豚でもある。

前記投与は、目的組織に達するすることができる限り、いかなる一般的な経路を介しても投与される。例えば、点眼投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経皮パッチ投与、経口投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与のような経路を介しても投与され、具体的には、点眼投与の経路などを介し、目的とするところによっても投与される。前記投与は、全身または局所にも投与される。

本願に使用されるように、「治療」、あるいは「治療するところの」、「緩和するところの」または「改善するところの」は、相互交換可能にも使用される。それら用語は、治療利益及び／または予防利益を含むが、それらに限定されるものではない有利であったり要望されたりする結果を得る方法を称する。該治療利益は、治療下の１以上の疾病、疾患または症状の、任意の治療的に有意味な改善、またはそれに係わる効果を意味する。該予防利益において、組成物は、特定の疾病、疾患または症状が生じる危険性がある対象体、または疾病、疾患または症状がまだ示されていなくとも、疾病の１以上の生理学的症状を報告する対象体にも投与される。

用語「有効量」または用語「治療的有効量」は、有利であったり、要望されたりする結果を引き起こすのに十分な作用剤の量を称する。該治療的有効量は、治療される対象体及びその病態、対象体の体重及びその年齢、病態の重度度、投与方式などのうち１以上によっても異なり、それは、当業者によって容易に決定されうるのである。また、前記用語は、本願に記述された映像化方法において、任意のものによる検出のためのイメージを提供する用量に適用される。特定用量は、選択された特定作用剤、後に続く投与療法、それが他の化合物と併用して投与されるか否かということ、投与時期、映像化される組織、及びそれを運搬する身体伝達システム中の１以上によっても異なる。

前記投与は、ヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩を、１個体当たり０．１ｍｇないし１，０００ｍｇ、例えば、０．１ｍｇないし５００ｍｇ、０．１ｍｇないし１００ｍｇ、０．１ｍｇないし５０ｍｇ、０．１ｍｇないし２５ｍｇ、１ｍｇないし１，０００ｍｇ、１ｍｇないし５００ｍｇ、１ｍｇないし１００ｍｇ、１ｍｇないし５０ｍｇ、１ｍｇないし２５ｍｇ、５ｍｇないし１，０００ｍｇ、５ｍｇないし５００ｍｇ、５ｍｇないし１００ｍｇ、５ｍｇないし５０ｍｇ、５ｍｇないし２５ｍｇ、１０ｍｇないし１，０００ｍｇ、１０ｍｇないし５００ｍｇ、１０ｍｇないし１００ｍｇ、１０ｍｇないし５０ｍｇ、または１０ｍｇないし２５ｍｇを投与するものでもある。ただし、該投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢・体重・性別・病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によっても多様に処方され、当業者であるならば、そのような要因を考慮し、投与量を適切に調節することができるであろいう。投与回数は１日１回、または臨床的に容認可能な副作用の範囲内において、２回以上が可能であり、投与部位についても、１ヵ所または２ヵ所以上に投与することができ、毎日、または２ないし５日間隔で、総投与日数は、１回の治療時、１日から３０日まで投与されうる。必要な場合、適正時期以後に同一治療を反復することができる。ヒト以外の動物についても、ｋｇ当たりヒトと同一投与量にするか、あるいは、例えば、目的とする動物とヒトとの器官（心臓など）の容積比（例えば、平均値）などにより、前述の投与量を換算した量を投与することができる。

さらに他の様相において、ヒドランゲノールを含むアジサイ抽出物を、それを必要とする個体に投与する段階を含む肥満または代謝性疾患を、予防、改善または治療する方法を提供する。

さらに他の様相において、ヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩を、肥満または代謝性疾患の予防用、改善用または治療用の組成物製造に使用するための用途を提供する。

さらに他の様相において、ヒドランゲノールを含むアジサイ抽出物を、肥満または代謝性疾患の予防用、改善用または治療用の組成物製造に使用するための用途を提供する。

前記発明について記述された用語及び方法などは、各発明間に同一に適用される。

以上において説明したように、本願発明は、ヒドランゲノールを有効成分にし、ｍＴＯＲ（mammalian target of rapamycin）のリン酸化を低減させ、ＦｏｘＯ１（forkhead box Ｏ１）のリン酸化を増大させ、最終的にＰＰＡＲγ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma）のような脂肪細胞分化因子を減少させ、中性脂肪（triglyceride）の蓄積及び分泌を抑制させることにより、過度な栄養分の露出によって生ずる脂肪の蓄積を抑制させ、かつ体脂肪を減少させることを確認した。ヒドランゲノールは、天然植物に由来する物質として、健康機能食品分野、化粧品分野に有用に使用されうる。

