JP4974116B2 - ビワ葉抽出物を含有する飲食品及び医薬品 - Google Patents

Description

本発明は、例えば抗高脂血症作用、高血圧抑制作用、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用及び／又は抗酸化作用を有する飲食品又は医薬品及びその製造方法に関する。

ビワ葉は、ビワ茶の嗜好飲料に利用され、ビワ茶として親しまれているのみならず、古くから漢方に配合される薬として用いられている。
近年、ビワ葉の有する機能性が明らかにされつつある。例えば、ビワ葉に含まれているポリフェノール成分のヒト口腔癌細胞に対する細胞傷害活性（非特許文献１）、ビワ葉に含まれるメガスチグマン配糖体の抗発癌プロモーション作用（非特許文献２）、ビワ葉の抗腫瘍活性作用（非特許文献３）及び抗酸化作用（非特許文献４）などが報告されている。
本出願人が出願した特許文献１には、ビワ葉を利用して風味のあるビワ茶を多量に製造する方法及び製造設備が開示されている。本出願人は特許文献１に記載のビワ茶の製造設備を用いて、トルマリン石焙煎によりねじめびわ茶を製造している。製造したねじめびわ茶については、「糖尿の血糖値が下がった」、「高血圧の血圧が正常になった」などの声が消費者より寄せられているが、その実証的な証拠は確認されていなかった（非特許文献５）。
一方、特許文献１の段落番号「０００４」に「従来のビワ茶製造の材料となるビワの葉は、果実の収穫を目的とした果実栽培種が利用されているため、栄養分は果実に集まり、ビワの葉に栄養分が十分に行き渡らないため、薬用として利用しても本来の効果は得られないという欠点がある」という記載があるように、従来では、ビワ葉は薬用として十分に効果を発揮していなかった。
従来において、ビワには以下のような活性又は利用方法があることが開示されている。
特許文献２には、ビワ又はその抽出物がマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ−１）阻害活性を有することが開示されている。
特許文献３には、ビワの木の葉を焼いて炭にして粉末状食品素材とすることが開示されている。
特許文献４には、ビワの生葉を切断し、蒸気で蒸し、熱風を送りつつ揉み、乾燥させ、整形した後、再度乾燥させることにより香気と旨味とを増すように仕上げることを特徴とした漢方茶の製造方法が開示されている。
特許文献５には、イネ科植物の葉緑健康茶とビワの茶葉を混合し、より多くのγ−アミノ酪酸を含有する健康茶の製造方法が開示されている。
特許文献６には、果実部を除くビワの抽出物がα−グルコシダーゼ阻害活性を有することが開示されている。
特許文献７には、シャキョクとビワ葉を混合した滋養強壮健康増進用組成物が開示されている。
特許文献８には、黄杞の葉を焙煎処理したものをビワ茶と混合してなる健康茶が開示されている。
特許文献９には、甘茶とビワの混合物で構成する健康茶が開示されている。
特許文献１０には、バラ科ビワ属の有機抽出物を含む組成物が生物におけるＣＯＸ−２活性を阻害することが開示されている。
特許第３４５２３５１号公報 特開２００５−００８５３９号公報 特開２００４−１５４１０８号公報 特開２００４−１０５０３６号公報 特開２００２−０６５２２７号公報 特開２００１−１６３７９５号公報 特開２００１−１６３７９２号公報 特開平７−２７４８３２号公報 特開平５−０５６７７２号公報 特表２００４−５２９０７９号公報 Ｉｔｏ，Ｈ．ら，「Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．」，２０００年，第４８巻，ｐ．６８７−６９３ 吉田隆志ら，「Ｂｉｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ」，２００３年，第２０巻，ｐ．２７−３３ Ｉｔｏ，Ｈ．ら，「Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．」，２００２年，第５０巻，ｐ．２４００−２４０３ Ｊｕｎｇ，Ｈ．ら，「Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．」，１９９９年，第２２巻，ｐ．２１３−２１８ 農業生産法人有限会社十津川農場，「ねじめびわ茶パンフレット」，２００４年

上述したように、従来ではビワ葉に含まれる種々の生物学的活性や活性化合物の存在が明らかにされたものの、ビワ葉が高血糖値の降下作用、高血圧抑制作用、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、抗高脂血症作用等の効果を有することは知られていなかった。これらの効果が確認できれば、ビワ葉を糖尿病、高脂血症、高血圧症、癌等の疾患の予防又は治療に使用できるものと考えられる。
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、ビワ葉を用いた、抗高脂血症作用、高血圧抑制作用、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用及び／又は抗酸化作用を有する飲食品又は医薬品及びその製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ビワ茶を熱水抽出に供し、得られた抽出物をモデルマウス又はラットに給餌することで、血糖値を低下させ、またコレステロール及びトリグリセリド等の血清脂質並びに脂肪組織の重量を低下させることを見出した。また、ビワ茶の抽出物から得られた粗製分画物は強い抗酸化作用を有することを見出した。
更に、ビワ茶を熱水抽出に供し、得られた抽出物をモデルマウス又はラットに給餌することで、血圧の上昇を抑制し、また、癌細胞に直接作用させることによってその増殖を抑制し、更にまた、癌細胞に対してアポトーシス誘導すること及び／又は活性酸素種を産生させることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は以下を包含する。
（１）ビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物を有効成分として含有し、且つ抗高脂血症作用、高血圧抑制作用、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用及び抗酸化作用から成る群から選択される１以上の作用を有する飲食品又は医薬品。
（２）上記ビワ茶がねじめびわ茶であることを特徴とする、（１）記載の飲食品又は医薬品。
（３）上記精製物がクロロゲン酸、クエルセチン３−サンブビオシド、メチルクロロゲン酸、ケンフェロール３−ラムノシド、クエルセチン３−ラムノシド、２α−ヒドロキシウルソール酸及びウルソール酸から成る群から選択される１以上の化合物を含まないことを特徴とする、（１）記載の飲食品又は医薬品。
（４）上記飲食品が抗高脂血症作用、高血圧抑制作用、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用及び抗酸化作用から成る群から選択される１以上の作用を有する旨の表示を有するものであることを特徴とする、（１）記載の飲食品又は医薬品。
（５）ビワ葉又はビワ茶を熱水抽出又は溶媒抽出に供し、抽出物を得る工程を含むことを特徴とする、抗高脂血症作用、高血圧抑制作用、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用及び抗酸化作用から成る群から選択される１以上の作用を有する飲食品又は医薬品の製造方法。
（６）上記抽出物を精製手段に供し、精製物を得る工程をさらに含むことを特徴とする、（５）記載の製造方法。
（７）上記精製手段がカラムクロマトグラフィーであることを特徴とする、（６）記載の製造方法。
（８）上記ビワ茶がねじめびわ茶であることを特徴とする（５）記載の製造方法。
（９）上記精製物がクロロゲン酸、クエルセチン３−サンブビオシド、メチルクロロゲン酸、ケンフェロール３−ラムノシド、クエルセチン３−ラムノシド、２α−ヒドロキシウルソール酸及びウルソール酸から成る群から選択される１以上の化合物を含まないことを特徴とする、（６）記載の製造方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る飲食品又は医薬品は、ビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物を有効成分として含有し、且つ抗高脂血症作用、高血圧抑制作用、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用及び抗酸化作用から成る群から選択される１以上の作用を有するものである。本発明に係る飲食品又は医薬品をヒト等の動物に摂取又は投与することにより、高脂血症や高血圧症を予防又は治療することができる。また、本発明に係る飲食品又は医薬品をヒト等の動物に摂取又は投与することにより、癌細胞の増殖を抑制し、癌細胞にアポトーシスを誘導せしめ、癌細胞に活性酸素種を産生せしめることができる。さらに、本発明に係る飲食品又は医薬品をヒト等の動物に摂取又は投与することにより、血糖値を低下させ、また活性酸素等を取り除くことができる。
