KR102139600B1

KR102139600B1 - 지의류 유래의 추출 성분을 포함하는 항 염증 조성물

Info

Publication number: KR102139600B1
Application number: KR1020180128880A
Authority: KR
Inventors: 이성태; 허재선; 강경윤; 문슬기
Original assignee: 순천대학교 산학협력단
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2020-07-30
Also published as: KR20200046984A

Abstract

본 발명은 너덜너덜노란속매화나무지의(Myelochroa entotheiochroa) 추출물 또는 흰배면그리마지의(Heterodermia hypoleuca) 중에서 적어도 1종 선택되는 지의류 추출 성분을 유효 성분으로 포함하는 항 염증 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 지의류 추출물은 염증 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물이나, 염증을 완화하기 위한 식품 조성물 및/또는 화장품 조성물에 활용될 수 있다.

Description

지의류 유래의 추출 성분을 포함하는 항 염증 조성물{ANTIINFLAMMATORY COMPOSTION HAVING COMPONENTS EXTRACTED FROM LICHEN}

본 특허출원은 대한민국 정부 산림청의 산림생명자원 소재 개발 연구(주관기관: 순천대학교; 과제번호: 2017024A00-1720-BA01) 과제의 수행 결과물에 관한 것이다.

본 발명은 천연물 유래의 항 염증 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 지의류 유래의 추출 성분을 유효 성분으로 포함하는 항 염증 또는 염증 완화를 위한 조성물에 관한 것이다.

『생물다양성협약』을 이행하기 위해 국제적으로 발효된 『나고야의정서』가 2017년 국내에서도 발효되었다. 이에 따라 국내에서 「유전자원의 접근이용 및 이익 공유에 관한 법률」이 시행되고 있다. 나고야의정서 등에 따르면, 다른 국가의 생물자원으로 의약품이나 화장품 등을 만드는 국가의 이익을 생물자원을 제공한 국가와 공유하여야 할 뿐만 아니라, 생물 자원을 이용하기 위해서는 제공 국가의 허락을 받아야 한다. 이러한 점을 고려해 볼 때, 상대적으로 생물자원이 부족한 국내에서 서식하는 생물자원의 다양한 생리적 기능을 연구, 개발할 필요성이 있다.

한편, 지의류(lichens)는 균류(곰팡이류, fungi)와 조류(algae)가 복합체가 되어 공생한다. 지의류를 구성하는 균류는 자낭균류(Ascomycetes) 또는 담자균류(Basidiomycotes)의 1종이고, 조류는 남조식물(blue-green algae) 또는 녹조식물(green algae)의 1종이다. 독특한 공생 생활양식으로 인하여, 지의류는 일반 균류나 조류가 단독으로 생존할 수 없는 극한 환경에서도 적응한다. 세계적으로 지의류는 해발 6,000 m 이상의 고산까지, 적도에서 극지방가지 모든 환경에서 서식하고 있고, 일반 육상 식물들이 살기 어려운 남북극, 사막, 화산 지역 등 전 세계 대부분의 지역에 분포하고 있다.

지의류는 바위의 단단한 표면을 분해시켜 이끼가 들어갈 수 있는 터전을 만들어 주며, 이끼에 이어서 양치류, 소나무, 진달래처럼 척박한 산성 토양에서 살 수 있는 식물들이 뿌리내리게 해 줄 수 있도록 돕는다. 지의류는 공기 중 무기영양분을 먹고 살며 대기오염에 예민하게 반응하기 때문에 빗물과 먼지에 포함된 중금속에 노출되면 살 수 없다. 이러한 특성으로 지의류는 대기오염의 지표 종으로 주목을 받고 있었다.

지의류는 검버섯처럼 표면에 달라붙어 자라는 고착지의류, 잎처럼 생겨 양면의 구별이 뚜렷한 엽상지의류, 원대가 자라면서 식물체가 작립하는 수상지의류로 나뉠 수 있다.

한국을 비롯하여 중국 및 일본에서는 차와 식 재료로 지의류를 사용하고 있으며, 지의류가 생산하는 2차 대사산물은 매우 다양하며, 다른 생명체에서는 찾아보기 어려운 독특한 물질로서 다양한 생리적 활성을 보이고 있다. 최근에는 지의류의 항암, 항산화 등의 생리적 활성에 대한 연구가 진행되고 있다.

일례로, 대한민국공개특허 제10-2017-0082762호에서는 에버니아스트룸 베산스(Everniastrum vexans)의 지의체 추출물, 또는 이로부터 분리된 아트라노린(atranorin) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 폐암 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물을 개시하고 있다.

국내외적으로 지의류는 여타 생물군에 비하여 다소 생소한 생물군이다. 국내에서도 낮은 인지도 덕분에 다른 미생물이나 식물, 버섯에 비하여 상대적으로 연구가 덜 되어있고 천연물질 탐색이나 개발 역시 미진한 실정이다. 현재까지 국내에 약 700종 이상의 지의류가 서식하고 있는 것으로 알려져 있다. 나고야의정서의 발효에 의하여 이용 및 접근이 쉽지 않은 타국의 생물자원을 대체할 수 있는 생물자원으로서, 생물자원 빈국인 국내에서 서식하고 있는 지의류의 다양한 생리적 활성을 연구, 개발할 필요가 있다.