アジサイ葉熱水抽出物及びアジサイ抽出物（ヤマアジサイ（Hydrangea serrata））に含有されたヒドランゲノール（hydrangenol）と、ヒドランゲノールとのＨＰＬＣ分析結果である。ヒドランゲノールまたはアジサイ抽出物を処理した場合の脂肪細胞内中性脂肪蓄積変化を調べるために、オイルレッド－Ｏ染色及び定量分析を行った結果写真及びグラフである。ヒドランゲノールまたはアジサイ抽出物を処理した場合の脂肪細胞内中性脂肪調節タンパク質発現を確認するために、ウェスタンブロットした結果である。マウスの肥満誘導と共に、アジサイ葉熱水抽出物を同時に投与したときの体重変化を示したグラフである。マウスの肥満誘導後、アジサイ葉熱水抽出物を投与したときの体重変化を示したグラフである。アジサイ葉熱水抽出物の体脂肪減少効果を調べるために、マウスの肥満誘導と共に、アジサイ葉熱水抽出物を同時に投与した場合のマウスを、二重エネルギー放射線吸収計測法（dual-energy Ｘ-ray absorptiometry）を利用し、脂肪分布映像及び体内脂肪含有量を測定した写真である。ａは、マウスの肥満誘導と共に、アジサイ葉熱水抽出物を同時に投与した場合、体内脂肪含有量を示したグラフであり、ｂは、マウスの肥満誘導と共に、アジサイ葉熱水抽出物を同時に投与した場合、脂肪重量を示したグラフである。アジサイ葉熱水抽出物の体脂肪減少効果を調べるために、マウスの肥満誘導後、アジサイ葉熱水抽出物を投与した場合のマウスを二重エネルギー放射線吸収計測法を利用し、脂肪分布及び体内脂肪含有量を測定した写真である。ａは、マウスの肥満誘導後、アジサイ葉熱水抽出物を投与した場合、体内脂肪含有量を示したグラフであり、ｂは、マウスの肥満誘導後、アジサイ葉熱水抽出物を投与した場合、脂肪重量を示したグラフである。アジサイ葉熱水抽出物の脂肪区サイズ低減効果を調べるために、顕微鏡で観察した脂肪細胞を撮影した写真である。ａは、アジサイ葉熱水抽出物を投与した場合、コレステロールの量を示したグラフであり、ｂは、アジサイ葉熱水抽出物を投与した場合、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の量を示したグラフである。ａは、アジサイ葉熱水抽出物を投与した場合、脂肪組織において、ｐ－ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ：ＡＭＰ－activated protein kinase）タンパク質の発現を確認した結果であり、ｂは、アジサイ葉熱水抽出物を投与した場合、肝臓において、ｐ－ＡＭＰＫタンパク質の発現を確認した結果である。ヒドランゲノールの体重減少効果を調べるために、ヒドランゲノールをマウスに投与したとき、体重変化を示したグラフである。ヒドランゲノールの体脂肪減少効果を調べるために、ヒドランゲノールをマウスに投与し、マウスに対し、二重エネルギー放射線吸収計測法を利用し、脂肪分布映像及び体内脂肪含有量を測定した写真である。ａは、ヒドランゲノールを投与した場合、体内脂肪含有量を示したグラフであり、ｂは、ヒドランゲノールを投与した場合、脂肪重量を示したグラフである。ヒドランゲノールの脂肪区サイズ低減効果を調べるために、顕微鏡で観察した脂肪細胞を撮影した写真である。ａは、ヒドランゲノールを投与した場合、コレステロールの量を示したグラフであり、ｂは、ヒドランゲノールを投与した場合、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の量を示したグラフである。ａは、ヒドランゲノールを投与した場合、脂肪組織において、ｐ－ＡＭＰＫタンパク質の発現を確認した結果であり、ｂは、ヒドランゲノールを投与した場合、肝臓において、ｐ－ＡＭＰＫタンパク質の発現を確認した結果である。

以下、実施例を介し、本発明についてさらに詳細に説明する。それら実施例は、ただ、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例によって制限されると解釈されるものではない。

実施例１：ヒドランゲノールを含むアジサイ抽出物の製造
本発明の組成物において、アジサイ抽出物は、次のような過程で製造した。まず、乾燥されたアジサイ（ヤマアジサイ（Hydrangea serrata））原材料２０ｋｇと精製水３００ｋｇとを抽出タンクに入れ、１００℃で５時間還流抽出した。抽出された試料は、カートリッジフィルタ（１０μｍ）で濾過した後、減圧濃縮を進め、噴霧乾燥を介し、水溶性粉末を得た。

