KR20220064019A - 남극 지의류 아만디네아 추출물의 제조방법 및 아만디네아 추출물을 포함하는 조성물 - Google Patents

남극 지의류 아만디네아 추출물의 제조방법 및 아만디네아 추출물을 포함하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 남극 지의류 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물의 제조방법 및 상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물은 시험관 내 RAW264.7 세포 및 생체 내 제브라피쉬에서 전염증성 사이토카인 및 염증성 매개체의 생성을 억제하고 NF-κB 경로를 불활성화 시키므로, 염증성 질환의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

남극 지의류 아만디네아 추출물의 제조방법 및 아만디네아 추출물을 포함하는 조성물{A Method for Preparing An Extract of Antarctic Lichen Amandinea sp. and Composition Comprising the Extract of Amandinea sp.}
본 발명은 남극 지의류(lichen) 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물의 제조방법 및 상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
신체는 감염 및 손상으로부터 자신을 보호하기 위해 면역계로 불리는 방어 메카니즘을 갖는다. 염증반응은 신체의 면역계의 일차 반응이다. 염증반응 동안 손상 또는 감염을 효과적으로 최소화하기 위해 여러 세포 및 분자가 관련된다(Chen, L., et al. (2018). Oncotarget, 9(6) 7204-7218.). 사이토카인은 일반적으로 면역반응의 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. 사이토카인은 전(pro-)염증성 및 항(anti-)염증성 사이토카인, 및 전염증성 사이토카인의 가용성 억제제로서 분류될 수 있다. 인터루킨-6(IL-6), 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-1(IL-1), IL-12 및 인터페론-γ(IFN-γ)와 같은 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)은 염증을 촉진하는 반면, IL-1 수용체 길항제, IL-4, IL-6, IL-10, IL-11, 및 IL-13과 같은 항염증성 사이토카인은 전염증성 사이토카인의 생성을 억제하거나 염증반응에서 다수의 다른 억제효과를 발휘한다(Turner, MD., et al. (2014). Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research,　1843(11), 2563-2582.). 또한, NF-κB경로는 전염증성 사이토카인에 의해 활성화되는 프로토타입 전염증 신호전달 경로로서 간주되고, NF-κB의 역할은 광범위하게 연구되고 있다(Lawrence, T. (2009). Cold Spring Harbor Laboratory Press,　1(6), 1-10.).
LPS에 의해 유도된 뮤린(murine) 대식세포 세포주 RAW 264.7는 천연 화합물로부터 항염증 활성을 스크리닝하는 시험관 내 연구에 통상적으로 사용된다. RAW 264.7 세포의 LPS 자극 시, 전염증성 사이토카인 및 염증성 매개체 수준의 증가가 관찰되었다(Doyle, SL., O'Neill, LA. (2006). Biochemical pharmacology,　72(9), 1102-1113.; Kim, HK., et al. (1999). Biochemical pharmacology,　58(5), 759-765.). 또한, 제브라피쉬(Danio rerio)는 생체 내 동물모델로서 많은 이점을 갖는다. 제브라피쉬는 생물학, 배아학, 분자생물학, 면역학 및 독성약물 발견 연구와 같은 다양한 분야에서 널리 사용되어 왔으며, 생체 내 제브라피쉬 항염증 시험 모델은 항염증 검정을 위한 최상의 도구로서 인식된다(Liao, YF., et al. (2011). Journal of Food & Drug Analysis,　19(2).; Lee, SH., et al. (2013). Carbohydrate polymers,　92(1), 84-89.).
한편, 지의류(lichen)는 2개의 상이한 유기체인 진균 및 조류의 공생 관계로부터 유래되는 복합 유기체이다. 이들의 공생 존재로 인해, 지의류는 극단적인 생활 조건에 잘 적응할 수 있고 계속해서 성장할 수 있다. 이들은 사막지역, 연안지역, 임야지역 및 극지방과 같은 극단적인 환경에서 광범위하게 분포된다. 남극은 대부분 얼음으로 덮히고, 얼음이 없는 지상 영역은 지피식물(ground cover)의 0.5% 미만으로 구성된다. 이러한 극단적인 조건에서도, 62종의 지의류는 남극대륙에서 King George Island의 Barton Peninsula에 서식한다. 지의류는 우수한 약리학적 효과를 갖는 여러 2차 대사산물을 생산하는 것으로 알려져 있으며(Muller, K. (2001). Applied Microbiology and Biotechnology,　56(1-2), 9-16.), 다양한 종의 지의류로부터의 추출물은 항산화, 항박테리아, 및 항증식 활성을 갖는 것으로 보고되어 있다(Tanas, S., et al. (2010). Journal of natural medicines,　64(1), 42.; Mitrovic, T., et al. (2011). International journal of molecular sciences,　12(8), 5428-5448.). 그러나, 남극 지의류 아만디네아(Amandinea sp.)에 대한 연구는 미흡한 실정이며, 아만디네아 추출물의 항염증 효과는 보고된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 항염증 활성이 우수한 남극 지의류(lichen) 추출물을 스크리닝하고자 예의 노력한 결과, 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물이 RAW264.7 대식세포 및 제프라피쉬에서 LPS에 의해 유도되는 염증반응에 대한 항염증 효과를 갖는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 항염증 활성이 우수한 신규한 천연 추출물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 항염증 활성이 우수한 신규한 천연 추출물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 아만디네아 샘플을 건조하여 분말화시키는 단계; (b) 상기 분말화된 아만디네아를 극성 유기용매로 추출하는 단계; 및 (c) 상기 추출된 추출액에서 용매를 제거하여 아만디네아 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 방법으로 제조된 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품을 제공한다.
