KR20190015942A - 골 질환 예방 또는 치료용 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 골 질환 예방 또는 치료용 화합물 및 이의 용도에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.
본 발명에 따른 화합물들은 뼈 손실을 야기하는 파골세포에 대하여 강력한 증식 및 분화 억제 활성을 나타내고, 동시에 조골세포 분화 및 활성을 현저하게 증가시키기 때문에 안전하고 효과적인 골다공증 등 골 질환 예방 및 치료제 또는 개선용 의약품 및 식품을 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

골 질환 예방 또는 치료용 화합물 및 이의 용도{Compound preventing and treating of bone disease and Use therof}
본 발명은 골 질환 예방 또는 치료용 화합물 및 이의 용도에 대한 것으로, 보다 구체적으로는 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.
뼈는 몸의 골격 구조를 형성하고 혈중 칼슘(Ca2+) 수준을 유지하는 데 매우 중요한 역할을 한다. 뼈는 대사적으로 뼈를 흡수하는 파골세포(osteoclast)와 생성하는 조골세포(osteoblast) 간의 뼈 리모델링 순환(bone remodelling cycle)의 균형을 통해 유지된다. 뼈의 흡수와 생성 간의 균형이 파괴되어 흡수량이 생성량보다 많아지면 다양한 뼈 관련 질환이 발생하며, 파골세포의 분화 및 활성화와 관련된 대표적인 질환은 골다공증, 류마티스관절염, 관절통, 파제트 병, 골 전이암 및 골절 등을 들 수 있다.(Kim JH and Kim N, 2016; Shiozawa Y et al., 2011; Singer FR, 2016).
류마티스 관절염은 자가면역질환인데 자가면역항체가 파골세포 분화를 촉진한다. 그로 인한 과도한 골 흡수는 류마티스관절염을 악화시킨다(Takayanagi H, 2007). 그 기전은 다음과 같다. 파골세포 분화 관련 중추적인 전사인자인 NFAT 전사인자들은(NFATc1/c2/c3/c4) 기본적으로 calcium/calmodulin signaling에 의하여 활성화된다(Takayanagi H et al., 2002). 완전한 활성화를 위해서는 면역조절 단백질들인 DNAX-activating protein 12(DAP12) 및 면역항체 Fc receptor common γ chain(FcRγ)과 같은 tyrosine-based activation motif (ITAM)-bearing molecule들이 면역세포에서 calcium signaling을 자극한다(Pitcher LA and van Oers NS, 2003). 파골세포에서 역시 DAP12와 FcRγ가 calcium signaling을 통하여 NFATc1을 활성화시킨다. 따라서 DAP12 및 FcRγ와 연계된 immunoglobulin-like receptor가 파골세포 분화에서 중요한 역할을 한다(Koga T et al., 2004; MoA et al., 2004). 즉, FcRγ는 파골세포에서 osteoclast-associated receptor(OSCAR) 및 paired immunoglobulin-like receptor(PIR-A)와 상호작용한다. ITAM이 인산화되면 phospholipase C γ(PLCγ)를 활성화하고 이는 세포 내 calcium을 유리하고 이는 calmodulin-dependent phosphatase인 calcineurin을 활성화한다. Calcineurin은 직접 NFATc1의 serine을 탈인산화하여 핵 내로 보내고 활성화시킨다. 결과적으로 면역항체는 파골세포 분화를 촉진하게 되고, 파골세포에 의한 과도한 골 흡수는 류마티스 관절염을 악화시키게 된다. 결국, 류마티스관절염 환자에서 파골세포 분화 억제는 자가면역기전 자체의 이상을 교정하지는 못 해도 그 결과 유발된 골다공증과 통증 등 골격계 증상은 치료할 수 있다.
파제트 병(Osteitis deformans) 역시 파골세포의 비정상적 골 흡수가 유발한다(Singer FR, 2016). 그러면 조골세포의 비정상적 골 생성이 진행되고 이 과정이 반복되면서 골의 기형과 그로 인한 통증, 두통, 청력손실 등이 초래된다. 팔, 다리, 골반, 척추, 두개골에 호발한다. 새로 생성된 골은 약하여 골절 빈도가 높다. 고칼슘혈증, 심장마비, 반신불수가 유발될 수 있다(Ralstone SH, 2016). 발병 원인은 밝혀져 있지 않으나 유전적 소인과 어릴 적 바이러스 감염이 그 원인으로 의심된다. 약물치료가 병의 진행을 억제하는데 도움이 된다. 현재 가장 많이 사용하는 치료제는 파골세포 분화 억제제인 Fosamax 및 골 대사를 조절하는 calcitonin이다. 하지만 Fosamax는 부작용으로 일부 환자에서 장기 복용이 제한적이다. 통증이 심하면 Acetaminophen(Tylenol)이나 nonsteroidal anti-inflammatory drugs(NSAIDs)를 사용한다.
파골세포는 또한 고형암(solid tumor)의 골 전이를 촉진한다. 뼈는 암의 전이가 가장 호발하는 부위이다. 뼈에 암이 전이되면 극심한 통증과 함께 뼈가 부서져서 완치 가능성이 현저히 낮아진다(Weilbaecher KN et al., 2011). 전신에 퍼진 암세포들은 골수 내의 혈액 줄기세포 증식 장소에서 발견된다(Shiozawa Y et al., 2013). 암세포는 골수세포로부터 파골세포의 분화를 현저히 촉진하여 골 파괴와 이로 인한 골 전이, 암 성장을 촉진한다. 따라서 파골세포는 암의 골 전이에서 핵심적인 역할을 하여 파골세포 분화를 억제하면 골 전이가 감소한다. 많은 고형암의 전이가 골 전이인데 혈액 줄기세포 증식 장소를 거점으로 혈액 줄기세포를 몰아내고 증식하다가 다시 혈액으로 나와 다른 곳으로 전이하기도 한다. 골 전이가 가장 흔한 암은 전립선암으로서 골 전이가 암을 악화시켜서 완치를 어렵게 하고 사망의 주요 원인이다. 사람 전립선 암세포의 직접적인 주요 표적 역시 혈액 줄기세포 증식 장소로서 전이암의 거점으로 사용한다(Shiozawa Y et al., 2011). 또한 파골세포는 전립선 암 조직 내에 혈관 형성을 촉진하여 암 성장을 촉진한다(Bruni-Cardoso A et al., 2010). 유방암 세포도 파골세포 분화를 촉진하여, 유방 절제술을 시행한 유방암 환자에서 파골세포가 골 전이를 통한 암 재발을 촉진한다(Danilin S et al., 2012; Lu X et al., 2011).