実施例２：アジサイ抽出物に由来するヒドランゲノール（hydrangenol）製造
実施例１で得られた抽出粉末は、Diaion ＨＰ－２０を利用し、ゲル濾過（gel filtration）を実施した。展開溶媒は、３０％、５０％、７０％、１００％のメタノールとＣＨ_２Ｃｌ_２－ＭｅＯＨ（１：１、ｖ／ｖ）との混合溶液を、それぞれ２Ｌずつ使用して溶媒分画し、５個の小分画（３９２－７０ＥＤｉａ１～３９２－７０ＥＤｉａ５）に分けた。小分画３９２－７０ＥＤｉａ４は、Sephadex ＬＨ－２０を使用し、メタノールを展開溶媒とし、７個の小分画（３９２－７０ＥＤｉａ４ａ～３９２－７０ＥＤｉａ４ｇ）に分け、そのうち３９２－７０ＥＤｉａ４ｄ分画は、メタノールで再結晶させ、無定形の化合物１（ヒドランゲノール）単一物質を純粋に得た。

本発明の実施例１で得られた抽出粉末と、実施例２で得られたヒドランゲノールは、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）と紫外可視吸光光度検出器（ＵＶ／Ｖｉｓ detector）とで分析を実施した。ＨＰＬＣ機器は、Waters ｅ２６９５ Series system、Waters ２４４８９ＵＶ／Ｖｉｓ detector（Worcester、ＭＡ、米国）、Luna Ｃ１８（２）（５μｍ、２５０Ｘ４．６ｍｍ、Phenomenex、Torrance、ＣＡ、米国）カラムを使用し、分析に使用された全ての溶媒は、Ｊ．Ｔ．Baker（Phillipsburg、ＮＪ、米国）から購入したＨＰＬＣクラス溶媒を使用した。分析時、カラムの温度は、３０℃、注入容量は、２０μｌ、測定波長は、２１０ｎｍに設定した。移動相は、アセトニトリル（ＡＣＮ）と三次蒸溜水（Ｄ．Ｗ）を使用し、１ｍｌ／分の速度でＡＣＮ－Ｄ．Ｗ（２：８－１０：０、ｖ／ｖ）混合溶液を５０分間分析した。分析試料は、実施例１で得られた抽出粉末１００ｍｇを精密に秤量し、メタノール１０ｍｌを加えた後、２０分間、超音波振盪器に入れて溶解させ、室温で放冷させた後、上澄み額を取り、０．４５μｍメンブレンフィルタで濾過して使用し、実施例２で得られたヒドランゲノールは、１０ｍｇを精密に秤量し、メタノール４０ｍｌを加えた後、２０分間超音波振盪器に入れて溶解させ、室温で放冷させた後、メタノールを加え、０．４５μｍメンブレンフィルタで濾過して使用した。それぞれの分析試料は、２１０ｎｍでクロマトグラムを抽出し、アジサイ葉熱水抽出物ピークと、ヒドランゲノールピークとを比較分析した（図１）。

前記実施例２の構造を確認するために、まず、ＥＳＩＭＳ（positive-ion mode）を確認した結果、ｍ／ｚ＝２５７［Ｍ＋Ｈ］＋と示された。^１Ｈ－ＮＭＲにおいて、高磁場で示されるδＨ５．５０におけるメチンプロトン（methine proton）（Ｈ－３）と、δＨ３．３０とδＨ３．０６とにおけるメチレンプロトン（methylene proton）（Ｈ－４）とが互いにビシナルカップリング（vicinal coupling）するという点、及び化学シフト（chemical shift）値により、Ｃリングに起因するプロトンであるということが分かった。Ｂリングのｐ置換ベンゼン環に起因するＨ－２’，３’とＨ－６’，５’は、互いにオルトカップリング（ortho coupling）し、二重項（doublet）（Ｊ＝８．４Ｈｚ）として示され、Ｈ－２’とＨ－６’とのピーク、及びＨ－３’とＨ－５’とのピークも、互いにオルトカップリングし、二重項として示され、ヒドロキシ基を中心に、互いに対称構造であることが分かった。Ａリングの１，２，３－三置換ベンゼンにおいては、Ｈ－５と７番水素は、それぞれＨ－６水素とカップリングし、Ｈ－５と７番水素は、オルトカップリングによって二重項として、Ｈ－６プロトンは、オルトカップリングとメタカップリングとにより、ダブル二重項として示され、いずれも１つの水素に該当するピークであることが分かった。

