KR101253279B1

KR101253279B1 - 먼나무 잎 추출물 또는 이로부터 분리된 페닐프로파노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물

Info

Publication number: KR101253279B1
Application number: KR1020110002386A
Authority: KR
Inventors: 이민원; 최선은; 김많흔; 권동렬; 최장기
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2011-01-10
Filing date: 2011-01-10
Publication date: 2013-04-10
Also published as: KR20120092763A

Abstract

본 발명은 먼나무 잎 추출물 또는 이로부터 분리된 카페인산, 3,5-디카페오일퀸산, 3,4-디카페오일퀸산, 3,5-디카페오일시킴산, 3,4,5-트리카페오일퀸산, 및 쿼르세틴-3-루티노사이드 중 어느 하나의 페닐프로파노이드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항균 조성물에 관한 것이다. 본 발명 조성물의 유효성분인 먼나무 잎 추출물 또는 상기 페닐프로파노이드계 화합물은 항균 활성이 뛰어나고, 특히 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대해 우수한 항균 활성을 나타낸다. 본 발명의 추출물 및 화합물은 세균, 특히 피부에 감염성이 높은 황색포도상구균에 대에 뛰어난 항균 활성을 가지므로, 황색포도상구균에 의한 감염증을 치료, 예방 또는 완화시킬 수 있는 약물, 기능성 화장품 또는 기능성 식품 또는 동물 사료의 활성 성분으로 개발될 수 있다.

Description

먼나무 잎 추출물 또는 이로부터 분리된 페닐프로파노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물{Anti-Bacterial Composition Comprising Extract from Leaf of Ilex rotunda or Phenylpropanoid Compound As Active Ingredient}

본 발명은 먼나무 잎 추출물 또는 이로부터 분리된 페닐프로파노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는 먼나무 잎 추출물 또는 이로부터 분리된 카페인산, 3,5-디카페오일퀸산, 3,4-디카페오일퀸산, 3,5-디카페오일시킴산, 3,4,5-트리카페오일퀸산, 및 쿼르세틴-3-루티노사이드 중 어느 하나의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항균 조성물에 관한 것이다.

감탕나무속(Ilex.) 식물은 감탕나무과(Aquifoliaceae)에 속하며 일본, 대만, 중국 및 우리나라 제주도와 남부지방 다도해 섬지방(1), 남부 해안 지방에서 주로 자라며, 이국적인 수형 때문에 남부지방의 가로수와 공원수로 권장되는 나무이다. 먼나무는 전통적으로 나무 껍질과 뿌리는 '구필응(救必應)' 이라 하여, 한방에서 약으로 사용한다. 나무껍질에는 플라보노이드, 탄닌, 페놀 성분이 있고, 잎에는 아미노산, 플라보노이드 등의 성분이 있다. 한방에서는 열을 다스리고 통증을 멈추게 할 뿐 아니라 해독제, 관절염, 위장염의 치료약으로 달여 먹고 화상 치료에 달여 놓은 액체를 환부에 바르거나 고약을 만들어 바르기도 한다(2). 먼나무에 관한 연구로는 테르페노이드(Terpenoid) 배당체, 루툰제노이사이드(Rotungenoside), 1-카페오일퀸산(1-caffeoylquinic acid), 네오클로로겐산(neochlorogenic acid), 클로로겐산(chlorogenic acid) 등 다양한 성분이 분리 되었다(3-5). 이러한 페닐프로파노이드(Phenylpropanoid)계열의 성분을 이용하여 항산화 작용, 각종 면역 이상 질환, 알레르기 질환, 항암(6-9) 등에 영향을 미침을 보고되었다. 특히 감탕나무속 식물에서 많이 보여지는 페닐프로파노이드(Phenylpropanoid)계열의 퀸산(quinic acid) 성분 중에 하나인 디카페오일퀸산(dicaffeoylquinic acid), 트리카페오일퀸산(tricaffeoylquinicacid)와 같은 성분은 면역질환에 관한 다양한 인 비트로(in vitro) 실험을 통해 보고됨으로써(10) 면역과 관련된 다양한 이상 질환 치료제 개발 가능성을 보여 주었다.