본 발명에 따르면 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물은 시험관 내 RAW264.7 세포 및 생체 내 제브라피쉬에서 전염증성 사이토카인 및 염증성 매개체의 생성을 억제하고 NF-κB 경로를 불활성화 시키므로, 염증성 질환의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1A는 남극 지의류인 아만디네아(Amandinea sp.)의 천연 서식지를 나타낸다. 도 1B는 아만디네아 추출물이 세포 생존율에 미치는 효과를 나타내고, 도 1C는 아만디네아 추출물이 NO 생산에 미치는 효과를 나타낸다. 이들 데이터는 3회 반복의 평균±SEM을 나타낸다. LPS 자극군(#)에 대하여, *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001이다.
도 2는 ELISA 및 qPCR을 사용하여 LPS-자극된 Raw 264.7 세포에서의 염증성 유전자 발현의 측정을 도시한다. IL-6 (A) 및 TNF-α (C)의 단백질 수준을 도시하며, IL-6 (B) 및 TNF-α (D)의 상대적인 mRNA발현을 도시한다. 이들 데이터는 3회 반복의 평균±SEM을 나타낸다. LPS 자극군(#)에 대하여, *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001 이다.
도 3은 qPCR 및 웨스턴 블롯팅을 사용하여 LPS-자극된 Raw 264.7 세포에서의 염증성 유전자 발현의 측정을 도시한다. iNOS(A) 및 COX-2(C)의 상대적인 mRNA발현을 도시하며, iNOS (B) 및 COX-2 (D)의 단백질 수준을 도시한다. 이들 데이터는 3회 반복의 평균±SEM을 나타낸다. LPS 자극군(#)에 대하여, NS, p>0.05; *, p < 0.05; **, p < 0.01; 및 ***, p < 0.001 이다.
도 4는 웨스턴 블롯팅을 사용하여 LPS-자극된 Raw 264.7 세포에서 NF-κB 신호전달 경로에서의 단백질 p-l
Figure pat00001
B-α (A) 및 p65 (B) 발현의 측정을 도시한다. 이들 데이터는 3회 반복의 평균±SEM을 나타낸다. LPS 자극군(#)에 대하여, NS, p>0.05; *, p < 0.05; **, p < 0.01; 및 ***, p < 0.001 이다.
도 5는 생존율(A), 형태학적 변화(B), 심장 박동수(C), 및 제브라피쉬 배아의 신체 길이(D)에 대한 아만디네아 추출물의 효과를 도시한다. *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001.
도 6은 DCF-DA를 사용하여 LPS-자극된 제브라피쉬 유충에서 ROS 축적의 측정을 도시한다. 도 6A는 형광 현미경에 의해 측정된 ROS 생성의 수준을 도시하고, 도 6B는 이미지 J 프로그램을 사용하여 정량화된 각각의 제브라피쉬에서의 ROS 수준의 형광 강도를 도시한다. *p < 0.05, **p < 0.01, 및 ***p < 0.001.
도 7은 qPCR을 사용하여 꼬리 절단 후 제브라피쉬 유충에서 염증성 유전자인 IL-6 (A), IL-1
Figure pat00002
(B), IL-10 (C), TNF-α (D), iNOS (E), 및 COX-2 (F)의 상대적인 발현의 측정을 도시한다. 꼬리 절단군(#)에 대하여, NS, p>0.05; *, p < 0.05; **, p < 0.01; 및 ***, p < 0.001 이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 남극에서 수집한 지의류 샘플을 완전히 건조하여, 분말화시켰다. 분말화된 지의류를 메탄올로 추출한 후, 메탄올을 증발시켰다. 이어서, 건조된 추출물을 DMSO에 용해시켜 아만디네아 추출물을 수득하였다. 또한, 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물은 시험관 내 RAW264.7 대식세포 및 생체 내 제브라피쉬에서 NO의 생성, IL-6, IL-1β, IL-10 및 TNF-α 등과 같은 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 발현, 유도성 산화질소 효소(iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2) 등과 같은 염증성 매개체(inflammatory mediators)의 발현, 세포질(cytosolic) p-IκB-α 및 핵 인자 p65의 발현 및 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성을 억제시킴으로써, 염증성 질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 (a) 아만디네아 샘플을 건조하여 분말화시키는 단계; (b) 상기 분말화된 아만디네아를 극성 유기용매로 추출하는 단계; 및 (c) 상기 추출된 추출액에서 용매를 제거하여 아만디네아 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 극성 유기용매는 추출물은 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 용매는 메탄올이다.
본 발명에서 용어, "지의류"는 균류와 조류 또는/및 시아노박테리아(cyanobacteria)의 공생 복합체를 의미하며, 약 14,000 종으로 분류된다.