본 발명의 목적은 천연 소재로부터 얻어지는 추출 성분을 함유하는 항 염증 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

일 측면에 따르면, 본 발명은 너덜너덜노란속매화나무지의(Myelochroa entotheiochroa) 추출물 또는 흰배면그리마지의(Heterodermia hypoleuca) 추출물 중에서 적어도 1종 선택되는 지의류 추출물을 유효 성분으로 포함하는 항 염증 조성물을 제공한다.

예시적인 실시형태에서, 상기 지의류 추출물은 C₁~C₅ 알코올 추출물, 예를 들어 메탄올 추출물일 수 있다.

일례로, 항 염증 활성을 가지는 상기 유효 성분은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다.

화학식 1에서 R₁ 내지 R₃은 각각 독립적으로 C₁~C₅ 알킬기임.

다른 예시적인 실시형태에서, 상기 유효 성분은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품공학적으로 허용되는 염을 포함할 수도 있다.

또 다른 예시적인 실시형태에서, 상기 유효 성분은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 화장품공학적으로 허용되는 염을 포함할 수도 있다.

예를 들어, 상기 화학식 1에서 R₁ 내지 R₃은 각각 메틸기, 다시 말하면 상기 유효 성분은 아트라르산(atraric acid) 또는 이의 약학적, 식품공학적 및/또는 화장품공학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 염증 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품공학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 염증 완화용 식품 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 화장품공학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 염증 완화용 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명은 2개의 지의류에서 선택되는 적어도 하나의 지의류에서 얻어지는 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항 염증 조성물을 제안한다. 일례로, 상기 추출 성분은 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이들의 약학적, 식품공학적 또는 화장품공학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 항 염증 활성을 가지는 유효 성분은 천연 소재로부터 얻어지기 때문에, 인체에 대한 독성이나 부작용이 없다. 본 발명에 따라 얻어지는 지의류의 추출 성분을 유효 성분으로 사용하여, 염증 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약품이나, 염증을 완화시키는 식품 및/또는 화장품에 활용될 수 있다.

또한 국내에서 서식하고 있는 지의류에서 수득될 수 있는 유효 성분을 활용함으로써, 국내의 생물자원을 풍부하게 확보할 수 있다. 나고야의정서의 발효로 인하여 이용이 어려워지고 있는 타국의 생물자원을 대체할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 너덜너덜노란속매화나무지의(Myelochroa entotheiochroa; MM)에서 항 염증 효능을 가지는 유효 성분을 추출, 정제하는 과정을 개략적으로 나타낸 다이어그램이다. MeOH는 메탄올, EA는 에틸아세테이트, Fr은 분획(fraction), L.F.는 layer fraction을 의미한다.
도 2a는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 너덜너덜노란속매화나무지의(MM)에서 수득한 추출물의 고속액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC) 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 너덜너덜노란속매화나무지의(MM)에서 수득한 추출물의 고속액체크로마토그래피-질량분석(high performance liquid chromatography-molecular spectrometry; HPLC-MS) 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 흰배면그리마지의(Heterodermia hypoleuca; HH)에서 항 염증 효능을 가지는 유효 성분을 추출, 정제하는 과정을 개략적으로 나타낸 다이어그램이다. MeOH는 메탄올, EA는 에틸아세테이트, Fr은 분획(fraction), L.F.는 layer fraction을 의미한다.
도 4a는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 흰배면그리마지의(HH) 에서 수득한 추출물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 4b는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 흰배면그리마지의(HH)에서 수득한 추출물의 HPLC-MS 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5와 도 5b는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS)로 자극한 대식세포주에 지의류에서 추출한 유효 성분을 처리한 뒤, 대식세포주에 대한 유효 성분의 독성을 측정한 결과를 나타낸 그래프와, 배지에 잔존하는 산화질소(NO)의 양을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a 내지 도 6c는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 지질다당류로 자극한 대식세포주에 지의류에서 추출한 유효 성분을 처리한 뒤, 염증 반응과 관련된 cytokine 및 chemokine의 양을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7a 내지 도 7g는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 지질다당류로 자극한 대식세포주에 지의류에서 추출한 유효 성분을 처리한 뒤, 농도 별 유도성 산화질소합성효소(inducible nitric oxide synthase; iNOS)의 양을 유세포 분석방법(Flow cytometry)을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명자들은 국내에 서식하는 지의류의 생리적 활성을 연구하여, 지의류로부터 얻어진 추출 성분이 항 염증 활성을 가지는 것을 규명하여 본 발명을 완성하였다. 이하, 필요한 경우에 첨부하는 도면을 참조하면서 본 발명을 설명한다.

