KR102182733B1 - 복분자 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물 - Google Patents

복분자 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 복분자 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 항산화 활성이 우수하고 염증 유발 단백질 및 염증 기작 단백질의 발현을 억제함과 동시에 부작용 적은 복분자 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물에 관한 것이다.

Description

복분자 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물{Composition for anti-oxidation and Anti-inflammation comprising extract of immature Rubus coreanus fruit}
본 발명은 복분자 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 항산화 활성이 우수하고 염증 유발 단백질 및 염증 기작 단백질의 발현을 억제함과 동시에 부작용 적은 복분자 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물에 관한 것이다.
염증반응은 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 재생하기 위한 생체방어반응과정으로서 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포 및 면역세포 등이 작용한다. 정상적으로 외부 침입균에 의하여 유도되는 염증반응은 생체를 보호하기 위한 방어 시스템인 반면, 비정상적으로 과도한 염증반응이 유도되면 다양한 질환들이 나타나게 되는데, 이러한 질환들을 염증질환이라 한다. 상기 염증질환은 외부 자극에 의하여 활성화된 표적세포로부터 분비되는 다양한 염증 매개물질이 염증을 증폭 및 지속시켜 인체의 생명을 위협하는 질환으로서 급성염증, 류마티스 관절염과 같은 관절 내에서의 만성염증 질환 등이 있다. 이러한 염증질환을 유도하는 핵심적인 염증 매개물질은 프로스타글란딘류(prostaglandins), 수산화 지방산류(hydroxy fatty acids) 등이며 이들은 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase) 등에 의하여 생성된다.
한편, 염증을 소실시키기 위해 염증원의 제거, 생체 반응 및 증상을 감소시키는 작용을 하는 것을 항염제라 한다. 현재까지 항염의 목적으로 이용되고 있는 물질로는 비스테로이드계로 플루폐나믹산(flufenamic acid), 이부프로펜(ibuprofen), 벤지다민(benzydamine), 인도메타신(indomethacin) 등이 있고 스테로이드계통으로 프레드니솔론(prednisolone), 덱사메타손 (dexamethasone) 등이 있다. 또한, 알란토인, 아즈엔, 하이드로코티손 등이 항염증에 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 이들 물질은 피부에 대한 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있거나, 효과가 미미하여 실질적으로 염증 완화 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다.
한편, 복분자(Rubus coreanus)는 장미과의 복분자딸기(Rubus coreanus Miquel)의 채 익지 않은 열매로 만든 약재로서, 생김새는 작은 단과가 여러 개 모여서 덩어리를 이룬 것으로 원추형이나 눌려진 구형을 이루고 있다. 바깥면은 황록색 또는 엷은 갈색을 띠고 끝쪽은 둥근 원형을 이루고 꽃받침의 중심부는 함몰되어 있다. 복분자는 신(腎)기능을 북돋아 유정(遺精), 몽정(夢精), 유뇨(遺尿) 등에 사용하며 시력약화에 쓰고 몸을 가볍게 하며 머리를 검게 한다. 또한 약리작용으로 항산화작용, 항 헬리코박터 파이로리 작용, 항염증 효과가 알려져 있다.
그러나 현재까지 복분자 미성숙과의 항산화 및 항염증 효과에 대해서는 보고된 바가 없으며, 본 발명자들은 복분자 미성숙과가 복분자 성숙과보다 더욱 우수한 항산화 및 항염증 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국등록특허 제10-0820009호
본 발명은 항산화 활성이 우수하고 염증 유발 단백질 및 염증 기작 단백질의 발현을 억제함과 동시에 부작용 적은 복분자 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물을 제공하는데 목적이 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 의약품을 제공하는데 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 건강기능식품을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
상술한 본 발명의 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 복분자 미성숙과(immature Rubus coreanus fruit) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 복분자 미성숙과 추출물은 개화후 28~35일에 채취한 복분자 미성숙과로부터 추출된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 복분자 미성숙의 엘라그산(ellagic acid) 함량은 19~27 μg/ml 일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 복분자 미성숙과 추출물은 40~330 ㎍/ml의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 복분자 미성숙과 추출물은 C1 내지 C4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 물 및 헥산 중에서 선택된 적어도 하나의 용매로 추출된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 복분자 미성숙과 추출물은 20~40부피% 에탄올 수용액으로 추출된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 복분자 미성숙과 추출물은 80~230 ㎍/ml의 농도로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 조성물은 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2) 및 유도형 일산화질소 생성효소(inducible NO synthase)에 억제 활성을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항산화 및 항염증용 조성물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 의약품을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항산화 및 항염증용 조성물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 복분자 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물은 항산화 활성이 우수하고 염증 유발 단백질 및 염증 기작 단백질의 발현을 억제함과 동시에 부작용이 적기 때문에 항산화 및 항염증용 의약품 또는 건강기능식품에 널리 활용될 수 있다.