한편, 아토피피부염이 발생하는 데에는 유전적요인, 환경적요인, 면역학적요인 등 여러 가지 인자 간의 상호 작용이 작용할 것으로 추정되며, 혈청내의 총 IgE 농도 증가 등으로 관찰되는 B 세포의 과활성화나 면역조절 사이토카인들의 변화에 따른 T 세포계의 이상 등이 보고되고 있지만, 그 원인이나 발병 기전은 아직 명확히 밝혀 지지 않은 상태이다. 아토피피부염 환자의 피부는 건조하고 쉽게 손상 받으며 세균이나 항원의 침입이 쉽다(11, 12). 건조한 피부는 소양감을 악화시켜 더욱 긁게 만들고, 이런 행위는 진피층의 탈락과 함께 여러 염증 매개물질들의 방출을 유도하게 되는데, 이는 광노화 및 과도한 스트레스 등으로 자유라디칼(free radical)의 반응성이 커지면서 더욱 악화 된다(13, 14). 생체 내에는 자유 라디칼의 상해를 입은 단백질과 유전자 등을 보수하는 메커니즘이 존재하지만 자유 라디칼의 생성과 방어 시스템 사이의 불균형과 과도한 자유라디칼의 생성은 생체 내 분자들의 산화를 초래하여 고유의 기능을 발휘하지 못하게 한다(15). 그 결과 지질과산화 및 단백질, 세포막, DNA, 효소와 T 세포 등 면역 계통 인자의 손상을 일으킴으로써 아토피 피부염에서 보여지는 염증 물질을 방출하게 되는 것이다(16). 이러한 염증 물질은 세균들의 침입과 집락화를 더 쉽게 하며(17, 18), 세균 집락은 각질층 내의 세라마이드(ceramide)를 감소시켜 각질층의 수분 함유률을 더욱 저하시키는 악순환을 유발한다(19, 20). 피부의 이차적인 세균 감염은 아토피 피부염의 증상을 더욱 악화시키고 장기화하여 치료를 어렵게 한다. 세균 감염의 가장 흔한 원인 균으로는 황색포도상구균(S. aureus)로 정상인의 집락의 경우 5％ 미만인데 비해 아토피 피부염 환자 피부의 90％ 이상에서 검출 된다(21). 또한, 아토피 피부염 환자의 피부에서 황색포도상구균의 수는 병변 부위를 비교하였을 때 100-1000 배 차이가 나지만, 병변이 없는 부위에도 황색포도상구균이 집락화가 다수를 차지한다(22). 황색포도상구균이 아토피 피부염 병인에 영향을 미친다는 또 다른 증거로는 스테로이드 제제 사용만으로도 황색포도상구균 제거 효과를 일정 부분 볼 수 있다는 연구 결과로 이는 황색포도상구균의 균집락에 어떤 면역학적 요소가 기여할 가능성을 시사한다(23). 아토피피부염 환자 피부에 황색포도상구균 균집락이 증가하는 기전에는 여러 과정이 연관되어 있는 것으로 알려져 있는데, 피부 장벽 기능의 결함, 자연적 항세균 기능 및 세균을 박멸하는 능력의 결함, 피부의 산도가 알칼리화 되는 현상, 피부 지방 결핍, 건조한 피부로 인한 균 집락 증가 및 황색포도상구균의 부착력이 증가되는 현상 등이 관련이 있다(24). 한편, 1970년대에는 1％ 정도이던 MRSA (Methicillin resistant S.aureus, 메티실린 내성 황색포도상구균)의 빈도가 최근에는 10-50％ 까지 크게 증가하였고, 황색포도상구균(S. aureus) 외에 다른 세균들도 간혹 발견되어 항생제의 선택에 어려움을 주고 있다(25, 26).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 천연물로부터 유래된 항균활성을 갖는 물질을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 먼나무(Ilex rotunda) 잎 추출물과 이로부터 단리된 페닐프로파노이드(phenylpropanoid) 계열 화합물이 우수한 항균활성을 나타냄을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 먼나무 잎 추출물, 또는 이로부터 분리된 페닐프로파노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 먼나무(Ilex Rotunda)의 잎 추출물, 또는 이로부터 분리된 페닐프로파노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 세균 감염성 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 먼나무(Ilex Rotunda)의 잎 추출물, 또는 카페인산, 3,5-디카페오일퀸산, 3,4-디카페오일퀸산, 3,5-디카페오일시킴산, 3,4,5-트리카페오일퀸산, 및 쿼르세틴-3-루티노사이드 중 어느 하나의 화합물을 유효성분으로 함유하는 항균(anti-bacterial) 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 먼나무(Ilex Rotunda)의 잎 추출물, 또는 카페인산, 3,5-디카페오일퀸산, 3,4-디카페오일퀸산, 3,5-디카페오일시킴산, 3,4,5-트리카페오일퀸산, 및 쿼르세틴-3-루티노사이드 중 어느 하나의 화합물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 세균(bacteria) 감염성 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 먼나무(Ilex rotunda)의 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균(anti-bacterial) 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 먼나무(Ilex rotunda)의 잎 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 본 발명의 먼나무(Ilex rotunda) 잎 추출물을 추출하기 위한 추출 용매로는 추출 공정에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있는데, 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올), 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산, 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출되는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 먼나무 잎 추출물은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성을 가지며, 보다 바람직하게는 메티실린감수성 황색포도상구균(Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus) 뿐만 아니라 메티실린내성 황색포도상구균(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus)에 대해서도 항균 활성을 갖는다.

본 발명은 먼나무 잎 추출물로부터 분리된 카페인산, 3,5-디카페오일퀸산, 3,4-디카페오일퀸산, 3,5-디카페오일시킴산, 3,4,5-트리카페오일퀸산, 및 쿼르세틴-3-루티노사이드 중 어느 하나의 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다. 본 발명의 유효성분 화합물은 먼나무 잎 추출물로부터 항균 활성 추적법에 의해 단일화합물로 분리된 페닐프로파노이드(phenylpropanoid)계 화합물이다.

상기 유효성분 화합물인 카페인산(caffeic acid), 3,5-디카페오일퀸산(3,5-dicaffeoyl quinic acid), 3,4-디카페오일퀸산(3,4-dicaffeoyl quinic acid), 3,5-디카페오일시킴산(3,5-dicaffeoyl shikimic acid), 3,4,5-트리카페오일퀸산(3,4,5-tricaffeoyl quinic acid), 및 쿼르세틴-3-루티노사이드(quercetin-3-rutinoside)은 각각 하기 화학식 1 내지 화학식 6으로 표시되는 화합물이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 화학식 1 내지 화학식 6으로 표시되는 화합물은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대해 항균 활성을 나타내며, 메티실린 감수성 황색포도상구균(Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus) 뿐만 아니라 메티실린내성 황색포도상구균(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus)에 대해서도 항균 활성을 갖는다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 항균 조성물은 화장품 학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 화장품학적 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이 인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로 카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산에스테르 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장품학적 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 본 발명의 화장품학적 조성물에서 유효성분인 먼나무 잎 추출물 또는 화학식 1 내지 화학식 6으로 표시되는 화합물의 양은 특별히 한정되지 않으며, 바람직하게는 상기 항균 효능을 달성하는 데 충분한 양으로 포함된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 항균 조성물은 기능성 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 후박나무 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드 (예컨 대, 덱스트린,시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 항균 조성물은 동물 사료 첨가용 조성물 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 먼나무 잎 추출물과, 이 추출물로부터 분획한 분획물, 또는 이 추출물로부터 분리된 상기 화학식 1 내지 화학식 6 중 어느 하나의 화합물은 동물에서의 세균 감염성 질환의 예방 또는 개선 용도의 동물사료 첨가제로 사용될 수 있다. 상기 동물 사료 첨가용 조성물에 함유되는 유효성분인 먼나무 잎 추출물 또는 화학식 1 내지 화학식 6으로 표시되는 화합물의 양은 특별히 한정되지 않으나, 동물에서 상기 세균에 의한 감염성 질환을 예방 또는 개선하기에 적합한 양으로 포함된다. 본 발명의 동물사료 첨가용 조성물에는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염 (중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 동물사료 첨가용 조성물에는 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등을 포함할 수 있고, 상기 성분 이외에 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장촉진제, 질병 예방제 등과 같은 성분을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 동물 사료 첨가용 조성물은 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 선택되는 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 동물사료 첨가용 조성물은 탑 드레싱으로서 투여될 수 있고, 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 또는 다른 성분과 조합하여 투여할 수 있다. 본 발명의 동물 사료 첨가용 조성물은 당업계에 공지된 바에 따라 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.