[지의류 추출 성분 및 추출 방법]

염증(inflammation)이란 병원체에 의한 감염이나 조직의 손상과 같은 다양한 요인에 의해 일어나는 면역 반응(Medzhitov, R., Origin and physiological roles of inflammation. Nature 2008, 454, 428-435)이다. 염증과 관련하여, 대식세포(macrophage)와 포식세포(phagocyte)는 숙주의 면역반응에 중요한 역할을 하며 내재 면역(intrinsic immunity)에서의 병원성 요인의 제거 및 특이적 반응인 적응 면역(adaptive immunity)의 유도 등이 이루어 진다(Hawiger J., Innate Immunity and Inflammation: A Transcriptional Paradigm. Immunologic Research. 2001, 23, 99-109).

대식세포는 면역시스템에서 주요기능을 하며 손상된 세포, 병원체 또는 LPS와 같은 유해자극을 인식하고 제거하기 위해 전 염증성 사이토카인(cytokine)인 IL-6, IL-1β, IL-12 그리고 케모카인(chemokine)의 일종인 GM-CSF 및 프로스타글란딘 E2, iNOS, NO 생성을 유도한다(Tan, N.H., Zhou, J. Plant cyclopeptides. Chem. Rev. 2006, 106, 840-895.).

생체 내에서 일산화질소(nitric oxide, NO)는 병원균의 대사 작용을 억제하거나 DNA를 파괴하는 등 세포독성 물질로 작용하여 병원균을 제거하는 등의 염증 반응에 관여한다. 일산화질소는 '내피의존성이완인자(endothelium-derived relaxing factor, EDRF)'로서 다양한 산화질소합성효소(nitric oxide synthase, NOS)에 의하여 아르기닌(arginine) 및 산소 원자로부터 생-합성되기도 하지만, 인간의 면역 반응의 일부분으로서 대식세포와 같은 면역 포식세포(phagocyte)에 의해서도 생성된다.

그런데, 산화질소합성효소는 크게 생체의 반응에 무관하게 지속적으로 일산화질소를 합성하는 '계속적 산화질소합성효소(constitute nitric oxide synthase, cNOS)'와, 예를 들어 면역 반응을 매개하기 위한 경우에 크게 활성화되어 일산화질소를 합성하는 '유도성 산화질소합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)'로 크게 구분될 수 있다.

cNOS는 일정하게 발현되어 생리적 기능을 매개하는 일산화질소를 낮은 레벨로 생성하는 반면, iNOS는 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 또는 인터페론-감마(interferon-gamma, IFN-γ)나 종양괴사인자(TNF)와 같은 사이토카인이나 박테리아 독소를 만난 면역세포에서 급격하게 활성화되어 과량의 일산화질소를 생성함으로써 일산화질소에 의한 염증 반응 등을 유발하는 것으로 알려져 있다(Liang, Y.C., Huang, Y.T., Tsai, S.H., Lin-Shiau, S.Y., Chen, C.F. and Lin, J.K., Suppression of inducible cyclooxygenase and inducible nitric oxide synthase by apigenin and related flavonoids in mouse macrophages, Carcinogenesis 1999, 1945-1952; Sang-Sup Jew, Ok-Nam Bae and Jin-Ho Chung, Anti-inflammatory Effects of Asiaticoside on Inducible Nitric Oxide Synthase and Cyclooxygenase-2 in RAW 264.7 Cell Line, J. Toxicol. Pub. Health. 2003, 19(1) 33-37).

특히, 과도하게 일어난 염증 반응은 관절염, 천식, 동맥경화증, 뇌 손상 등과 같은 만성질환의 병인 과 심각한 조직손상을 기여할 수 있다(Libby, P., Ridker, P.M., Maseri, A., Inflammation and atherosclerosis, Circulation 2002, 105, 1135-1143; Manzi, S., Wasko, M.C., Inflammation-mediated rheumatic diseases and atherosclerosis, Ann. Rheum. Dis. 2000, 59, 321-325; Tak, P.P., Firestein, G.S., NF-_B: A key role in inflammatory diseases, J. Clin. Investig. 2001, 107, 7-11.).

따라서 항염증제는 과도하게 발생하는 염증 인자들을 조절하여 염증 매개체에 의한 손상을 줄이는 역할을 한다(Kundu, J.K.; Surh, Y.J. Inflammation: Gearing the journey to cancer. Mutat. Res. 2008, 659, 15-30). 하지만, 화학적으로 합성된 항염증제는 인체에 대한 부작용이나 독성이 나타날 수 있고, 이에 따라 천연 소재에서 수득되는 항 염증 유효 성분에 대한 관심이 높아지고 있다.

본 발명은 항 염증 활성을 가지는 천연 성분을 얻기 위하여, 국내에 서식하는 지의류를 채택한다. 항 염증 활성을 가지는 유효 성분은 너덜너덜노란속매화나무지의(Myelochroa entotheiochroa) 추출물 또는 흰배면그리마지의(Heterodermia hypoleuca) 중에서 적어도 1종 선택되는 지의류 추출물이다. 이하, 본 명세서에서 너덜너덜노란속매화나무지의 추출물 및 흰배면그리마지의 추출물을 통칭하여 지의류 추출물 또는 지의류 추출 성분이라고 지칭한다.