도 1은 비교예1~3 및 실시예1~3에 따른 시료를 처리한 세포주 및 시료를 처리하지 않은 대조군의 세포 생존율 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 비교예1~3 및 실시예1~3에 따른 시료를 처리한 세포주 및 시료를 처리하지 않은 대조군의 아질산염(nitrite) 생성량 측정 결과이다.
도 3a는 비교예1~3 및 실시예1~3에 따른 시료를 처리한 세포주 및 시료를 처리하지 않은 대조군의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현정도를 측정한 결과이다.
도 3b는 시료를 처리하지 않은 대조군 대비 비교예1~3 및 실시예1~3에 따른 시료를 처리한 세포주의 TNF-α 발현 억제 비율을 나타낸 그래프이다.
도 3c는 시료를 처리하지 않은 대조군 대비 비교예1~3 및 실시예1~3에 따른 시료를 처리한 세포주의 IL-1β 발현 억제 비율을 나타낸 그래프이다.
도 3d는 시료를 처리하지 않은 대조군 대비 비교예1~3 및 실시예1~3에 따른 시료를 처리한 세포주의 IL-6 발현 억제 비율을 나타낸 그래프이다.
도 4a는 비교예1~3 및 실시예1~3에 따른 시료를 처리한 세포주 및 시료를 처리하지 않은 대조군의 COX-2, iNOS의 발현정도를 측정한 결과이다.
도 4b는 시료를 처리하지 않은 대조군 대비 비교예1~3 및 실시예1~3에 따른 시료를 처리한 세포주의 COX-2 발현 억제 비율을 나타낸 그래프이다.
도 4c는 시료를 처리하지 않은 대조군 대비 비교예1~3 및 실시예1~3에 따른 시료를 처리한 세포주의 iNOS 발현 억제 비율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 비교예1~3 및 실시예1~3에 따른 시료를 처리한 세포주 및 시료를 처리하지 않은 대조군의 p65, p-p65, IkB-α 및 p-IkB-α의 발현정도를 측정한 결과이다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 항산화 활성이 우수하고 염증 유발 단백질 및 염증 기작 단백질의 발현을 억제함과 동시에 부작용 적은 복분자 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물을 제공하고자 한다. 또한, 본 발명에 따르면, 복분자 미성숙과는 복분자 성숙과보다 항산화 및 항염증 효과가 우수하며, 추출 조건과 추출물의 농도에 따라 항산화 및 항염증 효과를 더욱 향상시킬 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 있어서, “항산화 효과”라 함은 세포내 대사의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species)에 의한 세포의 산화를 억제하는 것을 말하며, 자유 라디칼 또는 활성산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다. 이러한 활성산소종은 유해산소라고도 하며, 화학적인 반응도가 높아 세포의 필수 구성물인 단백질, 지질, 핵산 등과 반응하여 세포 내 기능의 변화를 유발하고 결과적으로 세포 손상을 일으킨다. 또한, 핵산을 손상시켜 핵산 염기의 변형과 유리, 결합의 절단, 당의 산화분해 등을 일으켜 유전자 돌연변이를 유발하고, 암의 발생과 관련된 것으로 알려져 있다. 또한, 생리적 기능이 저하되어 건조 피부염, 소양증, 감염성 피부 질환, 피부 궤양 등과 같은 각종 질병과 노화의 원인이 되기도 한다.