본 발명은 먼나무(Ilex rotunda)의 잎 추출물 또는 상기 화학식 1 내지 화학식 6의 화합물 중 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 세균 감염성 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 세균은 황색포도상구균(Staphylo coccus aureus)이며, 보다 바람직하게는 메티실린감수성 황색포도상구균(Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus) 또는 메티실린내성 황색포도상구균(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus)이다. 본 발명의 먼나무 잎 추출물 또는 화학식 1 내지 화학식 6 중 어느 하나의 화합물은 세균 중에서 특히 황색포도상구균(Staphylo coccus aureus)에 대해 항균 활성을 나타내며, 메티실린감수성 황색포도상구균(Methicillin Sensitive Staphylococcus aureus) 뿐만 아니라 메티실린내성 황색포도상구균(Methicillin Resistant Staphylococcus aureus)에 대해서도 항균 활성을 갖는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100mg/kg (체중) 이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다. 본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 먼나무 잎 추출물 또는 이로부터 분리된 카페인산, 3,5-디카페오일퀸산, 3,4-디카페오일퀸산, 3,5-디카페오일시킴산, 3,4,5-트리카페오일퀸산, 및 쿼르세틴-3-루티노사이드 중 어느 하나의 페닐프로파노이드계 화합물을 유효성분으로 함유하는 항균 조성물에 관한 것이다. 본 발명 조성물의 유효성분인 먼나무 잎 추출물 또는 페닐프로파노이드계 화합물은 항균 활성이 뛰어나고, 특히 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대해 우수한 항균 활성을 나타낸다. 본 발명의 추출물 및 화합물은 세균, 특히 피부에 감염성이 높은 황색포도상구균에 대에 뛰어난 항균 활성을 가지므로, 세균, 특히 황색포도상구균에 의한 감염증을 치료, 예방 또는 완화시킬 수 있는 약물, 기능성 화장품 또는 기능성 식품 또는 동물 사료의 활성 성분으로 개발될 수 있다.

도 1은 먼나무(Ilex Rotunda) 잎 추출물로부터 항균활성을 갖는 추출물, 분획물 및 유효성분 화합물을 분리하는 과정을 도표로 보여주는 도면이다.
도 2a 및 도 2b, 도 2c는 본 발명의 추출물 및 분획물에 대해 TLC (Thin Layer Chromatography) 분석한 결과를 보여주는 실험결과 사진이다.
도 3a는 화합물 1의 ¹HNMR 스펙트럼(600 MHz, DMSO-d₆+D₂O)이고, 도 3b는 화합물 1의 ¹³C-NMR 스펙트럼(150 MHz, DMSO-d₆+D₂O)이다.
도 4a는 화합물 2의 ¹HNMR 스펙트럼(600 MHz, DMSO-d₆+D₂O)이고, 도 4b는 화합물 2의 ¹³C-NMR 스펙트럼(150MHz, DMSO-d₆+D₂O), 도 4c는 화합물 2의 Negative FAB MS 스펙트럼이다.
도 5a는 화합물 3의 ¹HNMR 스펙트럼(600 MHz, DMSO-d₆+D₂O)이고, 도 5b는 화합물 3의 ¹³C-NMR 스펙트럼(150MHz, DMSO-d₆+D₂O), 도 5c는 화합물 3의 Negative FAB MS 스펙트럼이다.
도 6a는 화합물 4의 ¹HNMR 스펙트럼(600 MHz, DMSO-d₆+D₂O)이고, 도 6b는 화합물 4의 ¹³C-NMR 스펙트럼(150MHz, DMSO-d₆+D₂O), 도 6c는 화합물 4의 Negative FAB MS 스펙트럼이다.
도 7a는 화합물 5의 ¹HNMR 스펙트럼(600 MHz, DMSO-d₆+D₂O)이고, 도 7b는 화합물 5의 ¹³C-NMR 스펙트럼(150MHz, DMSO-d₆+D₂O), 도 7c는 화합물 5의 Negative FAB MS 스펙트럼이다.
도 8a는 화합물 6의 ¹HNMR 스펙트럼(600 MHz, DMSO-d₆+D₂O)이고, 도 8b는 화합물 6의 ¹³C-NMR 스펙트럼(150MHz, DMSO-d₆+D₂O), 도 8c는 화합물 6의 Negative FAB MS 스펙트럼이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 활성성분의 분리

1-1: 실험재료

본 실험에 사용한 먼나무(Ilex rotunda)의 잎은 제주한라수목원에서 2010년 01월에 채취한 3Kg을 분양 받아 사용하였다.

1-2: 시약 및 기구

본 실험에 사용한 시약 및 기구는 다음과 같다: ① ¹H-NMR spectrometer: VNS 600 MHz (Varian, Palo Alto, USA); ② ¹³C-NMR spectrometer : VNS 150 MHz (Varian, Palo Alto, USA); ③ GC-EI MS spectrometer : Autospec (Micromass, London, UK); ④ FAB MS spectrometer : JMS-600W Agilent 6890 Series (Jeol, Tokyo,Japan); ⑤ TLC : Adsorbent : Kieselgel 60 F254 (Merck, Darmstadt, Germany); Solvent(v/v): ⓐ Chloroform : MeOH : H₂O = 6 : 4 : 1 ⓑ Benzene : Ethyl Formate : Formic acid = 1 : 7 : 1; Detection : ⓐ Ethanolic-FeCl₃ solution ⓑ 10％-H₂SO₄ in H₂O(heating) ⓒ UV-lamp (254 nm); ⑥ Chromatographic gels: Sephadex LH 20, 75-230μm mesh (Pharmacia, Uppsala, Sweden) MCI-gel CHP-20P, 75-150μm (Mitsubishi, Tokyo, Japan); ⑦ Middle pressure liquid column chromatograph(MPLC): sample injector : Waters 650E (Waters, Milford Massachusettsv, USA) pump : TBP5002 (Tauto Biotech, Sanghai, China) detector : Gilson 112 UV/VIS 280 nm (Gilson Inc., Middleton, USA) gel : Daisogel (SP-120-40/60-ODS-B, Daiso Co., LTD., Osaka, Japan) data system : Autochro-Win 3.0 plus (Young-lin Co., Anyang, Korea)