지의류 추출물을 수득하기 위한 추출 용매는 50% 내지 100%의 메탄올, 에탄올 등의 C₁~C₅ 알코올, 에틸아세테이트 등의 극성용매와 헥산, 클로로포름 또는 디클로로메탄의 비극성용매와 같은 유기용매, 이들의 혼합용매일 수 있으며, 바람직하게는 50% 내지 100%의 메탄올, 에탄올 등의 C₁~C₅ 알코올, 더욱 바람직하게는 70% 내지 100% 메탄올 또는 에탄올일 수 있다.

필요한 경우, 본 발명의 지의류 추출물은 냉침추출법, 온침추출법 또는 열 추출법 등일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 일례로, 추출 용매를 이용한 지의류 추출물을 얻는 방법은 건조된 지의류 중에서 지의체를 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 적당한 양의 추출 용매를 첨가, 가열하여 추출액을 얻는다. 지의류의 추출 효율을 높이기 위하여 상기 과정을 수회 이상 반복 수행할 수 있다.

상기 추출액을 여과하고, 감압농축하여 지의류의 조 추출물을 제조할 수 있다. 얻어진 지의류 추출물은 사용 시까지 급속 냉동고(deep freezer)에 보관할 수 있다. 또한, 상기 지의류 추출물은 상기 수득된 추출액을 농축 및 동결건조를 통하여 수분을 완전히 제거시킨 것일 수 있으며, 상기 수분을 완전히 제거시킨 지의류 추출물은 분말형태로 사용하거나 상기 분말을 증류수 또는 통상의 용매에 녹여 사용할 수 있다.

필요에 따라 유기 용매를 이용하여 얻어진 추출물은 용매를 이용하여 분획될 수 있다. 구체적으로, 상기 용매로 추출한 추출물은 이후, 헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 에틸아세테이트, 에틸에테르, 클로로포름, 물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 분획과정을 더욱 실시할 수 있다. 바람직하게는 상기 분획용매는 메탄올 수용액, 물, 에틸아세테이트, 클로로포름이고, 더욱 바람직하게는 메탄올 수용액과 에틸아세테이트일 수 있다. 특히, 상기 에틸아세테이트에 의한 분획물은 특히 항 염증 활성이 가장 우수한 것으로 확인되었다.

상기 분획 과정을 수행하여 수득한 분획물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일예로 회전 증발기를 이용하여 감압농축할 수 있으며, 상기 건조는 일예로 동결건조법으로 수행할 수 있다. 선택적인 실시형태에서, 위에서 얻어진 지의류 추출물을 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 분획할 수도 있다.

다른 선택적인 실시형태에서, 지의류 분획물을 고속액체크로마토그래피(High performance liquid chromatography; HPLC)를 수행하여 특정 유효 성분을 정제할 수 있다. 본 발명의 예시적인 실시형태에 따르면, 항 염증 활성을 가지는 유효 성분은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이다.

[화학식 1]

일례로, 항 염증 활성을 가지는 화합물은 화학식 1에서 R₁ 내지 R₃가 모두 메틸기인 아트라르산(atraric acid; A.A.)일 수 있다.

본 발명에서 지의류 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 이들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 본 발명에 따라 수득되는 지의류 추출물은 세포 독성이 없고(도 5a), 유도된 염증 반응에 의해 생성되는 산화질소의 생산량을 감소시킨다(도 5b). 특히, 염증 반응과 관련이 있는 다양한 사이토카인이나 케모카인의 발현을 억제하고(도 6a 내지 6c 참조), iNOS의 발현을 억제한다(도 7a 내지 7g 참조).

[항 염증 조성물]

본 발명은 전술한 지의류 추출물, 또는 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적/식품공학적/화장품공학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 항 염증 조성물에 관한 것이다. 화학식 1로 표시되는 화합물의 약학적/식품공학적/화장품공학적으로 허용되는 염은 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산 부가염 또는 염기성 염을 들 수 있다.

약학적/식품공학적/화장품공학적으로 허용되는 산 부가염에 사용되는 산은 무기산 및 유기산을 포함한다. 무기산 중에는 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아질산 및/또는 아인산이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 유기산은 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류를 포함한다.

