KR102284073B1 - 항염증 활성을 갖는 남극 지의류 움빌리카리아 안타티카 추출물 및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents
항염증 활성을 갖는 남극 지의류 움빌리카리아 안타티카 추출물 및 이를 함유하는 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항-염증 활성을 갖는 남극 지의류 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 움빌리카리아 안타티카(Umbilicaria antarctica) 추출물은 NF-κB 경로에 관여하는 NF-κB 활성화를 약화시킴으로써, 면역 세포에서 NO, 사이토카인 등의 염증 매개체를 하향 조절한다. 따라서, 본 발명의 추출물은 류마티스 관절염, 천식 및 암과 같은 염증성 질환의 예방 및 치료에 유용하다.
Description
본 발명은 항염증 활성을 갖는 남극 지의류 Umbilicaria antarctica 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증은 병원체 손상된 세포 또는 자극제와 같은 유해한 자극에 반응하여 다양한 요인에 의해 신체 조직에서 유도될 수 있는 면역계의 복잡한 생물학적 반응이며, 발적, 부종, 열, 통증 및 조직 기능의 손실이 특징이다 (Ferrero-Miliani L, et al., Clin Exp Immunol 147: 227-235, 2006; Takeuchi O and Akira, Cell 140: 805-820, 2010). 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)는 다양한 전 염증성사이토카인 및 프로스타글란딘 E2(PGE2) 및 산화질소(NO)를 비롯한 다른 전 염증성 분자를 생성하는 대식세포의 강력한 활성화제이다. 이들 분자 중에, 유도성 산화질소합성효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS) 및 사이클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2; COX-2)는 염증에 중요한 역할을 하며, 각각 전 염증 매개체인 NO 및 PGE2를 생성하는 염증 유발 효소이다(Hui-Seong KIM, et al., Molecular Medicine Reports 9: 1388-1394, 2014). 또한, LPS 자극은 종양 괴사 인자-α (tumor necrosis factor-α; TNF-α) 및 인터류킨(interleukin; IL)-6과 같은 염증성 사이토카인의 생성을 유발한다 (Lu Y, et al., Int Immunopharmacol 12: 175-181, 2012). 상기 분자들은 염증성 질환, 예후 및 치료 의사결정을 위한 잠재적인 바이오 마커 역할을 할 수 있다 (Linlin Chen, et al., Oncotarget 9: 7204-7218, 2018).
핵 인자-κB(nuclear factor-κB; NF-κB) 경로는 병원체 관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular patterns; PAMPs), 세포 간 염증성 사이토카인 및 많은 효소와 같은 LPS를 포함한 다양한 자극에 의해 유발된다(James B. Hayes, et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 291: 15614-15627, 2016). LPS는 대식세포의 세포 표면에서, 톨-유사 수용체(toll-like receptor-4; TLR-4)에 결합하고, 세포간 신호전달의 케시케이드를 자극하는 억제제 κB 키나아제(inhibitor κB kinases; IKK) 1α 및 2β를 포함하는 거대한 다중-서브유닛 키나아제 복합체에 의한 억제제 κB(inhibitor κB; IκB)의 인산화를 통해 NF-κB 활성화를 유발한다(Andrea Denk, et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 276: 28451-28458, 2001). IκB 인산화는 26S 프로테아좀에 의한 후속 유비퀴틴화(subsequent ubiquitination) 및 분해를 초래하여, NF-κB의 핵으로의 전위를 허용함으로써, 다양한 유전자의 발현을 조절한다. 상기 경로는 염증성 사이토카인의 생성 및 염증성 세포의 모집을 조절하여 염증반응에 기여한다(Chen J and Chen Z Curr Opin Immunol 25: 4-12, 2013).
한편, 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica; UA)는 석이과(Umbilicariaceae)에 속하는 지의류 종이다. UA는 남극에서 광범위하고 풍부하게 발견되는 종이다. UA는 종종 그늘진 북향의 경사면 및 바위에서 볼 수 있으며, 때로는 수상 지의(fruticose lichen) 및 이끼 쿠션 서브-형성 공동체(moss cushion sub-formation community)에서 주로 발견된다(Beata Krzewicka and Jerzy Smykla, Polar Biol 28: 15-25, 2004). 움빌리카리아 종에서 얻은 추출물은 여러 생물활성 화합물을 함유하고, 멜라닌 생성 억제효과와 함께 항산화, 항미생물, 항암 및 항혈전 활성과 같은 많은 생물학적 기능을 나타내는 것으로 보고되었다 (Kosanic M, Journal of Food Sci 77: 20-25, 2011; 11. Sun Y, Biol Pharm Bull 41: 57-64, 2018; Aslan A, Toxicol Ind Health 28: 505-512, 2012 및 Rankovic B, Biologia 64: 153-158, 2007; 등). 그러나, 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica)의 항염증 효과에 대한 연구는 보고된 바 없다.
이러한 배경기술 아래에서, 본 발명자들은 항-염증 활성을 갖는 남극 천연 추출물을 스크리닝하고자 예의 노력한 결과, NO 및 프로스타글란딘 E2의 생성, 전-염증성 효소의 발현, 및 NF-κB 활성화가 유발된 LPS-자극된 RAW 264.7 대식세포에서 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물을 처리한 경우에 NF-κB 경로 단백질의 활성화를 억제하여 NF-κB p65의 전위를 막음으로써, NO 및 PGE2의 생성, IL-6, TNF-α, iNOS 및 COX-2의 발현이 억제되고 염증반응이 감소하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 항-염증 활성을 갖는 신규한 천연 추출물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 항염증 활성을 갖는 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물 NF-κB 경로에 관여하는 NF-κB 활성화를 약화시킴으로써, 면역 세포에서 NO, 사이토카인 등의 염증 매개체를 하향 조절한다. 따라서, 본 발명의 천연 추출물은 류마티스 관절염, 천식 및 암과 같은 염증성 질환의 예방 및 치료에 유용하다.
