KR20140122588A

KR20140122588A - 감꼭지 추출물을 포함하는 항균 조성물

Info

Publication number: KR20140122588A
Application number: KR1020130039472A
Authority: KR
Inventors: 안봉전; 박근혜; 강연자; 김진철; 정용하; 박종국; 강경윤; 김현정
Original assignee: (주)튜링겐코리아
Priority date: 2013-04-10
Filing date: 2013-04-10
Publication date: 2014-10-20

Abstract

본 발명은 감꼭지 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 천연물 기반 추출물로서 인체에 안전하고, 다양한 세균에 대한 항균스펙트럼을 보유하여 세균성 피부질환을 치료, 예방 또는 완화시키기 위한 약물, 기능성 화장품 또는 기능성 식품으로 개발될 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기 항균 활성 외에도 항산화능 및 항염증 활성을 추가적으로 보유하여 면역력 향상 및 염증 완화에도 기여할 수 있다.

Description

감꼭지 추출물을 포함하는 항균 조성물{Anti-bacterial Composition Comprising Kaki Calyx Extract}

본 발명은 감꼭지(Kaki Calyx) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 인간의 피부는 인체 내에서 외부 환경과 가장 밀접하게 접하고 있는 신체 기관으로, 인체 내부를 보호하는 생화학적이고 물리적인 기능을 가지고 있는 아주 중요한 기관이다. 또한, 피부는 주위환경과 직접 접촉되는 부위이기 때문에 세균, 곰팡이 등의 감염이 쉽게 일어나고, 그람 양성 세균인 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.), 스트랩토코커스 속(Streptococcus sp.)과 그람 음성 세균인 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 에스체리시아 콜리(Escherichia coli) 및 곰팡이 등이 상재하는데, 상기 세균 중 가장 흔히 피부에서 검출되는 종으로는 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 아우에우스(Staphylococcus aureus) 및 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 등을 들 수 있다. 이러한 세균들에 의해 피부가 감염되어 여드름, 뾰루지, 버짐, 옹, 부스럼 등의 피부질환을 발생한다. 종래는 이러한 세균들을 살균시킬 목적으로 트리클로카반(Triclocarban), 트리클로산(Triclosan) 등의 화학 살균제를 사용하였으나, 그람 음성 세균에는 상대적으로 효과가 미약하며, 내성균 유발 및 피부자극을 초래하기 때문에 그 사용이 제한적일 수밖에 없었다.

P. 아크네스는 그람 양성 혐기성 세균으로 0.3~1.3 ㎛×1~10 ㎛이고 균체 일부가 팽대하며 균단은 뾰족하고 다형성이고 V자 배열을 하고 있다. 정상 성인의 피지선에서 80%까지 검출되는 정상 균총의 하나이나 피지분비가 많은 모공 주변 등에 분포하며 표피성 포도상 구균과 함께 피부에 존재하면서 여드름 등과 같은 모낭염 등 피부질환의 발생과 증상을 악화시키는 원인균이 되기도 한다. P. 아크네스는 피지를 주 영양원으로 하며, 피지의 주성분인 중성지방을 지방산과 글리세롤로 분해하며, 이때 생성된 유리 지방산은 피부에 심한 자극을 주어 모낭벽이나 모공 주위에 세포에 염증을 일으킨다. 또한 이 균에 의해 자극을 받은 상피세포는 각질세포 생성이 증가하여 정체 과각화가 이루어져 여드름의 초기단계인 미세면포를 형성하며, 계속하여 각질과 피지가 분해됨으로서 모낭 벽이 얇아지고, P. 아크네스를 탐식한 백혈구가 분비하는 가수분해효소의 작용에 의해 모낭 벽이 파열되고 모근 내용물이 진피내로 유리되어 염증반응이 가속화된다(이경숙 등, 2006).

한편, 여드름의 치료제는 피지 과잉생산 억제, 모낭벽의 과각화 방지, P. 아크네스의 증식억제 및 염증반응의 방지 측면에서 개발되고 있다. 그러나 현재 사용되고 있는 에리쓰로마이신(Erythromycin), 이소트레티노닌(Isotretinoin), 벤조일 페록사이드(Benzoyl peroxide), 비타민에이산(Vitamin A acid), 트리클로산(Triclosan) 및 아젤라산(Azelaic acid) 등의 약물들은 구순염, 점막 건조감, 최기 형성, 기미 또는 혈전증의 부작용과 함께 항생제 내성균주의 출현이나 치료 중단 시의 재발 등의 문제점 등 많은 문제점이 있는 것으로 알려져 있다.

감꼭지는 한약명으로 시체라 부르고, 감나무과(Ebenaceae)에 속하는 낙엽관목교목인 감나무(枾樹) Diospyros kaki THUNB.[KHPCP]의 과실 꽃받침이며, 가장자리가 얇게 넷으로 갈라진 넓적한 꽃받침으로 지름 15 ~ 25 ㎜, 두께 1 ~ 4 ㎜이다. 열편은 난원형 또는 삼각상 및 넓은 난형이며 위쪽으로 대개 말려져 있고 합편부의 중앙은 좀 두껍다. 겉면은 회갈색 또는 적갈색이고 흔히 네 개의 융기선이 있으며 과병의 잔기가 붙어 있거나 떨어진 자리가 오목하게 남아 있는 것도 있다. 안쪽면의 합편부를 확대경으로 보면 갈색의 짧은 털이 밀생하고 중앙 부위에는 열매가 떨어진 흔적이 나타난다. 주요성분으로는 우르솔릭산(Ursolic acid), 올레아놀산(Oleanic acid), 베툴산(Betulic acid), 탄닌산(Tannic Acid)등이 있으며 기침, 천식 및 만성 기관지염뿐만 아니라 딸꾹질에도 좋은 효과가 있는 것으로 여기고 있다(영림사, 2006). 하지만, 현재까지 상기 감꼭지 추출물이 피부 상재균에 대한 항균활성을 보유하고 있어 항균제로 사용될 수 있다는 사실은 알려진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 항균 활성이 우수하고, 항균 스펙트럼 범위가 넓으며, 인체에 안전한 천연 항균제를 개발하던 중 상기 감꼭지 추출물이 이와 같은 효과가 있음을 발견하여 본 항균제를 개발하게 되었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