본 발명에서 용어 "추출물"은 상기 아만디네아(Amandinea sp.)으로부터 분리된 항염증 활성을 가지는 물질을 말한다. 또한 본 발명에서 추출물은 추출액뿐만 아니라 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함하는 의미로 사용된다. 본 발명에서 추출물은 극성, 비극성, 물, 유기용매 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 극성 유기용매를 사용하여 추출할 수 있다. 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급알코올(메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올 등), 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 디클로로메탄, 사염화탄소 및 벤젠, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, N, N-디메틸 포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매 등을 사용할 수 있으며, 추출물의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다. 여과는 추출액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러 내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 크로마토그래피)에 의한 분리 과정을 추가로 포함할 수 있다. 여액을 건조하는 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라, 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 상기 추출된 추출액에서 고속 진공 농축기를 사용하여 용매를 증발시킴으로써 용매를 제거하여 아만디네아 추출물을 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 하나 이상의 하기 특징을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다:
1) 산화질소(NO)의 생성 억제;
2) IL-6, IL-1β, IL-10 및 TNF-α의 발현 억제;
3) 유도성 산화질소 효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 발현 억제;
4) NF-κB(nuclear factor kappa B)의 불활성화;
5) 세포질(cytosolic) p-IκB-α 및 핵 인자 p65의 발현 억제; 및
6) 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성 억제.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 산화질소(NO)의 생성을 억제하는 것을 확인하였다(실시예 2). NO는 다양한 면역 세포에서 생성되는 세포 내 매개체인 작은 분자이며, 염증 증상의 생리학적 및 병리학적 상태에 중추적인 역할을 한다.
본 발명에서 용어 "산화질소(NO)"는 세포 내 염증반응 유발시 산화질소 합성효소에 의해 생성량이 증가하는 물질로, 염증반응의 지표가 되는 분자이다. 신경계에서 산화질소는 신경세포에 존재하는 신경계 산화질소 합성효소(NOS)에 의하여 합성된다. 상기 합성된 산화질소는 뇌세포에서 cGMP의 생성을 증가시키고, 이로 인하여 외부로부터 인지한 정보를 오랫동안 저장하는 기능을 수행한다. NO는 자유 라디칼로 생리학적, 병리학적 과정에 관련된 것으로 알려져 있다. NO는 산화질소 합성효소에 의해 엘-아르기닌(L-Arginine) 산화에 의해 합성된다(Atkan, et al., 75: 639-653, 2004).
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 IL-6, IL-1β, IL-10 및 TNF-α의 발현을 억제하는 것을 확인하였다(실시예 3 및 7). TNF-α, IL 등과 같은 전염증성 사이토카인의 과잉 생성은 염증질환의 발병에 기여한다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 유도성 산화질소 효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 발현을 억제하는 것을 확인하였다(실시예 3 및 7). iNOS 및 COX-2는 염증성 매개체로서, iNOS는 NO를 생성하는 염증성 분자이며, COX-2는 PGE2를 생성한다. iNOS 및 COX-2의 과도한 활성 증가는 다양한 염증질환의 병인일 수 있다.
본 발명에서 용어 "COX-2"는 염증반응과 관련된 단백질인 프로스타글라딘을 생성하는데 관여하는 효소로, 세포내 COX-2 발현 수준의 증가는 염증반응이 진행되고 있음을 나타내는 지표가 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 NF-κB(nuclear factor kappa B) 경로를 불활성화하고, 세포질(cytosolic) p-IκB-α 및 핵 인자 p65의 발현을 억제하는 것을 확인하였다(실시예 4).
NF-κB는 면역 및 염증반응에서 중요한 역할을 하는 전사인자이며, 활성화된 NF-κB는 다양한 염증인자의 발현을 유도한다. NF-κB는 IL-6, TNF-α, iNOS, COX-2 및 IL-1β를 포함하는 150개 이상의 유전자를 조절하는 전사인자로 알려져 있다. IκB-α는 LPS, TNF 또는 IL-1에 의해 매개되는 NF-κB 활성화에서 중요한 역할을 한다. IκB-α의 활성화는 LPS-유도된 인산화에 의해 발생하여, p65의 핵 전좌(translocation)를 유도한다. 실시예 4에서, 아만디네아 추출물의 처리는 p-IκBα 및 p-65 수준의 감소효과가 있었으며, 이는 추출물의 성분이 NF-κB 신호전달을 억제하여 TNF-α, IL-6 및 NO와 같은 사이토카인 및 매개체의 발현을 감소시켰음을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 제브라피쉬의 생체 내 실험을 통하여 상기 추출물은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성을 용량-의존적으로 억제하는 것을 확인하였다(실시예 6 및 도 6).
ROS 수준은 염증과 밀접하게 연관되고, 산화적 스트레스로 인한 높은 ROS 생성은 세포 또는 조직 손상을 야기한다. 활성화된 호중구 및 대식세포에서의 ROS 축적은 전염증성 사이토카인 및 매개체의 방출을 유도한다.
