KR20160039520A - 때죽나무 어린잎 추출물 및 이를 함유하는 항산화, 항염, 항균 효능을 갖는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 때죽나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하여 피부에 대한 항산화, 항염, 항균 효과를 나타내는 화장료 또는 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

때죽나무 어린잎 추출물 및 이를 함유하는 항산화, 항염, 항균 효능을 갖는 화장료 조성물{Antioxidant, anti-inflammatory and antibacterial cosmetic composition containing extract of styrax japonicus' young leaves}

본 발명은 항산화, 항염, 항균용 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 때죽나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하여 피부에 대한 항산화, 항염, 항균 효과를 나타내는 조성물에 관한 것이다.

항산화(抗酸化)란 산화를 억제하는 작용을 말한다. 물이나 공기 중 산소에 의한 식품의 산화에는 특히 불포화지방산을 함유하는 산화와 변질, 열화가 문제가 되나 항산화작용이 강한 차의 카테킨류나 비타민 E를 첨가하므로써 그 산화가 억제된다. 한편 활성산소에 의한 생체지질의 산화에서는 생체막 인지질(불포화지방산포함) 이외에 단백질(여러 효소를 포함)이나 유전의 정보를 담당하는 DNA의 손상 등이 관련하여 나아가서 간 장해나 순환기계 질환 혹은 암 등의 질병 그리고 노화를 유도하는 것으로 생각하고 있다. 녹차에 다량으로 함유된 카테킨류는 생체의 in vitro에 있어서 과산화물(보기로서 t-butyl hydroperoxide) 유기의 과산화 반응은 물론 생체 내 in vitro에 있어서 반응생성물(thiobarbituric acid 반응생성물, TBARS)의 생성축적을 유의적으로 억제하는 작용이 있는 것이 증명되었다. 항산화작용 활성은 카테킨의 종류에 따라 약간 달리 epigallocatechin(EGC)과 그의 몰식자산 ester인 epigallocatechin gallate(EGCG)가 가장 강하고 적어도 in vitro의 실험에서는 비타민 C나 E, 혹은 식품첨가물로서 사용되는 BHT(t-butyl hydroperoxy toluene)를 상회한다.

한편, 염증(炎蒸, inflammation)이란 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 조직 변질, 순환장애와 삼출(出), 조직 증식의 세 가지를 병발하는 복잡한 병변을 일컫는다. 또한, 여러 가지 형태의 감염(infection)이나 생체 내 대사산물 중의 자극성 물질에 대한 생체 내 방어기전의 발현이라 할 수 있고, 다양한 화학적 매개체가 염증의 발현 기전에 관여하고 있으며, 그 병인도 매우 복잡하다. 이는 조직의 상해 또는 파괴에 의해 유발되는 국소 보호 반응으로, 상해 유발 물질과 상해된 조직 모두를 파괴, 약화시키거나 차폐하는 작용을 한다. 이러한 염증의 특징은 미세혈관이 천공되고, 혈액 성분이 틈새 공간으로 누출되며, 백혈구가 염증 조직으로 이동한다는 것으로, 통상적으로 홍반, 부종, 통각 과민 및 통증 등의 임상적 증상들을 동반한다. 생체에 있어서 염증의 발생 원인으로는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히 산화질소(nitric Oxide:NO)를 발생시키는 효소인 니트릭옥사이드 신타제(nitric oxide synthase:NOS)와 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성에 관련된 효소들이 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려진 바 있다. 이에 L-아르기닌(L-Arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 NOS나, 아라키돈산(Arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘류를 합성하는데 관련된 효소인 COX(시클로옥시게나제)는 염증을 차단하는데 있어서 주된 작용을 하고 있다. 최근의 연구 결과에 따르면, NOS는 뇌에 존재하는 bNOS(brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등이 있으며, 체내에 항상 일정수준으로 발현되고 있고, 이들에 의해 소량 생성되는 NO는 신경전달이나 혈관확장을 유도하는 등 정상적인 신체의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 이에 반하여, 각종 사이토카인(cytokines)이나 외부 자극물질에 의해 유도되는 iNOS(inducible NOS)에 의해 급격히 과량 발생되는 NO는 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 만성 염증은 iNOS 활성의 증가와 관련 있다는 연구가 있다. TNF-와 같은 다기능성 사이토카인(cytokine)은 정상조직에서 발현될 뿐만 아니라 병변 과정에서 그 발현 정도가 증가되며, 특히 암촉진 과정에서 일어나는 피부염증에 중요한 역할을 한다. TNF-가 인간의 염증성 피부 질환과 관련이 있음은 이미 많이 보고되고 있다. 또한, 여러 염증질환과 알러지(allergy) 현상에 TNF-에 대한 항체를 처리하였을 때 증상이 완화되었고, TNF-는 호중성 백혈구를 활성화시켜 과산화수소 생성을 증가시킴으로써 내인성 암촉진제로서의 기능도 하고 있다. 지금까지 널리 알려져 있는 항염 소재의 성분으로는 유기화합물(이종원자 구조화합물, 탄소환 또는 비환화합물), 생약추출물, 효소, 펩타이드, 당류, 스테로이드 및 오일 등이 있으나, 물리화학적 불안정으로 인한 제형에서의 안정성이 떨어지고 피부염의 특성상 장기 복용에 따른 부작용의 우려와 아토피로 인한 2차 감염 등 피부에 자극을 일으킬 수 있는 단점을 가지고 있어 실제적으로 제품에 적용하는데 한계가 있다.