본 발명에 있어서, “항염증 효과”라 함은 염증을 억제하는 것을 말하며, 상기 염증은 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 조직 변질, 순환 장애와 삼출, 조직 증식의 세가지를 병발하는 복잡한 병변을 말한다. 보다 구체적으로 염증은 선천성 면역의 일부이며 다른 동물에서처럼 인간의 선천성 면역은 병원체에 특이적으로 존재하는 세포 표면의 패턴을 인식한다. 식세포는 그런 표면을 가진 세포를 비자기(non-self)로 인식하고 병원체를 공격한다. 만일 병원균이 신체의 물리적 장벽을 깨고 들어온다면 염증반응이 일어난다. 염증반응은 상처부위에 침입한 미생물들에 대한 적대 환경을 만드는 비특이적인 방어작용이다. 염증반응에서 상처가 나거나 외부 감염체가 체내로 들어왔을 때, 초기단계 면역반응을 맡고 있는 백혈구들이 몰려들어 사이토카인을 발현한다. 따라서 세포내 사이토카인의 발현양이 염증반응 활성화의 지표가 된다. 염증과 관련된 피부질환의 예로는 아토피 피부염, 건선, 방사선, 화학물질, 화상 등에 의해 촉발되는 홍반성 질환, 산 화상, 수포성 피부병, 태선 모양 종류 질환, 알레르기에 기한 가려움증, 지루성 습진, 여드름, 심상성 천포창, 다형 삼출성 홍반, 결절 홍반, 귀두염, 음문염, 원형 탈모증과 같은 염증성 모발 손실, 피부 T-세포 림프종 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 “조성물(composition)”은 본 발명의 복분자 미성숙과 추출물에 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분들을 혼합한 혼합물을 의미한다.
용어 “담체(carrier)”는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
용어 “희석제(diluent)”는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상적으로 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명은 복분자 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 복분자 미성숙과는 성숙과보다 항산화 및 항염증 효과가 우수할 수 있으며, 미성숙과 및 성숙과는 개화 후 일 수 또는 엘라그산(ellagic acid)의 함량으로 구분할 수 있다.
일반적으로 복분자 미성숙과는 과실이 흑색으로 물들기 전에 채취한 것을 의미하나, 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면 상기 복분자 미성숙과는 개화후 28~35일에 채취한 것일 수 있고, 상기 복분자 미성숙과 추출물의 엘라그산(ellagic acid) 의 함량이 19~27 μg/ml 일 수 있다. 복분자 성숙과 추출물은 상기 엘라그산의 함량이 상기 복분자 미성숙과 추출물 보다 현저히 낮으며, 이를 통해 복분자 미성숙과와 성숙과가 대비될 수 있고, 상술한 조건을 만족하는 복분자 미성숙과를 추출 대상으로 할 경우, 복분자 미성숙과 추출물의 항산화 및 항염증 효과가 향상될 수 있다.
상기 엘라그산은 항산화효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 개화후 28~35일에 채취한 미성숙 복분자 상기 엘라그산의 함량이 현저히 높을 수 있다.
만일, 개화 후 28일 미만에 채취한 복분자를 사용할 경우, 과실이 작아 수확 량이 적어 생산성이 저하되는 등의 문제점이 있을 수 있고, 35일 이후에 채취한 복분자를 사용할 경우, 상기 엘라그산의 함량이 낮아지거나, 추출물로 제조 시 항산화 및 항염증 효과가 저하되는 등 본 발명의 목적을 달성하기에 어려울 수 있다.
상기 복분자 미성숙과를 추출하는 방법은 당업계에서 공지된 과실의 추출에 사용되는 방법을 사용할 수 있으며, 일예로 용매 추출법일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 황기 추출물은 컬럼 크로마토그래피를 이용한 추가적인 분획공정을 더 수행하여 정제한 분획물로 제조될 수도 있다.
추출대상이 되는 상기 복분자 미성숙과는 상업적으로 이용 가능한 것을 구매하여 사용할 수 있으며, 추출 공정을 수행하기 전에 흙과 같은 이물질을 제거한 후에 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 복분자 미성숙과 추출물은 조성물 내 40~330 ㎍/ml의 농도로 포함될 수 있다. 만일, 상기 농도가 40 ㎍/ml 미만일 경우, 목적하는 수준의 항산화 및 항염증 효과가 발현되지 않을 수 있고, 330 ㎍/ml를 초과하는 경우, 항산화 및 항염증 효과는 충분히 발현되나 도 1에 도시된 바와 같이 세포 독성이 증가하여 부작용을 야기하는 등 본 발명의 목적을 달성하기에 어려울 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 복분자 미성숙과 추출물은 조성물 내 80~230 ㎍/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 상기 농도 범위를 만족할 경우, 복분자 미성숙과 추출물의 항산화 효과가 가장 우수할 수 있다.
상술한 복분자 미성숙과를 용매추출법을 이용하여 추출할 때, 사용되는 용매는 1 내지 C4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 물 및 헥산 중에서 선택된 적어도 하나일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 물과 C1~C4의 저급알코올의 혼합물, 더욱 더 바람직하게는 에탄올 수용액일 수 있다. 또한, 상기 용매의 온도는 유효 성분의 파괴를 방지하기 위하여 바람직하게는 상온일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 복분자 미성숙과 추출물은 복분자 성숙과 추출물보다 항산화 및 항염증효과가 우수하며, 당해 효과에 대한 더욱 상승된 효과의 발현을 위해 본 발명의 바람직한 일 실시예에 있어서, 상기 복분자 미성숙과 추출물은 20~40부피% 에탄올 수용액으로 추출된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 항산화 및 항염증용 조성물은 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2) 및 유도형 일산화질소 생성효소(inducible NO synthase)에 억제 활성을 나타낼 수 있다.