본 발명의 용어 "항염증"이란, 염증을 억제하거나 감소시키는 작용을 의미하며, 상기 용어 "항염증"은 생체 조직이 손상을 입었을 때에 체내에서 일어나는 방어적 반응으로, 염증성 질환을 유발하는 원인이다. 본 명세서에서 사용된 용어, "항염증"이란 염증을 가라앉히고 예방하는 효능을 의미한다. 상기 항-염증 활성은 NO (산화질소) 억제 효과, PGE2 억제 효과, NF-κB 경로 억제 효과, Nrf2/HO-1 유도 효과, 초기 염증성 인자인 IL-1β, IL-6, TNF-α 등의 발현 억제 효과에 의해 항-염증 활성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "염증"이란, 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 각종 유해한 자극에 의한 상해를 제거하여 원래의 상태로 회복하려는 생체방어 기전이다. 염증의 자극에는, 감염 혹은 화학적, 물리적 자극이 있으며, 염증의 과정은 급성과 만성 염증의 2가지로 나눌 수 있다. 급성염증은 수일 이내의 단기적인 반응이며, 혈장성분이나 혈구 등이 미소순환계를 게재하여 이물 제거에 관련한다. 만성염증은 지속시간이 길며, 조직의 증식 등이 보여진다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 항염증 약학 조성물은 항염증 활성을 가짐으로써 염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선에 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 하나 이상의 하기 특징을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다:
1) 산화질소(NO)의 생성 억제;
2) IL-6, IL-1β, IL-10 및 TNF-α의 발현 억제;
3) 유도성 산화질소 효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 발현 억제;
4) NF-κB(nuclear factor kappa B)의 불활성화;
5) 세포질(cytosolic) p-IκB-α 및 핵 인자 p65의 발현 억제; 및
6) 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성 억제.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 상기 추출물을 10μg/mL 내지 80μg/mL의 농도로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 25μg/mL 내지 50μg/mL의 추출물을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 염증성 질환은 관절염, 비염, 간염, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 화상 염증, 피부염, 치주염, 치은염 및 퇴행성 신경염증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 "염증성 질환"은 염증을 주 병변으로 하는 질병을 총칭하는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 비제한적으로 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용가능한 염"이란, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약학적 염은, 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함된다. 옥살산 (oxalic)과 같은 산은 약학적으로 허용되는 것은 아니지만 약학적으로 허용되는 염을 얻기 위한 중간체로서, 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있는 것으로 당업자에게 인식될 수 있는 면역요법, 화학요법 및 방사선요법 등과 같은 염증성 질환의 치료법 및 다른 염증성 질환의 치료용 약학 조성물 등과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 방식은, 예를 들면, 피하, 정맥, 근육 또는 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 식품은 하나 이상의 하기 특징을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다:
1) 산화질소(NO)의 생성 억제;
2) IL-6, IL-1β, IL-10 및 TNF-α의 발현 억제;
3) 유도성 산화질소 효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 발현 억제;
4) NF-κB(nuclear factor kappa B)의 불활성화;
5) 세포질(cytosolic) p-IκB-α 및 핵 인자 p65의 발현 억제; 및
6) 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성 억제.
본 발명에 있어서, 상기 식품은 상기 추출물을 10μg/mL 내지 80μg/mL의 농도로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 25μg/mL 내지 50μg/mL의 추출물을 포함한다.
본 발명에서 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강기능식품 및 건강식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있으며, 본 발명에 따른 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태일 수 있다.
상기 건강식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강 식품, 건강보조식품의 용어는 혼용된다.
상기 식품조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 식품에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(foodadditives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 아만디네아 추출물과 함께 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 용어 "개선", "예방" 및 "치료"는 최광의의 개념으로 해석되어야 하며, "개선"이란 질환 또는 하나 이상의 임상적 증상을 일시적/지속적으로 완화시키는 모든 행위를 의미한다. "예방"이란, 질환에 노출되거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있으나 질환의 증상을 아직 경험하거나 드러내지 아니한 환자에게서 질환의 임상적 증상 중 하나 이상이 진행되지 아니하도록 하는 것을 의미한다. "치료"란, 질환 또는 이의 하나 이상의 임상적 증상의 발달을 저지 또는 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예1: 물질 및 분석방법
실시예1-1: 지의류(lichen)의 수집 및 추출물의 제조
지의류 샘플은 남극대륙의 Ardley island 상의 62°12'57.82"S, 58°56'01.87"W 에서 수집하였다. 샘플 동정 및 수집지역에 관한 상세한 정보는 표 1에 도시되어 있다. 확증표본(Voucher specimens)은 한국 극지연구소(Korea Polar Research Institute)에 보관되었다. 지의류 샘플을 완전히 건조하여, 막자(pestle) 및 모르타르(mortar)를 사용하여 분말화시켰다. 분말화된 지의류를 2주 동안 25°C의 어둠속에서 메탄올(1g/10mL)로 추출하였다. 추출물 중의 메탄올을 고속 진공 농축기(speed vacuum concentrator)를 사용하여 증발시켰다. 이어서, 건조된 추출물을 DMSO에 최종 농도 20 mg/mL로 용해시켰다.
지의류 수집 지역.
샘플 No. 종 지역 명칭 GPS 위치
2017-Ant-064 Amandinea sp. Ardley island, Antarctica 62°12'57.82"S, 58°56'01.87"W
실시예1-2: 세포 배양 및 처리
뮤린 대식세포 Raw 264.7 세포를 5% CO2/95% 공기 중 37°C에서 10% 소태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신(PS)을 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)에서 배양하고 배지를 5% FBS 및 1% PS를 함유하는 DMEM으로 교체한 후 처리하였다.