ここで、抗高脂血症作用とは、血中のコレステロールやトリグリセリドを低下させることを意味する。また、高血圧抑制作用とは、血圧の上昇を抑えることを意味する。
癌細胞増殖抑制作用とは、癌細胞を死滅させ、その増殖を抑えることを意味する。また、癌細胞アポトーシス誘導作用とは、癌細胞にアポトーシスを誘導せしめ、癌細胞を死滅させることを意味する。さらに、活性酸素種産生作用とは、癌細胞中に活性酸素種を産生し、癌細胞を死滅させることを意味する。
また、高血糖降下作用とは、血糖値を低下させることを意味する。さらに、抗酸化作用とは、体内の活性酸素を取り除くことを意味する。
本発明においては、ビワ葉又はビワ茶を用いる。ビワ葉としては、新鮮葉又は乾燥葉をそのまま使用することができる。ビワ茶としては、いずれのビワ茶であってもよいが、例えばねじめびわ茶（商品名）が挙げられる。ねじめびわ茶は、トルマリン石による高温加熱により焦がしたもので、上述した特許文献１に記載の方法によって調製することができる。なお、ねじめびわ茶（根占枇杷茶）は、鹿児島県農業生産法人有限会社十津川農場から市販されている。
本発明に係る飲食品又は医薬品に使用する抽出物は、ビワ葉又はビワ茶を熱水抽出又は溶媒抽出に供することで得ることができる。例えば、ビワ葉又はビワ茶を、熱湯を用いた抽出に供し、これを１回又は数回（例えば３回）繰り返すことでビワ葉又はビワ茶抽出物を得ることができる。あるいは、例えば、ビワ葉又はビワ茶を水、低級アルコールやアセトンなどの有機溶媒を用いた抽出に供することで、ビワ葉又はビワ茶抽出物を得ることができる。なお、本発明においては、ビワ葉又はビワ茶抽出物とは、上記抽出方法で得られた抽出液もしくは各種溶媒抽出液、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥粉末を意味する。
また、本発明においては、上述したビワ葉又はビワ茶抽出物を濾過、遠心分離又は精製処理等の精製手段に供することで、当該抽出物から夾雑物を除去した精製物を用いることができる。精製手段としては、例えば、カラムクロマトグラフィー、順相又は逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過が挙げられるが、カラムクロマトグラフィーが特に好ましい。
例えば、ビワ葉又はビワ茶の水抽出溶液を直接、逆相用のゲル（例えば、ＭＣＩ ｇｅｌ ＣＨＰ−２０Ｐ（三菱化学）など）のオープンカラムクロマトグラフィーに付す。移動相にＡ液として水、Ｂ液としてエタノールを用い、Ａ液とＢ液との比率を１００：０、３０：７０、７０：３０と変えて、クロマトグラフィーを行う。最後にＣ液としてアセトンを用い、Ａ液とＣ液との比率を５０：５０にしてクロマトグラフィーを行う。Ａ液とＢ液との比率が７０：３０で溶出する粗製分画物並びにＡ液とＣ液との比率が５０：５０で溶出する粗製分画物には、強い高血糖降下作用が見られる。従って、これら粗製分画物は、ビワ葉又はビワ茶の精製物として好適に本発明に係る飲食品又は医薬品に使用することができる。
あるいは、８０％水性アセトンで抽出したビワ葉又はビワ茶の抽出溶液を減圧エバポレータにて溶媒を留去した後、残差を逆相用のゲル（例えば、ＭＣＩ ｇｅｌ ＣＨＰ−２ＯＰ（三菱化学）など）のオープンカラムクロマトグラフィーに付す。移動相にＡ液として水、Ｂ液としてメタノールを用い、Ａ液からＢ液へのリニアーグラジエントによってクロマトグラフィーを行う。最後にＣ液としてアセトンを用い、Ａ液とＣ液との比率を５０：５０にしてクロマトグラフィーを行う。この方法で溶出する粗製分画物には、強い抗酸化作用が見られる。従って、この粗製分画物は、ビワ葉又はビワ茶の精製物として好適に本発明に係る飲食品又は医薬品に使用することができる。なお、この粗製分画物には、クロロゲン酸、クエルセチン３−サンブビオシド、メチルクロロゲン酸、ケンフェロール３−ラムノシド、クエルセチン３−ラムノシド、２α−ヒドロキシウルソール酸及びウルソール酸のうち１以上の化合物が含まれない。従って、本発明に係る飲食品又は医薬品に使用するビワ葉又はビワ茶精製物には、これら化合物が含まれないことが好ましい。
以上のように説明したビワ葉又はビワ茶抽出物又は精製物を有効成分として用いることで、本発明に係る飲食品又は医薬品を製造することができる。
本発明の抽出物又は精製物の有効量を、錠剤、カプセル、顆粒、ドリンク、ペットボトルなどの任意の形態に添加又は封入するか、あるいは任意の食品に添加することで、本発明に係る飲食品を得ることができる。本発明に係る飲食品は、抗高脂血症作用、高血圧抑制作用、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用及び／又は抗酸化作用を有する飲食品、特に、健康補助食品又は特定保健用食品として使用することができる。好ましくは、錠剤、カプセル、顆粒、ドリンク、ペットボトルなどの形態の健康補助食品又は特定保健用食品とするのがよい。
飲食品には、例えば、菓子類、レトルト食品、ジュース類、お茶類、乳製品などが含まれるが、これらに限定されない。また、飲食品には、必要に応じて甘味剤、調味料、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤などを添加してもよいし、あるいはビタミン類、栄養剤、免疫増強剤（例えば、プロポリスやきのこ抽出物など）などを添加してもよい。
本発明に係る飲食品に対するビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物の添加量は、摂取する成人体重１ｋｇあたり０．１〜２００ｍｇに相当する範囲内の量又は１製品あたり例えば５０ｍｇ〜１ｇであるが、この範囲に限定されない。
一方、本発明に係る医薬品は、ビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物の有効量を含む。本発明に係る医薬品は、抗高脂血症用剤、高血圧抑制剤、癌細胞増殖抑制剤、癌細胞アポトーシス誘導剤、活性酸素種産生剤、高血糖降下剤又は抗酸化剤として使用することができる。
本発明に係る医薬品には、ビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物以外に、さらに製薬上許容可能な担体（賦形剤もしくは希釈剤）並びに結合剤、増量剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、懸濁化剤、保存剤、着色剤、風味剤及び甘味剤などから適宜選択される添加剤を含有させることができる。担体及び添加剤は、製剤化のために一般的に使用されるものを、本発明に係る医薬品の製造に使用することができる。例えば、結合剤の例としては、デンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどが挙げられる。増量剤の例としては、ラクトース、微結晶セルロースなどが挙げられる。滑沢剤の例としては、タルク、シリカ、ステアリン酸マグネシウムなどが挙げられる。崩壊剤の例としては、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなどが挙げられる。湿潤剤の例としては、ラウリル硫酸ナトリウムなどが挙げられる。乳化剤の例としては、セルロース誘導体、ソルビトールなどが挙げられる。また、保存剤の例としては、メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、ソルビン酸などが挙げられる。ただし、本発明に使用できる添加剤は、これら添加剤の例に限定されない。
本発明に係る医薬品は、例えば経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、腹腔内、経直腸内、皮下、筋肉内、舌下、経鼻腔内、経膣内など）用に製剤化され得る。製剤の形態としては、特に限定されないが、例えば溶液剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤、座剤、噴霧剤、制御放出剤、懸濁剤及びドリンク剤などが挙げられる。