^１３Ｃ－ＮＭＲにおいては、パラ置換体を含み、総１５個のピークが示された。δＣ１７２における四級（quaternary）炭素は、化合物１番炭素であるカルボニル基に起因したピークであり、δＣ１１６．９（Ｃ－３’，５’）とδＣ１２９．６（Ｃ－２’，６’）は、芳香族環（aromatic ring）のパラ置換体に起因したピークであり、δＣ３６．１とδＣ８３．１のピークは、それぞれ脂肪族炭素（aliphatic carbon）と酸素化炭素（oxygenated carbon）とに起因するということを予想することができた。また、ＤＥＰＴＮＭＲにおいては、７個のプロトン化炭素（protonated carbon）を確認することができ、δＣ３６．１のピークは、Ｃ－４に起因したメチレン基であることが分かった。それらの正確な構造を分析するために、２ＤＮＭＲを分析した。ＨＳＱＣから、ピークの正確な位置を同定し、ＨＭＢＣから、置換基が結合された位置を知ることができた。すなわち、δＨ７．２６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ、Ｈ－２’，６’）のピークは、δＣ３６．１のＣ－４との相関関係が示され、Ｈ－４に起因したδＨ３．０６とδＨ３．３０とのピークは、δＣ８３．１（Ｃ－３）、δＣ１１９．８（Ｃ－５）、δＣ１１０．０（Ｃ－９）、δＣ１４２．２（Ｃ－１０）のピークと相関関係が示されている。以上の結果を総合し、ヒドランゲノールを確認した。

図１は、アジサイ葉熱水抽出物及びアジサイ抽出物（ヤマアジサイ（Hydrangea serrata））に含有されたヒドランゲノールと、ヒドランゲノールとのＨＰＬＣ分析結果である。

実験例１．オイルレッドＯ染色を介する脂肪の蓄積抑制評価
本実験において、脂肪細胞分化を誘導するために、３Ｔ３－Ｌ１細胞をプレートに分注し、１０％ＢＳ培地において、細胞密度が１００％になるまで培養した。細胞の分化段階において、１０％ＦＢＳ分化培地（インシュリン５μｇ／ｍｌ、デキサメタゾン（dexametasone）１μＭ、３－イソブチル－１－メチルキサンチン（methylxanthine）０．５ｍＭ）に、それぞれヒドランゲノール含有アジサイ（ヤマアジサイ（Hydrangea serrata））（２５μｇ／ｍｌ）またはヒドランゲノール（２．５μｇ／ｍｌ）が加えられた。陽性対照群ピオグリタゾン（２５μＭ／ｍｌ）を処理し１０日後、オイルレッド－Ｏ染色及び定量分析を介し、脂肪蓄積をどれほど抑制することができるということを測定した。肉眼評価のために、染色後のイメージ撮影を行い、その後、染色された細胞を完全に乾燥させた後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解させ、９６ウェルプレートに移し、４５０ｎｍの吸光度で測定した。

図２は、ヒドランゲノールまたはアジサイ抽出物を処理した場合の脂肪細胞内中性脂肪蓄積変化を調べるために、オイルレッド－Ｏ染色及び定量分析を行った結果写真及びグラフである。

実験例２．ヒドランゲノール処理時の脂肪細胞分化関連タンパク質発現分析
ヒドランゲノール含有アジサイ（ヤマアジサイ（Hydrangea serrata））及びヒドランゲノールに係わる、脂肪細胞内中性脂肪を減少させるメカニズムを確認した。脂肪前駆体細胞である３Ｔ３－Ｌ１を１０日間分化させながら、それぞれアジサイ（ヤマアジサイ（Hydrangea serrata））（２５μｇ／ｍｌ）、ヒドランゲノール（２．５μｇ／ｍｌ）を２４時間処理した。その後、細胞を、modified ＬＩＰＡ bufferを利用して破砕した後、それぞれ２０μｇを分析に使用した。それぞれｐ－ｍＴＯＲ（ａｂ１０９２６８、Ａｂｃａｍ）、ｐ－Ｆｏｘ０１（９４６１Ｓ、Cell Signaling）、ＰＰＡＲγ（ｓｃ－７２７３、Santa Cruz）、β－アクチン（Ａ５３１６、Sigma）の一次抗体を使用して分析した。

図３に図示されているように、ヒドランゲノール含有アジサイ（ヤマアジサイ（Hydrangea serrata））及びヒドランゲノールがｍＴＯＲ（mammalian target of rapamycin）のリン酸化を低減させ、ＦｏｘＯ１（forkhead box Ｏ１）のリン酸化を増大させ、最終的に、ＰＰＡＲγ（peroxisome proliferator－activated receptor gamma）発現量を減少させることにより、脂肪細胞内中性脂肪形成を抑制することになることを確認した。