한편, 항균(抗菌)이란 약제나 생리활성물질에 의한 세균과 진균의 생육저해작용으로 살균적인 것과 정균적인 것으로 대별된다. 항균작용을 갖는 물질로서 가장 중시되고 있는 것이 항생물질(anti- biotics)이다. 항생물질이 항균작용에 미치게 할 수 있는 미생물의 범위를 항균 스펙트럼 또는 항균역이라고 부른다. 항균 스펙트럼이 넓은 항생물질을 광역 스펙트럼 항생물질이라고 부른다. 테트라사이클린(tetracy- cline)계 항생물질이나 세팔로스포린(cephalosporin)계 항생물질 등이 이에 해당한다. 항생물질의 등장에 의해 대부분의 세균감염증이 제압된 것은 주지의 사실이지만 항균작용에 저항하는 약제내성균의 출현과 만연은 치료에 문제점을 남기고 있다. 항생물질의 항균작용의 분자기구도 대부분의 것이 분명하게 밝혀져 있다. β-락탐계(β-lactam), 항생물질(penicillin계, 세팔로스포린계)의 항균작용은 세포벽합성저해에 의해, 클로람페니콜, macrolide계, 테트라사이클린계와 아미노배당계 항생물질은 단백질합성 저해에 의해 항균작용을 나타낸다. Quinolone은 DNA 합성을, 리팜피신은 RNA 합성을, 설파(sulfa)제는 엽산합성을 저해하는 것으로 항균작용을 발휘한다. 세균에 비하여 진균에 대한 작용을 발휘하는 뛰어난 항균제는 적지만 항생물질로서는 니아스타틴이나 클세오플빈이, 합성품으로는 살리실산(salicylic acid)이나 프로피온산, 소르브산염 등이 진균에 대하여 항균작용을 갖는 것이 알려지고 있다.

하지만 최근 화학물질들의 다양한 부작용으로 인해 피부 및 화장품 분야에서 천연 항균물질을 이용한 많은 추출물이 발명되었으나 실질적 효능을 갖기에는 미미한 실정이다. 따라서 실질적 효능을 갖는 천연물의 개발이 절실한 상태이다.

한편, 때죽나무(Styrax japonica Sieb. et Zucc.)는 Styrax 속에 속하는 관목으로 100종이 있으며, 열대지역이나 따뜻한 지역에서 자란다. 낙엽성 잎은 호생엽이고, 짧은 잎자루를 가지고 있다. 흰꽃은 주로 말단 군집형태로 매달려 있으며, 다섯 개의 둥근 돌출부로 된 화관을 가지고 있다. 과거에 섬 지역에서 물을 정화시키거나 세탁용으로 사용했다는 기록이 있다. 현재까지 때죽나무 추출물은 다른 용도로도 사용되고 있지 않은 신규한 원료이다. 게다가 본 발명에서와 같이 때죽나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염, 항균 효과가 있는 화장료 조성물에 대해서는 개시된 바가 없는 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-0981407호 대만민국 공개특허 제10-2012-0088139호 대한민국 공개특허 제10-2008-0081633호