本発明に係る医薬品に含まれるビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物の用量は、患者の年齢、体重、性別、状態、重篤度などの要因によって変化しうる。患者に投与されるビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物の１日用量は、例えば患者の体重１ｋｇあたり０．１〜２００ｍｇ、好ましくは１〜１００ｍｇの範囲であるが、この範囲に限定されない。必要に応じて、用量を数回、例えば２〜３回に分けて分割投与してもよい。また、本発明に係る医薬品は治療用途の同じ又は異なる他の抗高脂血症用剤、高血圧抑制剤、癌細胞増殖抑制剤、癌細胞アポトーシス誘導剤、活性酸素種産生剤、高血糖降下剤及び／又は抗酸化剤と併用して患者に投与することもできる。
本発明に係る飲食品又は医薬品は、例えば、以下のように薬理評価を行うことができる。
本発明に係る飲食品又は医薬品の抗高脂血症作用の薬理評価としては、例えばモデル動物に本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取させ、飼育中又は飼育後に、血清脂質分析又は臓器の脂肪組織重量測定を行う方法が挙げられる。本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取していない動物と比較して、本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取した動物において、血中の総コレステロール、ＨＤＬコレステロール及び／又はトリグリセリド量が有意に低下した場合には、本発明に係る飲食品又は医薬品が良好に抗高脂血症作用を有すると判断することができる。また同様に、臓器の脂肪組織重量が有意に低下した場合には、本発明に係る飲食品又は医薬品が良好に抗高脂血症作用を有すると判断することができる。
また、本発明に係る飲食品又は医薬品の高血圧抑制作用の薬理評価としては、例えば、ＳＨＲラット（高血圧自然発症ラット）の雄を用いる方法が挙げられる。すなわち、本発明に係る飲食品又は医薬品を当該ＳＨＲラットに給餌し、飼育終了後、各ラットの血圧を、無加温型カフ式血圧測定器（室町機械（株））などの血圧測定装置で測定し、本発明に係る飲食品又は医薬品を給餌していないラットと比較して、血圧が下がった場合には、本発明に係る飲食品又は医薬品が良好に高血圧抑制作用を有すると判断できる。
さらに、本発明に係る飲食品又は医薬品の癌細胞増殖抑制作用、癌細胞アポトーシス誘導作用及び活性酸素種産生作用の薬理評価としては、例えば、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）を用いる方法が挙げられる。すなわち、本発明に係る飲食品又は医薬品存在下でＨＬ−６０細胞を培養し、対照群（本発明に係る飲食品又は医薬品不在下）と比較して、その増殖が抑制された場合には、本発明に係る飲食品又は医薬品が良好に癌細胞増殖抑制作用を有すると判断できる。また、本発明に係る飲食品又は医薬品存在下でＨＬ−６０細胞を培養し、対照群（本発明に係る飲食品又は医薬品不在下）と比較して、その５０％生存率が抑制された場合には、本発明に係る飲食品又は医薬品が良好に癌細胞アポトーシス誘導作用を有すると判断できる。さらに、本発明に係る飲食品又は医薬品存在下でＨＬ−６０細胞を培養し、対照群（本発明に係る飲食品又は医薬品不在下）と比較して、細胞内の活性酸素が上昇した場合には、本発明に係る飲食品又は医薬品が良好に癌細胞に対する活性酸素種産生作用を有すると判断できる。
また、本発明に係る飲食品又は医薬品の高血糖降下作用の薬理評価としては、例えば、モデル動物（例えば、ＩＩ型糖尿病モデルマウスであるＫＫＡｙマウスなど）に本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取させ、飼育中又は飼育後に、血糖値を測定する方法が挙げられる。本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取していない動物と比較して、本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取した動物において、血糖値が有意に低下した場合には、本発明に係る飲食品又は医薬品が良好に高血糖降下作用を有すると判断することができる。同様に、モデル動物を用いたブドウ糖負荷試験において、本発明に係る飲食品又は医薬品を摂取した動物において、血糖値又はＨｂＡ１Ｃ値が有意に低下した場合には、本発明に係る飲食品又は医薬品が良好に高血糖降下作用を有すると判断することができる。
さらに、本発明に係る飲食品又は医薬品の抗酸化作用の薬理評価としては、例えば、Ｈａｒｗａｔ，Ｋ．Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓ．，３６：１７７−１８７，２００２に記載の方法が挙げられる。すなわち、本発明に係る飲食品又は医薬品にＤＰＰＨ（１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ）を加えて反応させ、吸光度を測定し、その吸光度の値からＴｒｏｌｏｘの吸光度標準曲線を用いてＴｒｏｌｏｘ濃度を換算する。その換算値より、Ｔｒｏｌｏｘのラジカル消去能標準曲線からラジカル消去率を算出する。本発明に係る飲食品又は医薬品のラジカル消去率が、例えば陽性対照であるビタミンＣ又はＥと同程度かそれ以上である場合に、本発明に係る飲食品又は医薬品が良好に抗酸化作用を有すると判断することができる。
焙煎ビワ葉や非焙煎ビワ葉には、抗高脂血症作用、高血圧抑制作用、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用又は抗酸化作用は全く認められない。一方、本発明においては、ビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物を用いることで、抗高脂血症作用、高血圧抑制作用、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用及び／又は抗酸化作用を有する飲食品又は医薬品を製造できる。これら飲食品又は医薬品は糖尿病、高脂血症、高血圧症、癌等の疾患の予防又は治療に有用である。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−１８７１３３号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。

図１は、実施例１において飼育期間中のコントロール群及びビワ茶群のラットの体重推移を調べた結果を示す。
図２は、実施例１においてコントロール群及びビワ茶群のラットの血中の総コレステロール量を調べた結果を示す。
図３は、実施例１においてコントロール群及びビワ茶群のラットの血中のＨＤＬコレステロール量を調べた結果を示す。
図４は、実施例１においてコントロール群及びビワ茶群のラットの血中のトリグリセリド量を調べた結果を示す。
図５は、実施例１において飼育終了後、コントロール群及びビワ茶群のラットの肝臓、副睾丸周辺及び腎臓周辺の脂肪組織の重量を測定した結果を示す。
図６は、実施例１において飼育期間中のコントロール群及びビワ茶群のマウスの体重推移を調べた結果を示す。
図７は、実施例１において飼育終了後、コントロール群及びビワ茶群のマウスの腎臓周辺及び副睾丸周辺の脂肪組織の重量を測定した結果を示す。
図８は、実施例２において飼育期間中のコントロール群及びビワ茶群のマウスの血糖値の推移を示す。
図９は、実施例２における飼育後のコントロール群及びビワ茶群のマウスの耐糖能試験の結果を示す。
図１０は、実施例２における耐糖能試験後のコントロール群及びビワ茶群のマウスの血中ＨｂＡ１Ｃ値の測定結果を示す。
図１１は、実施例３における乾燥粗製分画物の薄層クロマトグラフを示す。
図１２は、実施例３における飼育期間中のコントロール群及び各ビワ茶群のマウスの血糖値の推移を示す。
図１３は、実施例３において飼育後のコントロール群及び分画３と４を給餌したビワ茶群のマウスの耐糖能試験の結果を示す。
図１４は、実施例３において耐糖能試験後のコントロール群及び各ビワ茶群のマウスの血中ＨｂＡ１Ｃ値の測定結果を示す。
図１５は、実施例４における粗製分画物の薄層クロマトグラフを示す。
図１６は、実施例４において粗製分画物の抗酸化作用を調べた結果を示す。
図１７は、実施例５において、実施例３で調製した粗製分画物の抗酸化作用を調べた結果を示す。
図１８は、実施例５において、実施例３の分画３から更に得られた粗製分画物の抗酸化作用を調べた結果を示す。
図１９は、実施例６においてねじめびわ茶抽出物の高血圧抑制作用を調べた結果を示す。
図２０は、実施例８におけるアガロースゲル電気泳動写真であり、実施例３の粗製分画物のアポトーシス誘導の作用を調べた結果を示す。
