KR101349578B1

KR101349578B1 - 식용 꾀꼬리버섯에서 분리된 신규 아세틸렌산 유도체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101349578B1
Application number: KR1020110122093A
Authority: KR
Inventors: 이동호; 이성준; 홍성수
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2011-11-22
Filing date: 2011-11-22
Publication date: 2014-01-14
Also published as: KR20130056467A

Abstract

본 발명은 식용 꾀꼬리버섯에서 분리된 신규 아세틸렌산 유도체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 꾀꼬리버섯에서 분리된 천연물질인 신규한 아세틸렌산 유도체는 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor) 감마의 작동체로 작용하여 부작용을 최소화하면서 당뇨병 또는 염증성 질환의 예방 및 치료 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

식용 꾀꼬리버섯에서 분리된 신규 아세틸렌산 유도체 및 이의 용도{New acetylenic acid analogue from the Edible Mushroom Chanterelle (Cantharellus cibarius) and its use}

본 발명은 식용 꾀꼬리버섯에서 분리된 신규 아세틸렌산 유도체 및 이의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptor) 감마의 작동체로 작용하여 당뇨병 또는 염증성 질환의 예방 내지 치료 등에 유용하게 사용될 수 있는 식용 꾀꼬리버섯에서 분리된 신규 아세틸렌산 유도체 및 이의 용도에 관한 것이다.

퍼옥시좀 증식인자-활성화 수용체(Peroxisome proliferator-activated receptors : 이하 "PPAR"이라 칭함)는 리간드-활성화 전사 인자 중 중추신경계와 대사 과정, 세포 분화, 염증 반응, 면역 반응을 조절하는데 있어서 핵심적인 역할을 하는 핵 수용체 상위족(neclear receptor superfamily)에 속한다. PPAR들이 리간드에 결합하면 핵에서 9-시스 레티노인산 수용체(RXRs)와 이형이중체를 형성한다. 이들 이형이중체는 타깃 유전자와 프로모터에 있는 퍼옥시좀-증식인자 반응 요소(Peroxisome proliferator-response elements: PPRE)에 결합하여, 이들 유전자의 전사 및 발현을 조절한다. 총 3종의 PPAR 아이소형(isoform)인 알파(α), 델타(δ), 및 감마(γ)가 동정 되었다.

PPAR들은 지질(lipid)과 지질 단백질(lipoprotein)의 대사, 글루코오스 항산성(glucose homeostasis), 및 세포 분화의 조절자로 기능 할 뿐 아니라 염증 반응 조절에도 관여하는 것으로 보고되었다(Issemann and Green, Nature, 347:645-650, 1990; Daynes and Jones, Nat rev Immunol., 2:748-859, 2002).

수용체와 결합하여 생리적인 결과를 야기하는 리간드를 작동체(agonist)라 한다. PPAR 감마 작동체가 여러 종류의 질병에 대하여 임상적 용도의 가능성이 있다는 증거가 보고되었다. PPAR 감마는 염증반응을 조절하고, PAPR 감마 작동체는 사이토카인, 메탈로프로테아제 및 급성기 반응 유전자 같은 전염증 유전자의 발현을 억제함으로써 항염증 효과를 발휘하는 것으로 밝혀졌다(Delerive et al., H. Endocrinol., 169(3):453-459, 2001; Gerlman et al., Cell. Mol. Life. Sci., 55:932-943, 1999). 이와 같이 PPAR 감마 작동체는 제 2형 당뇨병, 염증성 만성질환 및 암 치료제로서 이용 가능성 있음이 보고되었다(Murphy and Holder, Trends Pharmacol. Sci., 21:469-474, 2000).

PPAR 감마는 티아졸리딘디온(thiazolidinedions), 프로스타글란딘 J2 및 PPAR 이의 유사체 같은 화합물과 결합함으로써 활성화된다. 리간드 결합에 의한 PPAR 감마 활성화는 글루코오스 및 지질 대사에 중요한 유전자 발현 변화의 원인이 된다 (Olefsky and Saltiel, Trends Endocrinol Metab., 11(9):362-368, 2000; Kooners and Vrana, Physiol. Res., 47:215-225, 1998). 이러한 변화를 바탕으로, 티아졸리딘디온, 즉 글리타존(glitazones)은 인슐린 작용 증진제(Insulin senitizers)로서 작용하며, 이들은 제 2형 당뇨병의 치료에 성공적으로 사용되어 왔다. 그러나, 글리타존 약물은 말초 부종을 동반하는 체액저류, 심한 경우 심부전증, 체중 증가를 유발하고, 특히 트로글리타존은 치명적인 특발성 간독성으로 인해 사망한 사례가 있는 등 문제점이 있었다.