1-3: 활성성분의 추출 및 분리

먼나무 잎 3Kg을 80％ 식용 MeOH으로 실온에서 2회 추출하였다. 추출액은 여과한 후 감압 농축하여 추출물(418.22g)을 얻었다. 농축한 추출물은 여과하여 여과층(filter layer)(310.43g)와 비-여과층(non-filter layer)(92g)를 얻었다. 그 중 여과층(310.43g)을 Sephadex LH-20 column chromatography (0→100％ MeOH, gradient system)를 실시하여 6 개의 분획(Fr 1, Fr 2, Fr 3, Fr 4, Fr 5, Fr6)으로 각각 나누었다. 그 중 우수한 활성을 나타낸 분획-6(Fr-6)(9.67g) 중 3 g을 재결정(recrystallization)를 실시한 결과 화합물 5(compound 5)(1.38g)을 얻었다. 가장 우수한 활성을 나타낸 Fr-5(20.57g)에 대해서는 Daisogel ODS-B MPLC system(30→100％ MeOH, gradient system)을 이용하여 6개의 분획(Fr 5-1, Fr 5-2, Fr 5-3, Fr 5-4, Fr 5-5)으로 나누었다. 그 중 분획 Fr 5-3은 Sephadex LH-20 column chromatography (0→100％ MeOH, gradient system)를 실시하여 7개의 분획을 나누었으며, 다시 Daisogel ODS-B MPLC system (30→100％ MeOH, gradient system)을 실시하여 그 중 Fr 5-3-4에서 화합물 2(3.58g)과 화합물 1(25mg)을 얻었다. 또한 Fr 5-3-4에선 화합물3 (6.34g)을 얻었다. 그 다음 Fr 3(11.48g)에서 Daisogel ODS-B MPLC system(30→100％ MeOH, gradient system)을 실시하여 화합물 4 (449mg)과 화합물 6 (667mg)을 얻었다. 또한 활성의 편차가 있는 Fr 2(144.44g)중 20g을 Sephadex LH-20 column chromatography (0→100％ MeOH, gradient system)을 실시하여 화합물 6을 다량 확보할 수 있었다(도 1 참조).

1-4: TLC 테스트

먼나무 잎의 구성 성분을 추정하기 위하여 TLC를 통한 분석을 실시하였다. 먼저 먼나무 잎을 80％ MeOH으로 추출하여 먼나무 잎의 추출물을 얻었고, 이어서 농축한 추출물은 여과하여 여과층(filter layer)와 비여과층(non-filter layer)을 얻었다. 그 중 여과층을 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 MeOH 용매를 0-100％ 까지 농도를 높여 Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5, Fr6 로 분획하여 TLC (Thin Layer Chromatography) 테스트를 실시하였다. 전개용매는 Benzene : Ethyl Formate : Formic acid = 1 : 7 : 1 를 사용하였으며, 전개 시킨 뒤에는 염화철 분무, 아니스-알데하이드(Anis-Aldehyde) 및 10％ 황산을 분무한 후 열판에 가열하는 방법을 이용하여 발색시켰다. TLC 결과 각 분획이 효율적으로 나누어졌음을 알 수 있었으며 먼나무(Ilex rotunda) 잎 추출물과 이로부터 분획한 분획 Fr 6, Fr 5로부터 카페인산(caffeic acid), 3.4-디카페오일퀸산(3,4-dicaffeoylquinic acid), 3,5-디카페오일퀸산(3,5-dicaffeoylquinic acid) 및 3,4,5-트리카페오일퀸산(3,4,5,-tricaffeoylquinic acid)으로 추정되는 성분이 있음을 나타냈으며, 또한 Fr 3에서 3,5-디카페오일시킴산(3,5-dicaffeoylshikimic acid) 및 루틴(rutin)으로 추정되는 성분이 있음을 나타냈다(도 2a 및 도 2b 참조).

1-5: 화합물 1 내지 6의 구조 확인

① 화합물 1

화합물 1은 갈색분말이며 TLC 테스트에서 UV 램프 254 nm 파장에서 흡수에 의한 스폿(spot)을 나타내었고, FeCl₃ 분무에 의해서 양성으로, 10％ H₂SO₄를 분무하고 가열시 옅은 갈색으로 발색하였다. ¹H-NMR 스펙트럼에서 1개의 ABX-type에 의한 시그날이 δ 7.030~7.026 (d, H-5), 6.777~6.663 (d, H-8), 6.938~6.921 (dd, H-9)에서 나타낸 시그날이 각각 H-5와 H-6이 메타 커플링(meta coupling) 및 오르토 커플링(ortho coupling)하고 있는 H-9와 H-8이 나타나며, 이를 사이에 양쪽으로 알켄기가 동일한 J 밸류값을 가지면서 시그날이 δ 7.546~7.520, 6.261~6.235(d, H-3, 2)이 나타나므로써 트랜스(trans) 형태의 알켄임을 확인하였다. 이로써 화합물 1은 카페인산(caffeic acid)로 추정하였다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서도 카페올기와 1개의 알켄의 존재를 확인하여 화합물 1을 카페인산(caffeic acid)으로 추정하였다. 또한 Negative FAB MS 스펙트럼에서 m/z 179 [M-H]-를 확인하였으며, 문헌의 데이터와 비교를 통해 화합물 1을 카페인산(caffeic acid)로 최종 동정하였다(27-34). 갈색무정형 분말(brown amorphous powder); Negative FAB MS : m/z 179 [M-H]- ; ¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d ₆+D₂O 아래 표 1 참조); ¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d ₆+D₂O, 아래 표 1 참조). 아래 화학식 1은 화합물 1인 카페인산(caffeic acid)의 화학구조식이다.