図３は、ヒドランゲノールまたはアジサイ抽出物を処理した場合の脂肪細胞内中性脂肪調節タンパク質発現を確認するために、ウェスタンブロットを行った結果である。

実験例３．アジサイ葉熱水抽出物（ＷＨＳ）の生体内（in vivo）効果分析
３－１．マウス及び実験デザイン
アジサイ葉熱水抽出物の生体内抗肥満効能を分析するために、まず、肥満動物モデルを作製した。８週齢になる雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（ＳＰＦ（specific－pathogen－free） grade、２０±２ｇ、オリエントバイオ）を、次のように７個群に設定し、各群当たり１０匹ずつ実験した：正常対照群として、高脂肪食餌せず、何も投与していない一般マウス（ＣＯＮ）と、３０％高脂肪食餌で肥満を誘導し、何も投与していない肥満マウス（ＨＦＤ）とをそれぞれ置き、陽性対照群としては、肥満マウスに肥満治療剤であるオルリスタット（orlistat）を経口投与した。実験群としては、肥満マウスにアジサイ葉熱水抽出物を、それぞれ７５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ経口投与したものと、一般マウスに、アジサイ葉熱水抽出物を３００ｍｇ／ｋｇ経口投与したものとを置いた。また、マウスの肥満誘導と共に、アジサイ葉熱水抽出物を、同時に１２週間投与した場合と、１０週肥満誘導後、アジサイ葉熱水抽出物を後投与した場合とに分け、実験を進めた。アジサイ葉熱水抽出物は、投与期間の間、１週当たり５日経口投与した。暗（dark）：明（light）周期は、１２時間：１２時間間隔で維持し、水は、自由に摂取させた。

３－２．アジサイ葉熱水抽出物による体重及び脂肪の減少効果分析
アジサイ葉熱水抽出物を投与したとき、マウスの体重及び脂肪が減少するか否かということを分析する実験を行った。その結果、各実験群、及び経時的なマウスの体重変化を見たとき、陽性対照群と、アジサイ葉熱水抽出物を投与した群とにおいて、体重減少効果を見ることができた（図４、図５）。

また、各実験群マウスに対し、動物実験の最後週に、二重エネルギー放射線吸収計測法（dual-energy Ｘ－ray absorptiometry）を利用し、脂肪分布映像及び体内脂肪含有量を測定し、動物を犠牲にし、副睾丸脂肪を含む腹腔脂肪組織が分離し、脂肪重量を測定した。実験結果は、Sigma plot統計プログラム内ｔ－testを利用し、群間有意性差が示された（ｐ^＃＜０．０５ｖｓ正常対照群、ｐ^＊＜０．０５，ｐ^＊＊＜０．０１，Ｐ^＊＊＊＜０．００１ｖｓ肥満群）。その結果、陽性対照群と、アジサイ葉熱水抽出物を投与した群とにおいて、体脂肪が減少されたことを確認した（図６、図７、図８、図９）。

図４は、マウスの肥満誘導と共に、アジサイ葉熱水抽出物を同時に投与したときの体重変化を示したグラフである。

図５は、マウスの肥満誘導後、アジサイ葉熱水抽出物を投与したときの体重変化を示したグラフである。

図６は、アジサイ葉熱水抽出物の体脂肪減少効果を調べるために、マウスの肥満誘導と共に、アジサイ葉熱水抽出物を同時に投与した場合のマウスを二重エネルギー放射線吸収計測法を利用し、脂肪分布映像及び体内脂肪含有量を測定した写真である。

図７ａは、マウスの肥満誘導と共に、アジサイ葉熱水抽出物を同時に投与した場合、体内脂肪含有量を示したグラフであり、図７ｂは、マウスの肥満誘導と共に、アジサイ葉熱水抽出物を同時に投与した場合、脂肪重量を示したグラフである。

図８は、アジサイ葉熱水抽出物の体脂肪減少効果を調べるために、マウスの肥満誘導後、アジサイ葉熱水抽出物を投与した場合のマウスに対し、二重エネルギー放射線吸収計測法を利用し、脂肪分布及び体内脂肪含有量を測定した写真である。

図９ａは、マウスの肥満誘導後、アジサイ葉熱水抽出物を投与した場合、体内脂肪含有量を示したグラフであり、図９ｂは、マウスの肥満誘導後、アジサイ葉熱水抽出物を投与した場合、脂肪重量を示したグラフである。

３－３．アジサイ葉熱水抽出物による脂肪細胞サイズ低減効果分析
組織学的分析のために、マウスの副睾丸脂肪組織を、４％パラホルマリンに固定させた。連続したアルコール濃度勾配（graded alcohol series）と、洗浄を介する脱水化（dehydration）とを数回進めた後、組織をパラフィンに包埋させた。組織切片を厚み４μｍに切り、ヘマトキシリン（haematoxylin）とエオシン（eosin）とで染色を進めた。白色脂肪細胞（white adipocyte）の大きさを確認するために、各脂肪細胞の領域につき、cellSence software（Olympus Ｃｏ．、米国）で各切片を測定した。その結果、肥満誘導と共に、アジサイ葉熱水抽出物を投与した群において、脂肪細胞サイズが低減されたことを確認した（図１０）。