図２１は、実施例８におけるアガロースゲル電気泳動写真であり、実施例３の分画３から更に得られた粗製分画物のアポトーシス誘導の作用を調べた結果を示す。
図２２は、実施例９において、実施例３の粗製分画物の癌細胞に対する活性酸素種産生の作用を調べた結果を示す。
図２３は、実施例９において、実施例３の分画３から更に得られた粗製分画物の癌細胞に対する活性酸素種産生の作用を調べた結果を示す。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されないものとする。
なお、下記の実施例における抗酸化作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った（Ｈａｒｗａｔ，Ｋ．Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓ．，３６：１７７−１８７，２００２）。
また、下記の実施例で使用するねじめびわ茶は、鹿児島県農業生産法人有限会社十津川農場から市販されているものである。
さらに、各実施例に伴う図中の結果は、各群の平均値又は平均値±標準偏差で示す。
［実施例１］ねじめびわ茶抽出物のダイエット効果
（１）ねじめびわ茶の抽出物の調製
市販のねじめびわ茶（５０ｇ）を熱湯（４００ｍｌ）で抽出した。これを３回繰り返した。得られた熱湯抽出液を凍結乾燥（Ｔｏｋｙｏ Ｒｉｋａｋｉｋａｉ Ｃｏ．，ＬＴＤ，Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｅｒ ＦＲ−１）に供し、乾燥粉末を得た。
用いたねじめびわ茶の総乾燥重量は３４６．２ｇであり、熱湯抽出液の総乾燥粉末量は５７．３７ｇであった。従って、ねじめびわ茶に対する熱湯抽出液の乾燥粉末含量は、１６．５７％であった。
（２）動物の準備
Ｗｉｓｔａｒ系ラット（日本ＳＬＣ社製）及びＫＫＡｙマウス（日本クレア社製）を用いた。飼養試験には、下記の表１に示す割合となるように各材料を計量したものを混合し、これを蒸留水にて混練した後、凍結乾燥機にて乾燥させたものをコントロール用餌（当該餌を給餌したラット又はマウスを本実施例では「コントロール群」という）として用いた。また、上記（１）で得られた熱湯抽出液の乾燥粉末を１％となるようにコントロール用餌に加え、これをねじめびわ茶群用餌（当該餌を給餌したラット又はマウスを本実施例では「ビワ茶群」という）として用いた。
（３）ラットの血清脂質の分析及び臓器重量の測定
Ｗｉｓｔａｒ系ラット（日本ＳＬＣ社製）を１２匹用いて実験した。これらラットをコントロール群（６匹）とビワ茶群（６匹）とに分け、コントロール群のラットにはコントロール用餌を自由摂取させた。また、ビワ茶群のラットにはねじめびわ茶群用餌を自由摂取させた。双方の群を、それぞれ１ヶ月間飼育した。
飼育期間中、３日おきにラットの体重測定を行った。また、ラットの給水には両群とも水道水を用い、飼育期間中は自由給水とした。
飼育終了後、各動物をネンブタールで麻酔し、心臓より採血を行い血清脂質の分析を行った。また、各群のラットの臓器を摘出し、その重量を測定した。
ラットの体重測定の結果を図１に示す。図１は、飼育期間中の両群のラットの体重推移を調べた結果である。図１中、黒塗りの丸がコントロール群のラットの結果であり、白抜きの丸がビワ茶群のラットの結果である。
図１に示すように、飼育期間中、両群のラットの体重は増加したが、３週目より両群間で徐々に体重差が現れ、ビワ茶群のラットの体重はコントロール群のラットの体重に比べて、その増加が抑制されることが分かる。
飼育終了後の血清脂質の分析結果を図２〜図４に示す。図２は、血中の総コレステロール量（ｍｇ／ｄｌ）を調べた結果である。図３は、血中のＨＤＬコレステロール量（ｍｇ／ｄｌ）を調べた結果である。また、図４は、血中のトリグセリド量（ｍｇ／ｄｌ）を調べた結果である。なお、図２〜４において、「コントロール」はコントロール群のラットの結果であり、「ビワ茶」はビワ茶群のラットの結果である。
図２及び３に示すように、総コレステロールとＨＤＬコレステロールの値は、コントロール群のラットと比較してビワ茶群のラットはやや低い値になることが分かる。トリグリセリドについて、図４に示すように、コントロール群のラットに比べ、ビワ茶群のラットは低い水準（図４中、＊はＰ＜０．０１であることを示す）で推移することが分かる。
さらに飼育後の臓器重量を調べた結果を図５に示す。図５は、飼育終了後、ラットの肝臓、副睾丸周辺及び腎臓周辺の脂肪組織の重量を測定した結果である。図５において、「コントロール」はコントロール群のラットの結果であり、「ビワ茶」はビワ茶群のラットの結果である。
図５に示すように、肝臓、副睾丸周辺および腎臓周辺の脂肪組織の重量を比較した結果、コントロール群のラットの重量に比べ、ビワ茶群のラットの重量のほうがより低くなることが分かる。特に、腎臓周辺の脂肪組織の重量については、ビワ茶群のラットの重量は有意に低い（図５中、＊はＰ＜０．０５であることを示す）ことが分かる。
（４）マウスの体重及び臓器重量の測定：
ＫＫＡｙマウス（日本クレア社製）を２０匹用いて実験した。これらマウスをコントロール群（１０匹）とビワ茶群（１０匹）とに分け、コントロール群のマウスにはコントロール用餌を自由摂取させた。また、ビワ茶群のマウスにはねじめびわ茶群用餌を自由摂取させた。双方の群を、それぞれ７週間飼育した。
飼育期間中、３日おきにマウスの体重測定を行った。また、マウスの給水には両群とも水道水を用い、飼育期間中は自由給水とした。
飼育終了後、各動物をネンブタールで麻酔し、各群のマウスの臓器を摘出し、その重量を測定した。
マウスの体重測定の結果を図６に示す。図６は、飼育期間中の両群のマウスの体重推移を調べた結果である。図６中、黒塗りの丸がコントロール群のマウスの結果であり、白抜きの丸がビワ茶群のマウスの結果である。なお、図６において、＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
図６に示すように、飼育期間中、両群のマウスの体重は増加したが、ビワ茶群のマウスの体重はコントロール群のマウスの体重に比べて、その増加が有意に（Ｐ＜０．０１）抑制されることが分かる。
飼育後の臓器重量を調べた結果を図７に示す。図７は、飼育終了後、マウスの腎臓周辺及び副睾丸周辺の脂肪組織の重量を測定した結果である。図７において、「コントロール」はコントロール群のマウスの結果であり、「ビワ茶」はビワ茶群のマウスの結果である。
図７に示すように、腎臓周辺及び副睾丸周辺の脂肪組織の重量を比較した結果、コントロール群のマウスの重量に比べ、ビワ茶群のマウスの重量のほうがより低くなることが分かる。特に、腎臓周辺の脂肪組織の重量については、ビワ茶群のマウスの重量は有意に低い（図７中、＊はＰ＜０．０５であることを示す）ことが分かる。
［実施例２］ねじめびわ茶抽出物の高血糖値抑制効果
（１）ねじめびわ茶の抽出物の調製
市販のねじめびわ茶（５０ｇ）を熱湯（４００ｍｌ）で抽出した。これを３回繰り返した。得られた熱湯抽出液を凍結乾燥（Ｔｏｋｙｏ Ｒｉｋａｋｉｋａｉ Ｃｏ．，ＬＴＤ，Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｅｒ ＦＲ−１）に供し、乾燥粉末を得た。
用いたねじめびわ茶の総乾燥重量は３００．０ｇであり、熱湯抽出液の総乾燥粉末量は５１．７３ｇであった。従って、ねじめびわ茶に対する熱湯抽出液の乾燥粉末含量は、１７．２４％であった。
（２）動物の準備
高血糖の（ＩＩ型糖尿病モデル）マウスとしてＫＫＡｙマウス（日本クレア社製）を用いた。飼養試験には上記の表１に示す割合となるように各材料を計量したものを混合し、これを蒸留水にて混練した後、凍結乾燥機にて乾燥させたものをコントロール用餌（当該餌を給餌したマウスを本実施例では「コントロール群」という）として用いた。また、上記（１）で得られた熱湯抽出液の乾燥粉末を１％となるようにコントロール用餌に加え、これをねじめびわ茶群用餌（当該餌を給餌したマウスを本実施例では「ビワ茶群」という）として用いた。
（３）ＩＩ型糖尿病モデルマウスの血糖値の測定
ＩＩ型糖尿病モデルマウスとしてＫＫＡｙマウス（日本クレア社製）を２０匹用いて実験した。マウスをコントロール群（１０匹）とビワ茶群（１０匹）とに分け、コントロール群のマウスにはコントロール用餌を自由摂取させた。また、ビワ茶群のマウスにはねじめびわ茶群用餌を自由摂取させた。双方の群をそれぞれ７週間飼育した。マウスの給水には両群とも水道水を用い、飼育期間中は自由給水とした。
飼育期間中、１週間おきにマウスの血糖値を測定した。血糖値の測定には酵素電極法を用いた。