실시예1-3: 세포독성 분석
The MTT [(3-(4,5)-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 분석을 사용하여 세포 생존율을 평가하였다. Raw 264.7 세포(96-웰 플레이트에서 2.5 X 104 cells/well)를 4시간 동안 배양한 후, 다양한 농도의 지의류 추출물(0, 10, 20, 40, 및 80 μg/mL)로 24시간 동안 처리하였다. 배양 후, 5 μM MTT 용액을 각 웰에 첨가하고 4시간 동안 배양하였다. 각 웰의 배지를 제거한 다음, 100 μL/well의 DMSO를 첨가하고 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 결정했다. 상대적인 세포 생존율(%)은 미처리 대조군 세포에 대한 백분율로서 계산하였다.
실시예1-4: NO 측정
Griess 시약은 세포 배양 배지에서 아질산염(Nitrite) 생산을 검정하는 데 사용하였다. Raw 264.7 세포(96-well plate 에서 5 x 105 cells/well)를 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 신선한 DMEM 배지 (5 % FBS)로 교체한 다음 37 °C에서 4시간 동안 배양했다. 세포를 다양한 농도의 지의류 추출물(0, 10, 20, 40, 80 μg/mL)로 1시간 동안 처리한 후, E.coli 지질다당류(LPS, serotype O111:B4)로 24시간 동안 처리했다. 세포 배양 배지(100 μL/well)를 96-웰 플레이트의 웰로 옮긴 다음 동일한 부피의 Griess 시약(1% sulfanilamide 및 0.1% N-1-naphylenediamine dihydrochloride in 2.5% phosphoric acid)을 첨가하고, NO 농도를 확인하기 위해 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예1-5: IL-6 및 TNF-α의 측정
Sandwich-enzyme-linked immunosorbent assay kits(ELISA)를 사용하여 세포로부터 분비된 IL-6(DY406-05, R&D Systems Inc, USA) 및 TNF-α(DY410-05, R&D Systems Inc, USA)의 농도를 측정하였다. Raw 264.7 세포(2.5 x 104 cells/mL)를 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 새로운 DMEM 배지로 교체한 다음 37°C에서 4시간 동안 배양하였다. 세포를 다양한 농도의 지의류 추출물(0, 10, 20, 40, 80 μg/mL)로 1시간 동안 처리한 후, 0.5 μg/mL의 E.coli 지질다당류(LPS, serotype O111:B4)로 24시간 동안 처리했다. ELISA는 제조업체의 지침에 따라 수행하였고, 광학밀도는 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 즉시 측정하였다.
실시예1-6: 정량적 실시간 PCR 분석 (IL-6, TNF-α, iNOS, COX-2, IL-1β, IL-10)
총 RNA를 제조업체의 지침에 따라 easy-BLUETM Total RNA Extraction Kit (17061, Intron biology)를 사용하여 분리하였다. RNA (1 μg)를 M-MLV 역전사효소 (RT001S, Sigma-Aldrich)를 사용하여 역전사시킨 후, Rotor 유전자 6500 (Corbett research)을 사용하여 TOPrealTM qPCR 2X PreMIX (RT500, Enzynomics)로 실시간 PCR 증폭을 수행했다. 표적 유전자 프라이머 서열은 표 2에 기재되어 있다. 발현 데이터는 비교 사이클 역치(Ct) 방법을 사용하여 분석하였고, β-액틴 발현의 수준으로 표준화하였다.
정량적 실시간 PCR에 사용된 PCR 프라이머의 목록
표적 유전자 프라이머 배향 서열 Size(bp) 서열번호
Raw264.7 IL-6 forward 5'- CTCTGGGAAATCGTGGAAAT -3' 134 1
reverse 5'-CCAGTTTGGTAGCATCCATC -3' 2
TNF-α forward 5'- CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA -3' 175 3
reverse 5'- TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC -3' 4
iNOS forward 5'- GGAGCCTTTAGACCTCAACAGA -3' 123 5
reverse 5'- TGAACGAGGAGGGTGGTG -3' 6
COX-2 forward 5'- GAAGTCTTTGGTCTGGTGCGTG -3' 133 7
reverse 5'- GTCTGCTGGTTTGGAATAGTTGC -3' 8
β-actin forward 5'- TGTTTGAGACCTTCAACACC -3' 195 9
reverse 5'- AGTCTGTCAGGTCCCGGCC -3' 10
Zebrafish IL-6 forward 5'- TGAAGGGGTCAGGATCAGCA -3' 108 11
reverse 5'- CACGTCAGGACGCTGTAGATT -3' 12
IL-1β forward 5'- GCACGGCTATTCAGAGATGGT -3' 133 13
reverse 5'- CCAAGAATAAGCAGCACTTGGG -3' 14