이경숙 등, 여드름병변에서 채취한 Propionibacterium acnes의 분리, 동정 및 생화학적 특정 연구, 한국의류산업학회지 8(5), 571-576, 2006 영림사, 한약본초학. 2006; p.491-492 Satue-Garcia MT, Heinonen IM, Frankel EN. (1997) Anthocyanins as antioxidants on human low-density lipoprotein and lecithinliposomesystem. J. Agric. Food Chem. 45, 3362-3367. Miquel J. (1998) An update on the oxygen stress-mitochondrial mutation theory of aging: genetic and evolutionary implications. Exp. Gerontol. 33, 113-126. Ansel JC, Luger TA, Lowry D, Perry P, Roop DR, Mountz JD. (1988) The expression and modulation of IL-1α in murine keratinocytes. J. Immunol. 140, 2274-2278. Fridovich I. Quantitative aspects of the production of superoxide anion radical by milk xanthin oxidase. J. Biol. Chem. 1970;245:4053-4057 Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF, Minna JD and Mitchell HB. (1987) Evaluation of a tetrazolium based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res. 47(4), 936-942 Conner DE, Beuchat LR. 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본 발명자들은 천연물 기반 추출물로서 인체에 안전하고, 다양한 세균에 항균력을 보유하여 세균성 피부질환의 예방 및 치료에 효과적인 천연 추출물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과 감꼭지 추출물이 다양한 세균에 대한 항균 스펙트럼을 보유하고 있으며, 더불어 항산화능 및 항염증 활성까지도 추가적으로 보유한다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 감꼭지 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항균 조성물을 포함하는 세균성 피부질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 감꼭지(Kaki Calyx) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

본 발명은 감꼭지(시체, Kaki Calyx)의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균(anti-bacterial) 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 감꼭지 추출물은 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다.

본 발명의 감꼭지 추출물을 추출하기 위한 추출 용매로는 추출 공정에서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있는데, 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물이 포함하는 추출물은 상기 추출방식 외에 상기 추출물에 추가적인 추출을 수행하거나, 분획 용매를 이용하여 추가적으로 분획한 분획물을 포함한다.

분획 용매로서 일반적으로 사용할 수 있는 용매를 사용할 수 있는데, 헥산, 벤젠, 에테르, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 분획하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 피부에 감염될 수 있는 다양한 종류의 피부 상재균 또는 각종 피부질환을 유발하는 다양한 세균에 항균활성을 보유하며, 바람직하게는 스타 필로 코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis), 에스체리시아 콜리(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)로 구성된 군으로부터 선택되는 피부 상재균에 대해 항균 활성을 갖는다.

본 발명의 조성물을 항균제로 이용할 경우, 바람직하게는 0.1 ㎍/㎖~1,000 ㎎/㎖, 보다 바람직하게는 1 ㎍/㎖~100 ㎎/㎖ 범위에서 상기 추출물 또는 분획물을 포함하여 목적에 적합하게 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 상기 항균 활성 외에도 항산화능을 추가적으로 보유한다.

상기 항산화능은 다양한 방식으로 측정이 가능하며, 전자 공여 활성, SOD(Superoxide dismutase) 유사 활성, ABTS 라디칼 소거 활성, 수퍼옥사이드(Superoxide) 음이온 라디칼 소거 활성 등을 측정하여 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물을 이용하여 항산화능을 측정한 결과 전자 공여 활성, SOD 유사 활성, ABTS 라디칼 소거 활성, 수퍼옥사이드 음이온 라디칼 소거 활성 등에서 농도 의존적인 증가를 나타내었다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 상기 항균 활성 외에도 항염증 활성(anti-inflammatory activity)을 추가적으로 보유한다.

상기 항염증 활성은 다양한 방식으로 측정이 가능하며, NO 저해 활성, PGE₂ 저해 활성, TNF-α 저해 활성, IL-1β 저해 활성, IL-6 저해 활성, IL-8 저해 활성, iNOS 단백질 발현 저해 활성, COX-2 단백질 발현 저해 활성 등을 측정하여 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물을 이용하여 항염증 활성을 측정한 결과 NO 저해 활성, PGE₂ 저해 활성, TNF-α 저해 활성, IL-1β 저해 활성, IL-6 저해 활성, IL-8 저해 활성, iNOS 단백질 발현 저해 활성, COX-2 단백질 발현 저해 활성 등에서 농도 의존적인 증가를 나타내었다.

상기한 바와 같이 다양한 피부 상재균에 대해 항균 스펙트럼을 갖는 본 발명의 항균 조성물은 농약, 의약, 화장품, 생활용품, 식품 등에서 항균, 살균, 소독, 방부 등의 목적을 달성하기 위해 광범위하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 농업에 있어서는 항균, 살균, 소독의 목적으로, 의약에 있어서는 항생제나 오염방지제와 같은 목적으로, 식품에 있어서는 방부나 항균목적으로, 화장품이나 생활용품에 있어서는 비듬억제용, 무좀방지용, 겨드랑이 채취억제용, 항여드름용 등 미생물과 직접 연관된 제품에 사용되거나 청소용 세정제나 식기세척용 세정제 등에 방부나 항균 또는 살균목적으로 사용되어 질 수 있으며, 이러한 목적으로만 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항균 조성물이 화장품 조성물의 형태로 제공되는 경우, 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이 인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로 카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 충진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산아미드에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산에스테르 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분과 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 본 발명의 화장품 조성물에서 유효성분인 감꼭지 추출물 또는 이의 분획물의 양은 특별히 한정되지 않으며, 바람직하게는 상기 항균 효능을 달성하는 데 충분한 양으로 포함된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 세균성 피부질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 ㎎/㎏(체중)이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 피부 도포, 경피 투여, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다. 본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 항균 조성물은 기능성 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 기능성 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서의 감꼭지 추출물 또는 이의 분획물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨 대, 덱스트린,시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 감꼭지 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 세균성 피부질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(ⅲ) 본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 천연물 기반 추출물로서 인체에 안전하고, 다양한 세균에 대한 항균스펙트럼을 보유하여 세균성 피부질환의 예방 또는 치료에 효과적이며, 더불어 항산화능 및 항염증 활성을 추가적으로 보유하여 면역력 향상 및 염증 완화에 기여할 수 있다.