본 발명자들은 피부에 적용이 가능하고 인체에 무해하여 안전성이 매우 뛰어난 천연 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 또는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 때죽나무 잎 추출물 및 이를 유효성분으로 하고 항산화, 항염증, 항균력이 뛰어난 것을 특징으로 하는 화장료 또는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 때죽나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 때죽나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 때죽나무 잎 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는데, 여기서, 본 발명의 때죽나무 잎 추출물은 바람직하게는 때죽나무 어린잎 추출물을 사용하는 것이 좋다. 때죽나무 어린잎은 새로 나온 연한 잎을 의미하는 것으로 3 ~ 5월경의 이른 봄에 돋아나는 새싹을 채취하여 사용한다. 때죽나무 잎은 독성이 있어 인체안전성에 문제가 있으나, 때죽나무 어린잎은 독성이 없어 인체에 무해하고 항산화 효과가 뛰어나다. 게다가, 때죽나무 어린잎은 항염효과가 뛰어나 피부염증 개선에 효과적이며, 나아가 피부 트러블을 완화시키고, 아토피성 피부를 개선하며, 피부 과민 반응을 완화시키는 효과가 뛰어나다. 또한, 때죽나무 어린잎은 우수한 항균 활성을 나타내고, 항균 스펙트럼이 넓어 방부능력이 우수하다.

하기 실험예에 의하면, 본 발명의 때죽나무 어린잎 추출물은 항산화 효과(참조: 실험예 1), 항염 효과(참조: 실험예 3), 항균 효과(참조: 실험예 4, 실험예 5)가 뛰어나다. 또한, 이러한 효과를 갖는 때죽나무 어린잎 추출물을 유효성분으로 함유하여 제조한 화장료 조성물의 경우, 방부 효과(참조 : 실험예 6)가 뛰어난 것으로 나타났다.

한편, 본 발명의 때죽나무 잎 추출물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 다양한 추출 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 헥산의 용매를 각각 단독으로 또는 이들을 2종 이상 혼합한 용매를 추출 용매로 이용하여 추출할 수 있다.

또한, 본 발명의 때죽나무 잎 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라 다른 방법으로 추출된 추출물도 포함한다. 예컨대, 초고압 추출법에 의한 추출; 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리; 다양한 크로마토그래피, 예를 들어 크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 크로마토그래피에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 때죽나무 잎 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명의 때죽나무 잎 추출물은 바락직하게는 초고압 추출법을 이용하는 것이 좋으며, 이 경우에는 바람직하게는 압력 100∼3000MPa, 온도 40∼90℃에서 20 ~ 30시간 처리하며, 더욱 바람직하게는 압력 500∼1000MPa, 온도 40~60℃에서 23 ~ 25시간 처리하는 것이 좋다. 또한, 초고압 추출시 pH는 특정 pH에 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 초고압기 내부 물의 pH를 1∼6으로 낮춰 처리하는 것이 좋다. 또한, 본 발명은 이와 같이 초고압 처리한 때죽나무 잎을 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 헥산 및 그의 혼합물로부터 선택된 추출용매를 이용하여 환류 추출하고 냉침한 후, 여과시킨 여과액을 농축조로 이송하여 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결 건조하는 것이 바람직하다. 본 발명은 이렇게 얻어진 감압농축물 및 동결건조물이 0.001 ~ 70.0 중량% 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출물을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 때죽나무 잎 추출물은 상기 추출물을 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축물, 또는 다시 그 농축물을 건조시켜 제조한 추출 엑기스 및 추출물 중에 함유되고 있는 주 효과를 발휘하는 화학물질 그 자체를 포함한다.당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 때죽나무 잎 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.0001 ~ 30.0중량% 첨가되는 것일 수 있다. 상기 때죽나무 잎 추출물의 함량이 0.0001중량% 미만인 경우에는 항산화, 항염증, 항균 효과가 미미하며, 30.0중량% 초과인 경우에는 경제적이지 못하다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 유효 성분으로서 상기 때죽나무 잎 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 다만, 이에 반드시 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 약학 조성물의 제형으로는 일 예로 경고제(PLASTERS), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 첩부제, 서방화제제가 있다.

한편, 본 발명의 약학 조성물은 약리학적으로 허용되는 기제; 운반제; 부형제; 전분, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 당밀, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함하는 결합제; 한천, 전분, 젤라틴 가루, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 및 알긴산 나트륨을 포함하는 분쇄제; 스테아린산 마그네슘, 활석 및 수첨 식물유를 포함하는 윤활제; 및 착색제 등을 포함할 수 있고, 상기 운반제 및 부형제로는 젖당, 글루코오스, 수크로오스, 만니톨, 감자녹말, 옥수수녹말, 탄산칼슘, 인산칼슘 및 셀룰로오스 등이 있다. 상기 외에도 안정화제, 용해보조제, 경피흡수 촉진제 등의 보조제 방향제, 방부제 등의 첨가제가 더 첨가될 수 있다.