IL-10 forward 5'- TAGGATGTTGCTGGGTTGGAC -3' 148 15
reverse 5'- TAGTGTGATGGATGGACGGG -3' 16
TNF-α forward 5'- TCTCAGGGCAAGAAATTCGAC -3' 90 17
reverse 5'- TCTCACTGCATCGGCTTTGT -3' 18
iNOS forward 5'- CTGCGGTGGAATGAACATGG -3' 93 19
reverse 5'- TCTCCAGCTTCTACCTCGCTC -3' 20
COX-2 forward 5' -GCTGCTTTGGTGGACTTACAG -3' 100 21
reverse 5'- TCAGAGGAGGGCTATTGTCAG -3' 22
rpp0 forward 5'- CTGAACATCTCGCCCTTCTC -3' 161 23
reverse 5'- TAGCCGATCTGCAGACACAC -3' 24
실시예1-7: 면역블로팅(Immunoblotting)
단백질을 RIPA 완충액(Sigma), 프로테아제 억제제 칵테일 정제(Roche) 및 포스파타제 억제제 칵테일 정제(Rhoche) 또는 핵 추출 키트 (ab113474, Abcam)를 사용하여 추출하였다. 추출된 단백질(20μg)을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, PVDF 막으로 옮기고, TBST 완충액에서 5% 탈지유로 1시간 동안 세척하고, 1차 항체와 4°C에서 밤새 배양하였다. 1차 항체는 iNOS (ADI-905-431, Enzo), COX-2 (SC-166475, Santa Cruz Biotechnology), p-IκBα (#2859, Cell signaling), p65 (#3033, Cell signaling), PCNA (SC-25280, Santa Cruz Biotechnology) 및 GAPDH (SC-25778, Santa Cruz Biotechnology)이었다. 2차 항체는 항-마우스(HAF007, DuoSet) 및 항-래빗(SC-2537-CM, Santa Cruz Biotechnology)이였다. 블롯을 증강된 화학발광(ECL) 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 분석하였다.
실시예1-8: 모(parental) 제브라피쉬의 기원 및 유지
성인 제브라피쉬를 상인(Ansan aquarium, Korea)으로부터 입수하고, 14:10h 명:암 주기로 28°C±0.5로 유지하였다. 짝을 이루기 전에, 제브라피쉬를 암컷 및 수컷의 2개의 그룹으로 분리하였다. 이들은 아침에 접촉하여 빛에 반응하여 30분 이내에 알을 낳았다.
실시예1-9: 배아 독성의 측정
수정 후 6시간(hpf)에서, 제브라피쉬 배아(n = 10)를 웰 당 2 mL의 배아 배지를 함유하는 12-웰 플레이트로 옮겼다. 배아를 다양한 농도의 지의류 추출물(0, 1, 10, 100, 200 및 400 μg/mL)로 120 hpf 동안 처리하였다. 처리액 중의 최종 DMSO 농도는 1%였다.
생존율은 120 hpf까지 매일 측정하였다. 제브라피쉬를 48 hpf에서 0.25 mg/mL tricaine으로 마취시키고, 심장 박동수 및 신체 길이를 현미경을 사용하여 분석하였다.
실시예1-10: 제브라피쉬에서의 ROS 수준의 측정
제브라피쉬 유충에서의 ROS 생성은 인용문헌(Jeong, JW., et al. (2017). Molecular & Cellular Toxicology,　13(4), 405-417.)에 기재된 바와 같이, 산화-민감성 형광 프로브 염료인 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA, Sigma)를 사용하여 검출하였다. 3 hpf에서, 제브라피쉬 유충 (n = 10)을 12-웰 플레이트로 옮기고, 10 μg/mL LPS (지의류 추출물을 갖거나 갖지 않음)로 24시간 동안 처리하였다. 처리 후, 제브라피쉬 유충을 12-웰 플레이트로 옮기고 DCF-DA를 최종 농도 20 ㎍/mL로 배아 배지에 첨가하였다. 암실에서 28.5°C에서 1시간 동안 배양한 후, 제브라피쉬 유충을 배아 배지로 세척한 다음, 0.25mg/mL 트리카인(tricaine)으로 마취시켰다. ROS 생성을 형광 현미경으로 관찰하고, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다.
실시예1-11: 꼬리 절단(Tail transection) 모델
염증반응에 대한 지의류 추출물의 효과는 인용문헌(Li, JJ., et al. (2018). Fish & shellfish immunology, 83, 205-212.)에 기재된 바와 같이 꼬리 절단(tail transection) 모델을 사용하여 결정하였다. 96 hpf에서, 제브라피쉬 유충을 0.25 mg/mL 트리카인(tricaine)으로 마취시키고 꼬리의 절단을 메스(scalpel)를 사용하여 수행하였다. 이어서, 제브라피쉬 유충을 배아 배지로 세척하고, 6-웰 플레이트(n=20/well)로 옮겨, 다양한 농도의 지의류 추출물(0, 25, 50μg/mL) 및 100μM 덱사메타손으로 24시간 동안 처리했다.
실시예1-12: 통계적 분석
모든 실험을 3회 실시하여, 유사한 결과를 얻었다. 결과는 평균 ± 표준 오차로서 표현하고 t-검증(student's t-test)을 사용하여 분석하였다. 각 그래프의 바 상의 별표는 P-값(* P < 0.05, ** P < 0.01, ***P < 0.001)을 나타낸다.