飼育期間中の血糖値の推移を図８に示す。図８中、黒塗りの丸がコントロール群のマウスの結果であり、白抜きの丸がビワ茶群のマウスの結果である。
図８に示すように、血糖値は両群の動物とも徐々に上昇し、実験開始１週目より血糖値に差が現れることが分かる。すなわち、コントロール群のマウスに比べ、ビワ茶群のマウスは血糖値の上昇が抑えられたことが分かる。特に、３、５、６週目の血糖値については、コントロール群のマウスに比べ、ビワ茶群のマウスの血糖値は有意（図８中、＊はＰ＜０．０５であることを示す）に低くなることが分かる。
（４）ＩＩ型糖尿病モデルマウスのブドウ糖負荷試験
上記（３）での飼育終了後、各群のマウスを１４時間絶食させ、これにブドウ糖を投与した。ブドウ糖の投与量は、マウス体重×１／２００（ｍｌ）のブドウ糖４ｇ／１０ｍｌ（蒸留水）であった。この投与量をステンレス製ゾンデにて各マウスの胃に直接注入し、強制的に投与した。投与後、経時的に血糖値を測定した。
測定後、マウスをネンブタールで麻酔し、心臓より採血を行い、ＨｂＡ１Ｃの値を測定した。
飼育後の耐糖能試験の結果を図９に示す。図９中、黒塗りの丸がコントロール群のマウスの結果であり、白抜きの丸がビワ茶群のマウスの結果である。なお、図９中、＊はＰ＜０．０５であることを示す。
図９に示すように、血糖値はブドウ糖投与により、両群とも速やかな上昇を示し、１５分後にはおよそ４００ｍｇ／ｄｌの高い値となった。３０分後、コントロール群のマウスの血糖値はさらに上昇を続け、その後は減少することが分かる。これに対して、ビワ茶群のマウスの血糖値については、３０分後の値がコントロール群の値に比べて低く抑えられ（Ｐ＜０．０５水準で有意差あり）、その後はコントロール群の値と同様に血糖値は低下することが分かる。また、各測定時間におけるビワ茶群のマウスの血糖値は、コントロール群の血糖値に比べて、常により低い値をとって推移していくことが分かる。
さらに、耐糖能試験後の血中ＨｂＡ１Ｃ値の測定結果を図１０に示す。図１０において、「コントロール」はコントロール群のマウスの結果であり、「ビワ茶」はビワ茶群のマウスの結果である。
図１０に示すように、コントロール群のマウスの血中ＨｂＡ１Ｃ値に比べ、ビワ茶群のマウスの血中ＨｂＡ１Ｃ値が有意に（図１０中、＊＊はＰ＜０．０１であることを示す）低いことが分かる。
［実施例３］ねじめびわ茶の粗製分画物の血糖値上昇の抑制効果
（１）ねじめびわ茶の粗製分画物の調製
市販のねじめびわ茶（５０ｇ）を熱湯（４００ｍｌ）で抽出した。これを３回繰り返した。得られた熱湯抽出液を凍結乾燥（Ｔｏｋｙｏ Ｒｉｋａｋｉｋａｉ Ｃｏ．，ＬＴＤ，Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｅｒ ＦＲ−１）に供し、乾燥粉末を得た。なお、用いたねじめびわ茶の総乾燥重量は９５０．０ｇであった。
得られた熱湯抽出液を、冷後、順次、ＭＣＩ ｇｅｌ ＣＨＰ−２０Ｐのオープンカラムクロマトに付した。なお、ゲルの量は乾燥重量として、１ｋｇ前後量を使用することが好ましい。また、使用したガラスカラムのサイズは内径８ｃｍであった。本実施例では、ガラスカラムを使用したが、カラムの材質はガラス、アクリル材質などに限定されなくても良い。溶媒を、水（２Ｌ）、３０％エタノール水溶液（２Ｌ）、７０％エタノール水溶液（２Ｌ）及び水−アセトン（１：１の比率）（２Ｌ）をそれぞれ用いて溶出させ、４つの分画を得た。４つの乾燥粗製分画物の収量は、水（２Ｌ）で溶出した乾燥粗製分画物（以下、「分画１」という）が９８．０ｇ、３０％エタノール水溶液（２Ｌ）で溶出した乾燥粗製分画物（以下、「分画２」という）が４５．３ｇ、７０％エタノール水溶液（２Ｌ）で溶出した乾燥粗製分画物（以下、「分画３」という）が１８．３ｇ、水−アセトン（１：１の比率）（２Ｌ）で溶出した乾燥粗製分画物（以下、「分画４」という）が２．１ｇであった。
これら分画１〜４の薄層クロマトグラフ（Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、以下「ＴＬＣ」という）を図１１に示す。図１１中、１〜４の番号はそれぞれ分画１〜４の結果を示す。なお、ＴＬＣに用いた展開溶媒は、ベンゼン−ギ酸エチル−ギ酸の３種の溶媒を用い、その比率を３：６：１の溶液用量で混合したものを用いた。発色試薬は、塩化第二鉄（ＦｅＣｌ_３）を５％程度メタノールに溶解したものを用い、ＴＬＣへ直接噴霧することにより、化合物を発色検出した。
図１１に示すように、分画１及び２には、クロロゲン酸様の物質が、Ｒｆ値約０．１付近にあることが分かる。また、分画３及び４には、有機酸及びクロロゲン酸様の物質があまり含まれていないことが分かる。
（２）動物の準備
高血糖の（ＩＩ型糖尿病モデル）マウスとしてＫＫＡｙマウス（日本クレア社製）を用いた。飼養試験には、上記の表１に示す割合となるように各材料を計量したものを混合し、これを蒸留水にて混練した後、凍結乾燥機にて乾燥させたものをコントロール用餌（当該餌を給餌したマウスを本実施例では「コントロール群」という）として用いた。また、上記（１）で得られた分画１、分画２又は分画３と４をコントロール用餌に対して１％となるようにそれぞれ加え、ねじめびわ茶群用餌（当該餌をそれぞれ給餌したマウスを本実施例では合わせて「ビワ茶群」という）として用いた。
（３）ＩＩ型糖尿病モデルマウスの血糖値の測定
ＩＩ型糖尿病モデルＫＫＡｙマウス（日本クレア社製）を３２匹用いて実験した。マウスをコントロール群（８匹）、分画１を含有するねじめびわ茶群用餌を与えるビワ茶群（８匹）、分画２を含有するねじめびわ茶群用餌を与えるビワ茶群（８匹）、分画３と４を混合して含有するねじめびわ茶群用餌を与えるビワ茶群（８匹）、の４群に分け、コントロール群のマウスには１日１回、１．５ｇのコントロール用餌を給餌し、不足分はマウス用市販餌を飽食状態となるよう与えた。また、各ビワ茶群のマウスには１日１回、１．５ｇのコントロール用餌に１５ｍｇの各分画を含むねじめびわ茶群用餌を給餌し、不足分はマウス用市販餌を飽食状態となるよう与えた。各群をそれぞれ７週間飼育した。マウスの給水には各群とも水道水を用い、飼育期間中は自由給水とした。
飼育期間中、１週間おきにマウスの血糖値を測定した。血糖値の測定には酵素電極法を用いた。
飼育期間中の血糖値の推移を図１２に示す。図１２中、黒塗りの丸がコントロール群のマウスの結果であり、白抜きの四角が、分画１を含有するねじめびわ茶群用餌を給餌したビワ茶群のマウスの結果である。また、白抜きの三角が、分画２を含有するねじめびわ茶群用餌を給餌したビワ茶群のマウスの結果であり、白抜きの丸が、分画３と４を含有するねじめびわ茶群用餌を給餌したビワ茶群のマウスの結果である。
図１２に示すように、飼育期間中、血糖値はコントロール群及び各ビワ茶群のマウスの血糖値は上昇した。しかし、分画３と４を給餌したビワ茶群の血糖値は実験開始３週目より上昇が頭打ちとなり、コントロール群の血糖値に比べて低い値で推移することが分かる。
（４）ＩＩ型糖尿病モデルマウスのブドウ糖負荷試験
上記（３）での飼育終了後、各４群のマウスを１４時間絶食させ、これにブドウ糖を投与した。ブドウ糖の投与量は、マウス体重×１／２００（ｍｌ）のブドウ糖４ｇ／１０ｍｌ（蒸留水）であった。この投与量をステンレス製ゾンデにて各マウスの胃に直接注入し、強制的に投与した。投与後、経時的に血糖値を測定した。
測定後、マウスをネンブタールで麻酔し、心臓より採血を行い、ＨｂＡ１Ｃの値を測定した。
分画３と４を給餌したビワ茶群について、飼育終了後に耐糖能試験を行った結果を図１３に示す。図１３中、黒塗りの丸がコントロール群のマウスの結果であり、白抜きの丸が、分画３と４を含有するねじめびわ茶群用餌を給餌したビワ茶群のマウスの結果である。
図１３に示すように、分画３と４を給餌したビワ茶群の血糖値はブドウ糖投与により、コントロール群と同様に投与直後から速やかな上昇が認められ、１５分後にはおよそ５００ｍｇ／ｄｌと上昇した。３０分後には、コントロール群はさらに上昇を続け、その後、減少することが分かる。これに対し、分画３と４を給餌したビワ茶群では、３０分後既に血糖値の低下が始まり、その後、速やかに下降することが分かる。特に、３０、６０分後では有意に（図１３中、＊はＰ＜０．０５であることを示す）低いことが分かる。
さらに、耐糖能試験後の血中ＨｂＡ１Ｃ値の測定結果を図１４に示す。図１４において、「コントロール」はコントロール群のマウスの結果であり、「ビワ茶１」は、分画１を含有するねじめびわ茶群用餌を給餌したビワ茶群のマウスの結果である。また、「ビワ茶２」が、分画２を含有するねじめびわ茶群用餌を給餌したビワ茶群のマウスの結果であり、「ビワ茶（３＋４）」が、分画３と４を含有するねじめびわ茶群用餌を給餌したビワ茶群のマウスの結果である。