한편, 당뇨병(diabete)이란 탄수화물의 신진대사 장애로 혈당 수치가 높고, 소변으로 포도당이 배설되는 상태로 인슐린의 생산, 분비, 또는 이용의 이상으로 발생하는 질병으로, 당뇨병 환자는 췌장이 인슐린을 거의 생산하지 못하거나 세포가 인슐린에 반응하지 않아 포도당이 세포로 들어가지 못하고 혈액에 남아 소변으로 배출된다. 당뇨병 발병률은 1970년 대한민국에서 약 1% 미만으로 추정되었으나, 2001년에는 인구 1,000명당 25.65명으로 증가하였다. 당뇨병은 제 1형 당뇨병과 제 2형 당뇨병으로 분류된다. 제 1형 당뇨병은 유전적 요인, 바이러스 감염, 환경 독성 또는 영아기에 모유 대신 우유 섭취에 의한 환경적 요인 및 자가면역 같은 원인에 의해 발병한다. 제 1형 당뇨병은 소아 당뇨병이라고 불리며 외부로부터의 감염과 싸워야 할 우리 몸의 면역체계가 췌장에서 인슐린을 분비하는 베타세포를 공격하여 파괴시켜 인슐린이 전혀 분비되지 않거나 분비가 저하되며, 주로 모든 연령에서 발병한다. 제 2형 당뇨병은 유전적 요인, 운동 부족, 비만, 스트레스, 약물 남용, 고혈압, 및 고콜레스테롤혈증 같은 환경적 요인에 의해 발병한다. 제 2형 당뇨병은 인슐린 비의존성 당뇨병이라고도 하며 전체 당뇨병의 90%를 차지하는데 주로 40세 이후에 나타나며 대개 환자가 비만이다. 제 2형 당뇨병의 경우 췌장이 인슐린을 분비하지만 몸에서 분비한 인슐린을 효과적으로 활용하지 못하여 혈당이 높아지게 된다.

꾀꼬리버섯은 전세계에 분포되어 있고 가을에서 초봄 사이에 결실을 맺는 식용 버섯이다. 꾀꼬리버섯의 자실체는 항산화효과를 통해 다양한 질병으로부터 보호하는 효과를 지니고 있다. 꾀꼬리버섯으로부터 분리된 몇 가지의 지방산, 페놀성 화합물, 유기산, 카로테노이드, 스테로이드들이 항산화효과와 항 염증효과를 나타냈다. 그러나, PPAR-γ의 전사활동에 관련된 것은 아직까지 보고된 바가 없다.

본 발명의 배경이 되는 기술로서 대한민국 특허공보 제10-0702185호 (2006.11.27)에 PPAR 감마 작동체로 작용하는 페니실리움속 진균에서 분리된 소비실리노이드 폴리케타이드에 관해 기재되어 있고, 대한민국 특허공보 제10-0998570호(2010.12.07)에 꾀꼬리큰버섯(Hygrophoropsis aurantiaca) 균주 추출물 및 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 노화방지용 조성물에 대해 기재되어 있다. 그러나, 상기 문헌들에는 식용 꾀꼬리버섯(Cantharellus cibarius) 추출물의 PPAR-γ의 전사활동에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다.

대한민국 특허공보 제10-0702185호 (2006.11.27) 대한민국 특허공보 제10-0998570호(2010.12.07)