[화학식 1]

② 화합물 2

화합물 2는 담황색 무정형 분말로 TLC 테스트에서 FeCl₃ 분무에 의해서 양성으로, 10％ H₂SO₄을 분무하고 가열하였을 때는 진한 갈색으로 발색하였다. ¹H-NMR 스펙트럼에서 2개의 ABX-type에 의한 시그날이 δ 7.032~7.029, 6.997~6.994(d, H-5), 6.906~6.892, 6.840~6.827(d, H-8) 6.753~6.740, 6.723~6.709(dd, H-9)에서 나타낸 시그날이 각각 H-5와 H-6이 메타커플링(meta coupling) 및 오르토커플링(ortho coupling)하고 있는 H-9와 H-8이 나타나며, 이를 사이에 양쪽으로 알켄기가 동일한 J 밸류값을 가지면서 시그날이 δ 6.228~6.261, 6.245~6.218, 7.585~7.559, 7.487~7.460(d, H-3, 2)이 나타남으로써 트랜스(trans) 형태의 2개의 알켄임을 확인하였다. 또한 5.665 (m), 5.182 (m), 4.187 (m)에서 3개의 OH가 연결된 메틴(methine)과 2.183~2.358(4H, m)에서 4개의 수소에 해당하는 2개의 메틸렌(methylene)에 의한 시그날을 확인하여 퀸산(quinic acid)이 존재함을 알 수 있었다. 이로써 화합물 2은 3,5-디카페오일퀸산(3,5-dicaffeoyl quinic acid)로 추정하였다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서도 카페올기를 뺀 7개의 탄소의 시그날은 각각 δ 180은 COOH, δ 79.48, 68.51, 75.75, 66.22는 OH가 있는 메탄(methane), δ 38.23, 36.20은 2개의 메틸렌(methylene)으로 퀸산(quinic acid)임을 알 수 있었으며, 또한 Negative FAB MS 스펙트럼에서 m/z 515 [M-H]-를 확인하였으며, 문헌의 데이터와 비교를 통해 화합물 2을 3,5-디카페오일퀸산(3,5-dicaffeoyl quinic acid)로 최종 동정하였다(27-34). 담황색 무정형 분말(Yellow amorphous powder); Negative FAB MS : m/z 515 [M-H]- ; ¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d ₆+D₂O, 아래 표 2참조); ¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d ₆+D₂O, 아래 표 2 참조). 하기 화학식 2는 3,5-디카페오일퀸산의 화학구조식이다.

[화학식 2]

③ 화합물 3

화합물 3은 담황색 무정형 분말로 TLC 테스트에서 FeCl₃ 분무에 의해서는 양성으로, 10％ H₂SO₄을 분무하고 가열하였을 때는 진한 갈색으로 발색하였다. ¹H-NMR 스펙트럼에서 2개의 ABX-type에 의한 시그날이 δ 6.973, 6.920(s, H-5), 6.864~6.851, 6.745~6.714(d, H-8) 6.714~6.701, 6.665~6.651(dd, H-9)에서 나타낸 시그날이 각각 H-5와 H-6이 메타커플링(meta coupling) 및 오르토커플링(ortho coupling)하고 있는 H-9와 H-8이 나타나며, 이를 사이에 양쪽으로 알켄기가 동일한 J 밸류 값을 가지면서 시그날이 δ 6.251~6.224, 6.150~6.123, 7.570~7.544, 7.465~7.438(d, H-3, 2)이 나타남으로써 트랜스(trans) 형태의 2개의 알켄임을 확인하였다. 또한 5.710(m), 5.160~5.143, 4.472에서 3개의 OH기가 연결된 메틴(methine)과 2.278~2.453(4H, m)에서 4개의 수소에 해당하는 2개의 메틸렌(methylene)에 의한 시그날을 확인하여 퀸산(quinic acid)이 존재함을 알 수 있었다. 이로써 화합물 3은 3,4-디카페오일퀸산(3,4-dicaffeoyl quinic acid)으로 추정하였다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서도 카페올기를 뺀 7 개 탄소의 시그날은 각각 δ 178.37은 COOH, δ 78.24, 69.25, 75.32, 67.48는 OH가 있는 메탄(methane), δ 38.93, 36.46은 2개의 메틸렌(methylene)으로 퀸산(quinic acid)임을 알 수 있었으며, 또한 Negative FAB MS 스펙트럼에서 m/z 515 [M-H]-를 확인하였으며, 문헌의 데이터와 비교를 통해 화합물 3을 3,4-디카페오일퀸산(3,4-dicaffeoyl quinic acid)로 최종 동정하였다(27-34). 담황색 무정형 분말(Yellow amorphous powder); Negative FAB MS : m/z 515 [M-H]-; ¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d ₆+D₂O, 아래 표 3참조); ¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d ₆+D₂O, 아래 표 3 참조). 하기 화학식 3은 3,4-디카페오일퀸산의 화학구조식이다.

[화학식 3]

④ 화합물 4

화합물 4는 갈색분말로 TLC 테스트에서 FeCl₃ 분무에 의해서는 양성으로, 10％ H₂SO₄을 분무하고 가열하였을 때는 진한 갈색으로 발색하였다. ¹H-NMR 스펙트럼에서 2개의 ABX-type에 의한 시그날이 δ 6.913, 6.881(s, H-5), 6.698~6.712, 6.704~6.691(d, H-8) 6.852~6.839, 6.821~6.807(dd, H-9)에서 나타낸 시그날이 각각 H-5와 H-6이 메타 커플링(meta coupling) 및 오르토 커플링(ortho coupling) 하고 있는 H-9와 H-8이 나타나며, 이를 사이에 양쪽으로 알켄기가 동일한 J 밸류 값을 가지면서 시그날이 δ 6.181~6.154, 6.085~6.058, 7.418~7.392, 7.348~7.321 (d, H-3, 2)이 나타남으로써 트랜스(trans) 형태의 2개의 알켄임을 확인하였다. 또한 5.178~5.153, 5.135~5.153, 4.765~4.750, 4.760~4.745, 4.174~4.158, 4.102~4.097 에서 3개의 OH가 연결된 메틴(methine)과 2.063~1.848 (2H, m)에서 2개의 수소에 해당하는 1개의 메틸렌(methylene)에 의한 시그날을 확인하였으며, 1개의 이중결합에 의한 시그날이 3.716~3.711, 3.700~3.695으로 나타나 시킴산(shikimic acid)이 존재함을 알 수 있었다. 이로써 화합물 4는 3,5-디카페오일시킴산(3, 5-dicaffeoyl shikimic acid)으로 추정하였다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서도 카페올기를 뺀 7개의 탄소의 시그날은 각각 δ 180.14 은 COOH, δ 77.55, 72.82, 76.82, 70.67는 OH가 있는 메탄(methane), δ 37.22은 1개의 메틸렌(methylene)으로, 1개의 이중결합 시그마로 64.87 나타남으로써 시킴산(shikimic acid)임을 알 수 있었으며, 또한 Negative FAB MS 스펙트럼에서 m/z 497 [M+H]+ 를 확인하였으며, 문헌의 데이터와 비교를 통해 화합물 4을 3,5-디카페오일시킴산(3, 5-dicaffeoyl shikimic acid)로 최종 동정하였다(27-34). 갈색무정형 분말(brown amorphous powder); Negative FAB MS : m/z 498 [M+H]+; ¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d ₆+D₂O, 아래 표 4참조); ¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d ₆+D₂O, 아래 표 4 참조) 하기 화학식 4는 3,5-디카페오일시킴산의 화학구조식이다.