한편, 많은 환자에게 본 발명인 약학 조성물에 대한 표준 투여량은 환자의 개별적 특성에 의해 그 양이 변화될 수 있으며, 실질적으로 숙련된 임상 의사는 환자를 위해 본 발명의 약학 조성물에 대한 이상적인 투여량 및 투여 계획, 예를 들어, 특정 필요 및 환자의 전체적인 조건의 관점에서 가장 적절한 치료 전략을 정할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 대하여, 적절한 투여량을 결정하는 데는 수많은 참조 문헌을 참조할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물의 적절한 투여량은 시험관 내 또는 동물 모델에서 일반적으로 결정될 수도 있다. 예를 들어, 시험관 내에서 표적 세포에 대해 여러 농도의 본 발명의 약학 조성물을 첨가하여 그 적절한 투여량을 결정할 수도 있다. 일 예로, 본 발명의 약학 조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.1 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 처방가능하다. 그러나 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 환자의 상태에 따라 의사의 처방에 이해 변화될 수 있다.

본 발명은 인체에 무해하여 안전성이 뛰어나고 항산화 효과가 뛰어난 화장료 또는 약학 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 피부 자극 등의 문제가 없고 항산화, 항염증 및 우수한 항균효과를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 항염효과가 뛰어나 피부염증 개선에 효과적이며, 나아가 피부 트러블을 완화시키고, 아토피성 피부를 개선하며, 피부 과민 반응을 완화시키는 효과가 뛰어나다.

또한, 본 발명은 우수한 항균 활성을 나타내고, 항균 스펙트럼이 넓어 방부능력이 우수하다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

제조예 1 : 때죽나무 잎 추출물의 제조

때죽나무의 어린잎을 정제수로 세척하고 건조한 다음 모두 분쇄한 후 100메시의 체를 이용하여 미세하게 만들었다. 그 후, 때죽나무의 어린잎 분쇄물을 100g/L가 되도록 70% 에탄올을 첨가하여 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침하고, 와트만(whatman) #3 여과지로 여과 후, 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결 건조하였다.

제조예 2 : 때죽나무 잎 초고압 추출물의 제조

때죽나무의 어린잎을 음건하여 파쇄 후 50.0 g을 초고압처리기를 이용하여 압력 1000MPa 하에서 온도를 50℃로 승온시키고 24시간 처리한 후 실온으로 냉각시켰다. 초고압 처리한 때죽나무 어린잎을 최종 70%(V/V) 에탄올 수용액이 되도록 에탄올을 첨가하여 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(whatman) #10 여과지로 여과하였다. 이렇게 얻은 여과액을 다시 0.25uM의 여과기를 이용하여 농축조로 이송하여 60℃ 정도에서 감압농축 또는 동결 건조하였다.

비교제조예 1 : 때죽나무 가지 추출물의 제조

때죽나무 가지에 대하여 제조예 1과 동일한 방법으로 때죽나무 가지 추출물을 제조하였다.

비교제조예 2 : 때죽나무 열매 추출물의 제조

때죽나무 열매에 대하여 제조예 1과 동일한 방법으로 때죽나무 열매 추출물을 제조하였다.

비교제조예 3 : 때죽나무 가지 초고압 추출물의 제조

때죽나무 가지에 대하여 제조예 2와 동일한 방법으로 때죽나무 가지 초고압추출물을 제조하였다.

비교제조예 4 : 때죽나무 열매 초고압 추출물의 제조

때죽나무 열매에 대하여 제조예 2와 동일한 방법으로 때죽나무 열매 초고압 추출물을 제조하였다.

[실험예 1: 때죽나무 잎 추출물의 DPPH법을 이용한 항산화 평가]

제조예 1, 2에서 수득한 때죽나무 잎 추출물의 농도별(0.001, 0.002, 0.005, 0.01 %) 자유라디칼 소거 활성(free radical scavenging acticity)을 평가하고자 하였다.