본 발명자들은 천연물로부터 분리된 생물학적 활성제들에 대한 연구 결과 꾀꼬리버섯의 추출물이 PPAR-γ의 리포터 유전자 검정에서 중요한 활성을 갖는다는 것을 확인하였다. 나아가 본 발명자들은 상기 PPAR-γ의 리포터 유전자 검정 과정 중 활성을 보인 꾀꼬리버섯의 추출물에서 새로운 아세틸렌산인 (10E, 14Z)-9-oxooctadeca-10,14-dien-12-ynoic acid와 이미 알려진 (10E, 14Z)-9-hydroxyoctadeca-10,14-dien-12-ynoic acid를 분리했고, 화합물들의 분리, 구조 동정, 그리고 생물학적 활성을 밝혀 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 PPAR-γ 작동체로 작용하는 부작용이 적은 꾀꼬리버섯 추출물 및 꾀꼬리버섯 추출물에서 분리된 신규 아세틸렌산 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 유도체의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 꾀꼬리버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아세틸렌산 유도체를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 메탄올로 꾀꼬리버섯 추출물을 추출하는 제1단계; 상기 제1단계에서 추출된 추출물을 에틸아세테이트(ethylacetate:EtOAc)와 헥산(hexane)으로 분획하는 제2단계; 상기 제2단계에서 상기 에틸아세테이트에 용해된 분획물을 클로로포름과 메탄올(CHCl₃-MeOH)의 혼합용매를 사용하여 농도구배 실리카 젤 크로마토그래피(gel chromatography)를 수행하여 분획물을 수득하는 제3단계; 상기 제3단계에서 수득된 분획물을 아세토니트릴과 물(MeCN-H₂0)을 사용하여 역상(Reverse Phase, RP) 컬럼을 이용하여 분획물을 수득하는 제4단계; 및 상기 제4단계에서 수득된 분획물을 클로로포름과 아세톤(CHCl₃-acetone)의 혼합용매를 사용하여 크로마토그래피를 수행하여 화학식 1의 아세틸렌산 유도체를 수득하는 제5단계를 포함하는 상기 아세틸렌산 유도체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 아세틸렌산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 아세틸렌산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 PPAR-γ의 리포터 유전자 검정 과정 중 활성을 보인 꾀꼬리버섯의 추출물에서 새로운 아세틸렌산인 (10E, 14Z)-9-oxooctadeca-10,14-dien-12-ynoic acid(화학식 1)와 이미 알려진 (10E, 14Z)-9-hydroxyoctadeca-10,14-dien-12-ynoic acid(화학식 2)를 분리했고, 화합물들의 분리, 구조 동정, 그리고 생물학적 활성을 확인한 결과 화학식 1의 화합물은 트로글리타존의 효과와 비견될 정도의 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 꾀꼬리버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물의 유효 성분인 꾀꼬리버섯 추출물을 제조하기 위한 추출 용매로는 천연물 추출에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있는데, 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 메탄올이다.

또한, 본 발명은 꾀꼬리버섯 추출물로부터 분리한 상기 화학식 1로 표시되는 아세틸렌산 유도체를 제공한다.

상기 화학식 1의 아세틸렌산 유도체는 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 염, 수화물 및 용해화물을 포함한다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 바람직하게는 꾀꼬리버섯 균주로부터 추출 및 정제하여 얻을 수 있고, 유기합성을 통하여 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 신규 아세틸렌산 유도체의 분리 및 정제방법은 다음과 같다.

메탄올로 꾀꼬리버섯 추출물을 추출하는 제1단계; 상기 제1단계에서 추출된 추출물을 에틸아세테이트(ethylacetate:EtOAc)와 헥산(hexane)으로 분획하는 제2단계; 상기 제2단계에서 상기 에틸아세테이트에 용해된 분획물을 클로로포름과 메탄올(CHCl₃-MeOH)의 혼합용매를 사용하여 농도구배 실리카 젤 크로마토그래피(gel chromatography)를 수행하여 분획물을 수득하는 제3단계; 상기 제3단계에서 수득된 분획물을 아세토니트릴과 물(MeCN-H₂0)을 사용하여 역상(Reverse Phase, RP) 컬럼을 이용하여 분획물을 수득하는 제4단계; 및 상기 제4단계에서 수득된 분획물을 클로로포름과 아세톤(CHCl₃-acetone)의 혼합용매를 사용하여 크로마토그래피를 수행하여 화학식 1의 아세틸렌산 유도체를 수득하는 제5단계를 포함한다.