図１０は、アジサイ葉熱水抽出物の脂肪区サイズ低減効果を調べるために、顕微鏡で観察した脂肪細胞を撮影した写真である。

３－４．アジサイ葉熱水抽出物による肝臓及び腎臓に及ぼす影響分析
アジサイ葉熱水抽出物が、マウスの肝臓及び腎臓に損傷を起こすか否かということを確認するために、肥満誘導と共に、アジサイ葉熱水抽出物を投与した群のアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＧＯＴ：glutamic oxaloacetic transaminase（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素（ＧＰＴ：glutamic pyruvic transmainase）、血液尿素窒素（ＢＵＮ：blood urea nitrogen）につき、生化学分析器（ＡＵ４８０Chemistry Analyzer、Beckman coulter、ＣＡ、米国）を利用し、血清分析を行った。その結果、表１に示されたように７、個群間の有意的な差が示されなかった。そのような結果は、アジサイ葉熱水抽出物が肝臓及び腎臓の損傷を起こさないということを意味する。

３－５．アジサイ葉熱水抽出物による血中中性脂肪及び血中コレステロールの変化分析
アジサイ葉熱水抽出物の血中中性脂肪及び血中コレステロールに及ぼす影響を分析するために、肥満誘導と共に、アジサイ葉熱水抽出物を投与した群の血液生化学検査を、生化学分析器（ＡＵ４８０ Chemistry Analyzer、Beckman coulter、ＣＡ、米国）を利用して行った。その結果、表２及び図１１に示されているように、肥満誘導と共に、アジサイ葉熱水抽出物を投与した群において、総コレステロール、中性脂肪、ＬＤＬ含量が減少し、ＨＤＬ含量は、有意な差を示さないということを確認した。そのような結果は、アジサイ葉熱水抽出物がＨＤＬ含量に影響を与えないが、総コレステロール、ＬＤＬ及び中性脂肪を減少させることにより、肥満を予防する効果があるということを意味する。

図１１ａは、アジサイ葉熱水抽出物を投与した場合、コレステロールの量を示したグラフであり、図１１ｂは、アジサイ葉熱水抽出物を投与した場合、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の量を示したグラフである。

３－６．アジサイ葉熱水抽出物によるエネルギー代謝に係わるタンパク質発現分析
ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ：ＡＭＰ－activated protein kinase）は、肝臓において、エネルギー恒常性維持のために、肝細胞内のエネルギーが低下する場合に活性化され、脂肪及びコレステロールの合成を抑制し、反対に、脂肪酸酸化を促進する役割を行う。従って、アジサイ葉熱水抽出物の投与が、ＡＭＰＫの発現を増大させるか否かということを確認するために、肥満誘導と共に、アジサイ葉熱水抽出物を投与した群のタンパク質発現量を分析した。

具体的には、脂肪及び肝臓組織をタンパク質抽出溶液と混ぜた後、組織粉砕器を利用して破砕した後、４℃、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄み液を得た後、ブラッドフォード（Bradford）法で標準曲線を作り、タンパク質を定量した。タンパク質３０μｇに、６倍の試料緩衝液を加え、５分間湯煎した後、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを利用して電気泳動させた後、１時間２０分間、ＰＶＤＦ膜に免疫ブロッティングを行った。それに対し、５％（ｗ／ｖ）脱脂乳が含まれたＴＢＳＴ緩衝溶液（Tris-buffered saline-Tween ２０）で１時間ブロッキングした後、抗ｐ－ＡＭＰＫ抗体を１：１，０００に希釈し、４℃で１８時間反応させた。ＴＢＳＴ緩衝溶液において、１０分間３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ（peroxidase）が結合された二次抗体で室温で２時間反応させた。ＴＢＳＴ緩衝溶液において、１０分間３回洗浄した後、増強化学発光（enhanced chemiluminescence）キット（Amersham Life Sciences、Amersham、英国）を利用し、ハイパーフィルムで発色させて現像し、各対照群及び実験群のＡＭＰＫリン酸化変化を、ウェスタンブロットで確認した結果、アジサイ葉熱水抽出物を投与した場合、リン酸化されたＡＭＰＫタンパク質発現量が増加することを確認した（図１２）。

そのような結果は、アジサイ葉熱水抽出物が、抗肥満効果に重要なＡＭＰＫリン酸化誘導効果を有することを意味する。

図１２ａは、アジサイ葉熱水抽出物を投与した場合、脂肪組織において、ｐ－ＡＭＰＫタンパク質の発現を確認した結果であり、図１２ｂは、アジサイ葉熱水抽出物を投与した場合、肝臓において、ｐ－ＡＭＰＫタンパク質の発現を確認した結果である。