도 1: RAW 264.7 세포의 증식에 대한, 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica)의 메탄올 추출물의 효과. 세포를 24시간 동안 다양한 농도의 UA 추출물로 처리하고, MTT 분석에 의해 세포 생존력을 측정하였다. 3개의 독립적 실험의 결과이며, 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다.
도 2: LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 산화 질소 (nitric oxide; NO) 생성 및 유도 질소 산화물 합성효소(iNOS) 발현에 대한 UA 추출물의 억제 효과.
(A) 24시간동안 LPS(0.5 μg/mL)로 처리하기 전에 상기 포를 지시된 농도의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 1시간 동안 처리하였다. 배양 배지의 아질산염 수준은 Griess 반응으로 측정하였다. 3번의 독립적 실험이 수행되었으며, 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. LPS 단독으로 처리 된 세포와 비교하였다 (*는 P <0.05, **는 P <0.01).
(B) 세포를 1시간 동안 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 전처리한 후 6 시간 동안 LPS로 자극 하였다. β-액틴 발현은 정량적 PCR 분석을 위한 내부 대조군으로서 사용되었다.
(C) 세포를 1시간 동안 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 전처리한 후 24시간 동안 LPS로 유도 하였다. 10개의 세포 용해물을 수득하고, iNOS 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 분석 하였다. β-액틴 발현은 웨스턴 블롯 분석을 위한 내부 대조군으로서 사용되었다.
도 3: LPS-자극 된 RAW 264.7 세포에서 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 생산 및 사이클로옥시게나아제-2 (COX-2) 발현에 대한 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 억제 효과.
(A) 24시간동안 LPS(0.5 μg/mL)로 처리하기 전에, 상기 세포를 지시된 농도의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 1시간 동안 처리하였다. 배양 배지에서 PGE2 수준은 ELISA를 사용하여 측정되었다. 3번의 독립적 실험이 수행되었으며, 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. LPS 단독으로 처리 된 세포와 비교하였다 (*는 P <0.05, **는 P <0.01).
(B) 세포를 1시간 동안 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 전처리한 후 6시간 동안 LPS로 유도 하였다. β-액틴 발현은 정량적 PCR 분석을 위한 내부 대조군으로서 사용되었다.
(C) 세포를 1시간 동안 UA로 전처리 한 후 24시간 동안 LPS로 유도하였다. 10개의 세포 용해물을 수득하고, COX-2 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. β-액틴 발현은 웨스턴 블롯 분석을 위한 내부 대조군으로서 사용되었다.
도 4. 전사 및 번역 수준에서 LPS 유도된 RAW 264.7 세포에서의 인터루킨 (IL)-6 및 TNF-α 발현에 대한 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 효과.
(A) 24시간 동안 LPS (0.5 μg/mL)로 처리하기 전에, 상기 세포를 지시된 농도의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 1시간 동안 전처리하였다. 상등액 중의 IL-6 및 TNF-α의 수준은 효소-결합 면역 흡착 분석(ELISA)에 의해 결정되었다.
(B) 세포를 1시간 동안 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 전처리한 후 6시간 동안 LPS로 유도하였다. β-액틴 발현은 정량적 RT-PCR 분석을 위한 내부 대조군으로 사용되었다. 3번의 독립적 인 실험이 수행되었으며, 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. LPS 단독으로 처리 된 세포와 비교하였다 (*는 P <0.05, **는 P <0.01).
도 5: 핵 인자 (NF)-кB 경로의 조절에 대한 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 영향.
세포를 지시된 농도의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 1시간 동안 처리한 후, 30분 동안 LPS (0.5 μg/mL)로 유도하였다. p-IкB 및 p65에 대한 특정 항체를 사용하여 동일한 양의 단백질을 분석 하였다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정된 각 p-IкB 및 p65의 (A) 세포질 및 (B) 핵 구획에서의 단백질 수준. 3번의 독립적인 실험이 수행되었으며, 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. LPS 단독으로 처리 된 세포와 비교하였다 (*는 P <0.05, **는 P <0.01). 웨스턴 블롯 분석을 위한 내부 대조군으로서 GAPDH 및 PCNA 발현이 사용되었다.
도 2: LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 산화 질소 (nitric oxide; NO) 생성 및 유도 질소 산화물 합성효소(iNOS) 발현에 대한 UA 추출물의 억제 효과.
(A) 24시간동안 LPS(0.5 μg/mL)로 처리하기 전에 상기 포를 지시된 농도의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 1시간 동안 처리하였다. 배양 배지의 아질산염 수준은 Griess 반응으로 측정하였다. 3번의 독립적 실험이 수행되었으며, 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. LPS 단독으로 처리 된 세포와 비교하였다 (*는 P <0.05, **는 P <0.01).
(B) 세포를 1시간 동안 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 전처리한 후 6 시간 동안 LPS로 자극 하였다. β-액틴 발현은 정량적 PCR 분석을 위한 내부 대조군으로서 사용되었다.
(C) 세포를 1시간 동안 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 전처리한 후 24시간 동안 LPS로 유도 하였다. 10개의 세포 용해물을 수득하고, iNOS 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 분석 하였다. β-액틴 발현은 웨스턴 블롯 분석을 위한 내부 대조군으로서 사용되었다.
도 3: LPS-자극 된 RAW 264.7 세포에서 프로스타글란딘 E2 (PGE2) 생산 및 사이클로옥시게나아제-2 (COX-2) 발현에 대한 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 억제 효과.