약학적/식품공학적/화장품공학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

일례로, 약학적/식품공학적/화장품공학적으로 허용되는 유기산은 아세트산, 트리플루오로아세트산, 젖산, 피루브산, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 퓨마르산, 타르타르산, 말레산, 시트르산, 벤조산, 아스코르브산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 2-히드록시에탄설폰산 및 캄포르산이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 한편, 약학적/식품공학적/화장품공학적으로 허용되는 염기 중에는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에틸아민 및 tert-부틸아민이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 지의류 추출물, 또는 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적/식품공학적/화장품공학적으로 허용되는 염(이하에서는 이들을 통칭하여 지의류 추출물 등이라 함)은 항 염증 조성물 중에 1 내지 1000 μM 농도, 바람직하게는 10 내지 500 μM 농도로 첨가될 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 지의류 추출물 등을 유효 성분으로 함유하며, 필요에 따라 약학적으로 허용되는 담체(carrier)를 포함하는 염증을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

일례로, 염증 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물은 지의류 추출물 등을 유효성분으로 단독으로 포함할 수 있고, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분 즉, 약학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 지의류 추출물 등을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 지의류 추출물 등은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제와 같은 희석제 또는 부형제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용할 수 있다.

예를 들어, 지의류 추출물 등을 포함하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용할 수 있다.

일례로, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 지의류 추출물 등에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 및 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥 주사 또는 근육내 주사를 통할 수 있다.

비경구 투여를 위한 형태로는 치약, 구강세정제, 국소 투여제(크림, 연고, 드레싱 용액, 분무제, 기타 도포제 등) 등을 들 수 있다. 상기 국소 투여제의 제형의 일예로는, 유효 성분인 지의류 추출물 등을 천연 섬유 또는 합성 섬유로 만든 거즈 등의 담체에 함침시킨 것일 수 있다. 상기 크림 또는 연고의 경우, 치주병 또는 치은병 환부나 그 주위에 직접 도포하는데 적합할 수 있다. 상기 분무제의 경우, 유효 성분으로 지의류 추출물 등을 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 분무제 제조방법으로 제조될 수 있고, 압축용기나 기타 분무용기에 충전 포장하여 구강질환 부위에 수시로 분무 도포하여 염증 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 드레싱 용액의 경우, 유효 성분으로 지의류 추출물 등을 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 드레싱 용액의 제조방법으로 제조될 수 있고, 염증 질환 부위에 드레싱이나 기타 세균 감염부위의 드레싱에 사용하여 염증 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

또한, 본 발명의 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제형은 사용 방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 경고제, 과립제, 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 산제, 시럽제, 안연고제, 액제, 에어로솔제, 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 전제, 침제, 점안제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 크림제, 환제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.

더 나아가 본 발명의 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 당해 기술분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화 될 수 있다.

필요한 경우, 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 상기 유효 성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 지의류 추출물 등은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

다른 선택적인 실시형태에서, 본 발명은 지의류 추출물 등을 유효 성분으로 함유하는 염증 완화용 식품 조성물을 제공한다. 본 명세서에서 식품이란 영양소를 한 가지 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 식품, 식품 첨가제, 건강기능식품, 음료 및 음료 첨가제를 모두 포함한다. 식품 조성물은 지의류 추출물 등 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물과 같은 식품 보조 첨가제 성분을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등과 같은 디사카라이드; 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드 등과 같은 통상적인 당은 물론이고, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제 또는 감미제로서 타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진)과 같은 천연 향미제/감미제; 사카린, 아스파탐과 같은 합성 향미제/감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 식품 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02~0.03 g 이다.

그 외에도 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명에 따른 식품 조성물 중에는 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명에 따른 지의류 추출물 등 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부, 바람직하게는 0.01 ~ 1.0 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또 다른 예시적인 실시형태에서, 본 발명은 지의류 추출물 등을 유효 성분으로 함유하는 염증 완화용 화장품 조성물을 제공한다. 염증 완화용 화장품 조성물은 본 발명에 따라 제조될 수 있는 지의류 추출물 등을 유효 성분으로 포함하는 것 이외에도, 화장품 분야에서 사용될 수 있는 성분을 포함할 수 있다.

화장품 조성물은 화장 및/또는 피부과학적으로 허용될 수 있는 매질을 포함한다. 일례로, 화장품 조성물은 성, 수성/알코올성 또는 유성 용액, 또는 수성, 수성/알코올성 또는 유성 겔, 또는 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀션(O/W) 또는 그 반대(W/O), 서스펜션, 마이크로에멀션, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비이온형의 소낭 분산제의 형태로 제공될 수 있다.

화장품 조성물을 제조하기 위한 용매로서 에탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세레스-26, 메틸글루세스-20, 이소세틸미리스테이트, 세틸옥타노에이트, 이소세틸옥타노에이트, 옥틸도데실미리스테이트, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴이소스테아레이트 및 네오펜티글리콜디카프레이트 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

그 외에도 화장품 조성물은 수용성 비타민, 지용성 비타민, 고분자 펩타이드, 고분자 다당, 스핑고 지질로 이루어진 군에서 적어도 1종 이상 선택되는 성분을 포함할 수 있다.

수용성 비타민은 비타민B1, 비타민B2, 비타민B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민C, 비타민H 등을 들 수 있으며, 이들의 염(티아민염산염, 아스코르빈산나트륨 염 등)이나 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 화장품 조성물에 사용될 수 있는 수용성 비타민에 포함된다.