[화학식 4]

⑤ 화합물 5

화합물 5는 갈색분말로 TLC 테스트에서 FeCl₃ 분무에 의해서 양성으로, 10％ H₂SO₄을 분무하고 가열하였을 때는 진한 갈색으로 발색하였다. ¹H-NMR 스펙트럼에서 3개의 ABX-type에 의한 시그날이 δ 7.069~7.065, 7.028~7.025, 6.995~6.992(d, H-5), 6.947~6.944, 6.933/6.917~6.914, 6.930~6.916/6.846~6.843, 6.846~6.832(d, H-8) 6.783~6.770, 6.762~6.748, 6.714~6.701(dd, H-9)에서 나타낸 시그날이 각각 H-5와 H-6이 메타커플링(meta coupling) 및 오르토커플링(ortho coupling)하고 있는 H-9와 H-8이 나타나며, 이를 사이에 양쪽으로 알켄기가 동일한 J 밸류 값을 가지면서 시그날이 δ 6.334~6.308, 6.228~6.202, 6.220~6.193/7.615~7.589, 7.551~7.526, 7.526~7.500(d, H-3, 2)이 나타남으로써 트랜스(trans) 형태의 2개의 알켄임을 확인하였다. 또한 5.761(m), 5.330~5.324, 5.672 에서 3개의 OH가 연결된 메틴(methine)과 2.307~2.473(4H, m)에서 4개의 수소에 해당하는 2개의 메틸렌(methylene)에 의한 시그날을 확인하여 퀸산(quinic acid)이 존재함을 알 수 있었다. 이로써 화합물 5은 3,4,5-트리카페오일퀸산(3,4,5-tricaffeoyl quinic acid)으로 추정하였다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서도 카페오일기를 뺀 7개의 탄소의 시그날은 각각 δ 174.22은 COOH, δ 73.23, 68.62, 71.28, 67.54는 OH가 있는 메탄(methane), δ 37.14, 35.19은 2개의 메틸렌(methylene)으로 퀸산(quinic acid)임을 알 수 있었으며, 또한 Negative FAB MS 스펙트럼에서 m/z 677 [M-H]-를 확인하였으며, 문헌의 데이터와 비교를 통해 화합물 5를 3,4,5-트리카페오일퀸산(3,4,5-tricaffeoyl quinic acid)로 최종 동정하였다(27-34). 갈색무정형 분말(brown amorphous powder); Negative FAB MS : m/z 677 [M-H]-; ¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d ₆+D₂O 아래 표 5 참조); ¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d ₆+D₂O, 아래 표 5 참조).

[화학식 5]

⑥ 화합물 6

화합물 6은 담황색분말로 TLC 테스트에서 FeCl₃ 분무에 의해서 양성으로, 10％ H₂SO₄을 분무하고 가열하였을 때는 노란색으로 발색하였다. ¹H-NMR 스펙트럼에서 플라보노이드에서 보여지는 B링에 해당되는 1개의 ABX-type에 의한 시그날이 δ 7.619~7.605(dd, H-2), 6.882~6.368(d, H-5), 7.664~7.661(d, H-6)에서 나타낸 시그날이 각각 H-2 메타 커플링(meta coupling) 및 오르토 커플링(ortho coupling)하고 있는 H-5와 H-6이 나타나며, A 링에 해당하는 6.201~6.197(d, H-6), 6.383(s, H-8)의 메타 커플링(meta couling)의 형태가 2개 보여짐으로써 플라보노이드 형태인 쿼르세틴(Quercetin)임을 확인할 수 있었으며, 또한 쿼르세틴의 OH기와 연결되어있는 아노머릭 프로톤은 글루코스(glocose) 1 번에 해당하는 1H에 해당함을 기존 문헌의 데이터와 비교하여 확인하였으며, 다음 연결된 람노스 또한 글루코스 6번과 연결이 되어있는 형태임을 문헌을 통해 확인함으로써 화합물 6은 루틴(rutin)으로 추정하였다. ¹³C-NMR 스펙트럼에서도 플라보노이드를 뺀 12개의 탄소 중 글루코스에 해당하는 시그날은 각각 δ 103.2, 75.7, 76.6, 69.9, 67.1이며, 람노스의 경우 100.9, 70.7, 70.6, 74.4, 68.2, 16.4 임을 기존문헌을 통해 확인할 수 있었다. 또한 Negative FAB MS 스펙트럼에서 m/z 609 [M+H]+를 확인하였으며, 문헌의 데이터와 비교를 통해 화합물 6을 루틴(rutin) 또는 쿼르세틴-3-루티노사이드(quercetin-3-rutinoside)으로 최종 동정하였다(27-34). 담황색 무정형 분말(Yellow amorphous powder); Negative FAB MS : m/z 609 [M+H]+; ¹H-NMR (600 MHz, DMSO-d6+D2O 아래 표 6참조); ¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d6 + D2O, 아래 표 6참조). 하기 화학식 6은 루틴(rutin)의 화학구조식이다.