본 발명에 따른 신규 아세틸렌산 유도체의 제조방법의 일 실시예는 다음과 같다. 꾀꼬리버섯의 건재를 실내 온도에서 메탄올과 함께 3회 추출한다. 진공 속에서 용매를 제거한 결과 2kg의 메탄올 추출물을 얻는다. 메탄올 추출물은 증류수 속에서 현탁 상태이며 이를 에틸아세테이트(ethylacetate:EtOAc)와 헥산(hexane)을 이용해 성공적으로 분획한다. EtOAc에 용해된 층(30g)은 CHCl₃-MeOH(1:0, 80:1, 50:1, 30:1, 17:1, 10:1, 7:1, 3:1, gradient)을 이동상으로 사용하여 실리카 젤 크로마토그래피(gel chromatography)를 수행하였으며, 10개의 분획을 얻는다. 얻어진 분획 중 분획 5(2.3g)는 MeCN-H₂0(50:50 - 100:0, gradient)를 이동상으로 사용하여 RP 컬럼을 통과시켜 13개의 분획을 얻는다. 얻어진 분획 중 분획 7을 CHCl₃-acetone(1:0, 80:1, 50:1,30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2:1, gradient)를 이동상으로 사용하여 화합물 1(10.4mg)과 화합물 2(33.5mg)를 분리한다.

본 발명의 상기 화합물 1은 무색의 오일형태이며 음성 HRESIMS (m/z 289.1952 [M - H]^-; C₁₈H₂₅O₃, 289.1960)의 분자 화학식량에 따라 분자 화학식은 C₁₈H₂₆O₃임을 알 수 있다. ¹³C-NMR과 HSQC NMR 스펙트럼으로 9개의 포화 메틸렌 탄소, 한 개의 1차 메틸기, 4개의 올레피닉 탄소, 한 개의 아세틸렌기, 한 개의 카르복실기, 그리고 한 개의 케톤기의 존재를 규명했다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서 δ_C 178.17의 카르보닐 탄소 신호와 δ_H 1.34에서 넓은 메틸렌 신호의 존재는 화합물 1이 지방산임을 나타낸다. 아세틸렌기의 존재는 2개의 4차 탄소 신호인 δ_C 96.4와 δ_C 91.0 에서 추론했다. C-18에서 C-14까지의 연결성을 확립하기 위해 ¹H-¹H COSY와 HMBC NMR 스펙트럼을 이용했다. HMBC NMR 스펙트럼에서 H-10(δ_H 6.49)과 C-12(δ_C 91.0)는 상호 연관성을 지니며 또한 C-11(δ_C 123.3), C-14(δ_C 108.7) 신호가 고자장으로 이동한 것은 한 개의 아세틸렌기가 2개의 이중 결합 사이에 위치하고 있음을 나타낸다. 케톤기의 위치는 HMBC NMR 스펙트럼에서 H-8(δ_H 2.55)과 H-10(δ_H 6.49)이 C-11(δ_C 199.3)와 함께 상호 연관성을 지니는 것을 통해 추론했다. 이들 상호 연관성은 케톤기가 C-9에 위치함을 분명하게 보여준다. 게다가 ¹H-¹H COSY NMR 스펙트럼을 통해 H-2/H-3, H-3/H-4의 상호 연관성을 찾았다. 우리는 2개의 이중 결합인 C-10/C-11와 C-14/C-15의 결합상수가 16.0 Hz와 11.0 Hz임을 통해서 이 화합물이 E 와 Z 기하학적 구조를 지니는 것을 알아냈다. 이 결과들에 의해서 새로운 아세틸렌산인 (10E, 14Z)-9-oxooctadeca-10,14-dien-12-ynonic acid의 구조를 규명했다.

본 발명은 상기 꾀꼬리버섯 추출물 또는 이로부터 분리한 상기 화학식 1의 신규 아세틸렌산 유도체를 유효성분으로 함유하는 PPAR 감마 작동체를 제공한다.

PPAR-γ 발현벡터와 PPRE 주도의 발광효소 보고유전자를 형질 주입시킨 CHO 세포에서 화합물 1과 화합물 2의 PPAR 전사 활성능력을 조사했다. 화합물 1과 2는 20 μg/mL의 농도에서 PPAR-α 또는 PPAR-δ을 활성화하지 못했다. 그러나 화합물 2의 EC₅₀ 값이 20 μg/mL를 초과하며 활성을 나타내지 못하는 동안 새로운 아세틸렌산(화합물 1)은 EC₅₀ 값이 1.88 μM로 PPAR-γ를 선택적으로 활성화시켰다. PPAR-γ를 양성 조절하는 것으로 이미 알려져 있는 PPAR-γ의 작동체인 트로글리타존(troglitazone)을 같은 실험 조건 아래에서 활성을 조사한 결과 EC₅₀ 값은 0.44 μM였다.