도 1은 감꼭지(Kaki Calyx)의 추출 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 감꼭지 추출물의 분획과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 감꼭지 추출물의 전자 공여능을 나타낸 도면이다.
도 4는 감꼭지 추출 분획물의 전자 공여능을 나타낸 도면이다.
도 5는 감꼭지 추출물의 SOD-유사 활성을 나타낸 도면이다.
도 6은 감꼭지 추출 분획물의 SOD-유사 활성을 나타낸 도면이다.
도 7은 감꼭지 추출물의 ABTS 라디칼 양이온 소거 활성을 나타낸 도면이다.
도 8은 감꼭지 추출 분획물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타낸 도면이다.
도 9는 감꼭지 추출물의 Superoxide 음이온 라디칼 소거 활성을 나타낸 도면이다.
도 10은 감꼭지 추출 분획물의 Superoxide 음이온 라디칼 소거 활성을 나타낸 도면이다.
도 11은 감꼭지 추출 분획물 처리에 따른 대식세포의 생존율을 나타낸 도면이다.
도 12는 감꼭지 추출 분획물의 NO 저해 활성을 나타낸 도면이다.
도 13은 감꼭지 추출 분획물의 TNF-α 저해 활성을 나타낸 도면이다.
도 14는 감꼭지 추출 분획물의 PGE₂ 저해 활성을 나타낸 도면이다.
도 15는 감꼭지 추출 분획물의 IL-1β 저해 활성을 나타낸 도면이다.
도 16은 감꼭지 추출 분획물의 IL-6 저해 활성을 나타낸 도면이다.
도 17은 감꼭지 추출 분획물의 IL-8 저해 활성을 나타낸 도면이다.
도 18은 감꼭지 추출 분획물이 iNOS 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 19는 감꼭지 추출 분획물이 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 20은 NF-κB 항체를 이용하여 면역형광 염색법을 실시 한 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 감꼭지 추출 CHCl₃ 분획물의 항균 활성을 나타낸 도면이다.
도 22는 감꼭지 추출 EtOAc 분획물의 항균 활성을 나타낸 도면이다.
도 23은 감꼭지 추출 n-BuOH 분획물의 항균 활성을 나타낸 도면이다.
도 24는 감꼭지 추출 H₂O 분획물의 항균 활성을 나타낸 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료

재료

본 실험에 사용한 감꼭지(Kaki Calyx)는 경상북도 영천시 임고면 수성리에서 수확한 것으로 대보약업사에서 구입하여 이물질을 제거하고 세척한 후, 음건하여 실험 재료로 사용하였다.

시료 추출 및 용매 분획

시료의 추출은 도 1과 같이 추출하였다. 열수 추출물의 경우 시료 100 g에 증류수 10배 양을 가하여 85℃에서 3시간 환류냉각 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였으며, 에탄올, 메탄올 및 아세톤 추출물의 경우 70% 에탄올, 메탄올과 아세톤을 시료 중량의 10배 양을 가하여 실온에서 24시간 침지하여 상등액과 침전물을 분리하여 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 각 추출물들은 원심분리 및 여과, 농축 후 동결 건조하여 냉장실에 보관하면서 본 실험의 시료로 사용하였다. 시료의 용매 분획은 아세톤 추출물을 증류수에 현탁 시킨 후 단계적으로 분획하였다. 감꼭지 아세톤 추출물과 CHCl₃을 1:1 비율로 분획깔대기에 넣고 CHCl₃을 분획하였고, CHCl₃층을 다시 감압 농축하여 CHCl₃층 분획물을 얻었다. 동일한 과정으로 EtOAc층, BuOH층 및 H₂O층을 순차적으로 가하여 각각의 분획물을 얻었다(도 2).

시약 및 기기

1) 감꼭지의 항산화 측정을 위한 시약

항산화능 실험에 사용된 시약인 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH), xanthine, xanthine oxidase, pyrogallol, nitro blue tetrazolium(NBT), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt, potassium persulfate 등은 Sigma Chemical Co. Ltd.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

2) 대식세포(Raw 264.7)의 배양 및 세포 생존률 측정 시약

세포 독성에 측정에 사용된 세포주는 대식세포인 Raw 264.7을 ATCC에서 구입하여 사용하였다. 세포 독성 측정 시약은 0.4% trypan blue stain은 Gibco BRL Co. Ltd.(Grand Island, USA) 및 Haemacytometer(Marienfeld, Germany)에서 구입하여 사용하였으며 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide (MTT)는 Sigma Chemical Co. Ltd.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

3) 항염증 측정을 위한 시약

항염증 측정 실험에 사용된 시약인 protease inhibitor, phosphatase inhibitor, griess reagent , 2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid), ripa buffer 등은 Sigma Chemical Co. Ltd(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 실험에 사용된 1차 항체인 iNOS BD Bioscience(Sanjose, CA, USA), COX-2 Cayman(Ann Arbor, MI, USA), β-Actin(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 2차 항체인 anti-rabbit IG-G horseradish peroxidase(HRP)-conjugated antibody는 Santa Cruz에서 구입하였으며, PGE2, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α 측정을 위한 ELISA kit는(R&D saystems Inc., Minneapolis, MN, USA)에서 구입 하였다.

4) 항균력 측정에 사용된 균주 및 배지

항균력 실험에서 사용한 공시 균주는 피부 상재균으로서 Staphylococcus aureus KTCT 1621, Staphylococcus epidermidis KTCT 1917 및 Escherichia coli KCTC 1039 및 여드름 유발균으로서 Propionibacterium acnes KCTC 3314를 계대 배양하여 사용하였다. 전 배양 및 본 배양을 위한 액체 배지는 tryptic soy broth(TSB), nutrient broth(NB) Difco Lab.(Sparks, USA) 및 Gifu anaerobic medium(GAM, Nissui Co. Japan)에서 구입하였다. 생육 저해 환 측정을 위한 고체 배지로는 tryptic soy agar(TSA), nutrient agar(NA) Difco Lab.(Sparks, USA) 및 Gifu anaerobic medium(GAM, Nissui Co. Japan)에 agar를 첨가하여 사용하였다.

5) 실험에 사용된 기기

생리활성 실험에 사용된 기기는 UV/VIS spectrophotometer(Hitachi, Japan), rotary vacuum evaporator(ToKyo, Rikakikai CO. Japan), centrifuge(Hitachi, Japan), freeze drier(Ilsin, Korea), microscope(Olympus, Japan), CO₂ 인큐베이터(Hanbaek Scientific Co. Korea), pH meter(Metrohm, Switzerland), BOD 인큐베이터(Hanbaek Co. Korea), autoclave(Hanbaek Scientific CO. Korea), ELISA reader(Tecan Ma nnedorf), PCR Bio-Rad, USA), ABI step one plusTM(Applied Biosystems, CA, USA)을 사용하였다.