DPPH 측정법은 억제제(inhibitor)가 안정한 라디칼 DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl radical)를 소거하여 탈색되는 정도를 540 nm에서 흡광도를 측정하는 방법이다. 사용한 시료는 하기 표 1과 같이 시험하여 하기 수학식 1을 이용하여 자유라디칼 소거활성을 측정하였다. 대조군은 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG, Epigallocatechin gallate)로 하였다.

A: Abs of experimental group

B: Abs blank of experimental group

C: Abs of control group

D: Abs blank of control group

	Material	Ctrol group	Blank of C	Exp. Group	Blank of E
A	DPPH(MeOH)	180	(180)	180	(180)
B	Sample(용매)	(20)	(20)	20	20

	제조예 1	제조예 2	비교제조예 1	비교제조예 2	비교제조예 3	비교제조예 4
25uM EGCG	58.15
0.001%	8.21	32.48	6.31	7.98	9.37	10.03
0.002%	19.55	55.45	10.54	12.25	16.55	19.18
0.005%	41.54	85.12	17.22	18.44	31.66	33.47
0.01%	68.22	94.54	33.12	35.43	57.44	59.21

실험결과, 상기 표 2와 같이 제조예 1, 2의 때죽나무 잎 추출물이 비교제조예 1 내지 4의 때죽나무 가지, 열매 추출물에 비하여 우수한 자유라디칼 소거활성을 나타내 항산화능이 높게 나타남을 확인할 수 있었다.

[실험예 2: 때죽나무 잎 추출물의 세포 생존율 평가]

제조예 1, 2의 때죽나무 잎 추출물이 세포에 미치는 독성을 측정하였다.

세포 독성은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 Mosmann의 방법을 변형하여 실시하였다.

HDF를 96-well plate에 1×10⁴ cells/well의 농도로 분주하여 37℃, 5% CO₂ 에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 배지를 제거하고 시료를 농도별로 처리한 배지에 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 PBS (Phosphate buffered saline) 두 번씩 세척하였다. 그 후, MTT 를 5 mg/mL 로 PBS에 녹여 50 L 첨가하고 37℃, 5%의 CO₂ 에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후, DMSO를 한 well 당 100 L 넣고 10분 동안 교반한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

측정 결과, 각 시료의 모든 농도에서 세포 독성은 나타나지 않았다. 이로부터 본 발명의 때죽나무 잎 추출물은 인체에 무해하며 안전성이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

[실험예 3: 때죽나무 잎 추출물의 항염 평가(5-Lipoxygenase 저해)]

제조예 1, 2의 때죽나무 잎 추출물과 비교제조예1 내지 4의 때죽나무 가지, 열매 추출물의 5-Lipoxygenase 저해 활성 실험을 하여 항염 효과를 평가하고자 하였다.

lipoxygenase는 arachidonic acid로부터 생체내 염증반응이나 알레르기 반응 등에 관여하는 다양한 화학적인 매개체 역할을 하는 여러 물질들을 생성한다. 따라서 lipoxygenase를 저해하는 물질은 각종 chemical mediators의 생성을 억제하는 결과를 가져오게 되므로 알레르기에 유효할 것이라고 추정할 수 있다. lipoxygenase의 활성정도는 기질과 효소를 이용하여 과산화물 생성정도로 측정하는 실험이다.

사용한 시료는 하기 표 3과 같이 시험하여 상기 수학식 1을 이용하여 5-Lipoxygenase 저해 활성을 측정하였다. 대조군은 노르디히드로구아이아레트산 (NDGA, Nordihydroguaiaretic acid)로 하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

	Material	Ctrl group	Blank of C	Exp. Group	Blank of E
A	Buffer	2ml	2ml	2ml	2ml
B	Sample(용매)	(20㎕)	(20㎕)	20㎕	20㎕
C	Enzyme	40㎕	-	40㎕	-
D	Substrate	70㎕	70㎕	70㎕	70㎕

	제조예 1	제조예 2	비교제조예 1	비교제조예 2	비교제조예 3	비교제조예 4
250nM NDGA	54.65
0.001%	7.43	15.43	1.92	3.22	2.71	3.64
0.002%	13.12	34.28	3.61	8.79	7.39	10.3
0.005%	25.59	54.54	8.45	12.52	15.65	18.91
0.01%	52.15	75.12	12.72	14.84	36.16	34.37

상기 표 4의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 때죽나무 잎 추출물은 때죽나무 가지, 열매 추출물에 비하여 5-Lipoxygenase 저해능이 우수하게 나타난 것으로 보아 우수한 항염효과를 확인할 수 있었으며, 특히, 때죽나무 잎 초고압 추출물이 가장 우수한 항염효과를 나타내었다.