(A) 24시간동안 LPS(0.5 μg/mL)로 처리하기 전에, 상기 세포를 지시된 농도의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 1시간 동안 처리하였다. 배양 배지에서 PGE2 수준은 ELISA를 사용하여 측정되었다. 3번의 독립적 실험이 수행되었으며, 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. LPS 단독으로 처리 된 세포와 비교하였다 (*는 P <0.05, **는 P <0.01).
(B) 세포를 1시간 동안 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 전처리한 후 6시간 동안 LPS로 유도 하였다. β-액틴 발현은 정량적 PCR 분석을 위한 내부 대조군으로서 사용되었다.
(C) 세포를 1시간 동안 UA로 전처리 한 후 24시간 동안 LPS로 유도하였다. 10개의 세포 용해물을 수득하고, COX-2 단백질 수준을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. β-액틴 발현은 웨스턴 블롯 분석을 위한 내부 대조군으로서 사용되었다.
도 4. 전사 및 번역 수준에서 LPS 유도된 RAW 264.7 세포에서의 인터루킨 (IL)-6 및 TNF-α 발현에 대한 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 효과.
(A) 24시간 동안 LPS (0.5 μg/mL)로 처리하기 전에, 상기 세포를 지시된 농도의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 1시간 동안 전처리하였다. 상등액 중의 IL-6 및 TNF-α의 수준은 효소-결합 면역 흡착 분석(ELISA)에 의해 결정되었다.
(B) 세포를 1시간 동안 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 전처리한 후 6시간 동안 LPS로 유도하였다. β-액틴 발현은 정량적 RT-PCR 분석을 위한 내부 대조군으로 사용되었다. 3번의 독립적 인 실험이 수행되었으며, 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. LPS 단독으로 처리 된 세포와 비교하였다 (*는 P <0.05, **는 P <0.01).
도 5: 핵 인자 (NF)-кB 경로의 조절에 대한 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 영향.
세포를 지시된 농도의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 1시간 동안 처리한 후, 30분 동안 LPS (0.5 μg/mL)로 유도하였다. p-IкB 및 p65에 대한 특정 항체를 사용하여 동일한 양의 단백질을 분석 하였다. 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정된 각 p-IкB 및 p65의 (A) 세포질 및 (B) 핵 구획에서의 단백질 수준. 3번의 독립적인 실험이 수행되었으며, 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. LPS 단독으로 처리 된 세포와 비교하였다 (*는 P <0.05, **는 P <0.01). 웨스턴 블롯 분석을 위한 내부 대조군으로서 GAPDH 및 PCNA 발현이 사용되었다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, LPS 자극된 RAW 264.7 세포의 염증 관련 메커니즘에 대한, 남극 지의류 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 유래의 천연 물질 추출물의 항염증 효과를 확인했다. 상기 추출물의 항염증 효과 관련 분자의 메커니즘을 이해하기 위해, NO, PGE2, IL-6, TNF-α 의 생산, iNOS 및 COX-2의 발현 및 NF-κB 경로 단백질의 활성화에 대한 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 억제효과가 뛰어남을 확인하고, 이러한 메커니즘을 통해 항염증 활성을 발현하는 것을 증명하였다. 구체적으로, 염증 반응이 유발되도록 LPS 자극된 RAW 264.7 세포에서, 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물이 iNOS 발현 및 NO의 생성을 억제하는 것을 확인하였으며 (실시예 2), COX-2의 단백질 발현을 억제함으로써, PGE2 생성을 감소시키는 것을 확인하였다 (실시예 3). 또한, 전 염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α의 mRNA 및 단백질 수준도 50%이하로 현저히 감소시키는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기한 것과 같은 움빌리카리아 안타티카 추출물의 항-염증 활성의 작용기전을 확인하였다. 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 전처리가 용량-의존적으로 LPS-자극된 RAW 264.7 세포와 비교하여 p-IκB-α의 세포질 단백질 수준 및 NF-κB p65의 핵 단백질 수준을 현저히 약화시키는 것을 확인 하였으며, 이는 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물이 IκB-α의 인산화 및 NF-κB p65핵 전위를 억제함으로써 NO, PGE2, iNOS, TNF-α 및 IL-6 수준의 LPS 자극에 대한 억제 효과를 매개한다는 것을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 항-염증 활성을 가지는 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물은, NO 및 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2; PGE2)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 “추출물”은 상기 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica)로부터 분리된 항-염증 활성을 가지는 물질을 말한다. 또한 본 발명에서 추출물은 추출액뿐만 아니라 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함하는 의미로 사용된다. 본 발명에서 추출물은 극성, 비극성, 물, 유기 용매 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 유기 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급알코올(메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올 등), 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸 포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매 등을 사용할 수 있으며, 추출물의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다. 여과는 추출액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러 내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 크로마토그래피)에 의한 분리 과정을 추가로 포함할 수 있다. 여액을 건조하는 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라, 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 움빌리카리아 안타크티카(Umbilicaria antarctica) 추출물을 제조하여 항-염증 활성 및 작용기전을 확인하였다. 구체적으로, 동결건조기 (Labconco corp. 12 liter cascade freeze dryer)를 사용하여 48시간 동안 완전 건조 시킨 후 분쇄기 (신일 대형 스텐드 믹서기)를 이용하여 약 10분간 분쇄하여 가루형태의 시료를 준비한다. 준비된 분쇄 시료 약 1g을 Erlenmyer flask (1L)에 넣고 메탄올 500mL를 첨가하고 상온에서 정치된 상태로 약 7일간 추출을 진행한다. 추출된 용액을 여과지(WhatmanTM, glass microfiber filter)를 이용하여 감압 여과하여 용액을 얻고 1L round flask에 옮겨 농축기(화신 기계 상사, Rotary vacuum evaporator)를 이용 완전 농축한다. 농축된 추출물은 50mL 용기로 옮겨 담은 후, 추가로 동결건조기를 이용하여 완전 건조시켜 추출물을 제조하였다.