다음으로, 양적 실시간 PCR를 실시하여 화합물 1이 HepG2 간세포에서 PPAR-γ의 타깃 유전자 전사에 미치는 효과에 대해서 분석했다. PPAR-γ 발현은 2.43배만큼 상향 조절되는 것을 보였다. 화합물 1이 SCD-1의 발현에 영향을 주지는 못하지만 이 화합물은 2개의 글루코오스생성 유전자인 G6Pase와 PEPCK의 발현을 감소시켰다. 이것은 트로글리타존의 효과와 비견될 정도의 활성을 나타낸다. 이 결과들은 PPAR-γ 전사활성을 강하게 가진 아세틸렌산을 포함하고 있는 꾀꼬리버섯이 당뇨병 또는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다는 것을 보여준다(도 3 참조).

나아가 본 발명은 상기 꾀꼬리버섯 추출물, 이로부터 분리한 상기 화학식 1의 신규 아세틸렌산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 꾀꼬리버섯 추출물, 이로부터 분리한 상기 화학식 1의 신규 아세틸렌산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상술한 바와 같이, 꾀꼬리버섯 추출물 또는 이로부터 분리한 상기 화학식 1의 신규 아세틸렌산 유도체는 PPAR 감마 작동체로 작용하므로, 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물, 또는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

상기의 화학식 1의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식의 화합물에 존재할 수 있는 히드록시기의 염을 포함하며, 히드록시기의 염으로는 리튬, 나트륨, 칼륨 등의 알카리 금속류염, 마그네슘, 칼슘 등의 알카리 토금속류염을 들 수 있다. 바람직하게는 생리학적으로 허용 가능한 나트륨, 칼륨, 칼슘과의 염 등을 들 수 있으며, 이들 염들은 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화학물 1은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 무독성염 및 용매화물로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

본 발명의 아세틸렌산 유도체의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 아세틸렌산 유도체에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트 (토실레이트) 염이 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 바람직하게는 조성물 총중량에 대하여 상기 아세틸렌산 유도체를 0.0001 내지 90 중량%로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에서, 바람직하게는 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 주사제, 크림, 젤, 패취, 분무제 또는 연고제 제형 제형을 가질 수 있다. 본 발명의 아세틸렌산 유도체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌[Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company,Easton PA] 에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 하거나 경구투여할 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합물은 1일 0.0001 내지 l00 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상술한 바와 같이 구성된 본 발명에 따르면, 본 발명에 의한 꾀꼬리버섯 추출물 및 이로부터 분리한 신규한 아세틸렌산 유도체는 PPAR 감마 작동체로 작용하고, 천연물 추출물 성분으로서 상대적으로 부작용 및 독성 발현율이 낮아 생체 친화적으로 당뇨병 또는 염증성 질환 등을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.

도 1은 본 발명에 의한 화합물 1 및 2의 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는 화합물 1의 선택된 HMBC (→) 및 COSY (-) correlation을 나타내는 도면이다.
도 3은 HepG2 hepatocytes에서 PPAR-γ 타겟 유전자의 발현을 나타내는 도면이다. 세포는 트로글리타존(10μM) 또는 다양한 농도(μM)의 화합물 1로 각각 처리되었고 유전자의 발현이 실시간 PCR로 분석되었다(NC: nontreated control; PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxylkinase; SCD-1: stearoryl CoA desaturase; G6Pase: glucose-6 phosphatase.*, P<0.05 compared with NC).

이하, 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 꾀꼬리버섯 추출물로부터 아세틸렌산 유도체 분리

꾀꼬리버섯은 중국 청두의 산림 야생 버섯 회사로부터 구입했고 발명자 중 한명인 H. Z. Jin에 의해 확인했다. 대조 표본은 대한민국 서울 고려대학교 생명공학과에 보관되고 있다.