[화학식 6]

실시예 2: 항산화 실험

2-1: DPPH를 이용한 자유 라디칼(free radical) 소거능 측정

Hatano의 방법(35)에 의하여 먼나무(Ilex Rotunda) 잎 추출물과 분획물 Fr 1, Fr 2, Fr 3, Fr 4, Fr 5, Fr 6 시료를 최종 농도가 각각 3.125 ㎍/ml, 6.25 ㎍/ml, 12.5 ㎍/ml, 25 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 100 ㎍/ml이 되도록 6 가지 농도로 조제하였으며, 먼나무(Ilex rotunda)추출물의 분획 Fr 6, 5 및 Fr 3에서 얻은 화합물 1, 2, 3, 4, 5 및 6(카페인산; 3,5/3,4-디카페오일퀸산; 3,5-디카페오일시킴산, 3,4,5-트리카페오일퀸산; 루틴)시료는 최종 농도가 3.125 μM/ml, 6.25 μM/ml, 12.5 μM/ml, 25 μM/ml, 50 μM/ml, 100 μM/ml이 되도록 6 가지 농도로 조제한 후, 각 시료 10 μL에 0.1 mM DPPH 용액(99.5％ 에탄올) 180 μL을 가한 후 볼텍스 믹서(vortex mixer)로 10 초간 진탕한 후 37℃에서 30분 동안 인큐베이션(incubation) 시켰다. 이어서, ELISA reader(TECAN, Sazburg, Austria)를 이용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조 약물로는 L-아스코르브산(L-ascorbic acid)을 마찬가지 방법으로 6가지 농도로 조제하여 측정하였다. 각 시료의 항산화효과를 측정하기 위하여 DPPH에 대한 EDA％(Electron donating ability, 전자공여능)에 의한 환원력으로 항산화능을 표시하였고, 각 시료의 항산화능을 비교 검토하기 위해서 EDA가 50％에 이르도록 하는데 필요한 시료의 양인 IC₅₀을 측정하였다.

2-2: 항산화능 실험 결과

DPPH법은 항산화 효과를 측정하는 대표적인 방법이다(36). DPPH는 분자 내에 안정한 라디칼을 함유하지만 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 라디칼이 제거 되는데 이때 DPPH의 흡광도의 변화를 측정하여 항산화 효과를 확인할 수 있다. DPPH는 이때 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 프리라디칼로서 시스틴(cystin), 글루타티온(glutathion)과 같은 황을 함유한 아미노산과 L-아스코르브산(L-ascorbic acid), BHA, BHT 등에 의해 환원되어 탈색되므로 이러한 색도의 변화를 통하여 다양한 천연 소재로부터 항산화 물질을 검색하는 데 많이 이용되고 있다(37). 먼나무(I. Rotunda) 잎 추출물과 이를 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피 분획하여 얻은 분획물 Fr 1, Fr 2, Fr 3, Fr 4, Fr 5, Fr 6로 자유라디칼(Free Radical) 소거능을 측정하였을 때, 먼나무(I. Rotunda)추출물 (IC₅₀=32.78 ± 2.51㎍/ml)가 양성 대조군인 L-아스코르브산(L-ascorbic acid)(IC₅₀ =7.94 ± 0.45㎍/ml)에 미치진 못하지만 자유 라디칼 억제능을 보였으며, 컬럼크로마토그래피로 분획한 분획물은 Fr5 > Fr6 > Fr3 > Fr4 > Fr2 > Fr1 순으로 자유 라디칼 억제능을 확인할 수 있었다. 특히, 분획물 Fr 5 (IC₅₀ = 11.46 ± 0.87㎍/ml)의 경우 양성 대조군인 L-아스코르브산(L-ascorbic acid) (IC₅₀ = 7.94 ± 0.45㎍/ml)와 비교하였을 때 우수한 자유 라디칼 억제능을 보였다. 우수한 자유 라디칼 소거능을 나타낸 Fr 5, Fr6 및 Fr 3로부터 분리한 화합물 1(카페인산), 화합물 2(3,5-디카페오일퀸산), 화합물 3 (3,4-디카페오일퀸산), 화합물 4 (3,5-디카페오일시킴산), 화합물 5 (3,4,5-트리카페오일퀸산), 및 화합물 6(루틴)에 대하여 동일한 방법으로 DPPH를 실행하였다. 그 결과 화합물 5 (IC₅₀ = 11.44 ± 0.16㎍/ml), 화합물 3 (IC₅₀ = 14.08 ± 0.16㎍/ml)가 양성 대조군인 L-아스코르브산(L-ascorbic acid)(IC₅₀ = 7.43 ± 0.22㎍/ml)와 비교하였을 때 우수한 자유 라디칼 억제능을 보였다. 특히 화합물 5와 3의 경우 활성이 좋았던 Fr5, Fr6 에서 분리한 화합물로 분획물의 것과 유사한 수준의 자유라디칼 억제능을 보였다.

실시예 3: 항균력 실험

3-1. 사용 균주 및 배양 조건

① 사용균주

황색포도상구균(S.aureus)으로서 MSSA ATCC 25923, 및 MRSA 33591 표준 균주는 한국미생물보존센터로부터 분양받아 사용하였다. 계대배양 활성시 배지는 Mueller Hinton Agar (MHA,Difco, USA), Mueller Hinton Broth (MHB, Difco, USA)를 사용하였다.

② 배양조건

사용한 배지와 모든 기구는 오토클레이브(autoclave)(온도 121℃, 1.3 기압에서 15 분)을 사용하여 멸균시켜 사용하였으며, 균주는 -70 ℃에서 보관할 수 있도록 처리하여 보관되었다.

3-2. 액체배지 희석법에 의한 항균력 측정

최소억제농도는(MIC, Minimum Inhibitory Concentration)는 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)의 기준에 따라 실시하였다. 메티실린-내성 황색포도상구균(Methicillin resistant staphylococcus aureus, MRSA) 1종, 메티 실린-감수성 황색포도상구균(Methicillin susceptible staphylococcus aureus, MSSA) 1종을 Muller-Hinton Broth에 현탁한 후 표준 탁도액 (0.5 Mcfarland standard)과 같은 탁도로 조정된 균액을 제조하여 균의 농도가 약 1 X 10⁸CFU/㎖가 되도록 만들어 액체 배지 희석법에 의한 항균력 실험에 사용하였다.

먼나무(I. rotunda) 잎 추출물을 DMSO(Dimethylsulfoxide)을 용매로 하여 최고 농도 2 ㎎/㎖에서 최저농도 0.97 ㎍/㎖에 이르도록 단계적으로 희석하여 96 웰 플레이트의 각 웰에 10 ㎕씩 주입한 후 균액을 100㎕, 배지 90㎕씩 첨가하였다. 이것을 배양기(incubator)에서 37 ℃ 조건에서 24 시간 배양한 후, 육안으로 관찰하여 균의 생장이 억제된 최저농도를 최소억제 농도(MIC, minimal inhibitory concentration)로 정하였다. 암피실린(Ampicillin)은 최고 농도 250 ㎍/㎖에서 최저농도 0.06 ㎍/㎖에 이르도록 단계적으로 희석하여 먼나무(I. rotunda) 잎 추출액과 같은 조건에서 배양하였다. 사용한 용매와 DMSO가 시료의 항균력에 영향을 미치지 않았음을 대조실험을 통해 확인하였다.