본 발명의 용어, "항염증"이란, 염증을 억제하거나 감소시키는 작용을 의미하며, 상기 용어, "항염증"은 생체 조직이 손상을 입었을 때에 체내에서 일어나는 방어적 반응으로, 염증성 질환을 유발하는 원인이다. 본 명세서에서 사용된 용어, "항염증"이란 염증을 가라앉히고 예방하는 효능을 의미한다. 상기 항-염증 활성은 NO (산화질소) 억제 효과, PGE2 억제 효과, NF-κB 경로 억제 효과, Nrf2/HO-1 유도 효과, 초기 염증성 인자인 IL-1β, IL-6, TNF-α 등의 발현 억제 효과에 의해 항-염증 활성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물은 항염증 활성을 가짐으로써 염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선에 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물은 NF-κB 경로를 약화 또는 억제하여, 면역 세포에서의 염증성/전염증성 사이토카인과 같은 염증성 매개체를 하향 조절하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물은 IκB-α 인산화를 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물은 NF-κB p65의 핵으로의 전위를 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물은 염증 매개체 및 사이토카인의 발현 및 활성, 및 염증 관련 유전자의 전사를 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물은 유도성 산화 질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS), 사이클로옥시게나아제-2(cyclooxygenase-2; COX-2), 인터류킨-6(IL-6) 및 종양 괴사 인자-α(tumor necrosis factor (TNF)-α)의 발현 또는 활성을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
NO는 몇가지 생리적 및 병리생리학적 효과를 가지는 가용성 자유 라디칼 가스이다. NO는 내피 NOS(endothelial NOS; eNOS), 신경 NOS (neuronal NOS; nNOS) 및 유도성 NOS(inducible NOS; iNOS)를 포함하는 산화 질소 신타아제(NOS) 효소군에 의해 L-아르기닌으로부터 생성된다. iNOS는 eNOS 및 nNOS와 달리 더 많은 양의 NO를 생성하는 칼슘-독립적인 효소로서 NO의 생리학적 생성이 낮은 칼슘 의존적 효소를 가지고 있다. NO는 다양한 병원체를 방어하는 데 중요한 역할을 하지만 염증 환경에서의 iNOS로부터 NO의 과생성은 유해하며, 조직의 손상, 자가면역 질환 및 염증 관련 질환을 유발한다. 따라서, 염증 환경에 대한 반응으로 iNOS 발현의 억제는 염증성 질환을 완화시키는데 유용한 치료전략일 수 있다.
본 발명의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물은 본 발명은 iNOS의 mRNA 및 단백질 수준을 모두 용량 의존적으로 현저하게 감소시켜 NO 생성의 감소를 유발 시킬 수 있다.
프로스타글란딘은 면역 반응 조절, 혈압, 혈소판 응집 및 신경 전달 물질 방출과 같은 신체 생리적 또는 병리학적 변화에 관여한다(Joan Claria Current Pharmaceutical Design 9: 2177-2190, 2003). PGE2는 프로스타글란딘 중에서 가장 많이 연구된 것 중 하나이며, 발적, 통증, 붓기 및 열과 같은 전형적인 염증 증상을 유발하는 모든 과정에 관여한다(Tae-Hwan Kwon et al., Kidney Res Clin Pract. 34: 194-200, 2015). PGE2의 합성은 포스포리파아제 A2(phospholipase A2)의 효소 작용에 의한 막 인지질로부터의 아라키돈산의 방출로 시작된다. 이후, 아라키돈산은 효소 작용에 의해 프로스타글란딘 G2(PGG2)로 전환되며, 이는 사이클로옥시나아제(COX)에 의해 불안정한 대사산물인 프로스타글란딘 H2(PGH2)로 전환된다. COX는 다음 두가지 유형의 동종효소(isoenzyme)로 구성된다: 위 점막 세포 보호 및 항상성 유지와 같은 하우스키핑 기능을 유지하는 생리적 기능을 담당하는 COX1, 및 암 및 염증과 같은 염증성 질환에서 중요한 역할을 하는 염증 자극, 호르몬 및 성장 인자에 의해 유도되는 COX-2(Chusana Mekhora, et al., Asian Pacific J Cancer Prev 13: 653-664, 2012).
따라서, 본 발명의 일 실시예에서, 염증 반응에서 PGE2 및 COX-2 발현에 대한 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 효과를 조사하였다.
본 발명의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물은 COX-2의 발현을 감소시킴으로써, PGE2 생산을 억제할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica)가 전 염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α의 생성 및 발현을 용량 의존적으로 억제함을 확인하였다. 상기 사이토카인은 대식세포에서 염증을 유발하는데 중요한 물질이다. IL-6는 전신 및 국소 염증 반응 모두에 기여하는 급성 단계 반응(acute phase response)에서 강하게 활성화된다. 또한, TNF-α는 염증, 분화, 세포증식 및 자연사멸 동안 면역계에 중요한 역할을 한다. 따라서 상기 사이토카인의 생성 또는 기능의 억제는 본 발명의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 항-염증 활성을 가지는 중요한 메커니즘으로 간주될 수 있다.
본 발명의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물은 IL-6 및 TNF-α와 같은 염증 사이토카인의 생성 또는 활성을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
NF-κB는 염증과정에서 iNOS, COX-2, IL-6 및 TNF-α를 포함한 염증 매개체의 발현을 조절하여 면역을 촉진하는 중요한 전사인자이다(Pichanan Intayoung, et al., Biol. Pharm. Bull. 39: 54-61, 2016). NF-κB 신호전달은 LPS와 같은 박테리아 병원체에 의한 자극 시에 IκB-α 인산화 및 IKK 복합체에의한 분해를 유도함으로써 활성화된다. NF-κB는 핵으로 이동하여 iNOS, COX-2, IL-6 및 TNF-α를 코딩하는 것과 같은 많은 염증성 유전자의 프로모터 영역에서 동족 서열(cognate sequence)에 결합하여 전사를 촉진한다(Ting Liu, Lingyun Zhang, Donghyun Joo, Shao-Cong SunSignal Transduction and Targeted Therapy 2: 17023, 2017).