実験例４．ヒドランゲノール（ＨＧ）の生体内（in vivo）効果分析
４－１．マウス及び実験デザイン
ヒドランゲノールの生体内抗肥満効能を分析するために、まず、肥満動物モデルを作製した。８週齢になる雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（ＳＰＦ（specific－pathogen－free） grade、２０±２ｇ、オリエントバイオ）を、次のように７個群に設定し、各群当たり１０匹ずつ実験した：正常対照群として、高脂肪食餌せずに、何も投与していない一般マウス（ＣＯＮ）と、３０％高脂肪食餌で肥満を誘導し、何も投与していない肥満マウス（ＨＦＤ）とをそれぞれ置き、陽性対照群としては、肥満マウスに肥満治療剤であるオルリスタットを経口投与した。実験群としては、肥満マウスに、ヒドランゲノール（ＨＧ）をそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ経口投与したものと、一般マウスに、ヒドランゲノールを８０ｍｇ／ｋｇ経口投与したものとを置いた。マウスの肥満誘導と共に、ヒドランゲノールを同時に投与し、ヒドランゲノールは、１週当たり５日投与し、１２週間投与した。暗（dark）：明（light）周期は、１２時間：１２時間間隔に維持し、水は、自由に摂取させた。

４－２．ヒドランゲノールによる体重及び脂肪の減少効果分析
ヒドランゲノールを投与したとき、マウスの体重及び脂肪が減少するか否かということを分析する実験を行った。その結果、各実験群、及び経時的なマウスの体重変化を見たとき、陽性対照群と、ヒドランゲノールを投与した群とにおいて、体重減少効果を見ることができた（図１３）。

また、各実験群マウスに対し、動物実験の最後週に、二重エネルギー放射線吸収計測法を利用し、脂肪分布映像及び体内脂肪含有量を測定し、動物を犠牲し、副睾丸脂肪を含む腹腔脂肪組織を分離し、重量を測定した。実験結果は、Sigma plot統計プログラム内ｔ－testを利用し、群間有意性差を示した（ｐ＃＜０．０５ｖｓ正常対照群、ｐ＊＜０．０５、ｐ＊＊＜０．０１、Ｐ＊＊＊＜０．００１ｖｓ肥満群）。その結果、陽性対照群と、ヒドランゲノールを投与した群とにおいて、体脂肪が減少したということを確認した（図１４、図１５）。

図１３は、ヒドランゲノールの体重減少効果を調べるために、ヒドランゲノールをマウスに投与したとき、体重変化を示したグラフである。

図１４は、ヒドランゲノールの体脂肪減少効果を調べるために、ヒドランゲノールをマウスに投与し、マウスに対し、二重エネルギー放射線吸収計測法を利用し、脂肪分布映像及び体内脂肪含有量を測定した写真である。

図１５ａは、ヒドランゲノールを投与した場合、体内脂肪含有量を示したグラフであり、図１５ｂは、ヒドランゲノールを投与した場合、脂肪重量を示したグラフである。

４－３．ヒドランゲノールによる脂肪細胞サイズ低減効果分析
組織学的分析のために、マウスの副睾丸脂肪組織を４％パラホルマリンに固定させた。連続したアルコール濃度勾配と、洗浄を介する脱水化とを数回進めた後、組織をパラフィンに包埋させた。組織切片を厚み４μｍに切り、ヘマトキシリンとエオシンとで染色を進めた。白色脂肪細胞の大きさを確認するために、各脂肪細胞の領域につき、cellSence software（Olympus Ｃｏ．、米国）で各切片を測定した。その結果、ヒドランゲノールを投与した場合、脂肪細胞サイズが低減したことを確認した（図１６）。

図１６は、ヒドランゲノールの脂肪区サイズ低減効果を調べるために、顕微鏡で観察した脂肪細胞を撮影した写真である。

４－４．ヒドランゲノールによる肝臓及び腎臓に及ぼす影響分析
ヒドランゲノールが、肝臓及び腎臓に損傷を起こすか否かということを確認するために、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素（ＧＰＴ：glutamic pyruvic transaminase（ＧＰＴ）、血液尿素窒素（ＢＵＮ：blood urea nitrogen）につき、生化学分析器（ＡＵ４８０Chemistry Analyzer、Beckman coulter、ＣＡ、米国）を利用し、血清分析を行った。その結果、表３に示されたように、７個群間の有意的な差が示されなかった。そのような結果は、ヒドランゲノールが、肝臓及び腎臓に損傷を起こさないということを意味する。

３－５．ヒドランゲノールによる血中中性脂肪及び血中コレステロールの変化分析
ヒドランゲノールの血中中性脂肪及び血中コレステロールに及ぼす影響を分析するための血液生化学検査を、生化学分析器（ＡＵ４８０ Chemistry Analyzer、Beckman coulter、ＣＡ、米国）を利用して行った。