[실험예 4: 때죽나무 잎 추출물의 항균력 평가(Paper disc test)]

본 발명의 때죽나무 잎 추출물의 항균 효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. 균주는 CTFA에서 선정한 4가지 피검균 포도상구균(Staphylococcus aureus) KCTC1916, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) KCTC 1636, 대장균(Escherichia coli) KCTC 1039, 캔디다균(Candida albicans) KCTC 7965 에 적용하여 수행한다. 세균은 Tryptic Soy Broth 배지에, 진균은 Potato Dextrose Broth 배지에 시험균주 1%씩을 접종한 후 세균은 37℃에서 24시간, 진균은 25℃에서 48시간 진탕 배양한 후, 세균은 1×10⁶ cfu/ml, 진균은 1×10⁵ cfu/ml로 0.9% NaCl에 희석한다. 준비한 샘플은 실험할 농도별로 희석한 후 빈 페트리디쉬에 지름 8mm의 paper disc를 올리고 50 ㎕ 처리하여 클린벤치 내에서 완전히 건조한다. 미리 만들어 50℃에서 보관한 tap agar(0.7% Agar) 10 ㎖에 희석한 균을 각각 100 ㎕씩 접종하여 세균은 Tryptic Soy Broth 배지에, 진균은 Potato Dextrose Broth 배지에 부어준다. agar 가 완전히 굳으면 그 위에 건조된 paper disc를 올려 놓는다. 세균은 37℃에서 24시간, 진균은 25℃에서 48시간 배양한 후 paper disc 주의의 미생물이 성장하지 못한 지름(inhibition zone)을 측정하여 mm로 나타내어 항균활성을 평가하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

시료	포도상구균	녹농균	대장균	캔디다균
제조예 1	24	24	25	23
제조예 2	31	30	30	29
비교제조예 1	11	10	10	9
비교제조예 2	10	10	11	9
비교제조예 3	15	15	14	12
비교제조예 4	16	14	15	11

(단위 : mm)

상기 표 5의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 때죽나무 잎 추출물은 때죽나무 가지, 열매 추출물에 비하여 저해환이 넓게 나타난 것으로 보아 우수한 항균효과를 확인 할 수 있었다. 특히, 때죽나무 잎 초고압 추출물이 저해환이 가장 넓게 나타나 항균효과가 매우 높음을 알 수 있었다.

[실험예 5: 때죽나무 잎 추출물의 항균력 평가(MIC test)]

본 발명의 때죽나무 잎 추출물의 항균 효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. 균주는 CTFA에서 선정한 4가지 피검균 포도상구균(Staphylococcus aureus) KCTC1916, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) KCTC 1636, 대장균(Escherichia coli) KCTC 1039, 캔디다균(Candida albicans) KCTC 7965 에 적용하여 수행한다. 세균은 Tryptic Soy Broth 배지에, 진균은 Potato Dextrose Broth 배지에 시험균주 1%씩을 접종한 후 세균은 37℃에서 24시간, 진균은 25℃에서 48시간 진탕 배양한 후, 세균은 1×10⁶ cfu/ml, 진균은 1×10⁵ cfu/ml로 0.9% NaCl에 희석한다. 준비한 샘플을 각 농도별로 세균은 Tryptic Soy Broth 배지에, 진균은 Potato Dextrose Broth 배지에 용해하여 총 10 ㎖가 되게 하고, 여기에 희석한 균주를 100 ㎕ 씩을 접종하였다. 그 후, 세균은 24시간 , 진균은 48시간 후 배지의 탁도(turbidity) 변화를 통하여 피검균의 성장 여부를 확인하여 평가하였다. 한편, 피검균이 자라지 않은 농도를 최소저해농도(Minimal inhibitory concentration, MIC)라 한다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

시료	포도상구균	녹농균	대장균	캔디다균
제조예 1	2.5	2.5	2.5	2.0
제조예 2	2.0	2.0	2.0	1.5
비교제조예 1	-	-	-	-
비교제조예 2	-	-	-	-
비교제조예 3	-	-	-	-
비교제조예 4	7.0	5.0	5.0	6.0

(단위 : %)

상기 표 6의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 때죽나무 잎 추출물은 때죽나무 가지, 열매 추출물에 비하여 MIC 농도가 낮게 나타난 것으로 보아 항균효과가 높음을 확인 할 수 있었다.