본 발명의 일 실시예에서, 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물이 사이토카인에 영향을 미치고 항-염증 효과를 가하는 메커니즘을 조사하기 위해, LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 IκB-α의 인산화 및 핵 NF-κB p65의 수준을 평가하였으며, 움빌리카리아 안타티카 추출물이 용량 의존적으로 LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 IκB-α 분해 및 NF-κB p65의 핵으로의 전위를 억제한다는 것을 확인하였다.
본 발명의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물은 NF-κB 경로에 관여하는 NF-κB 활성화를 약화시킴으로써 항-염증 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학 또는 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, RAW 264.7 세포를 24시간 동안 0, 10, 20, 40 및 80 μg/mL의 농도로 움빌리카리아 안타티카 추출물과 함께 인큐베이션 하여 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 세포 독성을 확인하였다. 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물은 최대 80 μg/mL까지 RAW 264.7 세포에 대해 세포독성 효과를 나타내지 않는 것으로 확인되었다(도 1).
따라서 본 발명에 있어서, 상기 염증성 질환의 개선, 예방 또는 치료용 약학/식품 조성물은 독성을 미치지 않기 위해서 함유 농도가 조절될 수 있다. 바람직하게는, 상기 추출물 또는 이의 분획물을 80 μg/mL 이하의 농도로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10 μg/mL 내지 80 μg/mL의 농도로 함유 또는 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica)를 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 분획물은 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 헥산 분획물, 에틸 아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 또는 물 분획물인 것일 수 있다. 상기 분획물은 각각 약학 조성물 또는 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 구체적으로 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 움빌리카리아 안타티카 추출물을 물로 현탁한 후 n-헥세인(n-hexane), 에틸 아세테이트(EtOAc) 또는 n-부탄올(n-BuOH)과 같은 비극성 용매를 사용하여 분획함으로써 극성 용매 분획물과 비극성 용매 분획물을 각각 수득할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 사용된 용매 분획물로서 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 메탄올 추출물을 디메틸 술폭사이드(DMSO, 20 mg/mL -20℃에서 저장)에 용해시키고 지시된 농도(1, 10, 20, 40 및 80 μg/mL)로 희석하였다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 알코올 등의 극성 용매; 헥세인(Hexane), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(Dichloromethane) 등의 비극성 용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 분획 용매 중 알코올을 사용하는 경우에는 구체적으로 C1 내지 C4의 알코올을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인 "염증성 질환"은 염증을 주 병변으로 하는 질병을 총칭하는 것이다.
예를 들어, 각종 암, 부종, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스성 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선 관절염, 골관절염, 류마티스성 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome) 중증근무력증, 다발성 경화증 피부염, 알러지, 비염, 간직성 척추염, 건주위염, 제1형 당뇨병, 피부경화증(scleroderma), 퇴행성 신경질환, 제2형 당뇨병, 규폐증, 죽상동맥경화증, 백반증, 결막염 및 자가면역 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 해당할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 염증성 질환 중 하나인 "자가면역질환"은 자가면역 반응에 의해 발생하는 질환을 총칭하는 것으로서, 예를 들어, 류마티스성 관절염, 전신성 경피증(scleroderma), 아토피 피부염, 건선(乾癬), 천식, 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 중증근무력증, 피부근염(dermatomyositis), 다발성근염(polymyositis), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 자가면역성 뇌척수염, 결절성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa), 측두동맥염(temporal arteritis), 소아기 당뇨병, 원형탈모증, 청포창, 아프타구내염, 크론병 및 베체트병으로 구성된 군에서 선택된 어느 하나에 해당할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 “개선”, "예방" 및 "치료"는 최광의의 개념으로 해석되어야 하며, “개선”이란 질환 또는 하나 이상의 임상적 증상을 일시적/지속적으로 완화시키는 모든 행위를 의미한다. "예방"이란, 질환에 노출되거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있으나 질환의 증상을 아직 경험하거나 드러내지 아니한 환자에게서 질환의 임상적 증상 중 하나 이상이 진행되지 아니하도록 하는 것을 의미한다. "치료"란, 질환 또는 이의 하나 이상의 임상적 증상의 발달을 저지 또는 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 식품 또는 약학 조성물은 그 유효성분인 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 상술한 항-염증 활성을 통한 염증성 질환에 대한 개선, 예방 또는 치료효과를 나타낸다.
상기 약학 조성물은 상기 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물을 함유하는 것 이외에 통상적으로 약학 조성물에 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 비제한적으로 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용가능한 염"이란, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약학적 염은, 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함된다. 옥살산 (oxalic)과 같은 산은 약학적으로 허용되는 것은 아니지만 약학적으로 허용되는 염을 얻기 위한 중간체로서, 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있는 것으로 당업자에게 인식될 수 있는 면역요법, 화학요법 및 방사선요법 등과 같은 염증성 질환의 치료법 및 다른 염증성 질환의 치료용 약학 조성물 등과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 방식은, 예를 들면, 피하, 정맥, 근육 또는 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강기능식품 및 건강식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있으며, 본 발명에 따른 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태일 수 있다.
상기 건강식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강 식품, 건강보조식품의 용어는 혼용된다.