꾀꼬리버섯의 건재를 실내 온도에서 메탄올과 함께 3회 추출했다. 진공 속에서 용매를 제거한 결과 2kg의 메탄올 추출물을 얻었다. 메탄올 추출물은 증류수 속에서 현탁 상태이며 이를 에틸아세테이트(ethylacetate:EtOAc)와 헥산(hexane)을 이용해 성공적으로 분획하였다. EtOAc에 용해된 층(30g)은 CHCl₃-MeOH(1:0, 80:1, 50:1, 30:1, 17:1, 10:1, 7:1, 3:1, gradient)을 이동상으로 사용하여 실리카 젤 크로마토그래피(gel chromatography)를 수행하였으며, 10개의 분획을 얻었다. 얻어진 분획 중 분획 5(2.3g)는 MeCN-H₂0(50:50 - 100:0, gradient)를 이동상으로 사용하여 RP 컬럼을 통과시켜 13개의 분획을 얻었다. 얻어진 분획 중 분획 7을 CHCl₃-acetone(1:0, 80:1, 50:1,30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2:1, gradient)를 이동상으로 사용하여 화합물 1(10.4mg)과 화합물 2(33.5mg)를 분리했다.

실시예 2. 화합물의 구조 분석

상기 실시예 1에서 얻은 화합물 1 및 2의 구조를 분석하기 위하여 하기와 같은 분석을 실시하였다. NMR 스펙트럼은 Varian 500 MHz NMR spectrometer를 이용하여 내부 표준(internal standard)으로 TMS와 함께 얻어졌고 화학적 이동(Chemical shifts)은 δ 값으로 표시되었다. ESI-MS는 Waters Q-TOF micro mass spectrometer를 이용하여 측정되었다. UV 및 IR 스펙트럼은 각각 Mecasys Optizen 2120 UV 및 Varian 640-IR을 이용하여 얻어졌다.

이상의 기기분석 결과를 문헌과 비교 분석한 결과, 본 발명의 화합물은 화학식 1로 표시되며, 아세틸렌산 유도체(C₁₈H₂₆O₃)로, 아직 보고되지 않은 신규 화합물임을 확인하였다.

보다 구체적으로 살펴보면, 화합물 1 및 화합물 2는 다음과 같이 분석되었다.

[화합물 1]

(10E,14Z)-9-oxooctadeca-10,14-dien-12-ynoic acid (1): 무색 오일 형태이고 UV 스펙트럼을 MeOH을 이용해 측정한 결과 218, 309nm에서 최대흡수파장을 나타냈으며 IR 스펙트럼을 측정한 결과 3420, 2927, 2856, 2360, 1735, 1245, 761 cm^-1에서 띠(band)가 관찰되었다. ¹H 및 ¹³C NMR 자료는 표 1의 결과와 같다. 음성 ESI-MS에서 289.2 [M - H]^-, 579.3 [2M - H]^-의 값이 관찰되었고 음성 고분해능 ESI-MS에서 289.1952 [M - H]^- (C₁₈H₂₅O₃, 289.1960로 추정)의 값을 얻었고 분자 화학식은 C₁₈H₂₅O₃이다. 이에 따라 (10E,14Z)-9-oxooctadeca-10,14-dien-12-ynoic acid (1)은 신규 화합물로 동정하였다.

[화합물 2]

(10E,14Z)-9-hydroxyoctadeca-10,14-dien-12-ynoic acid (2): 무색 오일 형태이고 선광도를 측정한 결과 [a]_D ²⁷-3.5°(c 0.3, CHCl₃)의 수치를 얻었다. UV 스펙트럼을 MeOH를 이용해 측정한 결과 266, 280nm에서 최대흡수파장을 나타냈으며 ¹H 및 ¹³C NMR 자료는 표 1의 결과와 같다. 음성 ESI-MS에서 291 [M - H]^-, 583 [2M - H]^-의 값이 관찰되었다.

^a The assignments were based on DEPT, HSQC, and HMBC experiments.

실시예 3. PPAR 감마 활성도에 대한 효능 분석

PPAR-γ 발현벡터와 PPRE 주도의 발광효소 보고유전자를 형질 주입시킨 CHO 세포에서 화합물 1과 화합물 2의 PPAR 전사 활성능력을 조사했다.