図１４に示すように、コントロール群のマウスの血中ＨｂＡ１Ｃ値に比べ、分画３と４を給餌したビワ茶群のマウスの血中ＨｂＡ１Ｃ値が有意に（図１４中、＊はＰ＜０．０５であることを示す）低いことが分かる。
［実施例４］ねじめびわ茶の粗製分画物の抗酸化作用の効果
（１）ねじめびわ茶の粗製分画物の調製
市販のねじめびわ茶（１２４７ｇ）を８０％水性アセトン（５０００ｍｌ）で抽出した。これを３回繰り返した。得られた８０％水性アセトン抽出液は、減圧下で溶媒を留去することで、シロップ状のエキス（４４８．２ｇ）を得た。得られたエキスの一部（２７８ｇ）を分取し、ＭＣＩ ｇｅｌ ＣＨＰ−２０Ｐのカラムクロマトに付した。なお、ゲルの量は乾燥重量として、１ｋｇ前後量を使用することが好ましい。また、使用したガラスカラムのサイズは内径８ｃｍであった。本実施例では、ガラスカラムを使用したが、カラムの材質はガラス、アクリル材質などに限定されなくても良い。移動相にＡ液として水、Ｂ液としてメタノールを用い、Ａ液からＢ液へのリニアーグラジエントによってクロマトグラフィーを行った。より詳しくは、Ａ液とＢ液とを１：０の比率（３００ｍｌ）及び９５：５の比率（３００ｍｌ）で溶出した分画溶液をまとめたものを粗製分画１とした。Ａ液とＢ液とを９：１の比率（３００ｍｌ）、８：２の比率（３００ｍｌ）及び７：３の比率（３００ｍｌ）で溶出した分画溶液をまとめたものを粗製分画２とした。Ａ液とＢ液とを６：４の比率（３００ｍｌ）で溶出した分画溶液を粗製分画３とした。Ａ液とＢ液とを５：５の比率（３００ｍｌ）で溶出した分画溶液を粗製分画４とした。Ａ液とＢ液とを４：６の比率（３００ｍｌ）で溶出した分画溶液を粗製分画５とした。Ａ液とＢ液とを３：７の比率（３００ｍｌ）で溶出した分画溶液を粗製分画６とした。Ａ液とＢ液とを２：８の比率（３００ｍｌ）で溶出した分画溶液を粗製分画７とした。Ａ液とＢ液とを１：９の比率（３００ｍｌ）で溶出した分画溶液を粗製分画８とした。Ａ液とＢ液とを０：１の比率（３００ｍｌ）で溶出した分画溶液を粗製分画９とした。最後にＣ液としてアセトンを用い、Ａ液とＣ液との比率を５０：５０（１Ｌ）にしてクロマトグラフィーを行った。なお、このＡ液とＣ液との比率を５０：５０（１Ｌ）にしてクロマトグラフィーを行い、得ることができる分画溶液は、上記の粗製分画９と混合した。この結果、粗製分画１〜９と称する９つの粗製分画物を得た。９つの粗製分画物の収量は、粗製分画１が１２．３ｇ、粗製分画２が１２．８ｇ、粗製分画３が０．４ｇ、粗製分画４が２．９ｇ、粗製分画５が８．３ｇ、粗製分画６が６．７ｇ、粗製分画７が１９．９ｇ、粗製分画８が５．０ｇ、粗製分画９が４．９ｇ、であった。
これら９つの粗製分画物のうち粗製分画２〜８のＴＬＣを図１５に示す。図１５中、２〜８の番号はそれぞれ粗製分画２〜８の結果を示す。なお、ＴＬＣに用いた展開溶媒は、ベンゼン−ギ酸エチル−ギ酸の３種の溶媒を用い、その比率を３：６：１の溶液用量で混合したものを用いた。発色試薬は、塩化第二鉄（ＦｅＣｌ_３）を５％程度メタノールに溶解したものを用い、ＴＬＣへ直接噴霧することにより、化合物を発色検出した。
図１５に示すように、緑色から青色に発色するものはフェノール性の物質であることが分かる。
（２）抗酸化作用の実験
抗酸化作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った（Ｈａｒｗａｔ，Ｋ．Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓ．，３６：１７７−１８７，２００２）。
サンプルは、上記（１）で得られた９つの粗製分画物をそれぞれ１０μｇ／ｍｌの濃度で調整したもの、コントロールとしてビワ茶の熱湯抽出物の乾燥粉末を１０μｇ／ｍｌの濃度で調整したもの、標準品として、ビタミンＣ（アスコルビン酸）を５μｇ／ｍｌの濃度で調整したもの、ビタミンＥを５μｇ／ｍｌの濃度で調整したものを用いた。
これらのサンプルを平底のプレート（９６ｗｅｌｌ）に加え、さらにＤＰＰＨ（１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ、マイクロモーラーの濃度で調整したもの）を１９０μｌ加え、１０秒間混合した後、遮光して３０分間放置した。この反応後、各ウエルの反応溶液を、４９０ｎｍの波長の吸光度を用いてマイクロプレートリーダーで測定し、その吸光度の値からＴｒｏｌｏｘの吸光度標準曲線を用いてＴｒｏｌｏｘ濃度を換算した。その換算値より、Ｔｒｏｌｏｘのラジカル消去能標準曲線からラジカル消去率を算出した。
抗酸化作用の実験結果を図１６に示す。図１６中、１〜９のサンプルナンバーは、それぞれの粗製分画１〜９に対応する。また、サンプルナンバー１０はビワ茶の熱湯抽出物の乾燥粉末である。ＶＣはビタミンＣであり、ＶＥはビタミンＥを示す。
図１６に示すように、粗製分画６、８及び９に強い抗酸化作用があることが分かる。その程度は、ビタミンＥと同程度かそれ以上であり、ビタミンＣの２分の１程度である。また、粗製分画６、８及び９の抗酸化作用は、ビワ茶の熱湯抽出物の乾燥粉末に比べ３倍程度強くなることが分かる。
［実施例５］ねじめびわ茶の粗製分画物の抗酸化作用の効果２
（１）実施例３で調製した分画１〜４の抗酸化作用の実験
抗酸化作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った（Ｈａｒｗａｔ，Ｋ．Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓ．，３６：１７７−１８７，２００２）。
サンプルは、実施例３で得られた４つの粗製分画物：分画１〜４をそれぞれ１０μｇ／ｍｌの濃度で調整したもの、コントロールとして実施例１で得られたねじめびわ茶熱湯抽出液の乾燥粉末を１０μｇ／ｍｌの濃度で調整したものを用いた。
これらのサンプルを平底のプレート（９６ｗｅｌｌ）に加え、さらにＤＰＰＨ（１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ、マイクロモーラーの濃度で調整したもの）を１９０μｌ加え、１０秒間混合した後、遮光して３０分間放置した。この反応後、各ウエルの反応溶液を、４９０ｎｍの波長の吸光度を用いてマイクロプレートリーダーで測定し、その吸光度の値からＴｒｏｌｏｘの吸光度標準曲線を用いてＴｒｏｌｏｘ濃度を換算した。その換算値より、Ｔｒｏｌｏｘのラジカル消去能標準曲線からラジカル消去率を算出した。
抗酸化作用の実験結果を図１７に示す。図１７中、縦軸はＤＰＰＨラジカル消去率を％として表示し、横軸の分画１〜分画４のサンプルは、実施例３で調製したそれぞれの分画１〜４に対応する。また、ビワ茶は実施例１で得られたねじめびわ茶熱湯抽出液の乾燥粉末である。
図１７に示すように、分画２、分画３及び分画４に強い抗酸化作用があることが分かる。その程度は、実施例１で得られたねじめびわ茶熱湯抽出液の効果より大きいことがわかる。また、分画３の抗酸化作用は、実施例１で得られたねじめびわ茶熱湯抽出液の乾燥粉末に比べ１．６倍程度強いことが分かる。
（２）ねじめびわ茶の粗製分画物の調製
実施例３によって得られた分画３の乾燥粉末５．０ｇを秤量し、これを適量の水に溶解した後、オープンカラムクロマトグラフィーに付した。オープンカラムクロマトグラフィーの条件は、固定相にクロマトレックスＯＤＳ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ、富士シリシア化学株式会社、Ｆｕｊｉ Ｓｉｌｙｓｉａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＬＴＤ．）を用い、移動層にＡ液として蒸留水（Ｈ_２Ｏ）、Ｂ液としてメタノール（ＭｅＯＨ）を用い、Ａ液からＢ液の含量を増やすことによって各種クロマトグラフィーを行った。具体的には、溶媒を、８０％Ｈ_２Ｏ−２０％ＭｅＯＨ（４００ｍｌ）、７０％Ｈ_２Ｏ−３０％ＭｅＯＨ（４００ｍｌ）、６０％Ｈ_２Ｏ−４０％ＭｅＯＨ（４００ｍｌ）、５０％Ｈ_２Ｏ−５０％ＭｅＯＨ（４００ｍｌ）、４０％Ｈ_２Ｏ−６０％ＭｅＯＨ（４００ｍｌ）、３０％Ｈ_２Ｏ−７０％ＭｅＯＨ（４００ｍｌ）、２０％Ｈ_２Ｏ−８０％ＭｅＯＨ（４００ｍｌ）、１０％Ｈ_２Ｏ−９０％ＭｅＯＨ（４００ｍｌ）、１００％ＭｅＯＨ（４００ｍｌ）で溶出させ、各４００ｍｌ溶出画分を分取し、３−１から３−９までの計９個の分画を得た。各分画の収量と収率は次のとおりであった。分画３−１（０．１９ｇ、３．９％）、分画３−２（０．２８ｇ、５．７％）、分画３−３（０．５７ｇ、１１．６％）、分画３−４（０．８５ｇ、１７．３％）、分画３−５（０．６４ｇ、１３．１％）、分画３−６（０．７９ｇ、１６．１％）、分画３−７（０．５４ｇ、１１．０％）、分画３−８（０．７８ｇ、１５．９％）、分画３−９（０．１７ｇ、３．５％）。