상기 식품조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(foodadditives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 움빌리카리아 안타티카 추출물과 함께 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
(실시예)
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
하기 실시예에서 사용된 재료 및 방법
움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 준비
움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica)는 2017년 1월, 남극대륙의 킹 조지섬(S62°14' 06.15'', W58°46'22.68'')의 바튼반도(Barton Peninsula)에서 수집되었다. NCBI GenBank 데이터베이스에 대한 서열 유사성을 확인하기 위해 BLAST를 사용하여 남극 지의 움빌리카리아 안타티카의 게놈 미토콘드리아 작은 서브유닛 rDNA (mtSSU)의 뉴클레오티드 서열을 분석하여 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica)임을 확인하였다.
추출물은 움빌리카리아 안타크티카(Umbilicaria antarctica)를 동결건조기 (Labconco corp. 12 liter cascade freeze dryer)를 사용하여 48시간 동안 완전 건조 시킨 후 분쇄기 (신일 대형 스텐드 믹서기)를 이용하여 약 10분간 분쇄하여 가루형태의 시료를 준비한다. 준비된 분쇄 시료 약 1g을 Erlenmyer flask (1L)에 넣고 메탄올 500mL를 첨가하고 상온에서 정치된 상태로 약 7일간 추출을 진행한다. 추출된 용액을 여과지(WhatmanTM, glass microfiber filter)를 이용하여 감압 여과하여 용액을 얻고 1L round flask에 옮겨 농축기(화신 기계 상사, Rotary vacuum evaporator)를 이용 완전 농축한다. 농축된 추출물은 50mL 용기로 옮겨 담은 후, 추가로 동결건조기를 이용하여 완전 건조시켜 제조하였다.
In vitro 연구를 위해, 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 메탄올 추출물을 디메틸 술폭사이드(DMSO, 20 mg/mL -20℃에서 저장)에 용해시키고 지시된 농도로 희석하였다.
세포 배양
10% 열-불활성 태아 소혈청(fetal bovine serum; FBS, Invitrogen, Burlington, ON, Canada) 및 1%(w/v) 항생-항진균 용액(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)으로 보충한 둘베스코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium; DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 95%로 가습된 대기 및 5% CO2, 37℃에서 RAW 264.7 세포를 배양하였다.
세포독성 분석
RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트에 1x105 세포/mL의 밀도로 접종하고 다양한 농도의 움빌리카리아 안타티카의 존재 하에서 24시간동안 배양하였다. 포마잔(formazan)에 대한 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT, Amresco, Solon, OH, USA)의 미토콘드리아 의존적 감소를 평가하여 세포 생존률을 결정하였다. 구체적으로 5μL의 5mg/mL MTT 용액을 세포에 첨가하고, 37℃에서 4시간동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 배지를 버리고 생존 세포 유래의 포르마잔 결정을 100μL의 신선한 DMSO에 10분간 용해하였다. 마이크로플레이트 판독기(microplate reader, Thermo Scientific Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 570nm에서 흡광도를 측정했다. 비처리 대조군의 흡광도를 비교함으로써 상대적인 세포 생존률을 계산하였다. 모든 실험은 3회 반복 수행하였다.
산화 질소의 생산의 측정
세포 내 NO 합성효소 활성을 반영하는 배양 배지 및 혈청에서의 아질산염(nitrite) 수준을 Griess 반응을 통해 측정하였다. 구체적으로, 5x105 세포/mL을 96-웰 플레이트에 접종한 뒤 최종부피 200μL에서 24시간동안 0.5 μg/mL의 LPS (0.5 μg/mL, Sigma-Aldrich, CA, USA)로 자극하기 전에 37℃에서 한시간 동안 지시된 농도의 움빌리카리아 안타티카 추출물로 처리하였다. 세포를 96-웰 플레이트에 분배하고, 각각의 상등액 100μL를 동일한 부피의 Griess 시약(1% sulfanilamide, 0.1% N-(1-naphathyl)-ethylenediamine dihydrochloride and 5% phosphoric acid)과 혼합하고 실온에서 5분간 인큐베이션 하였다. 아질산 나트륨을 사용하여 표준곡성을 생성하고, 아질산염의 농도를 540nm에서의 흡광도로 측정하였다. 모든 결정은 3회 반복 수행하였다.
효소-연결 면역흡착 분석(ELISA)
이전에 공지된 한 쌍의 항체(Ju-Mi HONG, et al., International Journal of Molecular Medicine 35: 1403-1410, 2015)를 사용한 ELISA를 통해 처리된 세포 배양 배지의 TNF-α, IL-6 및 PGE2 수준을 측정했다. 구체적으로, RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트에 5x105 세포/mL을 96-웰의 밀도로 접종하고 1시간동안 다양한 농도의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물(1, 10, 20, 40 및 80μg/mL)로 처리한 뒤, 0.5μg/mL의 LPS로 24시간동안 자극하였다. 구매 가능한 DuoSet ELISA 키트 (R&D systems, MN, USA) 및 프로스타글란딘 E2 분석 키트 (Cayman chemical, Ann Arbor, MI)를 각각 사용하여 배양 상등액에서 TNF-α, IL-6 및 PGE2 수준을 제조사의 안내에 따라 측정하였다. TNF-α, IL-6 및 PGE2 농도를 표준 곡선으로부터 측정하고 pg/mL로 나타내었다.