실험 방법

1) 전자 공여능 측정

전자 공여능(EDA:electron donating ability)은 Blois(Satue-Garcia et al., 1997)의 방법을 변형하여 측정하였다. 각 시료용액 2 ㎖에 0.2 mM의 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl(DPPH) 1 ㎖ 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 전자 공여능은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

전자공여능(%)=(1 - 시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100

2) ABTS+·cation radical scavenging activity 측정

ABTS+˙radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+˙cation decolorization assay(Miquel, 1998) 방법에 의하여 측정 하였다. 7 mM 2,2-azino-bis(3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid)와 2.4 mM potassium persulfate를 혼합하여 실온에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+˙을 형성시킨 후 ethanol로 희석하여 ABTS+˙100 ㎕에 시료 100 ㎕를 가하여 1분 동안 방치한 후 732 ㎚ 흡광도에서 측정하였다.

소거율(%) = (1 - 시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) ×100

3) Superoxide dismutase(SOD) 유사 활성 측정

SOD 유사활성은 Marklund(Ansel et al., 1988)의 방법에 따라 측정하였다. 각 시료용액 0.2 ㎖에 tris-HCl 완충용액(50 mM tris + 10 mM EDTA, pH 8.5) 2.6 ㎖와 7.2 mM pyrogallol 0.2 ml를 가하여 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1M HCl 0.1 ㎖를 가하여 반응을 정지시키고 반응 중 산화된 pyrogallol의 양을 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. SOD 유사활성은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.

SOD 유사활성능(%) = (1 - 시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100

4) Superoxide anion radical 소거능 측정

Superoxide anion radical 소거능은 nitroblue tetrazolium(NBT) 환원방법에 의해 측정하였다(Fridovich, 1970). 각 시료용액 0.1 ㎖와 0.1M potassium phosphate buffer(pH 7.5) 0.6 ㎖에 xanthine(0.4 mM)과 NBT(0.24 mM)을 녹인 기질액 1 ㎖를 첨가하고 xanthine oxidase (0.049 U/㎖) 1 ㎖를 가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 1 N HCl 1 ㎖를 가하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액 중에 생성된 superoxide anion radical의 양을 560 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

저해율(%) = (1 - 시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도) ×100

5) 대식세포(Raw 264.7)를 이용한 세포 생존률 측정

세포 독성 측정은 Carmichael(Carmichael et al., 1987) 방법으로 분석하였다. Raw 264.7 cell 5 x 104 cells/㎖를 96 well plate에 분주하고 시료를 농도 별 (5, 10, 25, 50, 100, 500 ㎍/㎖)로 24시간 동안 처리하였다. Well 당 20 ㎕의 MTT용액을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 4시간 동안 반응시킨 후, microplate reader를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.

6) Nitric Oxide 생성량 측정

NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 griess reagent를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 5 x 10⁵ cells/㎖로 조절한 후 6 well plate에 접종하고, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 전 배양하였다. 세포에 1 ㎍/㎖의 LPS를 처리하고 1시간 뒤에 농도별로 CopA3를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후 griess 시약과 반응 시킨 후 ELISA reader로 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 NO 생성율을 백분율로 표시하였다.

7) Western blot을 이용한 inducible NO synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2) 활성 측정

iNOS protein 활성 측정을 확인하기 위하여 대식세포주인 Raw 264.7 cell은 DMEM 배지를 이용하여 5 x 10⁵cells/㎖로 조절한 후 100 ㎜ cell culture dish에 접종하고, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 전 배양하였다. 세포에 1 ㎍/㎖의 LPS를 처리하고 1시간 뒤에 5, 10, 50, 100 ㎍/㎖의 CopA3를 처리하여 24시간 배양 한 후 배지를 제거하고 Phosphate buffer saline(PBS)로 2번 세척해 준 후, lysis buffer 를 이용하여 단백질을 추출한 후 원심 분리하여 상등액을 취하였다. 상등액을 Bradford assay로 단백질 농도를 정량 한 후 10% SDS-PAGE를 시행하고, 전개된 단백질을 nitrocellulose membrane으로 transfer시켰다. 이 membrane을 5% skim milk로 1시간 동안 블로킹하고, 1차 항체(1:1000)를 희석하여 4℃에서 over night한 다음, TBST로 10분 간격으로 3회 세척하고, 각각의 2차 항체를 1:1000으로 희석하여 실온에서 2시간 동안 상온에서 반응시켰다. 다시 TBST로 10분간 3회 세척 후 ECL용액으로 반응시켜 LAS 4000 chemiluminescence detection system(Fuji, Tokyo, Japan)을 이용하여 현상 및 정량을 하였다.

8) PEG₂, TNF-α, IL-1β, IL-6 생성량 측정

세포배양액 내의 TNF-α, IL-1β, IL-6 생성량은 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. Raw 264.7 cell은 DMEM배지를 이용하여 5 x 10⁵cells/㎖로 조절한 후 6 well plate에 접종하고, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 세포에 1 ㎍/㎖의 LPS를 처리 한 뒤 1시간 후에 CopA3를 처리하여 24시간 배양 한 후 배양배지를 취하여 TNF-α, IL-1β, IL-6를 측정하였다.