（３）実施例３の分画３から更に得られた分画３−１〜３−９の抗酸化作用の実験
抗酸化作用の実験は、以下の文献に記載の方法を用いて行った（Ｈａｒｗａｔ，Ｋ．Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓ．，３６：１７７−１８７，２００２）。
サンプルは、上記（２）で得た９つの粗製分画物：分画３−１〜３−９をそれぞれ１０μｇ／ｍｌの濃度で調整したものと、コントロールとして実施例３で得られた分画３の乾燥粉末を１０μｇ／ｍｌの濃度で調整したものを用いた。
これらのサンプルを平底のプレート（９６ｗｅｌｌ）に加え、さらにＤＰＰＨ（１，１−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｉｃｒｙｌｈｙｄｒａｚｙｌ、マイクロモーラーの濃度で調整したもの）を１９０μｌ加え、１０秒間混合した後、遮光して３０分間放置した。この反応後、各ウエルの反応溶液を、４９０ｎｍの波長の吸光度を用いてマイクロプレートリーダーで測定し、その吸光度の値からＴｒｏｌｏｘの吸光度標準曲線を用いてＴｒｏｌｏｘ濃度を換算した。その換算値より、Ｔｒｏｌｏｘのラジカル消去能標準曲線からラジカル消去率を算出した。
抗酸化作用の実験結果を図１８に示す。図１８中、縦軸にはＤＰＰＨラジカル消去率を％の値として表示し、横軸の３−１〜３−９のサンプルは、調製したそれぞれの分画３−１〜３−９に対応する。また、分画３は実施例３で調製した分画３である。
図１８に示すように、分画３−１、３−２及び３−４に強い抗酸化作用があることが分かる。その程度は、実施例３で調製した分画３の効果より大きいことがわかる。特に、分画３−１の抗酸化作用は、分画３の乾燥粉末に比べ１．３７倍程度強いことが分かる。
［実施例６］ねじめびわ茶抽出物の高血圧抑制の効果
（１）動物の準備
ＳＨＲラット（高血圧自然発症ラット）の雄（５週齢）を１２匹（日本ＳＬＣ社製）用いた。飼養試験には、下記の表２に示す割合となるように各材料を計量したものを混合し、これを蒸留水にて混練した後、凍結乾燥機にて乾燥させたものをコントロール用餌（当該餌を給餌したラットを本実施例では「コントロール群」という）として用いた。また、実施例１で得られた熱湯抽出液の乾燥粉末を０．２％となるようにコントロール用餌に加え、これをねじめびわ茶群用餌（当該餌を給餌したラットを本実施例では「ビワ茶群」という）として用いた。
（２）ラットの血圧の測定
ＳＨＲラット（高血圧自然発症ラット）雄（５週齢）（日本ＳＬＣ社製）を１２匹用いて、血圧を測定した。これらラットをコントロール群（６匹）とビワ茶群（６匹）とに分け、コントロール群のラットにはコントロール用餌を自由摂取させた。また、ビワ茶群のラットにはねじめびわ茶群用餌を自由摂取させた。双方の群を、それぞれ５０日間飼育した。
飼育期間中、飼料、飲水は自由摂食、自由飲水とした。また飼育室は２３℃とし、１２時間照明（７：００〜１９：００）とした。
飼育終了後、各動物の血圧を測定するために、血圧測定装置として無加温型カフ式血圧測定器（室町機械（株））を用いた。
ラットの血圧測定の結果を図１９に示す。図１９は、飼育期間中の両群のラットの血圧推移を調べた結果である。図１９中、白抜きの丸がコントロール群のラットの結果であり、黒塗りの丸がビワ茶群のラットの結果である。また、血圧（最大血圧）は一定時刻（午前中１０時頃）より測定した。測定は各個体について平均１０回繰り返し、その平均値で表記した。縦棒は標準誤差を示す。血圧測定の実験的な困難さとして、血圧の値は大変容易に変動し、ラットの精神状態、環境条件で極めて容易に変動することがあるので、実験はラットを出来るだけ落ち着かせ、静かな環境下で行った。
図１９に示すように、スタート時にはコントロール群とビワ茶群の最大血圧の平均値はともに１３４ｍｍＨｇ程度であった。コントロール群の血圧は飼育期間の経過に伴って１０日過ぎより上昇し、２０日以降はかなり高めに推移した。それに対し、ビワ茶群は２１日までほとんど上昇せず、特に２１日ではコントロール群と有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。その後は実験日数の進展に伴って上昇していくが、コントロール群に較べて１０ｍｍＨｇ以下低い血圧を示し、ねじめびわ茶抽出物の高血圧を抑制する効果が認められた。この結果、ねじめびわ茶抽出物は血圧の上昇を抑制することがわかる。
［実施例７］ねじめびわ茶の粗製分画物の癌細胞増殖抑制作用の効果
（１）実施例３で調製した分画１〜４の癌細胞増殖抑制効果
ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）の５０％生存率は以下の文献記載の方法で測定した（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：５５−６３，１９８３）。ＨＬ−６０細胞は、１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養した。実施例１で得たねじめびわ茶熱湯抽出液の乾燥粉末と、実施例３で調製した分画１〜４を、０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０μｇ／ｍｌの濃度で含むように、０．１％ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）溶液に溶解し、ＨＬ−６０細胞を６時間処理した。
処理後、細胞を遠心分離法により回収し、細胞溶解緩衝液により細胞膜を取り除き、ＲＮＡ分解酵素によりＲＮＡを分解し、さらにタンパク質分解酵素によりタンパク質を除去した。得られたＤＮＡ断片を２％アガロースゲル電気泳動法により分離し、染色後、ＵＶトランスイルミネーターにより検出し、ＤＮＡの断片率を算出した。４８時間後のＨＬ−６０細胞生存率に対する５０％抑制濃度（ＩＣ_５０）を算出した。その結果を表３に示した。なお、表３における抽出物は、実施例１で得たねじめびわ茶熱湯抽出液の乾燥粉末の結果である。
表３に示すように、ねじめびわ茶熱湯抽出液の乾燥粉末に対して、分画２〜４は比較的強いＨＬ−６０細胞増殖抑制効果を有した。中でも、分画４は最も強いＨＬ−６０細胞増殖抑制効果を有することが分かる。
（２）実施例５で調製した分画３−１〜３−９の癌細胞増殖抑制効果
上記（１）と同様の方法で、実施例５で調製した分画３−１〜３−９のＨＬ−６０細胞増殖抑制効果を検討した。
ＨＬ−６０細胞の５０％生存率は以下の文献記載の方法で測定した（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：５５−６３，１９８３）。ＨＬ−６０細胞は、１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養した。実施例１で得たねじめびわ茶熱湯抽出液の乾燥粉末と、実施例５で調製した分画３−１〜３−９を、０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０μｇ／ｍｌの濃度で含むように、０．１％ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）溶液に溶解し、ＨＬ−６０細胞を６時間処理した。
処理後、細胞を遠心分離法により回収し、細胞溶解緩衝液により細胞膜を取り除き、ＲＮＡ分解酵素によりＲＮＡを分解し、さらにタンパク質分解酵素によりタンパク質を除去した。得られたＤＮＡ断片を２％アガロースゲル電気泳動法により分離し、染色後、ＵＶトランスイルミネーターにより検出し、ＤＮＡの断片率を算出した。４８時間後のＨＬ−６０細胞生存率に対する５０％抑制濃度（ＩＣ_５０）を算出した。その結果を表４に示した。なお、ねじめびわ茶熱湯抽出液の乾燥粉末についての結果は、表３に示す結果である。
表４に示すように、分画３−１、３−２及び３−４は比較的強いＨＬ−６０細胞増殖抑制効果を有した。中でも、分画３−４は最も強いＨＬ−６０細胞増殖抑制効果を有することが分かる。
［実施例８］ねじめびわ茶の粗製分画物の癌細胞アポトーシス誘導作用の効果
（１）実施例３で調製した分画１〜４の癌細胞アポトーシス誘導効果
ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）のＤＮＡ断片化については以下の文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ，Ｄ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，２３：７０５−７１２，２００３）。実施例３で調製した各分画２、分画３及び分画４を２５０、５００、７５０μｇ／ｍｌの３つの濃度に調整し、ＨＬ−６０細胞を６時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を行い、その結果を図２０に示した。