정량 실시간 중합 효소 연쇄 반응 분석(Quantitative real-time polymerase chain reaction analysis; qRT-PCR)
RNA 추출 및 RT-PCR은 기존에 공지된 방법으로 수행하였다(Sung-Suk Suh, et al., International Journal of Medical Sciences 15: 929-936, 2018.). RT-PCR의 경우 올리고(dT) 프라이머 및 M-MLV 역전사효소를 사용하여 1μg의 전체 RNA로부터 단일 가닥 cDNA를 합성하였다. RT-PCR은 Rotor-Gene 6500 RT-PCR 시스템 (Corbett Research, Sydney, Australia)에서 실시간으로 SYBR-Green의 양의 증가를 모니터링하여 수행하였다. 사용된 프라이머는 하기 표 1과 같다.
| 프라이머 이름 | 프라이머 서열(5`-3`) | 서열번호 | |
| iNOS | Sense | GGA GCC TTT AGA CCT CAA CAG A | 1 |
| Antisense | TGA ACG AGG AGG GTG GTG | 2 | |
| COX-2 | Sense | GAA GTC TTT GGT CTG GTG CGT G | 3 |
| Antisense | GTC TGC TGG TTT GGA ATA GTT GC | 4 | |
| IL-6 | Sense | GAG GAT ACC ACT CCC AAC AGA CC | 5 |
| Antisense | AAG TGC ATC GTT GTT CAT ACA | 6 | |
| TNF-α | Sense | CAT CTT CTC AAA ATT CGA GTG ACA A | 7 |
| Antisense | TGG GAG TAG ACA AGG TAC AAC CC | 8 | |
| β-actin | Sense | TGT TTG AGA CCT TCA ACA CC | 9 |
| Antisense | CGC TCA TTG CCG ATA GTG AT | 10 | |
β-액틴은 각 유전자의 발현수준을 표준화하기 위한 참조 유전자로 사용하였다. RT-PCR 열 사이클링 조건은 다음 표 2와 같다(30회 반복).
| 단계 | 조건 |
| - | 37℃, 60분 |
| cDNA 합성 | 72℃, 15분 |
| 변성 (denaturation) | 95℃, 10초 |
| 어닐링 (annealing) | 60℃ 60초 |
| 신장 (elongation) | 72℃, 60초 |
RT-PCR 데이터는 Rotor-Gene 6500 탐지 시스템을 사용하여 수집되었다. 사이클 임계값(Cycle threshold; Ct)은 자동화된 임계값 분석에 의해 결정되었고 프라이머의 품질은 용융 곡선 분석에 의해 확인되었다. 모든 실험은 3회 반복 수행되었다.
면역블롯 분석
웨스턴 블롯 분석은 종래에 공지된 방법으로 수행하였다(Ju-Mi HONG, et al., International Journal of Molecular Medicine 35: 1403-1410, 2015). 전체 단백질(25μg)을 8% 젤에서 SDS-PAGE를 이용하여 분리하고, 분리된 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride; PVDF, Millipore corporation, Billerica MA) 막으로 옮겼다. 상기 막을 차단 용액(5% skim milk)과 함께 인큐베이션한 뒤, 적절한 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음의 1차 항체 및 희석이 사용되었다: iNOS 항체 (1:1000 dilution, Enzo Life Science, NY, USA), COX-2 항체 (1:1000 dilution, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), NF-кB p65 항체 (1:1000 dilution, Cell signaling, CA, USA), phospho-IкB-α 항체 (1:1000 dilution, Cell signaling), β-actin 항체 (1:1000 dilution, Cell Signaling), PCNA 항체 (1:1000 dilution, Santa Cruz Biotechnology) 및 GAPDH 항체 (1:1000 dilution, Santa Cruz Biotechnology). 막을 0.1% Tween 20을 함유하는 Tris 완충 식염수(TBST)로 3회 세척한 후, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase; HRP)-접합된 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology)의 1:2000 희석액과 함께 25℃에서 1시간동안 인큐베이션 하였다. 막을 TBST로 3회 세척한 후, 화학발광 향상 키트(ECL kit, Translab, South Korea)를 사용하여 확인하였다. 정량 분석을 위해 LAS-3000 imager(Fujifilm, Japan)를 사용하여 농도계 밴드 값(densitometric band value)을 측정하였다.
통계 분석
데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 표시하였다. 통계적 차이는 스튜던트 t-검정으로 평가하였다. *P < 0.05 및 **P < 0.01에서 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1: 세포 생존력에 대한 움빌리카리아 안타티카 추출물의 영향(세포 독성 평가)
움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 생물학적 활성을 위한 연구의 전제 조건은 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물이 세포 대사에 유해한 영향을 미치지 않도록 하는 것이다. 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물이 세포 생존력에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해, RAW 264.7 세포를 24시간 동안 0, 10, 20, 40 및 80 μg/mL의 농도로 움빌리카리아 안타티카 추출물과 함께 인큐베이션 하였다. 움빌리카리아 안타티카 추출물은 80 μg/mL까지 RAW 264.7 세포에 대해 세포독성 효과를 나타내지 않는 것으로 확인되었다(도 1). 따라서, 본 발명의 다른 실시예에서도 움빌리카리아 안타티카 추출물의 수준을 최대 80 μg/mL로 사용하였다.
실시예 2: 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물이 iNOS 발현 및 NO 생성에 미치는 영향
LPS-자극된 RAW 264.7 세포는 L-아르기닌에 의해 유도된 iNOS 활성화를 통해 NO의 생성을 증가시킨다. LPS-자극된 iNOS 발현에 대한 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 억제효과를 조사하기 위해, 세포 용해물을 웨스턴 블롯 및 정량 RT-PCR을 이용하여 단백질 및 mRNA 발현에 대해 분석하였다. 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 전처리는 LPS-자극된 iNOS 단백질 및 mRNA 수준을 용량 의존적으로 유의하게 억제하였다 (도 2B 및 도2C). NO생성에 대한 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 효과를 조사하기 위해, Griess 반응을 사용하여 배지의 아질산염 수준을 측정하였다. 도 2A에 도시된 바와 같이, RAW 264.7 세포에서 아질산염의 농도는 LPS 자극시에 실질적으로 증가하였다. 대조적으로 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로의 전처리는 아질산염의 LPS 자극된 생성을 용량의존적으로 억제하였다. 상기 결과는 LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 NO생성의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물-매개 억제가 전사 수준에서 iNOS 발현의 방해와 연관되어 있음을 시사한다.