9) PCR을 통한 mRNA의 발현 측정

(1) Total RNA 분리 및 cDNA합성

세포를 100 ㎜ 디쉬에 씨딩한 뒤 24시간 동안 배양한 후 샘플을 농도별로 처리하여 24~48시간 동안 배양하였다. 배지 상등액을 제거한 후 Trizol lysis buffer를 각 well에 1 ㎖씩 분주하여 세포를 lysis한 후 70℃에 보관하였다. 보관된 시료를 실온에서 녹인 후 클로로포름 200 ㎕를 분주하여 20초간 인버팅하였다. 그 후 13,200 rpm에서 2분간 원심 분리하여 상층액을 이소프로판올 500 ㎕이 들어 있는 튜브에 옮겨 섞었다. 다시 13,200 rpm에서 15분간 원심 분리 하였고, 그 상층액을 제거 한 후 70% EtOH를 각 튜브에 1 ㎖씩 분주하여 13,200 rpm에서 5분간 원심분리 한 뒤 상층액을 제거한 뒤 실온에서 건조 시켰다. Dietheyl pyrocarbonate(DEPC)를 20~40 ㎕씩 분주하여 녹인 후 RNA 5 ㎕에 0.1% DEPC를 955 ㎕를 첨가 하여 260 ㎚, 280 ㎚에서 각각 흡광 측정하여 total RNA양을 측정하였다. Oligo(dT) 1 ㎕, 추출한 RNA(2 ㎍)와 Rnase free water로 5 ㎕을 맞추고 75℃에서 5분간 반응 시킨 후 5 X reaction buffer, MgCl₂, dNTP, recombinant rnasin, Reverse transcriptase을 첨가하여 25℃ 5분, 42℃ 60분, 70℃ 15분간 반응 시켜 cDNA를 합성시켰다.

(2) RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)

iNOS, COX-2의 mRNA 발현을 알아보기 위하여 Polymerase chain reaction(PCR)을 실시하였다. 실험에 사용한 프라이머 서열은 표 1과 같다.

프라이머 서열

iNOS	Sense	ATT CGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT
iNOS	Antisense	GCT GTG TGT CAC AGA ACT CTC GAA CTC
COX-2	Sense	GGA GAG ACT ATC AAG ATA CT
COX-2	Antisense	ATG GTC AGT AGA CTT TTA CA

PCR 튜브에 Go Flexi DNA polymerase, 프라이머, 합성한 cDNA를 첨가하여 잘 섞은 후 PCR을 실행하였다. iNOS, COX-2의 조건은 95℃ 60초, 60℃ 60초, 72℃ 1분(35 사이클)이었다. PCR로 합성 시킨 후 0.002% ethidium bromide가 첨가된 1.5% 아가로스젤에 105 V에서 40분간 전기영동 후 LAS 4,000을 이용하여 밴드를 확인하여 분석 정량하였다.

10) 면역형광법(Immunofluorescence)

각 cell line을 Lab-tex chamber 8 well에 세포를 1×10³ 개로 분주 하여 24시간 안정시킨 뒤, 시료를 농도 별로 처리한다. 24~48시간이 지난 뒤 차가운 PBS 완충용액으로 3회 세척한 뒤 0.5% triton X-100을 10분 간 가하여 세포를 투과하였다. 다시 PBS 완충용액으로 3회 세척한 뒤 1% BSA를 넣어 1시간 동안 방치 하였다. Primary anti-body를 4℃에서 over night하였다. 1차 반응이 끝나면 PBS로 3차 세척 후 alexa flour 568 goat anti-mouse IgG(1:1,000)을 첨가하고 차광하여 1시간 동안 반응 시켰다. 40분 후에 DAPI를 200 ㎕씩 well에 첨가하였다. PBS 완충용액으로 4회 세척 후 chamber를 제거 한 후 슬라이드에 마운팅 용액을 첨가하여 커버 슬립으로 고정하여 관찰을 하였다.

11) 항균 효과 측정

(1) 균배양

전 배양 및 본 배양을 위한 액체 배지는 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis) 및 에스체리시아 콜리(Escherichia coli)의 액체배지로는 nutrient broth(NB)를 스타필로코커스 아우레우 스(Staphylococcus aureus)의 액체배지로는 tryptic soy broth(TSB)를 사용했고, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)균은 Gifu anaerobic medium(GAM)배지를 사용했다. 스타필로코커스 에피더미스 및 에스체리시아 콜리의 고체배지는 nutrient agar(NA)를 사용했으며, 스타필로코커스 아우레우스의 액체배지로는 tryptic soy agar(TSA)를 사용하여 배양했으며, 프로피오니박테리움 아크네스 균은 Gifu anaerobic medium(GAM) 배지에 agar를 첨가하여 본 실험에 사용하였다. 프로피오니박테리움 아크네스 균은 5% CO₂ 인큐베이터에서 37℃로 배양하였고, 그 외의 모든 균주는 BOD 인큐베이터에서 37℃로 배양하였다.

(2) 생육 저해환(Clear zone) 측정

항균력 측정은 paper disc agar diffusion 법(Conner et al., 1984)으로 측정하였다. 즉, 평판 배지에 배양된 각 균주를 1 백금이 취해서 액체배지 10 ㎖에서 18~24시간 배양하여 활성화시킨 후 다시 액체배지 10 ㎖에 균액을 0.1 ㎖ 접종하여 3~6시간 본 배양한 후 평판배지 1개당 균수가 약 1×10⁷cells이 되게 접종하여 멸균 면봉으로 균일하게 도말하였다. 멸균된 filter paper disc(8 ㎜, Whatman, Japan)를 고체 평판배지에 올려놓은 다음 0.05 ㎖/disc가 되도록 시료를 농도별로 흡수시켜 37℃에서 18~24시간 배양하여 disc 주위의 생육 저해환(㎜)의 직경을 측정하였다.

실험결과

감꼭지 추출물과 용매 분획물의 총 폴리페놀 함량 측정 결과

페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물로서 플라보노이드, 카테킨, 탄닌류로 크게 구분된다. 이들은 phenolic hydroxyl(OH)기를 가지고 있기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 쉽게 결합하여 항산화, 항암 등의 다양한 생리활성을 가진다(Lee et al., 1996). 특히 항산화 작용과 관련하여 최근 생체 내에서의 산소 자유 라디칼 반응이 생체조직의 노화나 질병과 관련이 있으며 페놀성 물질의 하이드록시 그룹은 유지의 유리기 수용체로서 유지 산패의 초기 단계에 생산된 유리기들이 안정된 화합물을 형성 하도록 하여 산화억제 작용을 한다(Kim et al., 1997). 본 실험에서는 감꼭지 추출물과 분획물에 존재하는 총 폴리페놀 함량을 탄닌산을 기준물질로 하여 감꼭지 추출물과 분획물의 폴리페놀 함량을 측정한 결과 각각 표 1 및 2와 같이 나타났다.