[실시예 1: 때죽나무 잎 추출물을 함유하는 화장료의 제조]

제조예 1, 2의 때죽나무 잎 추출물 30.0중량%가 포함된 화장료 조성물을 하기 표 7의 조성으로 제조하여 이를 처방예 1, 2이라 하고, 비교제조예 4의 때죽나무 열매 초고압 추출물 30.0중량%가 포함된 화장료 조성물을 하기 표 7의 조성으로 제조하여 이를 비교처방예 1이라 하였다.

성분	처방예 1 (중량%)	처방예 2 (중량%)	비교처방예 1 (중량%)
제조예 1	30.0	-	-
제조예 2	-	30.0	-
비교제조예 4	-	-	30
1,3-BG	10.0	10.0	10.0
글리세린	5.1	5.1	5.1
프로필렌글리콜	4.2	4.2	4.2
토코페릴아세테이트	3.0	3.0	3.0
유동파라핀	4.6	4.6	4.6
트리에탄올아민	1.0	1.0	1.0
스쿠알란	3.1	3.1	3.1
마카다미아너트오일	2.5	2.5	2.5
폴리아위베이트60	1.6	1.6	1.6
아위비탄세스퀴롤레이트	1.6	1.6	1.6
프로필파라벤	0.6	0.6	0.6
카르복실비닐폴리머	1.5	1.5	1.5
향	미량	미량	미량
방부제	미량	미량	미량
정제수	잔량	잔량	잔량
계	100	100	100

[실험예 6: 때죽나무 잎 추출물을 함유하는 화장료의 방부력 평가(Challenge test)]

본 발명의 때죽나무 추출물을 함유하는 화장료의 방부력 효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. 균주는 CTFA에서 선정한 4가지 피검균 포도상구균(Staphylococcus aureus) KCTC1916, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) KCTC 1636, 대장균(Escherichia coli) KCTC 1039, 캔디다균(Candida albicans) KCTC 7965 에 적용하여 수행한다. 세균은 Tryptic Soy Broth 배지에, 진균은 Potato Dextrose Broth 배지에 시험균주 1%씩을 접종한 후 세균은 37℃에서 24시간, 진균은 25℃에서 48시간 진탕 배양한 후, 세균은 1×10⁶ cfu/ml, 진균은 1×10⁵ cfu/ml 로 0.9% NaCl에 희석하여 준비한 샘플 50g에 시험균주를 모두 접종한다. 접종 직후 30분 이내에 1ml을 취해 0.9% NaCl 9ml에 두 번 희석하여 세균은 37℃에서 24시간, 진균은 25℃에서 48시간 배양하여 생균수를 측정한다. 이는 대조군으로써 zero point로 사용하고, 1일, 2일, 3일, 7일, 14일, 28일 간격으로 위의 방법대로 생균수를 측정하여 더 이상 균이 측정되지 않는 지점을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 8은 실험예 5에서 MIC 농도를 확인하였던 제조예 1, 제조예 2, 비교제조예 4를 실시예 1과 같이 화장료로 제조하여 평가한 결과를 나타낸 것이다.

시료	포도상구균	녹농균	대장균	캔디다균
처방예 1	3	4	4	3
처방예 2	2	3	3	2
비교처방예 1	14	14	14	14

(단위: 일(days))

상기 표 8의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 때죽나무 잎 추출물을 함유하는 화장료인 처방예 1, 2의 경우 방부활성을 확인할 수 있었으며, 초고압 추출을 했던 처방예 2에서 더 높은 효과를 확인하였다. 한편 때죽나무 열매 추출물을 함유하는 화장료인 비교처방예 1의 경우 미미하지만 방부활성을 확인할 수 있었으나, 일반적으로 방부력에 따라 방부활성이 더 빨리 나타나므로 상기의 결과는 본 발명의 때죽나무 잎 추출물을 함유하는 화장료가 높은 방부력을 나타낸다는 것을 확인시켜 준 것이다.

Claims (12)

1. 때죽나무 잎 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 때죽나무 잎 추출물은 때죽나무 어린잎 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   피부 염증 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   피부 트러블 완화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   아토피성 피부 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   피부 과민 반응 완화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   항균용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   방부용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
9. 때죽나무 잎 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 때죽나무 잎 추출물은 때죽나무 어린잎 추출물인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
    
11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    항염용인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
    
12. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    항균용인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.