골 전이암을 예방하기 위한 골 표적 치료제가 현재 임상에서 사용되고 있으며 파골세포가 암 골 전이의 핵심 기전 중 하나이므로 항암 신약개발의 주요 표적이 되고 있다. 이에 따라 파골세포 분화를 억제하기 위한 목적으로 현재 미국 FDA 승인을 받은 유일한 bisphosphonate 계열 약제가 Zoledronic acid이다(El-Amm J et al., 2013). Zoledronic acid는 뼈를 보존하고 생존률을 높인다. 고 위험 비전이 전립선암(high risk nonmetastatic prostate cancer)에서 Zoledronic acid는 골 전이를 크게 감소시켰다(Wirth M et al., 2014). Zoledronic acid를 골 생성 촉진제인 부갑상선호르몬(parathyroid hormone)과 함께 투여하면 골 전이가 더욱 감소하였다(Schneider A et al.,2005). 파골세포 분화의 신호전달물질인 RANKL에 대한 단클론 항체(monoclonal antibody)인 Denosumab 역시 전립선암의 골 전이를 억제하여 파골세포 억제가 암의 골 전이 억제에 중요함이 다시 입증되었다(Smith MR et al., 2012). Multiple myeloma 환자에서도 Zoledronic acid를 투여하면 파골세포 분화가 억제되어 골 전이가 현저히 억제된다(Zhuang J et al., 2012).
다핵성 파골세포의 골흡수능으로 인해 골용해(osteolysis)가 발생한다. 따라서, 파골세포의 분화를 억제하고, 단핵 파골세포의 융합에 의해 다핵성 파골세포가 형성되는 것을 억제하며, 다핵성 파골세포의 골흡수능도 감소시킴으로써, 이러한 골용해를 효과적으로 억제할 수 있다.
치주염은 세균에 의해 발생하는 염증성 질환으로 염증 조건에서 파골세포의 형성이 증가하여 뼈의 파괴가 증가하게 된다. 파골세포의 분화를 억제하고, 단핵 파골세포의 융합에 의해 다핵성 파골 세포가 형성되는 것을 억제하며, 다핵성 파골세포의 골흡수능도 감소시킴으로써, 이러한 치주염을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
골다공증은 파골세포의 활성화로 뼈의 흡수와 생성 간의 균형이 파괴되어 흡수량이 생성량보다 많아지면 유발된다. 골다공증은 뼈 실질의 밀도를 감소시켜서 골절 빈도를 증가시킨다. 중년 및 노년 여성 등 호르몬 균형이 무너진 여성에서 가장 빈번하게 발생하며, 골절이나 중증 질환으로 거동을 못하는 환자에서도 발병한다. 최근에는 중장년층 이상의 남성에서도 발생 빈도가 증가하고 있다.
골수 monocyte/macrophage lineage 세포가 파골세포로 분화하는 분자적 기전에는 먼저 아래 2개의 cytokine이 중요한 역할을 한다(Teitelbaum SL and Ross FP, 2003). (i) Macrophage colony-stimulating factor(M-CSF)가 그 수용체인 c-Fms와 결합하면 파골세포 전구세포들이 증식하고 생존한다. Receptor activator of nuclear factor-κB ligand(RANKL)이 그 수용체인 RANK에 결합하면 파골세포의 분화와 골 흡수 기능을 활성화하고 성숙한 파골세포가 생존하게 한다(Lacey DL et al., 1998; Lum L et al., 1999; Sherr CJ, 1990; Suda T et al., 1999; Wong BR et al., 1999). (ii) M-CSF가 c-Fms의 활성화를 유도하면 파골세포 전구세포가 ERK 및 PI3K/Akt 경로를 통하여 증식하고 생존한다(Mancini et al., 1997). (iii) RANKL(OPGL, ODF, TRANCE)과 RANK 역시 파골세포 형성과 기능을 조절한다(Anderson DM et al., 1997; Dougall WC et al., 1999; Kong YY et al., 1999). RANKL이 RANK에 결합하면 TRAFs 1, 2, 3, 5, 6 등의 TNF receptor-associated factor(TRAF)들이 RANK와 결합한다(Darnay BG et al., 1998; Walsh MC and Choi Y, 2003). 이중 TRAF6가 파골세포 형성과 기능에 가장 중요하다(Lomaga MA et al., 1999; Naito A et al., 1999). TRAF6는 RANKL/RANK 신호를 NF-κB, c-Jun N-terminal kinase(JNK), extracellular signal-regulated kinase(ERK), p38, Akt, Nuclear Factor Of Activated T-Cells 1(NFATc1)에 전달하여 파골세포 증식, 융합, 분화가 이루어진다(Kobayashi N et al., 2001; Lomaga MA et al., 1999; Naito A et al., 1999; Takayanagi H et al., 2002; Wong BR et al., 1998; Wong BR et al., 1999)
기존의 골다공증의 치료제 개발 방향은 파골세포의 뼈 흡수를 억제하여 뼈 실질의 손실을 예방할 수 있는 물질을 발굴하는 것이었다. 그 대표적인 약품이 bisphosphonate 계열의 Fosamax이다. 같은 맥락에서 arachidonate 대사 산물이 뼈 조직 대사에 미치는 영향에 대하여서도 많은 연구가 이루어졌다(Lee Sung-eun, 1999). Leukotriene-B4(LTB4)는 arachidonate의 대사 경로인 5-lipoxygenase pathway의 대사 산물 중 하나이다(Ford-Hutchinson, A. W. et al., 1980). Giant cell tumor에서 얻은 간질세포주(interstitial cell)인 C433은 5-lipoxygenase 대사 산물을 증가시켜서 조골세포의 수와 활성을 증가시키는 것으로 보고되었다(Mundy, G. R. et al., 1993). 뼈 조직 배양 과정에서 LTB4를 투여하면, 뼈 흡수가 증가하는 것이 관찰되기도 하였다(Bonewald, L. F. et al., 1996). In vitro와 in vivo 연구에서 LTB4는 파골세포의 생성을 증가시켜서 뼈 흡수를 유도한다는 연구 결과도 있다(Bonewald, L. F. et al., 1996). 이에 따라, LTB4 수용체 억제제(LTB4 receptor antagonist)들이 골다공증 치료를 위하여 많이 개발되었지만, 파골세포의 뼈 실질 흡수를 충분히 억제하는 데는 성공하지 못했다.