실시예 2: 세포 생존율 및 NO 생산에 대한 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물의 효과
2017년에 King Sejong Antarctic Station 근처의 공급원으로부터 지의류를 수집하였다(도 1A). 지의류 종은 PCR(데이터 미표시)에 의해 아만디네아(Amandinea sp.)으로 동정되었다.
LPS의 존재 하에 RAW 264.7 세포 상에서 아만디네아 추출물의 독성을 측정하기 위해, MTT 분석을 수행하여 세포 생존율을 측정하였다. 추출물은 LPS-자극된 RAW264.7 세포에 대해 세포독성 효과를 갖지 않는 것으로 밝혀졌다. 이들은 10, 20, 40 및 80 μg/ml의 농도에서 생존율에 대해 유의한 효과를 나타내지 않았다(도 1B). 이어서, NO 검정을 사용하여 LPS-자극된 Raw 264.7 세포에서 NO 생산에 대한 추출물의 효과를 평가하였다. 결과는 추출물이 용량-의존적 방식으로 NO 생산이 감소시킴을 나타내었다(도 1C). 이러한 결과에 기초하여, 본 발명자들은 모든 후속 실험에서 10, 20, 40 및 80 μg/ml의 추출물 농도를 사용하였다.
실시예 3: 전염증성 사이토카인 생산에 대한 아만디네아 추출물의 효과
NO 생산 결과에 기초하여, LPS-유도된 염증성 사이토카인 생산에 대한 추출물의 효과를 추가로 조사하였다. 추출물은 전염증성 사이토카인 IL-6 및 TNF-α의 발현 수준을 억제하였고, LPS-자극된 Raw 264.7 세포에서 염증성 매개체인 iNOS 및 COX-2의 수준을 감소시켰다. 이들은 ELISA, qPCR, 및 웨스턴 블롯팅에 의해 측정하였다(도 2 및 3). COX-2 단백질 수준은 유의미하지 않았지만, 데이터는 추출물이 LPS-자극된 사이토카인 생산을 감소시킴을 보여준다.
실시예 4: NF-κB 신호전달에 대한 아만디네아 추출물의 효과
본 발명자들은 NF-κB 신호전달에 대한 추출물의 효과를 시험하였다. 웨스턴 블롯팅에 의해 검출된 바와 같이 세포질 p-IκB-α 및 핵 p65의 수준이 감소되었음을 확인하였다(도 4). 이들 결과는 추출물이 세포질 p-IκB-α 수준을 감소시킴으로써 핵 p65 수준을 억제한다는 것을 암시한다.
실시예 5: 제브라피쉬에서 생존율, 심장 박동수 및 신체 길이에 대한 아만디네아 추출물의 효과
제브라피쉬 추출물에서 아만디네아 추출물의 독성을 결정하기 위해, 생존율, 심장 박동수 및 신체 길이를 관찰하였다. 생존율은 200 및 400 μg/mL의 지의류 추출물로의 처리에서 상당히 감소되었다(도 5A). 이들 결과에 기초하여, 본 발명자들은 25 및 50 μg/mL의 추출물 농도를 사용하여 심장 박동수 및 신체 길이를 실험하였다. 추출물의 처리 시 대조군과 비교하여 심장 박동수 및 신체 길이에서의 유의한 변화는 검출되지 않았다. 따라서, 아만디네아 추출물은 100 μg/mL 이하에서 독성이 존재하지 않음을 알 수 있다.
실시예 6: LPS-처리된 제브라피쉬에서의 ROS 생산에 대한 아만디네아 추출물의 효과
본 발명자들은 LPS-유도된 제브라피쉬 유충에서 ROS의 과생산에 대한 아만디네아 추출물의 억제효과를 확인하였다. LPS-유도된 ROS 축적을 DCF-DA 염색을 통해 실험하였다. LPS-유도된 ROS 생성에서 DCF-DA 염색은 투명한 형광 이미지를 생성하였다. 추출물은 용량-의존성 방식으로 생체 내 ROS 생성을 감소시켰다(도 6).