지용성 비타민은 비타민 A, 카로틴, 비타민D2, 비타민D3, 비타민E(알파토코페롤) 등을 들 수 있으며, 이들의 유도체(팔미트산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 아세트산-알파토코페롤, 니코틴산-알파토코페롤, 판토네일알코올 등)도 화장품 조성물에 사용될 수 있는 지용성 비타민에 포함된다.

고분자 펩타이드는 젤라틴, 엘라스틴, 가수분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 다당은 하이드록시셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴황산 또는 그 염(나트륨염 등)을 들 수 있다. 스핑고 지질은 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당 지질 등을 들 수 있다.

화장품 조성물은 상기 성분과 더불어 필요에 따라 통상적으로 화장품에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있다. 첨가될 수 있는 배합 성분으로는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제(연화제), 계면활성제, 유기 및 무기 안료, 유기분체, 자외선흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, 항산화제, 식물추출물, pH 조정제, 알코올, 발포제, 충전제, 자외선 흡수제, 안료, 착색제, 겔화제 또는 농축제, 향료, 혈행촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 3 중량%의 비율로 배합될 수 있다. 또한, 본 발명의 화장품 조성물은 염증 완화를 위한 화장품, 세안제 및 샴푸 등에 다양하게 적용될 수 있다.

일례로, 본 발명의 화장품 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품류와 샴푸, 린스, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다. 구체적으로, 본 발명의 화장품 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저와 같은 다양한 제형으로 조제될 수 있다.

이하, 예시적인 실시형태를 통하여 본 발명을 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되지 않는다.

실시예 1: 너덜너덜노란속매화나무지의 추출 및 정제

도 1에 나타낸 공정으로 너덜너덜노란속매화나무지의에서 유효 성분을 추출, 정제하였다. 한국지의류연구센터에서 분양 받은 Myelochroa entotheiochroa(ME)의 메탄올 추출물(1.4988g)을 에틸아세테이트(EA) 50 mL로 녹인 다음, 물(30% 메탄올) 50 mL을 첨가하고, 잘 흔들어서 층이 분리되기를 기다리고, 층이 분리되면 EA층만을 회수하여 앞서 수거한 EA층과 합쳐 감압 농축시켜 용매를 제거하였다. 농축시킨 EA층(291.7 mg)을 DMSO: Methanol 25 mg/mL로 용해하였다. 용해시킨 시료를 MPLC(mild pressure liquid chromatography) 조건으로 처리하였다. 구체적으로, 아세토니트릴(acetonitrile, ACN) 수용액(0.05% 포름산) (5%, 5%, 100%, 100%, 5%)로 ACN(0.05% 포름산)-water(0.05% 포름산) 혼합 용액으로 단계적 구배 용매 시스템을 이용하여 MPLC를 실시하였다. 컬럼을 이용하여 3.5 mL(87.5 mg)씩 주입하고, 5개의 분획으로 분리하였다. 15 mL/min 유속으로 수행하여 분리하였으며, 항 염증 효과가 있는 세 번째 분획은 40분~44.8분에서 얻었으며, 그 분획(19.4 mg)을 C18 컬럼을 이용하여 분취 역상 HPLC (semi-preparative reverse phase HPLC)로 반복하여 유효 성분을 분리, 정제하였다.

본 실시예에서 이용된 HPLC는 Agilent Technologies 1260 series HPLC (Agilent Technologies, U.S.A)system이며, 365 nm에서 흡광도를 측정하였다. 사용된 column은 분취용: Luna 5u (C18 100A 250Х10mm, Phenomenex Inc.), column 온도는 24℃로 고정하였다. 이동상의 용매 A는 0.1% formic acid(v/v, in water)이며, B는 0.1% formic acid(v/v, in acetonitrile)를 사용하였다. 이동상의 유속은 1.0 mL/min이었고, 용매 구배는 0∼60분 B용매 50%로 하였다. MS 분석은 Agilent Technologies 1260 series HPLC (Agilent Technologies, U.S.A) system에 Agilent Technologies 6130 Quadrupole mass spectrometer (Agilent Technologies, U.S.A), and Agilent 1260 UV/visible detector를 사용하였으며, CAPCELL C18 5 ㎛, 250×10 mm (Shiseido Inc.) column을 이용하고 column 온도는 24℃로 고정하였다. 이동상의 용매 A는 0.1% formic acid(v/v, in water)이며, B는 0.1% formic acid(v/v, in methanol)를 사용하였다. 이동상의 유속은 1.0 mL/min 이었고, 용매 구배는 0∼5분 B용매 5%, 5∼45분 B용매 5~70%, 45~50분 B용매 70~100%로 유지, 50~60분 B용매 100%로 하였다. 위와 같은 HPLC 방법에 의하여 획득한 분획(8.6 mg)을 수거하여 건조한 뒤 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 분석용 시료로 사용하였다. HPLC 크로마토그램을 도 2a에, MS 분석 결과를 도 2b에 나타낸다.