뿐만 아니라, 기존 골다공증 치료제의 부작용과 고가의 약값도 환자의 치료에 충분한 용량으로 투여하는데 큰 장애가 되고 있다. Fosamax의 주요 부작용으로는 중증 식도염, 신 손상, 간 손상, 저칼슘혈증, 근육 경련 등이 있고, 로슈(Roche)의 Bonviva는 전신근육통, 몸살 등의 부작용이 있다. 노바티스(Novartis)의 Aclasta(zoledronate)와 일라이 릴리(Eli Lilly)의 anabolic 치료제인 parathyroid hormone인 Forsteo와 Forteo(teriparatide)는 효과는 좋으나 가격이 너무 비싸서 사용이 매우 제한적이다. 특히 Forsteo/Forteo는 약물 과민반응 환자, 임산부, 모유수유, 고칼슘혈증(hypercalcemia), 신부전, 부갑상선 기능항진증(hyperparathyroidism)과 파제트 병(Paget’disease) 등의 대사성 골질환, 원인미상의 알칼리포스파타제 활성 증가(unexplained elevations of alkaline phosphatase), 방사선 치료 환자, 골수암 혹은 골 전이암 환자 등에게는 사용할 수 없기 때문에 적용가능한 환자군이 크지 않다.
따라서 보다 효과가 강력하고 부작용 없이 안전하며, 기존 치료제보다 저비용으로 생산가능한 골 관련 질환 치료제 개발이 시급히 요구되고 있다.
[비특허문헌 1] Anderson DM, Maraskovsky E, Billingsley WL, Dougall WC, Tometsko ME, Roux ER, et al. A homologue of the TNF receptor and its ligand enhance T-cell growth and dendritic-cell function. Nature 1997;390:175-9. [비특허문헌 2] Bonewald, L. F., et al., Leukotriene B4 stimulates osteoclastic bone resorption both in vitro and in vivo. J. Bone Miner. Res., 11, 1619-1627, 1996. [비특허문헌 3] Bonewald, L.F. et al., Effects of synthetic peptido-leukotrienes on bone resorption in vitro. J. Bone Miner. Res., 11, 521-529, 1996.
이에 본 발명자들은 부작용이 적고 안전하며 효과가 뛰어난 골 질환 치료제를 개발하기 위하여, 골 손실 억제 활성이 있는 화합물들을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은
하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
<화학식 1>
Figure pat00001
R1은
Figure pat00002
, 및 치환기 R7와 1개 이상의 헤테로원자를 갖는 3-9원자의 헤테로아릴기로 이루어진 군에서 선택된 하나이고, 이 때 헤테로원자는 O, N 및 S로 이루어지며;
R5, R6는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, -OH, -SH, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시기, 할로겐, 알릴록시기(allyloxy), 카르복실산기, 카르복실에스터기 및 카르복시아미드기로 이루어진 군에서 선택된 하나이고;
R7는 -H, -OH, -SH, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시기, 할로겐, 알릴록시기(allyloxy), 카르복실산기, 카르복실에스터기 및 카르복시아미드기로 이루어진 군에서 선택된 하나이고;
R2, R3는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소 및 C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기로 이루어진 군에서 선택된 하나이며;
R4은 C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, -NH(R8), -N(R8)2 및 -OH로 이루어진 군에서 선택된 하나이며:
R8은 C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
<화학식 1>
Figure pat00003
R1은
Figure pat00004
, 및 치환기 R7와 1개 이상의 헤테로원자를 갖는 3-9원자의 헤테로아릴기로 이루어진 군에서 선택된 하나이고, 이 때 헤테로원자는 O, N 및 S로 이루어지며;
R5, R6는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, -OH, -SH, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시기, 할로겐, 알릴록시기(allyloxy), 카르복실산기, 카르복실에스터기 및 카르복시아미드기로 이루어진 군에서 선택된 하나이고;
R7는 -H, -OH, -SH, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시기, 할로겐, 알릴록시기(allyloxy), 카르복실산기, 카르복실에스터기 및 카르복시아미드기로 이루어진 군에서 선택된 하나이고;
R2, R3는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소 및 C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기로 이루어진 군에서 선택된 하나이며;
R4은 C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, -NH(R8), -N(R8)2 및 -OH로 이루어진 군에서 선택된 하나이며:
R8은 C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기이다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
<화학식 1>
Figure pat00005
R1은
Figure pat00006
, 및 치환기 R7와 1개 이상의 헤테로원자를 갖는 3-9원자의 헤테로아릴기로 이루어진 군에서 선택된 하나이고, 이 때 헤테로원자는 O, N 및 S로 이루어지며;
R5, R6는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, -OH, -SH, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시기, 할로겐, 알릴록시기(allyloxy), 카르복실산기, 카르복실에스터기, 카르복시아미드기로 이루어진 군에서 선택된 하나이고;
R7는 -H, -OH, -SH, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시기, 할로겐, 알릴록시기(allyloxy), 카르복실산기, 카르복실에스터기 및 카르복시아미드기로 이루어진 군에서 선택된 하나이고;
R2, R3는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소 및 C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기로 이루어진 군에서 선택된 하나이며;
R4은 C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, -NH(R8), -N(R8)2 및 -OH로 이루어진 군에서 선택된 하나이며:
R8은 C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기이다.