その結果、表４及び図１７に示されているように、ヒドランゲノールを投与した場合、総コレステロールとＬＤＬとの含量が減少し、中性脂肪とＨＤＬとの含量は、有意な差を示さないということを確認した。そのような結果は、ヒドランゲノールが、中性脂肪とＨＤＬとの含量に影響を与えないが、総コレステロールとＬＤＬとを減少させることにより、肥満による血中脂質悪化を改善する効果があることを意味する。

図１７ａは、ヒドランゲノールを投与した場合、コレステロールの量を示したグラフであり、図１７ｂは、ヒドランゲノールを投与した場合、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の量を示したグラフである。

３－６．ヒドランゲノールによるエネルギー代謝に係わるタンパク質発現分析
ＡＭＰＫは、肝臓において、エネルギー恒常性維持のために、肝細胞内のエネルギーが低下する場合に活性化され、脂肪及びコレステロールの合成を抑制し、反対に、脂肪酸酸化を促進する役割を行う。従って、ヒドランゲノールがＡＭＰＫの発現を増大させるか否かということを確認するための実験を行った。

具体的には、脂肪及び肝臓組織を、タンパク質抽出溶液と混ぜた後、組織粉砕器を利用して破砕した後、４℃、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄み液を得た後、ブラッドフォード法で標準曲線を作り、タンパク質を定量した。タンパク質３０μｇに、６倍の試料緩衝液を加え、５分間湯煎した後、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを利用し、電気泳動をさせた後、１時間２０分間、ＰＶＤＦ膜に免疫ブロッティングを行った。それに、５％（ｗ／ｖ）脱脂乳が含まれたＴＢＳＴ緩衝溶液（Tris-buffered saline-Tween２０）で１時間ブロッキングした後、抗ｐ－ＡＭＰＫ抗体を１：１，０００に希釈し、４℃で１８時間反応させた。ＴＢＳＴ緩衝溶液において、１０分間３回洗浄した後、ペルオキシダーゼが結合された二次抗体で室温で２時間反応させた。ＴＢＳＴ緩衝溶液において、１０分間３回洗浄後、増強化学発光キット（Amersham Life Sciences、Amersham、英国）を利用し、ハイパーフィルムで発色させて現像し、各対照群及び実験群のＡＭＰＫリン酸化変化を確認した結果、ヒドランゲノールを処理した群において、リン酸化されたＡＭＰＫタンパク質発現量が増大することを確認した（図１８）。

そのような結果は、ヒドランゲノールが、抗肥満効果に重要なＡＭＰＫリン酸化誘導効果を有するということを意味する。

図１８ａは、ヒドランゲノールを投与した場合、脂肪組織において、ｐ－ＡＭＰＫタンパク質の発現を確認した結果であり、図１８ｂは、ヒドランゲノールを投与した場合、肝臓において、ｐ－ＡＭＰＫタンパク質の発現を確認した結果である。

剤形例１：錠剤の製造
ヒドランゲノールに対し、一般的な錠剤製造方法により、表５の成分を混合し、打錠して錠剤を製造する。

剤形例２：カプセル剤の製造
ヒドランゲノールに対し、一般的なカプセル剤製造方法により、表６の成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填し、カプセル剤を製造する。

剤形例３：ゼリーの製造
ヒドランゲノールに対し、好みに適するゼリー製造方法により、下記表７の成分を混合し、三面包みに充填し、ゼリーを製造する。

剤形例４：栄養クリームの製造
ヒドランゲノールに対し、栄養クリームを、一般的な方法により、表８の組成で製造した。

前記の組成比は、一般的に適する成分を混合して剤形例に組成したが、必要により、その配合比及び原料を任意に変更実施しても差し支えない。

本発明の試料は、全ての剤形例試験条件において、安定しているので、剤形の安定性には、問題がなかった。

Claims

ヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分とする、脂肪細胞におけるトリグリセリド形成の抑制、体脂肪の減少、及び脂肪細胞のサイズの減少のための健康機能食品組成物。
前記ヒドランゲノールは、下記化学式１に表示されるものある、請求項１に記載の健康機能食品組成物：
ヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分とする、脂肪細胞におけるトリグリセリド形成の抑制、体脂肪の減少、及び脂肪細胞のサイズの減少のための薬学的組成物。
ヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分として含む、血中の総コレステロールと低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の低減のための健康機能食品組成物。
ヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分として含む、血中の総コレステロールと低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の低減のための薬学的組成物。
ヒドランゲノール、またはその薬剤学的に許容可能な塩を、脂肪細胞におけるトリグリセリド形成の抑制、体脂肪の減少、及び脂肪細胞のサイズの減少、又は、血中の総コレステロールと低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の低減のための組成物製造に使用するための、用途。