실시예 3: 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물이 COX-2 발현 및 PGE2 생성에 미치는 영향
움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물이 LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 COX-2 발현을 조절하는지 여부를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 및 정량 RT-PCR을 이용하여 COX-2 단백질 및 mRNA 수준에 대한 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 효과를 각각 평가하였다. LPS-자극된 RAW 264.7 세포는 COX-2 mRNA를 과발현하였고, 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물로 처리된 LPS-자극된 RAW 264.7 감소하는 것으로 확인되었다(도 3B). COX-2 단백질 발현에 대한 결과는 COX-2 mRNA에 대한 결과와 일치하였다. 유사하게도, 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물은 또한 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 COX-2의 단백질 발현을 억제하였다(도 3C). PGE2는 COX-2 생산에 하류 생성물로서 사이클로 옥시게나아제 및 프로스타글란딘 합성효소 경로를 통해 합성된다. 이에 더하여, PGG2 생산에 미치는 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 영향을 평가하였다. COX-2 발현의 억제 이후, 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물은 용량 의존적으로 LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 PGE2 생성을 감소시켰다 (도 3A).
실시예 4: 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물이 전-염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 생성에 미치는 영향
전-염증성 사이토 카인의 LPS- 자극 생성에 대한 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 억제 효과가 추가적으로 조사하기 위해, LPS 처리된 RAW 264.7 세포에서의 IL-6 및 TNF-α의 수준을 ELISA 및 정량 RT-PCR을 사용하여 각각 조사하였다. IL-6 및 TNF-α는 정상 대조군 세포에서만 약간 생성되었고, LPS-처리된 RAW 264.7 세포에서 유의하게 증가하였다. 그러나 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물 (0, 10, 20, 40 및 80 μg/mL)의 전처리는 LPS-자극된 IL-6 및 TNF-α 생산을 용량 의존적으로 현저히 억제하였다(도 4A). 특히 80μg/mL의 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 경우에, IL-6 및 TNF-α의 생산은 LPS-처리된 RAW 264.7 세포에서의 생산값의 50% 이하로 현저히 감소되었다. 더욱이, mRNA 발현에 대한 움빌리카리아 안타티카 추출물의 억제 효과는 단백질 생산과 유사한 패턴을 따르는 것으로 나타났다(도 4B). IL-6 및 TNF-α의 mRNA 수준은 LPS에 의해 유의하게 증가하였지만, 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물을 사용한 전처리는 IL-6 및 TNF-α의 수준을 용량의존적으로 현저히 감소시켰다. 따라서, 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물은 LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 전-염증성 사이토카인의 단백질 및 mRNA 수준 모두 억제한다.
실시예 5: 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물이 NF-кB 경로(NF-кB pathway)에 미치는 영향
종래의 연구들은 NF-κB가 iNOS, COX-2 및 TNF-α 및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인의 발현을 조절하는 중요한 전사인자임을 시사하였다. 따라서, LPS-자극된 NF-κB 활성화에 대한 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물의 효과를 조사하였다. 도 5에 도시된 바와 같이 LPS 자극은 IκB-α의 인산화 및 NF-κB p65핵 전위를 유발하였다. 그러나, 움빌리카리아 안타티카(Umbilicaria antarctica) 전처리는 용량-의존적으로 LPS-자극된 RAW 264.7 세포와 비교하여 p-IκB-α의 세포질 단백질 수준 및 NF-κB p65의 핵 단백질 수준을 현저히 약화시켰다. 상기 결과는 움빌리카리아 안타티카(Umbilicaria antarctica) 추출물이 IκB-α의 인산화 및 NF-κB p65핵 전위를 억제함으로써 NO, PGE2, iNOS, TNF-α 및 IL-6 수준의 LPS 자극에 대한 억제 효과를 매개한다는 것을 나타낸다.
결론적으로, 상기 실시예들은 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물이 in vitro에서 항-염증 효과를 발휘하는 것에 관한 것이다. 움빌리카리아 안타티카(Umbilicaria antarctica)는 NF-κB 경로에 관여하는 NF-κB 활성화를 약화시킴으로써, LPS-자극된 RAW 264.7 세포에서 염증 매개체를 하향 조절하여 항-염증 활성을 나타내고 있음을 시사한다. 따라서, 이러한 결과는 움빌리카리아 안타티카 (Umbilicaria antarctica) 추출물이 류마티스 관절염, 천식 및 암과 같은 염증성 질환의 치료에 효과적인 치료 용도로 사용할 수 있음을 시사한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology
<120> An Extract of Umbilicaria antarctica Having Anti-inflammatory and
Immuno-modulating Activity and Composition Comprising the Same
<130> P19-B271
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS primer Sense
<400> 1
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<212> DNA
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<223> iNOS primer Antisense
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<213> Artificial Sequence
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Claims (6)
- 삭제
- 삭제
- 분쇄된 움빌리카리아 안타티카를 알코올에 첨가하여 추출된 추출물을 감압여과, 농축 및 동결건조하고, 유기용매에 재용해하여 제조되는 움빌리카리아 안타티카(Umbilicaria antarctica) 추출물 또는 이의 분획물을 10μg/mL 내지 80μg/mL의 농도로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 분쇄된 움빌리카리아 안타티카를 알코올에 첨가하여 추출된 추출물을 감압여과, 농축 및 동결건조하고, 유기용매에 재용해하여 제조되는 움빌리카리아 안타티카(Umbilicaria antarctica) 추출물 또는 이의 분획물을 10μg/mL 내지 80μg/mL의 농도로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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| Elzbieta Studzinska-Sroka, et al., Herba Polonica, 2018, Vol.64(1), (2018.03.27. 공개)* |
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