본 발명에서 사용한 용어 “알킬”은 1 내지 4 탄소수를 함유하는 직쇄 또는 측쇄형 알킬기를 포함하는 기 또는 기의 일부분을 기술하기 위해 사용되며; 이러한 기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert 부틸을 포함한다.
본 발명에서 사용한 용어 “알콕시”는 O-알킬을 의미한다.
상기 알콕시의 정의에 기재된 “알킬”은 본 발명에서 사용한 “알킬”과 동일하며, 상기 알콕시기는 구체적으로는 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 이소프로폭시기, n-부톡시기, 이소부톡시기, t-부톡시기이다.
본 발명에서 사용된 용어 "아릴"이란 무제한 용어는 일-, 이- 또는 삼-환식 탄소환식 방향족기를 뜻하고, 공유결합에 의하여 직접 연결되는 두개의 일환식 탄소환식 방향족 고리를 갖는 기를 포함한다. 이와 같은 기를 예시하면 페닐, 비페닐과 나프틸이 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "헤테로아릴"이란 무제한 용어는 S, N과 O에서 선택한 하나 또는 그 이상의 헤테로원자를 함유하는 일-, 이- 또는 삼-환식 방향족기를 뜻하고, 공유결합에 의하여 직접 연결되는, 두개의 이러한 일환식고리, 또는 하나의 이러한 일환식고리와 하나의 일환식 아릴고리를 갖는 기를 포함한다. 이와 같은 기를 예시하면 티에닐, 벤즈티에닐, 푸릴, 벤즈푸릴, 피롤일, 이미다졸일, 벤즈이미다졸일, 티아졸일, 벤즈티아졸일, 이소티아졸일, 벤즈이소티아졸일, 피라졸일, 옥사졸일, 벤즈옥사졸일, 이소옥사졸일, 벤즈이소옥사졸일, 이소티아졸일, 트리아졸일, 벤즈트리아졸일, 티아디아졸일, 옥사디아졸일, 피리딘일, 피리다진일, 피리미딘일, 피라진일, 트리아진일, 인돌일과 인다졸일이 있다.
또한, 상기 헤테로아릴기는 치환기로서 하나 또는 그 이상의 치환기가 독립적으로 포함될 수 있다. 이 때 치환기는 구체적으로 -H, -OH, -SH, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시기, 할로겐, 알릴록시기(allyloxy), 카르복실산기, 카르복실에스터기 및 카르복시아미드기를 포함한다.
본 발명에서 사용한 용어 ‘카르복실에스터기’는 O-알킬, 또는 O-아릴기가 치환된 에스터를 나타내며, ‘카르복시아미드기’는 N-알킬, N,N-디알킬, N-아릴, N,N-디아릴을 나타낸다.
본 발명의 “치환기 R7와 1개 이상의 헤테로원자를 갖는 3-9원자의 헤테로아릴기로 이루어진 군에서 선택된 하나이고, 이 때 헤테로원자는 O, N 및 S로 이루어진 군”은 보다 바람직하게는 다음과 같은 구조식을 가진 것일 수 있다.
Figure pat00007
본 발명에서 사용한 용어 ‘할로겐’은 할로겐족 원자를 나타내며, 불소, 염소, 브롬, 요오드 등을 포함한다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 상기 화학식 1의 유도체는 다음 화합물 중에서 선택된다.
[화합물 1]
(E)-4-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-3-부텐-2-온((E)-4-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-buten-2-one; 흰색 고체; M.W 192.21)
Figure pat00008
[화합물 2]
(E)-4-(3-히드록시-4-메톡시페닐)-3-부텐-2-온((E)-4-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-3-buten-2-one; 황색 고체; M.W 192.21)
Figure pat00009
[화합물 3]
(E)-4-(3-플루오로-4-히드록시페닐)-3-부텐-2-온 ((E)-4-(3-fluoro-4-hydroxyphenyl)-3-buten-2-one; 황색 고체; M.W 180.18)
Figure pat00010
본 발명에 따른 화합물은 천연물로부터 분리할 수도 있으며, 공지된 방법에 의해 합성될 수 있고, 상업적으로도 구입 가능하다.
본 발명의 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하며, 조골세포의 활성 증가 및 파골세포의 분화 또는 증식을 억제하여 골 질환 예방 및 치료의 효능이 있다.
골질환이란 뼈와 관련된 질환을 말하며, 예를 들어, 조골세포와 파골세포의 불균형이 원인이 되는 질환일 수 있으며, 바람직하게는 골다공증, 파제트병, 구루병, 골연화증, 골 용해, 신부전 환자의 신성골이영양증, 관절통, 골절, 류머티스성 골질환, 퇴행성 골질환, 골전이암, 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환일 수 있으며, 바람직하게는 골다공증, 파제트병, 구루병, 관절통, 골절, 류머티스성 골질환, 골전이암일 수 있다.
상기 본 발명 화합물들의 효능은 본 발명자들의 실시예에 의해 확인되었다.
본 발명자들은 일실시예에서 본 발명에 따른 화합물들이 뼈 조직을 파괴하고 재흡수하는 역할을 하는 파골세포(osteoclast)의 분화를 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 마우스에서 분리한 골수세포에서 파골세포의 줄기세포 전구세포인 단핵구 세포를 분리하여 분화촉진인자인 RANKL과 M-CSF로 자극하고, Benzylideneacetone 유도체들을 처리하여 파골세포의 분화에 미치는 영향을 확인한 결과, 골수세포가 다핵 파골세포로 분화하는 것을 효과적으로 억제하였다. 이에, 본 발명자들은 Benzylideneacetone 유도체들은 양성대조군인 Fosamax보다 IC50가 약 40배 낮아서 현저히 우수한 파골세포 분화 억제 활성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 세포독성은 매우 낮아 안전한 것으로 확인하였다.