이어서, 정제된 샘플을 MR 분석기기(JNM-ECZS series FT 400 NMR (JEOL, Japan)을 사용하여 분석하였다. TMS(Trimethyl silane: Cambridge isotope laboratory, Inc., U.S.A.)를 기준물질로 사용하였다. 분석 결과, ¹H NMR (methanol-d ₄, 400 MHz); 6.25 (1H, s, H-6), 3.83 (3H, s, H-10), 2.31 (3H, s, H-8), 1.89 (3H, s, H-9), ¹³C NMR (methanol- d ₄, 100 MHz); 172.5 (C-1), 162.1 (C-3), 160.1 (C-5), 140.0 (C-7), 111.1 (C-6), 108.4 (C-4), 104.4 (C-2), 52.4 (C-10), 23.9 (C-8), 8.1 (C-9)으로 Atraric acid를 확인 할 수 있었다.

실시예 2: 흰배면그리마지의의 추출 및 정제

도 3에 나타낸 공정으로 흰배면그리마지의에서 유효 성분을 추출, 분석하였다. 한국지의류연구센터에서 분양 받은 Heterodermia hypoleuca(HH)의 메탄올추출물(1.9337g)을 EA 50 mL로 녹인 다음, 물(30% 메탄올) 50 mL을 첨가하여 잘 흔들어 준 뒤 층이 분리되기를 기다리고, 층이 분리되면 EA층만을 수거하고 다시 EA 50 mL을 첨가하여 흔들어준다. 층이 갈리면 EA층만을 회수하여 앞서 수거한 EA층과 합쳐 감압 농축시켜 용매를 제거하였다. 실시예 1과 동일한 절차에 따른 MPLC, HPLC, MS 및 NMR 분석을 실시하였다. MPLC에서 항 염증 효과가 있는 3번째 분획은 40분~44.8분에서 얻었으며, 그 분획(70.1 mg)을 실시예 1과 동일한 절차에 따라 분석하였다. HPLC 크로마토그램을 도 4a에, MS 분석 결과를 도 4b에 나타낸다. 실시예 1에서 최종적으로 분리, 정제된 것과 동일한 Atraric acid를 확인할 수 있었다.

실시예 3: 아트라르산의 전처리 효과 확인

LPS에 의해 유도된 아질산염 발생량에 대하여, 실시예 1 및 실시예 2에서 각각 정제된 Atraric acid(A.A)의 전처리 효과를 확인하였다. RAW 264.7 macrophage는 한국세포주 은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양 받아 10% FBS(fetalbovine serum), 1% 항생제(antibiotics), 2-ME(2-mercaptoethanol, 50 mM)를 함유한 RPMI1640 배지를 이용하여 37℃, 4% CO₂에서 조절된 incubator에서 배양하였다.

세포독성을 측정하기 위해 RAW 264.7 macrophage를 96-well plate에 well당 5X10⁴ cells/ 100 ㎕씩 분주한 뒤, 24시간 동안 CO₂ incubation 하였다. LPS (lipopolysaccharide) 1 ㎍/mL와 분리한 A.A를 각각 1, 3, 10, 30, 100, 300 μM/mL 농도로 100 ㎕씩 처리하여 24시간 동안 CO₂ incubation 하였다. 그 다음 조건 당 배양 상층액을 100 ㎕씩 제거하고, Cell counting Kit-8 (CCK-8)을 10 ㎕씩 처리하여 3시간 CO₂ incubation 한 뒤에 Micro plate reader(VERSA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 1~300μM/mL 에서 RAW 264.7 macrophage에 대한 독성이 없음을 확인하였다(도 5a).

또한 LPS로 활성화된 RAW 264.7 macrophage를 이용하여 NO의 생산량을 확인하기 위해 RAW 264.7 macrophage를 96-well plate에 well당 5X10⁴ cells/100 ㎕씩 분주하여 24시간 동안 배양한다. 1시간 전 LPS 1 ㎍/mL를 50 ㎕씩 분주한 뒤 A.A를 각각 1, 3, 10, 30, 100, 300 μM/mL 농도로 처리하여 24시간 동안 CO₂ incubation 하였다. 그 다음 조건 당 배양 상층액을 96-well plate에 100 ㎕씩 넣고 여기에 동량의 Griess 시약 (0.1% N-1-naphtyl-ethylendiamine in H₂O: 1% sulfanilamide in 5% H₃PO₄ = 1:1)을 첨가하여 10분간 반응시킨 후, Microplate reader로 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 농도는 NaNO₂ (sodium nitrite)를 64μM에서부터 0.5μM까지 2배씩 희석 하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다. 그 결과 10~300μM에서 농도 의존적으로 LPS로 자극된 RAW 264.7 macrophage의 NO생산량을 감소시키는 것으로 나타나 다음 실험부터의 농도가 10~300μM로 정해졌다(도 5b).