보다 구체적으로 살펴보면 CHO 세포들은 24-well plate에 1-well 당 1 x 10⁵의 농도로 배양되었다. 다음날 Hilymax를 이용해 세포들은 보고 벡터인 pGL3-PPRE3-TK-luc(PPRE의 조절아래 반딧불 루시페라아제 포함), 사람 PPAR-γ을 부호화하는 발현 벡터, β-갈락토시다아제를 부호화하는 발현 벡터와 상호트랜스펙션됐다. 배지는 4시간의 인큐베이션 이후에 제거되고 높은 글루코스를 함유한 DMEM으로 대체됐다. 18시간 후에 세포들은 화합물(0, 5, 20, 40, 60, 80, or 100 μM) 혹은 트로글리타존(10 μM)에 24시간 동안 처리됐으며 반딧불 루시페라아제 용해 버퍼에서 용해됐다. 세포 용해물에서 루시페라아제 활성은 제조자의 설명에 따라 반딧불 루시페라아제 측정 세트에 의해 측정됐다. β-갈락토시다아제의 활성은 β-갈락토시다아제 효소 측정 시스템에 의해서 측정됐다. 트랜스펙션 효과에 대한 결과들을 정규화하기 위해 루시페라아제 활성은 같은 용해물에서 β-갈락토시다아제의 활성에 관련해서 표현됐다.

전체 RNA는 RNAiso Plus 세트를 사용해 조절이나 처리된 세포들로부터 분리됐다. cDNA 합성 과정에서 RNA의 2μg이 oligo(dT)와 20μL의 반응량에서 PrimeScript 역전사 효소와 함께 역전사됐다. PCR을 위한 인간의 유전자 특정 프라이머는 생명정보센터(NCBI)의 nucleotide BLAST tool에 의해 디자인됐다. PCR은 이들 프라이머들과 iQ5 iCycler 시스템의 iQ SYBR Green Supermix 반응제를 이용해 시행됐다. PCR 조건은 초기 변성(95℃, 3분) 이후 95℃에서 10초, 60℃에서 15초, 그리고 72℃에서 20초를 60회전하는 것으로 구성됐다. 프라이머의 특이성을 결정하기 위해 71회전 변성 곡선은 55℃에서 시작했고 10초마다 0.5℃ 씩 상승시켰다. 유전자 발현 수준은 글리세르알데히드-3-인산디히드로게나아제(GAPDH) 유전자의 수치와 대응해 정규화됐고 iQ5 시스템 소프트웨어를 사용해 분석됐다.

그 결과, 화합물 1과 2는 20 μg/mL의 농도에서 PPAR-α 또는 PPAR-δ을 활성화하지 못했다. 그러나 화합물 2의 EC₅₀ 값이 20 μg/mL를 초과하며 활성을 나타내지 못하는 동안 새로운 아세틸렌산(화합물 1)은 EC₅₀ 값이 1.88 μM로 PPAR-γ를 선택적으로 활성화시켰다. PPAR-γ를 양성 조절하는 것으로 이미 알려져 있는 PPAR-γ의 작동체인 트로글리타존(troglitazone)을 같은 실험 조건 아래에서 활성을 조사한 결과 EC₅₀ 값은 0.44 μM였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였으나, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

삭제
하기 화학식 1로 표시되는 아세틸렌산 유도체.
[화학식 1]
제2항에 있어서, 상기 아세틸렌산 유도체는 꾀꼬리버섯에서 분리된 것을 특징으로 하는 아세틸렌산 유도체.
메탄올로 꾀꼬리버섯 추출물을 추출하는 제1단계;
상기 제1단계에서 추출된 추출물을 에틸아세테이트(ethylacetate:EtOAc)와 헥산(hexane)으로 분획하는 제2단계;
상기 제2단계에서 상기 에틸아세테이트에 용해된 분획물을 클로로포름과 메탄올(CHCl₃-MeOH)의 혼합용매를 사용하여 농도구배 실리카 젤 크로마토그래피(gel chromatography)를 수행하여 분획물을 수득하는 제3단계;
상기 제3단계에서 수득된 분획물을 아세토니트릴과 물(MeCN-H₂0)을 사용하여 역상(Reverse Phase, RP) 컬럼을 이용하여 분획물을 수득하는 제4단계; 및
상기 제4단계에서 수득된 분획물을 클로로포름과 아세톤(CHCl₃-acetone)의 혼합용매를 사용하여 크로마토그래피를 수행하여 화학식 1의 아세틸렌산 유도체를 수득하는 제5단계를 포함하는 제2항의 아세틸렌산 유도체를 제조하는 방법.
제2항의 아세틸렌산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제2항의 아세틸렌산 유도체 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.