본 발명자들은 다른 일실시예에서 본 발명에 따른 화합물들이 조골세포 활성을 증가시키는 것을 확인하였다. 상기 조골세포란 골아세포라고도 불린다. 조골세포는 세포 밖으로 골질을 분비하고 스스로는 골질에 싸여 골세포로 변한다. 조골세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)에서 분화한 것으로, 분열 능력이 크고, 형성 과정에 있는 경골의 표층에 한 층으로 배열되어 수상돌기로 서로 연락하고 있다. 이 세포군의 바깥쪽에는 골막이 있다. 뼈 형성이 끝나도 골막내면에는 조골세포가 존재하지만 노화된 뼈에서는 그 수가 감소한다.
본 발명의 일실시예에서는 조골세포의 초기 분화 표지자인 ALP(Alkaline phosphatase, 염기성 인산분해효소) 활성을 확인하는 ALP assay를 실시하여, 본 발명의 화합물들이 대조군에 비해 ALP 활성을 400% 이상 증가시켜서 유의하게 조골세포의 분화를 촉진시키고 활성을 증가시키는 것을 확인하였다.
따라서 통상의 기술자는 본 발명자들이 규명한 화합물들의 상기 활성을 이용하여 파골세포에 의한 골 흡수와 조골세포에 의한 새로운 골 기질의 형성 및 이후의 무기질화 과정의 골 대사 과정의 균형이 깨지면서 골밀도와 강도가 감소하여 발생하는 다양한 골 질환에 대한 효과적인 예방, 증상의 개선 또는 치료의 효과를 기대할 수 있음을 이해할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 화합물들은 그 자체 또는 염, 바람직하게는 "약학적으로 허용되는" 염의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하며, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
또한, 상기 약학적으로 허용되는 염은 추가적으로 담체, 부형제 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 명세서에서 '치료'란 치료되는 개체 또는 세포의 자연적 과정을 변경시키려는 임상적 시술을 의미하며, 임상적 병리의 예방을 위해서도 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질병의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선, 호전, 완화 또는 개선된 예후 등을 포함한다.
또한 용어 '예방'은 질병의 발병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 시간, 치료 횟수, 치료 기간, 치료가 필요한 개체의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 약물에 대한 민감도, 식이 및 배설율, 등 다양한 요인을 고려하여 당업자가 상술한 특정 용도에 따른 적절한 유효량을 결정할 수 있다. 상기 “유효량”이란 개체에게 투여하였을 때, 골 질환의 개선, 치료, 예방, 검출 또는 진단 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다. 본 발명의 약학적 조성물의 유효량으로는, 이에 한정되지는 않으나, 0.1~200mg/day/체중kg, 바람직하게는 1~50mg/day/체중kg이다.
상기‘개체’란 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 골 질환 환자(patient) 일 수 있다.
상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여되거나 골 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있는 것으로 알려진 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 병용하여 투여할 경우 다른 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 단독 투여 또는 병용 투여시 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 히드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 ‘경피투여’는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 약학적 조성물은 골질환을 예방 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다. 상기 화합물의 예로는, 천연 비타민 D3, 에스트로겐, 알렌드로네이트(alendronate) 및 랄록시펜(raloxifene) 등이 있다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 개선용 식품용 조성물을 제공한다.
본 발명자들이 규명한 화합물들의 상기 골 질환에 대한 예방 또는 개선의 효과는 본 명세서에서 전술한 바와 같다.
상기 식품용 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형들은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 식품용 조성물 자체를 차, 쥬스 및 드링크 등 액제의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한 본 발명의 식품용 조성물은 골 질환 예방 또는 개선의 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
상기 분말은 가루나 결정성 물질을 뭉쳐서 눌러 둥글넓적한 원판이나 원추 모양으로 만든 제형으로 복용하기 쉽고 투여량이 정확하다. 본 발명의 기능성 식품 정제는 이에 제한되지는 아니하나 유당, 전분, 백당, 만니톨, 소르비톨, 무기염 등의 부형제를 포함 할 수 있으며, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 과립은 둥글고 잔 알갱이 모양의 제형을 말하며, 혼합제제의 경우 항상 일정한 비율을 취할 수 있고 복용하기 쉽다. 본 발명의 과립제에는 필요에 따라 착색제, 방향제 등이 첨가 될 수 있으며, 적당한 제피제 등으로 제피를 할 수 있다. 과립제의 과립은 전제의 20%가 355um 이상 1400um이하의 크기를 가지는 것이 바람직하다.
상기 액제는 액체로 된 제형을 말하며, 본 발명의 필요에 따라 안정제, 교미제, 보존제 등이 첨가 될 수 있다. 또한 본 발명의 기능성 음료조성물은 풍미개선을 위해 과실추출물을 추가로 포함할 수 있다. 과실추출물은 풍미개선과 함께 과실이 지니는 각종 유효성분을 함께 이용할 수 있는 장점을 준다. 상기 과실추출물에 사용되는 과실로는 이에 한정되는 것은 아니나 파인애플, 레몬, 감귤, 오렌지, 사과, 배, 그레이프후르츠, 살구, 딸기, 복숭아, 멜론, 구아바, 레몬, 자두에서 선택된 적어도 1종을 포함 할 수 있다. 기타 본 발명의 기능성 음료조성물에는 공지의 첨가물을 포함할 수 있다. 이들 공지의 첨가물로는 비타민류로는 니코틴산아마이드, 비타민 A, B, C, D, E, 엽산 등이 사용 될 수 있고, 아미노산류로는 L-글리신, L-라이신, DL-메치오닌, L-발린, 비오틴, L-시스테인, L-시스틴, L-트립토판, L-트레오닌, L-페닐알라닌 등이 사용 될 수 있고, 생약제제로는 구기자, 오가피, 백출, 백작약, 녹곽, 홍삼, 인삼, 음양곽, 우황, 황정 등이 사용 될 수 있고, 착향제로는 혼합과일향, 사과향, 요구르트향, 드링크향 등이 사용 될 수 있고, 감미제류는 정백당, 포도당, 과당, 프락토올리고당, 이소말토올리고당, 말토올리고당, 키토산올리고당, 키토올리고당, 대두올리고당, 자일로올리고당, 이성화당(고과당), 전화당, 아스파탐, 스테비오사이드, 솔비톨, 만니톨 등이 사용될 수 있고, 산미제로는 구연산, DL-사과산, 호박산 등이 사용 될 수 있고, 안정화제로는 소르베이트류 중 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 80 등이 사용 될 수 있고, 보존제류로는 안식향산 및 그의 유도체, 데히드로초산 및 그의 염류, 소르빈산 및 그의 염류 등이 사용 될 수 있다.