실시예3: 염증성 사이토카인/케모카인 분비량 측정

RAW 264.7 macrophage를 24-well plate에 well당 5×10⁵ cells/1 mL이 되도록 분주하고 24시간 CO2 incubation 하였다. 이후 well에 LPS를 1 ㎍/mL 농도로 500 ㎕로 분주하여 1시간 CO2 incubation한 뒤 준비한 NO inhibition 효과가 있던 10, 30, 100, 300μM/mL의 농도로 500 ㎕씩 처리하여 24시간 CO₂ incubation 하였다. 그 다음 세포배양 상층액을 수거 하였다. 수거한 상층액에 포함된 사이토카인 (cytokine)인 IL-6, GM-CSF, IL-1β을 효소항체법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, plate-bottom micro-well에 1차 항체(2 ㎍/mL)를 coating buffer(0.1 M NaHCO₃, pH 8.2)에 희석하여 50 ㎕/well로 분주하고 4℃에서 Overnight 후, washing 용액(0.05% Tween 20/PBS)으로 세척하였다. 세척된 micro-well은 10% FBS가 첨가된 PBS로 blocking 하였으며, 앞서 수거한 상층액을 적당한 비율로 희석한 후 각 well에 분주하여 상온에서 반응시켰다. 그 다음, biotin이 부착된 2차 항체(1 ㎍/mL) 100 ㎕/well와 일정시간 상온에서 반응시킨 후, avidin-peroxidase(2.5 ㎍/mL) 100 ㎕/well을 첨가하였다. 마지막으로 기질(2, 2’-azino-bis, 0.1M citritic acid, H₂O₂)을 첨가하여 발색시킨 다음 Micro-plate reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 IL-6, GM-CSF, IL-1β의 농도는 표준곡선을 이용하여 환산하였다. 그 결과 LPS로 자극된 RAW 264.7 macrophage의 cytokine 생산량은 IL-6, IL-1β, 그리고 케모카인의 일종인 GM-CSF에서는 농도 의존적인 패턴을 보였으며 100~300μM에서 큰 억제율을 보여 주었다(도 6a 내지 6c). 따라서 다음 실험에서의 농도가 정해졌다.

실시예4: 유세포 분석

RAW 264.7 macrophage를 24-well plate에 well당 5×10cells/mL이 되도록 분주하고 24시간 CO2 incubation 하였다. 이후 well에 LPS를 1 ㎍/mL 농도로 500 ㎕ 분주하고, 1시간 CO2 incubation한 후 뒤 준비한 cytokine inhibition 효과가 있는, 100, 300 μM/mL의 농도로 500 ㎕씩 처리하여 24시간 CO2 incubation 하였다. 세포와 배양액을 수거하여 원심을 돌린 다음 상층액을 버리고 세포만 획득한 다음 anti-CD16/32로 30분 동안 blocking 시켜주었다. 그 다음 Fixation Buffer(BD, U.S.) 를 20분 동안 처리하여 고정 시켜준다. 다음으로 Perm Buffer Ⅲ(BD, U.S)로 5min처리하여 세포에 구멍을 뚫어준 뒤 마지막으로 PE-conjugated monoclonal antibodies iNOS로 염색시킨 뒤 flow cytometry (FACS CantoⅡ)를 이용하여 측정하였다. 이때 데이터 분석은 BD FACS Diva software을 사용하였다. 그 결과 LPS로 자극된 마우스 대식세포의 iNOS 발현량은 A.A에 의해 감소되는 결과를 나타내었다(도 7a 내지 도 7g 참조).

상기에서는 본 발명의 예시적인 실시형태 및 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 상기 실시형태 및 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되는 것은 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 전술한 실시형태 및 실시예를 토대로 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다. 하지만, 이러한 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은, 첨부하는 청구범위에서 분명하다.

Claims

너덜너덜노란속매화나무지의(Myelochroa entotheiochroa) 추출물을 유효 성분으로 포함하는 항 염증 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 C₁~C₅ 알코올 추출물인 것을 특징으로 하는 항 염증 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 메탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 항 염증 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 유효 성분은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 항 염증 조성물.
[화학식 1]

화학식 1에서 R₁ 내지 R₃은 각각 독립적으로 C₁~C₅ 알킬기임.
제 1항에 있어서, 상기 유효 성분은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품공학적으로 허용되는 염을 포함하는 항 염증 조성물.
[화학식 1]

화학식 1에서 R₁ 내지 R₃은 각각 독립적으로 C₁~C₅ 알킬기임.
제 1항에 있어서, 상기 유효 성분은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 화장품공학적으로 허용되는 염을 포함하는 항 염증 조성물.
[화학식 1]

화학식 1에서 R₁ 내지 R₃은 각각 독립적으로 C₁~C₅ 알킬기임.
제 4항 내지 제 6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 화학식 1에서 R₁ 내지 R₃은 각각 메틸기인 항 염증 조성물.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 상기 항염증 조성물은 염증 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물을 포함하는 항 염증 조성물.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 상기 항염증 조성물은 염증 완화용 식품 조성물을 포함하는 항 염증 조성물.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 하나의 청구항에 있어서, 상기 항염증 조성물은 염증 완화용 화장품 조성물을 포함하는 항 염증 조성물.