실시예 7: 제브라피쉬의 꼬리 절단-유도된 염증에서 전염증성 사이토카인 생성에 대한 아만디네아 추출물의 효과
추출물은 제브라피쉬 꼬리-절단(tail-transection) 모델에서 염증성 사이토카인 IL-6, IL-1β, IL-10, 및 TNF-α의 발현 수준을 억제하였고, 염증성 매개체인 iNOS 및 COX-2의 수준을 감소시켰다. IL-1β 및 COX-2의 mRNA 발현은 덱사메타손이 처리된 양성대조군의 발현에 비해 상당히 감소되었다(도 7).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Institute of Ocean Science & Technology <120> A Method for Preparing An Extract of Antarctic Lichen Amandinea sp. and Composition Comprising the Extract of Amandinea sp. <130> P20-B274 <160> 24 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Raw264.7 IL-6 forward primer <400> 1 ctctgggaaa tcgtggaaat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Raw264.7 IL-6 reverse primer <400> 2 ccagtttggt agcatccatc 20 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Raw264.7 TNF-alpha forward primer <400> 3 catcttctca aaattcgagt gacaa 25 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Raw264.7 TNF-alpha reverse primer <400> 4 tgggagtaga caaggtacaa ccc 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Raw264.7 iNOS forward primer <400> 5 ggagccttta gacctcaaca ga 22 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Raw264.7 iNOS reverse primer <400> 6 tgaacgagga gggtggtg 18 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Raw264.7 COX-2 forward primer <400> 7 gaagtctttg gtctggtgcg tg 22 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Raw264.7 COX-2 reverse primer <400> 8 gtctgctggt ttggaatagt tgc 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Raw264.7 beta-actin forward primer <400> 9 tgtttgagac cttcaacacc 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Raw264.7 beta-actin reverse primer <400> 10 agtctgtcag gtcccggcc 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zebrafish IL-6 forward primer <400> 11 tgaaggggtc aggatcagca 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zebrafish IL-6 reverse primer <400> 12 cacgtcagga cgctgtagat t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zebrafish IL-1beta forward primer <400> 13 gcacggctat tcagagatgg t 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zebrafish IL-1beta reverse primer <400> 14 ccaagaataa gcagcacttg gg 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zebrafish IL-10 forward primer <400> 15 taggatgttg ctgggttgga c 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zebrafish IL-10 reverse primer <400> 16 tagtgtgatg gatggacggg 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zebrafish TNF-alpha forward primer <400> 17 tctcagggca agaaattcga c 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zebrafish TNF-alpha reverse primer <400> 18 tctcactgca tcggctttgt 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zebrafish iNOS forward primer <400> 19 ctgcggtgga atgaacatgg 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zebrafish iNOS reverse primer <400> 20 tctccagctt ctacctcgct c 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zebrafish COX-2 forward primer <400> 21 gctgctttgg tggacttaca g 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zebrafish COX-2 reverse primer <400> 22 tcagaggagg gctattgtca g 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zebrafish rpp0 forward primer <400> 23 ctgaacatct cgcccttctc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zebrafish rpp0 reverse primer <400> 24 tagccgatct gcagacacac 20

Claims (12)

  1. 다음 단계를 포함하는 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물의 제조방법:
    (a) 아만디네아 샘플을 건조하여 분말화시키는 단계;
    (b) 상기 분말화된 아만디네아를 극성 유기용매로 추출하는 단계; 및
    (c) 상기 추출된 추출액에서 용매를 제거하여 아만디네아 추출물을 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 극성 유기용매는 추출물은 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 추출물의 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항의 방법으로 제조된 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물.
  4. 제3항에 있어서, 하나 이상의 하기 특징을 가지는 것을 특징으로 하는 추출물:
    1) 산화질소(NO)의 생성 억제;
    2) IL-6, IL-1β, IL-10 및 TNF-α의 발현 억제;
    3) 유도성 산화질소 효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 발현 억제;
    4) NF-κB(nuclear factor kappa B)의 불활성화;
    5) 세포질(cytosolic) p-IκB-α 및 핵 인자 p65의 발현 억제; 및
    6) 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성 억제.
  5. 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 하나 이상의 하기 특징을 가지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물:
    1) 산화질소(NO)의 생성 억제;
    2) IL-6, IL-1β, IL-10 및 TNF-α의 발현 억제;
    3) 유도성 산화질소 효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 발현 억제;
    4) NF-κB(nuclear factor kappa B)의 불활성화;
    5) 세포질(cytosolic) p-IκB-α 및 핵 인자 p65의 발현 억제; 및
    6) 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성 억제.
  7. 제5항에 있어서, 상기 추출물을 10μg/mL 내지 80μg/mL의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 염증성 질환은 관절염, 비염, 간염, 각막염, 위염, 장염, 신장염, 기관지염, 흉막염, 복막염, 척추염, 췌장염, 염증성 통증, 요도염, 방광염, 화상 염증, 피부염, 치주염, 치은염 및 퇴행성 신경염증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  9. 제5항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  10. 아만디네아(Amandinea sp.) 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 식품.
  11. 제10항에 있어서, 하나 이상의 하기 특징을 가지는 것을 특징으로 하는 식품:
    1) 산화질소(NO)의 생성 억제;
    2) IL-6, IL-1β, IL-10 및 TNF-α의 발현 억제;
    3) 유도성 산화질소 효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS) 및 시클로옥시게나아제-2(COX-2)의 발현 억제;
    4) NF-κB(nuclear factor kappa B)의 불활성화;
    5) 세포질(cytosolic) p-IκB-α 및 핵 인자 p65의 발현 억제; 및
    6) 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성 억제.
  12. 제10항에 있어서, 상기 추출물을 10μg/mL 내지 80μg/mL의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190358327A1 (en) * 2016-12-23 2019-11-28 Klox Technologies Inc. Biophotonic compositions comprising lichen extract and their use to treat skin disorders

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101290745B1 (ko) * 2010-06-03 2013-07-29 한국해양과학기술원 라말린을 함유하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
US20200029575A1 (en) * 2018-07-24 2020-01-30 Frances Trail Lichen compounds that inhibit mycotoxin production
KR102139600B1 (ko) * 2018-10-26 2020-07-30 순천대학교 산학협력단 지의류 유래의 추출 성분을 포함하는 항 염증 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190358327A1 (en) * 2016-12-23 2019-11-28 Klox Technologies Inc. Biophotonic compositions comprising lichen extract and their use to treat skin disorders

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