또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋우기 위하여 매실, 레몬향, 파인애플향 또는 허브향과 같은 천연향료나 천연과즙, 클로르필린(Chlorophyllin), 플라보노이드(Flovonoid) 등의 천연색소 및 감미 성분인 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕 등과 구연산, 구연산나트륨 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수 있다.
또한 기능성 식품으로는 정제, 과립제, 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품 (예를 들어 과일 통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예를 들어 햄, 소시지, 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예를 들어 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예를 들어 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예를 들어 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 식품용 조성물을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 기능성 식품 제조는 본 발명의 식품 조성물이 포함되는 것 이외 다른 특별한 제한이 없으며, 통상의 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제로써 식품별로 필요한 성분을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 식품용 조성물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 총 중량 중 0.01 내지 50중량%이다. 본 발명의 식품용 조성물을 식품첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

도 1은 실시예 1-1에서 합성한 (E)-4-(3-히드록시-4-메톡시페닐)-3-부텐-2-온 (화합물 2)의 NMR 동정 결과이다.
도 2는 실시예 1-2에서 합성한 (E)-4-(3-플루오로-4-히드록시페닐)-3-부텐-2-온 (화합물 3)의 NMR 동정 결과이다.
도 3은 본 발명의 화합물 1 내지 화합물 3과 그의 양성 대조군인 Fosamax 및 Osmundacetone을 포함한 화합물들의 파골세포 분화 및 증식 억제능을 TRAP assay로 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 화합물 1 내지 화합물 3과 그의 양성 대조군인 Osmundacetone을 포함한 화합물들의 조골세포 분화 및 활성 효과를 ALP assay로 측정한 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
<실시예 1-1>
(E)-4-(3-히드록시-4-메톡시페닐)-3-부텐-2-온 (화합물 2)의 합성
Figure pat00011
3-히드록시-4-메톡시벤잘데하이드(2d, 152.1mg, 1.0mmol) 및 CuBr2(223.35mg,1mmol)를 실온에서 5mL 아세톤에 용해시켰다. 상기 반응 혼합물을 60 ℃에서 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각한 6시간 뒤, 셀 라이트로 여과 하였다. 유기층을 진공 농축시키고, 황색 고체인 생성물 (E)-4-(3-히드록시-4-메톡시페닐)-3-부텐-2-온(3d, 47.8%, 92mg)를 용리액으로서 에틸 아세테이트 및 n- 헥산 (1 : 4)을 사용하는 플래시 크로마토그래피로 정제 하였다.
NMR 및 MS 분석 결과는 다음과 같다.(도 1 참조)
1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 9.22 (1H, br), 7.48 (1H, d, J = 16.4 Hz), 7.14-7.10 (2H, m), 6.97 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.54 (1H, J = 16.4 Hz), 3.81 (3H, s), 2.29(3H, s); Ms(ESI) m/z: 193.1 [M+H]+;
<실시예 1-2>
(E)-4-(3-플루오로-4-히드록시페닐)-3-부텐-2-온 (화합물 3)의 합성
Figure pat00012
3-플루오로-4-히드록시벤잘데하이드(2e, 140.1mg, 1.0mmol) 및 CuBr2(223.35mg,1mmol)를 실온에서 5mL 아세톤에 용해시켰다. 상기 반응 혼합물을 60 ℃에서 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각한 6시간 뒤, 셀 라이트로 여과 하였다. 유기층을 진공 농축시키고, 황색 고체인 생성물 (E)-4-(3-플루오로-4-히드록시페닐)-3-부텐-2-온 (3e, 44mg, 24.4%)를 용리액으로서 에틸 아세테이트 및 n- 헥산 (1 : 4)을 사용하는 플래시 크로마토그래피로 정제 하였다.
NMR 및 MS 분석 결과는 다음과 같다.(도 2 참조)
1H NMR (400 MHz, DMSO): δ 7.58 (1H, dd, J = 2.0, 2.0 Hz), 7.51 (1H, d, J = 16.4 Hz), 7.35 (1H, dd, J = 1.6, 1.6 Hz), 6.97 (1H, t, J = 8.8 Hz), 6.66 (1H, J = 16.4 Hz), 2.28 (3H, s); Ms(ESI) m/z: 181.1 [M+H]+;
<실시예 2>
MTT 어세이
본 발명의 화합물 1 내지 3에 대하여 MTT assay를 이용하여 정상세포에 대한 세포독성을 확인하였다.
본 발명의 화합물 1은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)의 #306045이며, 화합물 2는 본 발명 실시예 1-1에서 합성한 것이며, 화합물 3은 실시예 1-2에서 합성한 것을 사용하였다.
MTT assay 방법은 다음과 같다.
정상세포(RAW264.7 쥐 마크로파지 세포주(파골세포 전구세포), NIH3T3 쥐 섬유아세포주, 및 HaCAT 인간 피부 세포)를 10% FBS(fetal bovine serum)가 첨가된 DMEM를 포함하는 96웰 플레이트에서 5% CO2, 37℃에서 배양한 후, 화합물 1 내지 3을 10, 100, 1000, 5000μM 농도로 세포배지에 첨가하고 48시간 배양하였다. 그 후 MTT(0.5mg/mL 인산완충식염수) 100μL를 투여한 후, 2시간 배양하였다. 각 well에 100μL의 DMSO를 가하고 10분간 배양 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader; SPCTRA MAX 340PC, Molecular Devices, USA)를 이용하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 생존한 세포의 수를 나타내는 지표로서 하단의 식으로 계산되며, 3회의 실험으로 재현성을 확인하였다.