図２０中、ＭはＤＮＡマーカー、Ｃは濃度０μｇ／ｍｌのコントロールを示す。この結果、分画３の５００μｇ／ｍｌと７５０μｇ／ｍｌの濃度にＤＮＡラダーが観察され、アポトーシスを誘導することが分かる。
（２）実施例５で調製した分画３−１〜３−９の癌細胞アポトーシス誘導効果
上記（１）と同様の方法で、実施例５で調製した分画３−１〜３−９の癌細胞アポトーシス誘導効果を検討した。
ＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化については以下の文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ，Ｄ．Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．，２３：７０５−７１２，２００３）。実施例５にて調製した各分画３−１〜３−９を５００μｇ／ｍｌの濃度に調整し、ＨＬ−６０細胞を６時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を行い、その結果を図２１に示した。
図２１中、ＭはＤＮＡマーカー、Ｃは濃度０μｇ／ｍｌのコントロールを示す。この結果、分画３−１、３−２、３−４及び３−６にＤＮＡラダーが観察され、アポトーシスを誘導することが分かる。特に、分画３−２と３−４には強いＤＮＡラダーが観察され、アポトーシスを強く誘導することが分かる。
［実施例９］ねじめびわ茶の粗製分画物の活性酸素種産生作用の効果
（１）実施例３で調製した分画１〜４の活性酸素種産生効果
ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）を２．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで継代した。これをＲＰＭＩ１６４０培地で４倍に希釈し、２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／４００μｌとした。必要量は１ｗｅｌｌあたり４００μｌ細胞液であり、従って、１ｐｌａｔｅあたり２０ｍｌの細胞液を準備した。プレートを軽く振って細胞の偏りを防ぎながら、これを、３７℃、５％ＣＯ_２気流下で２４時間培養した。
２４時間の培養後、この培養液に、実施例３で調製した分画１〜４を５００μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した。また、比較のために、実施例１で調製したねじめびわ茶熱湯抽出液を同様に添加した。これを３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで１５分間培養した。培養後、それぞれのｗｅｌｌにＭＴＴ液（５ｍＭ ＤＣＦＨ−ＤＡ：ＤＣＦＨ−ＤＡの１ｍｇをエタノール４１３μｌで溶かしたもの；ＤＣＦＡ−ＤＡ、ジクロロフルオレシン２酢酸）を１．６μｌずつ分注し、引き続き、３７℃、５％ＣＯ_２気流下のインキュベーターでさらに３０分間培養した。
培養後、各ｗｅｌｌをマイクロプレートリーダー（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ波長：４８５ｎｍ，ｅｍｉｓｓｉｏｎ波長：５３０ｎｍ）により測定し、コントロールと比較して、吸光度からＨＬ−６０細胞内で産生された活性酸素の量を算出した。その結果を図２２に示す。なお、コントロールはＨＬ−６０細胞のみで試験を行った場合の結果である。
図２２中、コントロールは対照を示す。また、図２２において、抽出物は、実施例１で調製したねじめびわ茶熱湯抽出液である。この結果、分画３はＨＬ−６０細胞内に対して強い活性酸素産生能を有することが分かる。
（２）実施例５で調製した分画３−１〜３−９の活性酸素種産生効果
上記（１）と同様の方法で、実施例５で調製した分画３−１〜３−９の活性酸素種産生効果を検討した。
ＨＬ−６０細胞を２．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌで継代した。これをＲＰＭＩ１６４０培地で４倍に希釈し、２．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／４００μｌとした。必要量は１ｗｅｌｌあたり４００μｌ細胞液であり、従って、１ｐｌａｔｅあたり２０ｍｌの細胞液を準備した。プレートを軽く振って細胞の偏りを防ぎながら、これを、３７℃、５％ＣＯ_２気流下で２４時間培養した。
２４時間の培養後、この培養液に、実施例５で調製した分画３−１〜３−９を５００μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した。これを３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーターで１５分間培養した。培養後、それぞれのｗｅｌｌにＭＴＴ液（５ｍＭ ＤＣＦＨ−ＤＡ：ＤＣＦＨ−ＤＡの１ｍｇをエタノール４１３μｌで溶かしたもの；ＤＣＦＡ−ＤＡ、ジクロロフルオレシン２酢酸）を１．６μｌずつ分注し、引き続き、３７℃、５％ＣＯ_２気流下のインキュベーターでさらに３０分間培養した。
培養後、各ｗｅｌｌをマイクロプレートリーダー（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ波長：４８５ｎｍ，ｅｍｉｓｓｉｏｎ波長：５３０ｎｍ）により測定し、コントロールと比較して、吸光度からＨＬ−６０細胞内で産生された活性酸素の量を算出した。その結果を図２３に示す。なお、コントロールはＨＬ−６０細胞のみで試験を行った場合の結果である。
図２３中、コントロールは対照を示す。この結果、分画３−１、３−２、３−３及び３−５がコントロールより強い活性酸素産生能を有することが分かる。特に、分画３−１はＨＬ−６０細胞内に対してコントロールと比較して約２．６倍程度強い活性酸素産生能を有することが分かる。

本発明によれば、抗高脂血症作用、高血圧抑制作用、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用及び／又は抗酸化作用を有し、ビワ葉又はビワ茶の抽出物又は精製物を含有する飲食品又は医薬品が提供される。本発明に係る飲食品（特に、健康補助食品もしくは特定保健用食品）又は医薬品は、抗高脂血症作用、高血圧抑制作用、癌細胞増殖抑制作用、癌細胞アポトーシス誘導作用、活性酸素種産生作用、高血糖降下作用及び／又は抗酸化作用を有することから、抗高脂血症用剤、高血圧抑制剤、癌細胞増殖抑制剤、癌細胞アポトーシス誘導剤、活性酸素種産生剤、高血糖降下剤、抗酸化剤として使用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (5)

1. (a) ねじめびわ茶を熱水抽出に供し、抽出物を得る工程であって、該抽出物が濃縮物又は乾燥粉末である、前記工程と、
   (b) 工程(a)の熱水抽出物をカラムクロマトグラフィーに供し、30％エタノール水溶液、70％エタノール水溶液又は1：1の比率で水とアセトンとを含有する混合液を用いた抽出により分画物を得る工程と、
   を含む、癌細胞増殖抑制剤又は癌細胞アポトーシス誘導剤の製造方法。
2. (a) ねじめびわ茶を熱水抽出に供し、抽出物を得る工程であって、該抽出物が濃縮物又は乾燥粉末である、前記工程と、
   (b) 工程(a)の熱水抽出物をカラムクロマトグラフィーに供し、70％エタノール水溶液を用いた抽出により分画物を得る工程と、
   (c) 工程(b)の分画物をカラムクロマトグラフィーに供し、80％：20％、70％：30％又は50％：50％の割合で水とメタノールとを含有する混合液を用いた抽出により分画物を得る工程と、
   を含む、癌細胞増殖抑制剤又は癌細胞アポトーシス誘導剤の製造方法。
3. 分画物がクロロゲン酸、クエルセチン3-サンブビオシド、メチルクロロゲン酸、ケンフェロール3-ラムノシド、クエルセチン3-ラムノシド、2α-ヒドロキシウルソール酸及びウルソール酸から成る群から選択される1以上の化合物を含まないことを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により得られた分画物を有効成分として含有する癌細胞増殖抑制剤又は癌細胞アポトーシス誘導剤。
5. 癌細胞がヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞であることを特徴とする、請求項４記載の癌細胞増殖抑制剤又は癌細胞アポトーシス誘導剤。