3-3. 항균력 측정 결과

먼나무(I. rotunda) 잎을 항균활성을 검사하기 위해 액체배지 희석법을 이용 하여 시료의 최소억제농도(MIC)를 측정하였다. 황색포도상구균(S. aureus) MSSA ATCC 25923, MRSA 33591 균주에 대하여 항균활성을 측정해본 결과, 먼나무(I. rotunda) 잎 추출물에서 분획물 Fr3 및 Fr5, Fr6은 황색포도상구균(S. aureus) MSSA ATCC 25923, MRSA 33591의 균주에 대해서는 500 - 1000 ㎍/㎖로 측정되었다. 이는 양성 대조군인 암피실린(ampicillin) (0.12 - 125 ㎍/㎖)과 비교하였을 때 항균 활성이 있음을 나타냈다. 먼나무(I. rotunda) 잎 추출물과 분획물 Fr1, Fr2, Fr3, Fr4, Fr5 및 Fr6은 황색포도상구균(S. aureus) MSSA ATCC 25923, MRSA 33591 균주에 대해서 500-1000 ㎍/㎖로 측정되어 우수한 항균효과를 나타냈다. 특히 분획물 Fr 6, Fr 5 및 Fr 3에는 Fr6 > Fr5 = Fr3 > Fr4 = Fr2 = Fr1 과 같은 순으로 향균 활성을 나타내었다. 이러한 항균 활성을 나타낸 분획물 Fr 3, Fr 5 및 Fr 6에는 화합물 1(카페인산), 화합물 2 (3,5-디카페오일퀸산), 화합물 3 (3,4-디카페오일 퀸산), 화합물 4 (3,5-디카페오일 시킴산), 화합물 5 (3,4,5-트리카페오일 퀸산) 및 화합물 6 (루틴)이 포함되어 있다(아래의 표 9 참조). 표 9는 황색포도상구균(S. aureus)들에 대한 먼나무(IR, I. rotunda) 잎의 MeOH 추출물, 분획물-1 (Fr-1), 분획물-2 (Fr-2), 분획물-3 (Fr-3), 분획물-4 (Fr-4), 분획물-5 (Fr-5), 분획물-6 (Fr-6) 및 암피실린(AMP, ampicillin)에 대한 최소억제농도(MIC, minimum inhibitory concentration)가 정리되어 있다. .

또한, 항균 활성이 가장 우수하게 나타난 분획물 Fr 6, Fr 5, 및 Fr 3로부터 분리된 화합물 1(카페인산), 화합물 2(3,5-디카페오일 퀸산), 화합물 3(3,4-디카페오일 퀸산), 화합물 4(3,5-디카페오일 시킴산), 화합물 5(3,4,5-트리카페오일 퀸산) 및 화합물 6(루틴)에 대해 동일한 방법으로 항균활성을 측정해 본 결과, 황색포도상구균(S. aureus) MSSA ATCC 25923, MRSA 33591의 균주에 대해서 500 - 1000 ㎍/㎖로 측정되어 항균효과 나타내었다. 항산화 활성 측정 결과에서와 유사하게 항균활성에서도 화합물 3 (3,4-디카페오일 퀸산)과 화합물 5 (3.4.5-트리카페오일 퀸산)에서 항산화 및 항균 효과가 매우 우수함을 확인할 수 있었다. 결과적으로 화합물 3 및 5를 모두 포함한 분획물 Fr. 6 과 Fr5 에서도 강한 항산화, 및 항균 효과를 확인할 수 있었다(아래의 표 10 참조). 표 10에는 황색포도상구균(S. aureus)들에 대한 좀사방오리나무(Alnus pendula)수피의 식용 에탄올 추출물의 분획물-4(AP-4), 카페인산 (화합물 1, C), 3,5-디카페오일퀸산 (화합물 2, 35C), 3,4-디카페오일퀸산 (화합물 3, 34C), 3,5-디카페오일시킴산(화합물 4, 35S), 3,4,5-트리카페오일퀸산 (화합물 5, 345), 루틴(화합물 6, R)및 암피실린(AMP, ampicillin)에 대한 최소억제농도(MIC, minimum inhibitory concentration)를 나타내었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

먼나무(Ilex Rotunda)의 잎 추출물, 또는 카페인산(caffeic acid), 3,5-디카페오일퀸산(3,5-dicaffeoyl quinic acid), 3,4-디카페오일퀸산(3,4-dicaffeoyl quinic acid), 3,5-디카페오일시킴산(3,5-dicaffeoyl shikimic acid), 3,4,5-트리카페오일퀸산(3,4,5-tricaffeoyl quinic acid), 및 쿼르세틴-3-루티노사이드(quercetin-3-rutinoside) 중 어느 하나의 화합물을 유효성분으로 함유하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에 대한 항균(anti-bacterial) 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 먼나무(Ilex Rotunda)의 잎 추출물은 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산, 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
먼나무(Ilex Rotunda)의 잎 추출물, 또는 카페인산(caffeic acid), 3,5-디카페오일퀸산(3,5-dicaffeoyl quinic acid), 3,4-디카페오일퀸산(3,4-dicaffeoyl quinic acid), 3,5-디카페오일시킴산(3,5-dicaffeoyl shikimic acid), 3,4,5-트리카페오일퀸산(3,4,5-tricaffeoyl quinic acid), 및 쿼르세틴-3-루티노사이드(quercetin-3-rutinoside) 중 어느 하나의 화합물을 유효성분으로 함유하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 감염성 질환의 개선용 화장품학적 조성물.
삭제
삭제
(a) 먼나무(Ilex Rotunda)의 잎 추출물, 또는 카페인산, 3,5-디카페오일퀸산, 3,4-디카페오일퀸산, 3,5-디카페오일시킴산, 3,4,5-트리카페오일퀸산, 및 쿼르세틴-3-루티노사이드 중 어느 하나의 화합물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 감염성 질환의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.