세포 증식율(%)=OD550(sample)/OD550(control)
Benzylideneacetone 유도체들의 정상세포 MTT assay 결과
Compound LD50(μ)
정상세포
RAW264.7 NIH3T3 HaCaT
화합물1 399±42 >5000 1110±10
화합물2 261±79 >5000 569±24
화합물3 1110±48 >5000 821±17
표 3에서 확인할 수 있듯이, 화합물 1 내지 3투여 후 세포증식율의 변화에 근거하여 산출된 화합물들의 정상세포에 대한 LD50 측정 결과, 세포 독성이 거의 없음을 확인하였다. 마크로파지(macrophage) 세포주인 RAW264.7의 경우, 화합물 1과 화합물 2가 약한 세포독성을 나타내서 이 화합물들은 약한 면역억제 기능이 있음을 확인하였다. 따라서 전반적으로 정상세포에 대한 낮은 세포독성을 가진 본 발명의 화합물들이 안전하게 약학, 식품 조성물로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 3>
파골세포의 증식 및 분화억제 활성
본 발명의 화합물들에 대하여 파골세포 특이적인 염색법인 TRAP assay(tartrate-resistant acid phosphatase)를 이용하여 파골세포에 대한 증식 및 분화억제의 활성을 확인하였다.
TRAP assay의 구체적인 방법은 다음과 같다.
1. 골수세포 배양
6~8주령 수컷 C57BL/6 마우스의 정강이뼈(tibia)와 대퇴골(femur)을 무균적으로 절제하고 골수세포를 syringe(21G, Korea Green Cross)로 무균적으로 채취하였다. 15 골수세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany), 1%(v/v) 항생제(100 U/mL penicillin G, 100 mg/mL streptomycin)을 포함하는 α-MEM 배지(Gibco BRL Co.) 500 μ에 부유하여 48well plate에 분주하고, triplicate으로 assay를 진행하였다. 37oC, 5% CO2에서 배양하며 3일 후 배지를 교환하였다. 파골세포 분화를 촉진하기 위하여 배지에 파골세포 분화인자인 M-CSF(60ng/mL)과 RANKL(150ng/mL) (PeproTech, Seoul, Korea)로 처리하면 파골세포의 전구세포인 단핵구세포가 5~7일 내에 성숙한 파골세포로 분화되었다.
2. 파골세포 분화 측정
1) 시료 준비: 화합물 1 내지 3 (0.05μ0.1μ0.5μ1μ5μ10μ또는 20μOsmundacetone 및 Fosamax(0.5μ1μ5μ또는 10μ등을 각각 적정한 농도로 DMSO(dimethylsulfoxide) 또는 무균 증류수에 용해하였다. 본 발명의 화합물 1은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)의 #306045이며, 화합물 2는 본 발명 실시예 1-1에서 합성한 것이며, 화합물 3은 실시예 1-2에서 합성한 것을 사용하였다.
2) 시료 투여: 시료는 골수세포 배양 첫날부터 1:20(v/v; 배지 500μ당 시료 25μ로 지속적으로 배지에 투여하고, 배지는 3일 간격으로 교체하였다.
3) 파골세포 분화 측정: 파골세포는 TRAP으로 염색된 TRAP-양성 다핵세포로 정의하였다. TRAP 염색 용액은 기질인 naphthol AS-MS phosphate(Sigma N-4875) 5 mg과 발색시약인 Fast Red Violet LB salt 25mg을 약 0.5 mL의 N,N-dimethylformamide에 녹인 후, 50mM tartaric acid를 포함하는 0.1N NaHC03 buffer solution(50mL)과 혼합하였다. 반응시약은 사용 전까지 냉장고에 보관하였다.
골수세포는 분화촉진인자를 포함하는 배지에서 6-7 일간 배양한 후, 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후 10% formalin을 포함한 PBS로 2~5분 동안 고정하였다. 이후 ethanol과 acetone의 1:1 혼합용액으로 1분간 고정하고, 건조하였다. 고정된 세포는 TRAP 염색용액으로 빛을 차단한 채 37oC에서 60 분간 처리하고 PBS로 세척한 후 Hematoxylin 염색을 시행하고, 세포의 염색 정도를 현미경으로 관찰하였다.
현미경 시야에서 TRAP-양성세포 중, 2개 이상의 핵을 갖는 세포를 파골세포로 판정하고 세포의 수를 측정하였다. 본 발명의 화합물 1, 화합물2 및 화합물3의 파골세포 분화억제 효과는 화합물을 처리하지 않은 대조군 대비 50% 억제 농도를 IC50로 계산하였다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 화합물들로 처리한 군에서는 양성대조군(배양 배지에 Osmundacetone 또는 Fosamax를 첨가한 군)과 유사하게 다핵세포인 거대한 파골세포 형성이 현저히 억제되었으며, 그 중에서도 osmundacetone의 phenyl ring의 4번 탄소의 hydroxyl 기를 methoxy 기로 치환한 화합물인 화합물 2의 경우, IC50가 0.1μM로서 임상에서 가장 많이 사용되는 골다공증 치료제인 Fsamax(IC50=4μM)의 40배, osmundacetone(IC50=8μM)의 80배 정도 강력한 파골세포 억제활성을 나타냈다. 부가적으로, 파골세포 전구세포의 증식도 현저히 억제되어 파골세포의 분화뿐만 아니라 증식 억제효과도 매우 큰 것으로 관찰되었다.
<실시예 4>
조골세포 증식 및 분화 활성
화합물 1, 화합물 2 및 화합물 3은 조골세포 활성 측정 방법인 ALP(Alkaline phosphatease) assay를 이용하여 조골세포에 대한 증식 및 분화 활성을 확인하였다. 본 발명의 화합물 1은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)의 #306045이며, 화합물 2는 본 발명 실시예 1-1에서 합성한 것이며, 화합물 3은 실시예 1-2에서 합성한 것을 사용하였다.