감꼭지 추출물의 전체 폴리페놀 함량

sample	polyphenol contents (㎎/g)
Kaki Calyx water extracts	2.31±0.11
Kaki Calyx ethanol extracts	1.94±0.69
Kaki Calyx methanol extracts	1.83±0.43
Kaki Calyx acetone extracts	5.69±0.14

감꼭지 분획물의 전체 폴리페놀 함량

sample	polyphenol contents (㎎/g)
CHCl₃ layer of Kaki Calyx extract	1.74±0.14
EtOAc layer of Kaki Calyx extract	11.89±0.46
n-BuOH layer of Kaki Calyx extract	7.69±0.42
H₂O layer of Kaki Calyx extract	4.96±0.24

항산화능 측정 결과

1) 전자공여능 확인

전자공여능 측정에 사용된 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)는 자체가 매우 안정한 자유 라디칼로서 517 ㎚에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물이다. DPPH는 알코올 등의 유기용매에 매우 안정하며 항산화 기작 중 Proton-radical scavenger에 의하여 탈색되기 때문에 항산화 활성을 육안으로 쉽게 관찰할 수 있는 장점이 있어 다양한 천연소재로부터 항산화 물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다(Heo et al., 2006). 또한 자유 라디칼은 인체 내에서 지질 또는 단백질 등과 결합하여 노화를 일으키기 쉬운데 페놀성 화합물의 경우 자유라디칼을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 강해 인체 내에서 자유 라디칼에 의한 노화를 억제하는 척도로 이용할 수 있다(Kim et al., 2006). 생체 내 정상적인 세포 대사 과정에서 생성되는 활성산소는 체내에서 세포막 손상, DNA 변성, 지질 산화, 단백질 분해 등을 초래한다(Kim et al., 1995). 이러한 활성산소에 대한 내인성 방어기작으로는 Catalase, Glutathione(GSH), S-transferase, Glutathione peroxidase, 그리고 Superoxide dismutase 등의 효소가 있으며 외인성 방어기작으로는 비타민 A, C, E, 플라보노이드계 색소, 폴리페놀류 등이 존재한다(Kim et al., 2005). 감꼭지 추출물과 분획물을 천연 항산화제로서 이용가능성을 확인하기 위하여 전자공여능을 측정한 결과 도 3 및 4와 같이 나타났다. 감꼭지 추출물의 경우 1000 ㎍/㎖의 농도에서 모든 추출물이 대조군 Vit-C와 유사한 약 90%의 전자공여능을 나타내었으며, 감꼭지 분획물의 경우 1000 ㎍/㎖의 농도에서 EtOAc층과 n-BuOH이 대조군 Vit-C와 유사한 약 95%의 전자공여능을 나타내었다. 또한 추출물과 분획물 모두 농도의존적인 증가를 나타내었다.

2) Superoxide dismutase(SOD) 유사활성 확인

Superoxide 라디칼 소거 활성능은 알칼리 상태에서 피로갈롤(Pyrogallol)의 자동산화에 의한 발색을 이용한 측정 방법으로 피로갈롤은 수용액에서 자동산화가 빠르게 일어나는데 여기에는 Superoxide가 관여한다고 알려져 있다. 그러므로 SOD(Superoxide dismutase)나 SOD 유사활성물질이 존재하는 경우 이의 자동산화가 억제될 수 있고, 이 억제되는 정도를 비교하여 실험대상의 물질 효능을 비교할 수 있다. Superoxide 라디칼은 주로 세포막 지질의 불포화 지방산과 반응하여 지질 과산화물을 생성하므로 세포 손상으로 초래 할 수 있다. 또한 Superoxide 라디칼은 반응성이 강한 음이온 유리기로 한 개의 쌍을 이루지 않은 전자를 가지고 있으며 불안정하기 때문에 시간이 흐르면 분해되어 퍼옥시다아제를 형성한다. 인체 내에서 superoxide는 산화작용을 이용해 이물질을 제거하는 역할을 하는 NADPH 산화효소에 의해서 다량으로 만들어지며 노화 현상과 관련이 깊은 것으로 알려져 있다. 항산화 효소 중의 하나인 SOD(superoxide dismutase)는 반응성이 매우 강한 superoxide 라다칼(O₂-2O²+2e-→2O^2-)과 반응하여 hydrogen peroxide(H₂O₂)생성을 촉매 하는 효소로 산소를 소비하는 모든 생물 종에 존재하며 대표적인 활성산소 저해제이다. 가장 독성이 강한 hydroxy 라디칼의 생성을 예방하는 작용을 하여 현재 항염증소재나 피부 노화방지를 위한 미용소재로 화장품 등의첨가제로서사용되어지고있다(Bryan et al., 2002; Grasbon et al., 1999). 감꼭지 추출물과 분획물의 SOD 유사활성능을 측정한 결과 도 5 및 6과 같이 나타났다. 감꼭지 추출물의 경우 1000 ㎍/㎖의 농도에서 아세톤 추출물이 약 10%의 유사활성능을 나타내었으며, 감꼭지 분획물의 경우 1000 ㎍/㎖의 농도에서 부탄올 분획물이 약 30%의 유사활성능을 나타내었다. 또한 추출물과 분획물 모두 농도의존적인 증가를 나타내었다.

3) ABTS+ cation radical scavenging activity 측정

ABTS 라디칼 양이온 소거능은 2,2-azino-bis(3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTS)와 potassium persulfate 와의 반응으로 ABTS+˙radical이 생성되면 특유의 색인 청록색을 띄게 되는데, 시료를 첨가함에 따라 연한 녹색으로 탈색되는 것을 측정하는 방법이며, hydrogen-donating antioxidant와 chain breaking antioxidant 모두를 측정할 수 있다. 감꼭지 추출물과 분획물의 ABTS 라디칼 소거능 측정한 결과 도 7 및 8과 같이 나타났다. 감꼭지 추출물의 경우 500 ㎍/㎖의 농도에서 모든 추출물이 약 100%에 가까운 라디칼 소거능을 나타내었으며, 감꼭지 분획물의 경우 1000 ㎍/㎖의 농도에서 모든 분획물에서 약 100% 이상의 라디칼 소거능을 나타내었다. 또한 추출물과 분획물 모두 농도의존적인 증가를 나타내었다.

4) Superoxide anion radical 소거능 확인

NBT(Superoxide anion radical) 소거능 측정은 Xanthine oxidase가 xanthine을 기질로 하여 요산(uric acid)를 생성하는 과정에 생성되는 superoxide 음이온 라디칼을 감꼭지 추출물과 반응시켜 NBT(nitro blue tetrazolium)로 superoxide 음이온 라디칼 소거 능을 확인하는 방법이다(Okamura et al., 1993). 감꼭지 추출물과 분획물의 xanthine oxidase에 의해 생성되는 superoxide 음이온 라디칼의 생성 저해활성을 관찰한 결과 도 9 및 10과 같이 나타났다. 감꼭지 추출물의 경우 1000 ㎍/㎖의 농도에서 모든 추출물이 약 90%에 가까운 라디칼 소거능을 나타내었으며, 감꼭지 분획물의 경우 1000 ㎍/㎖의 농도에서 클로르포름층을 제외한 모든 분획물에서 약 90%의 superoxide 음이온 라디칼 소거능을 나타내었다. 또한 추출물과 분획물 모두 대조군인 Vit-C보다 높은 소거능을 나타내었으며, 농도의존적인 증가를 나타내었다.

항염증 효과 측정 결과

1) Macrophage cell(Raw 264.7)의 생존율 확인

선천 면역계에서 생체 방어 기구의 최전선을 담당하는 대식세포는 숙주의 방어기구의 일부로서 면역계에 매우 중요한 역할을 수행하여 외부물질 침입을 가장 먼저 인지하여 체액성 면역과 세포성 면역에 관여하며 대식세포가 활성화되면 증식과 확산능력의 향상 등과 같은 세포의 형태적 변화뿐만 아니라 대식능력의 증강, nitric oxide(NO) 및 cytokine 생성의 향상을 수반하여 종국적으로 암세포와 각종 유해균의 성장을 억제시킬 수 있는 것으로 여겨진다(Kim et al., 2008). 감꼭지 추출물에 의한 대식세포의 독성을 MTT assay에 의해 확인한 결과 도 11과 같이 나타났다.

2) Nitric oxide 저해활성 측정결과

일산화질소(Nitric oxide; NO)는 대식세포 등의 면역세포로부터 생성되어 혈관을 확장시키거나 암조직의 성장을 억제하고, 바이러스나 세균들의 증식을 저해하거나 직접 사멸시키는 등 인체 면역염증반응에 있어서 중요한 역할을 하지만 과잉배출시에 만성염증질환 악화 등의 문제점이 발생되기도 한다(Marutti et al., 2007; MacMicking et al., 1997). NO는 자유 라디칼인 활성질소종(reactive nitrogen species; RNS)의 일종으로 NO synthase(NOS)에 의해 L-arginine이 citrulline으로 산화될 때 발생되는 반응성이 매우 높은 것으로 알려져 있다. 정상적인 농도로 존재하는 NO는 심혈관계와 신경계 및 면역계의 전달물질로서 신경전달물질을 운반하거나 종양을 억제하는 작용, 감염성 병원체에 대한 억제 등 매우 다양한 기능을 가지는 물질로 알려져 있다. 그러나 과도하게 발현된 NO는 독성 라다칼로 작용하여 인체에 유해한 영향을 주는 세포손상뿐만 아니라 염증 반응을 비롯한 뇌막염, 알츠하이머병과 파킨슨병 같은 퇴행성 질환에 중요한 요인으로 작용하는 것으로 보고되고 있다(Chung et al., 2001). 이와 같은 NO를 임의적으로 다량 생성시키기 위해 사용되는 lipopolysaccharide(LPS)는 그람 음성균의 세포외막에 존재하는 독소로서 RAW 264.7 cell과 같은 대식세포에 작용하여 tumor necrosis factor-α(TNF-α)나 interleukin-6(IL-6) 등과 같은 여러 가지 염증성 사이토카인의 발현과 함께 NO의 생성을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Lee et al., 2004). 따라서 항염증 활성을 가지는 물질이나 소재에 대한 연구들에서 NO의 생성 억제나 소거 활성에 대한 검토는 필수적으로 수행되어지고 있다(Kang et al., 2011; Ko et al., 2011). Raw 264.7 cell의 NO 생성억제 정도를 측정하기 위하여 감꼭지 분획물을 농도별로 세포에 처리하여 생성되는 NO량을 측정한 결과를 도 12에 나타내었다.

3) PGE₂ 와 사이토카인 저해활성 측정결과

PGE₂는 NO와 마찬가지로 손상된 부위나 조직에서 통증과 발열의 전달에 주로 관여하는 중요한 염증매개물질로서 COX-2에 의해 합성되는데, 과량 생산되면 과도한 면역반응을 야기하여 다발성 경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 대장암과 같은 각종 염증성 질환을 유발시키게 된다(Lee et al, 2010). 따라서 PGE₂ 생성 억제는 염증과 통증을 완화시킴으로써 염증질환 치료에 매우 효과적인 것으로 알려져 있다(Kuo et al., 2004; Kim et al., 2007). 조직이 손상되면 물리적인 손상뿐 아니라 염증을 매개하는 물질들이 다량 생성되기 때문에 통증이 유발되는데, 이 중 PGE₂는 조직손상이 일어나는 부위에서 생성되어 말초신경 말단부위에 작용하여 통증에 대한 역치를 감소시키게 된다(Park et al., 2006). 즉 NO와 마찬가지로 PGE₂의 생성억제는 같은 각종 면역질환을 포함한 염증성질환 치료에 중요한 도움이 될 수 있다. 사이토카인은 면역반응 중에 나타나는 세포간의 상호작용을 일으키는 세포가 분비한 단백질로서, 이러한 단백질들은 자연면역에서 매개 조절자로서 염증반응을 조절하는 역할을 하기도 하며, 획득면역에서도 특정항원을 인식하여 T세포에 의해 분비되고 염증반응을 강하게 하거나 특수화하는데 관여하는 매개 조절자의 기능 등 면역반응 및 염증반응에서 다양한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다(Dinarello 1997; 1994). 감꼭지 분획물이 Raw264.7 세포에서 LPS에 의해서 생성된 프로스타글랜딘 E₂와 전염증 사이토카인의 형성을 억제하는지 알아보기 위하여 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 의 생성을 측정하였다(도 13 내지 17).