조골세포의 세포막에 존재하는 Alkaline phosphatase(ALP)는 조골세포 활성의 표지인자로 알려져 있으며 석회화 과정 동안 무기인산의 운반, 세포 분열이나 분화의 조절자 역할을 한다. 그러므로 본 발명의 화합물들이 조골세포의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 ALP 활성을 측정하였다. ALP 활성도는 p-nitrophenyl phosphate(pNPP, Sigma, St.Louis, MO, USA)의 가수분해 반응에 ALP가 촉매로 작용하여 생성되는 p-nitrophenol의 양을 405nm 파장에서 microplate reader를 이용하여 측정함으로써 간접적으로 산출해내었다.
구체적으로, 조골세포(mouse MC3T3-E1)를 96-well plate에 3 ×103 cells/100μ의 농도로 조골세포 분화인자인 ascorbic acid(50 μ와 10 mM β-glycerophosphate를 첨가한 α-MEM 배지에 분주하고, 본 발명의 화합물 1 내지 3과 osmundacetone을 최종농도 10μM 및 50μM로 투여한 후, 72시간마다 배지를 교환하며 14일간 배양하였다. 14일 후, 각각의 well에서 배양액을 제거하고 PBS로 3회 세척 후 0.2% Nonidet P-40/10 mmol/L MgCl2로 세포를 용해한 후 3분간 sonifier cell disrupter(Model W-380, Heat Systems-Ultrasonics, Inc., Farmingdale, NY)로 4°에서 초음파 처리하였다. 세포 분해액을 1500g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 모아 ALP 활성도를 측정하였다. 세포수 차이에 따른 ALP 활성도 변화를 고려하기 위해, 총단백질 양은 bovine serum albumin을 표준 단백질로 bicinchoninic acid(BCA) protein assay kit를 사용하여 측정하였으며 효소 활성은 화합물을 첨가하지 않은 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 화합물 1과 화합물 2는 10μM, 50μM 농도에서 화합물을 첨가하지 않은 대조군보다 높은 ALP 활성을 나타냈으며, 특히 화합물 1 ((E)-4-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-buten-2-one)를 50μM 농도로 첨가한 경우, 대조군에 비해 ALP 활성을 400% 이상 증가시켰으며 osmundacetone에 비해서도 1.5배의 조골세포 활성 증가를 보이는 것을 확인하였다. 이는 기존 임상에서 골다공증 치료에 사용 중인 조골세포 활성화제들에 준하는 매우 우수한 결과이다. 반면 화합물 3은 파골세포 분화 억제활성은 매우 우수하였으나(IC50=6μM), 조골세포 활성화 활성은 전혀 없었다.
본 발명에 따른 화합물들은 뼈 손실을 야기하는 파골세포에 대하여 강력한 증식 및 분화 억제 활성을 나타내고, 조골세포 분화 및 활성을 현저히 증가시키기 때문에 안전하고 효과적인 골다공증 등 골 질환 예방 및 치료제 또는 개선용 식품을 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물;
    <화학식 1>
    Figure pat00013

    R1은
    Figure pat00014
    , 및 치환기 R7와 1개 이상의 헤테로원자를 갖는 3-9원자의 헤테로아릴기로 이루어진 군에서 선택된 하나이고, 이 때 헤테로원자는 O, N 및 S로 이루어지며;
    R5, R6는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, -OH, -SH, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시기, 할로겐, 알릴록시기(allyloxy), 카르복실산기, 카르복실에스터기 및 카르복시아미드기로 이루어진 군에서 선택된 하나이고;
    R7는 -H, -OH, -SH, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시기, 할로겐, 알릴록시기(allyloxy), 카르복실산기, 카르복실에스터기 및 카르복시아미드기로 이루어진 군에서 선택된 하나이고;
    R2, R3는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소 및 C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기로 이루어진 군에서 선택된 하나이며;
    R4은 C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, -NH(R8), -N(R8)2 및 -OH로 이루어진 군에서 선택된 하나이며:
    R8은 C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은
    (E)-4-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-3-부텐-2-온, (E)-4-(3-히드록시-4-메톡시페닐)-3-부텐-2-온 및 (E)-4-(3-플루오로-4-히드록시페닐)-3-부텐-2-온으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증, 파제트병, 구루병, 골연화증, 골 용해, 신부전 환자의 신성골이영양증, 관절통, 골절, 류머티스성 골질환, 퇴행성 골질환, 골전이암, 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 골 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물;
    <화학식 1>
    Figure pat00015

    R1은
    Figure pat00016
    , 및 치환기 R7와 1개 이상의 헤테로원자를 갖는 3-9원자의 헤테로아릴기로 이루어진 군에서 선택된 하나이고, 이 때 헤테로원자는 O, N 및 S로 이루어지며;
    R5, R6는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소, -OH, -SH, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시기, 할로겐, 알릴록시기(allyloxy), 카르복실산기, 카르복실에스터기 및 카르복시아미드기로 이루어진 군에서 선택된 하나이고;
    R7는 -H, -OH, -SH, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알콕시기, 할로겐, 알릴록시기(allyloxy), 카르복실산기, 카르복실에스터기 및 카르복시아미드기로 이루어진 군에서 선택된 하나이고;
    R2, R3는 서로 동일하거나 상이하고, 각각 독립적으로 수소 및 C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기로 이루어진 군에서 선택된 하나이며;
    R4은 C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기, -NH(R8), -N(R8)2 및 -OH로 이루어진 군에서 선택된 하나이며:
    R8은 C1-4의 직쇄 또는 측쇄 알킬기이다.
  5. 제4항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 (E)-4-(4-히드록시-3-메톡시페닐)-3-부텐-2-온, (E)-4-(3-히드록시-4-메톡시페닐)-3-부텐-2-온 및 (E)-4-(3-플루오로-4-히드록시페닐)-3-부텐-2-온으로 이루어지는 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증, 파제트병, 구루병, 골연화증, 골 용해, 신부전 환자의 신성골이영양증, 관절통, 골절, 류머티스성 골질환, 퇴행성 골질환, 골전이암, 원발성으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환 및 염증성 뼈 흡수질환으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 골 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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