4) iNOS 및 COX-2 생성 억제 효과 측정 결과

NO의 합성효소인 NOS는 정상 생리적 조건에서 존재하는 constitutive형 (cNOS)과 면역반응에 의해 일어나는 inducible형(iNOS)으로 나뉘며, cNOS는 다시 혈관에 작용을 하는 endothelial형(eNOS)과 신경에서 주된 작용을 하는 neuronal형(nNOS)으로 나뉘게 된다(Tsao et al., 2002). 유도성 iNOS는 세포내 칼슘 농도와 외부에서 주입된 calmodulin의 자극과는 무관하게 활성화된 세포에서만 활성을 보이며 다양한 세포에서 유도되어 병리생태학에서 중요한 역할을 한다(Vodovotz et al., 1995; Lowenstein et al., 1993). NOS의 과다 발현은 뇌출혈, 뇌성마비, 뇌졸중 등의 뇌손상이나 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌 신경질환의 신경독성과 밀접한 관련이 있다고 알려져 있다(Chabrier et al., 1999). COX는 COX-1과 COX-2로 구분되는데, 다양한 세포에서 각각 다른 발현 경향을 나타낸다. COX-1은 위 및 신장기능의 유지, 혈소판의 형성에 필요한 프로스타글랜딘을 합성한다(Seibert et al., 1994). 상대적으로 COX-2는 동물이나 인간의 염증반응부위에서 발현된다. 따라서 COX-2에 의한 프로스타글랜딘의 합성은 염증반응을 매개하는 것으로 여겨지고 있다. 도 18 및 19는 감꼭지 추출물의 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸다.

5) 면역형광법(Imunofluorecense)

대식 세포 주 내에서의 NF-κB의 발현 정도를 알아보기 위하여 NF-κB 항체를 이용하여 면역형광 염색법을 실시 한 결과 도 20과 같이 나타났다. 대조군에 비해 FITC의 색이 줄어 든 것을 확인하였고, Merge에서도 그 효과를 확인할 수 있다.

항균 효과 측정 결과

1) 생육 저해환(clear zone) 확인

여드름의 생성원인은 유전적 원인, 피로와 스트레스 등 여러 요인이 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있으며, 일반적으로 호르몬과 외부적 영향에 의해 피지가 모낭관 밖으로 배출되지 못하여 피부 모공이 막힌 경우, 피부 상재균들의 증식에 의해 야기되는 것으로 알려져 있다(Choi et al., 1998; Lee et al., 2004; Martin et al., 2003). 천연물 중에는 많은 종류의 항균활성을 가진 생리활성 물질이 존재하는데, 이는 매우 적은 양으로도 고부가가치를 얻을 수 있는 물질로서 오래전부터 이에 대한 연구가 이루어져 이미 수많은 종류가 산업적으로 유용하게 활용되고 있다. 일반적으로 피부 상재균 중 피부에 염증을 유발할 수 있는 세균으로는 스타필로코커스 아우레우스, 에스체리시아 콜리 및 스타필로코커스 에피더미스 등이 보고되어 있으며, 특히 피부 여드름 유발 원인세균으로는 프로피오니박테리움 아크네스가 알려져 있다(Ahn et al., 2002; Choi et al., 1998; Chomnawang et al., 2005; Jain et al., 2003; Ki et al., 2005; Yamaki et al., 1990). 감꼭지 추출 분획물의 피부 상재균 및 여드름 균에 대한 생육 저해환 형성을 관찰한 결과 표 4 및 도 21 내지 24와 같이 항균효과가 있음을 확인 할 수 있었다.

감꼭지 추출 분획물의 항균 활성

	CON. (㎎/disk)	Kaki Calyx CHCl₃ layer	Kaki Calyx EtOAc layer	Kaki Calyx n-BuOH layer	Kaki Calyx H₂O layer
Staphylococcus aureus KCTC 1621	0	-a	-a	-a	-a
	1	1.2±0.3	1.3±0.2	1.8±0.6	1.5±0.6
	2	2.4±0.2	2.6±1.1	2.4±0.9	2.9±1.1
	4	5.5±0.2	4.6±0.9	3.9±1.1	4.5±1.8
Staphylococcus epidermidis KCTC 1917	0	-a	-a	-a	-a
	1	1.2±0.2	1.5±0.9	2.3±1.6	2.9±1.8
	2	2.5±0.2	4.9±0.9	2.6±0.6	6.9±2.2
	4	6.6±0.3	7.8±0.4	4.8±0.4	7.8±2.1
Escherichia coil KCTC 1039	0	-a	-a	-a	-a
	1	1.2±0.1	2.9±0.8	1.2±0.4	1.1±0.6
	2	2.3±0.3	6.1±1.6	1.8±0.1	4.2±0.8
	4	6.6±0.1	8.9±1.2	3.7±1.0	5.4±0.3
Propionibacterium acnes KCTC3314	0	-a	-a	-a	-a
	1	0.8±0.4	2.6±0.9	0.9±0.6	3.0±0.9
	2	2.2±0.3	5.1±1.6	1.9±1.1	6.4±1.6
	4	7.7±0.6	7.5±2.0	3.8±0.9	8.0±2.4

a: no inhibition, b: inhibition zone diameter(㎜)

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

감꼭지(Kaki Calyx) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항균 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매에 의한 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 분획물은 상기 추출물을 헥산, 벤젠, 에테르, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 분획된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 스타필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermidis), 에스체리시아 콜리(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)로 구성된 군으로부터 선택되는 피부 상재균에 대해 항균 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 전자 공여 활성을 추가적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 SOD(Superoxide dismutase) 유사 활성을 추가적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 ABTS 라디칼 소거 활성을 추가적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 수퍼옥사이드(Superoxide) 음이온 라디칼 소거 활성을 추가적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 NO 저해 활성을 추가적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 PGE₂ 저해 활성을 추가적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 TNF-α 저해 활성을 추가적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 IL-1β 저해 활성을 추가적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 IL-6 저해 활성을 추가적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 IL-8 저해 활성을 추가적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 iNOS 단백질 발현 저해 활성을 추가적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 COX-2 단백질 발현 저해 활성을 추가적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항의 항균 조성물을 포함하는 세균성 피부질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 17 항에 있어서, 상기 세균성 피부질환은 여드름인 것을 특징으로 하는 조성물.
감꼭지(Kaki Calyx)를 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 1,3-부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매로 추출하는 단계를 포함하는 항균 조성물의 제조 방법.
제 19 항에 있어서, 상기 방법은 상기 추출하는 단계로부터 추출된 추출물을 헥산, 벤젠, 에테르, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 분획하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.