상기 싸이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2; Cox-2)는 염증에 관여하는 효소이며, 아라키본산(arachidonic acid)을 염증성 물질인 프로스타글란딘류(prostaglandins)를 생성하는 대표적인 효소이다. 또한, 상기 유도형 일산화질소 생성효소(inducible NO synthase; iNOS)는 면역계 세포에서 일산화 질소(NO)를 합성하는 효소이며, 감염 또는 염증 반응에 따라 iNOS에서 과도하게 생산된 NO는 생리기능 문제와 여러 질환을 유발하는 것으로 알려져 있는 염증성 손상의 주요 매개체이다.
도4a 및 도4b를 참조하면, 복분자 성숙과 추출물보다 복분자 미성숙과 추출물이 COX-2 발현 억제 효과가 우수하였으며, 특히 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 도4b에 도시된 바와 같이, 20~40부피% 에탄올 수용액으로 추출된 복분자 미성숙과 추출물의 COX-2 발현 억제 효과가 가장 우수한 것을 확인할 수 있다. 마찬가지로, 도4a 및 도4c를 참조하면, 복분자 성숙과 추출물보다 복분자 미성숙과 추출물의 iNOS 발현 억제 효과가 우수한 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항산화 및 항염증용 조성물은 TNF-α, IL-6, IL-1β, p65, p-p6, IkB-α 및 p-IkB-α 발현을 억제할 수 있다.
도3a 및 도3b를 참조하면, 복분자 성숙과 추출물은 TNF-α의 발현 억제 효과가 없었으나, 복분자 미성숙과 추출물은 TNF-α의 발현을 현저히 억제할 수 있는 것을 알 수 있다. 도3a 및 도3c를 참조하면, 복분자 성숙과 추출물보다 복분자 미성숙과 추출물이 IL-6 발현 억제 효과가 우수한 것을 확인할 수 있다. 도3a 및 도3d를 참조하면, 복분자 성숙과 추출물보다 복분자 미성숙과 추출물이 IL-1β 발현 억제 효과가 우수하였으며, 특히 20~40부피% 에탄올 수용액으로 추출된 복분자 미성숙과 추출물을 포함하는 조성물이 IL-1β 발현 억제 효과가 가장 우수하였다. 도5를 참조하면, p65, p-p6, IkB-α 및 p-IkB-α에 대한 발현 억제 효과는 복분자 성숙과 추출물보다 복분자 미성숙과 추출물이 우수하였으며, 특히, 20~40부피% 에탄올 수용액으로 추출된 복분자 미성숙과 추출물은 p65, p-p65의 발현 억제 효과가 가장 우수하였다.
본 발명은 복분자 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 의약품을 제공한다.
본 발명에 따른 항산화 및 항염증용 의약품은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
본 발명의 항산화 및 항염증용 의약품에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항산화 및 항염증용 의약품은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 항산화 및 항염증용 의약품은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 항산화 및 항염증용 의약품의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 항산화 및 항염증용 의약품은 개별 예방제 또는 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 복분자 미성숙과 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품 조성물의 종류에는 통상적으로 제조 및/또는 판매되는 것이라면 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있고 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
발명의 건강 음료 조성물은 본 발명에 따른 복분자 미성숙과 추출물을 함유하는 것 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
통상적으로, 건강기능식품에 포함되는 복분자 미성숙과 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.1~50 중량%, 바람직하게는 1~40 중량%로 포함될 수 있다. 또한, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수도 있다.
이하, 본 발명의 항산화 및 항염증용 조성물을 유효성분으로 포함하는 의약품의 제조예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
<제조예1: 피부 외용연고>
자외선에 의한 피부염증 억제용 항염증 조성물을 포함하는 피부 외용연고를 통상의 방법에 따라 제조하였다.
항산화 및 항염증용 조성물: 10중량%
디에틸 세바케이트: 8중량%
경납: 5중량%
폴리옥시에틸렌올레일에테르 포스페이트: 6중량%
벤조산 나트륨: 적량
바셀린: 잔량
이하 본 발명의 항산화 및 항염증용 건강기능식품의 제조예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
<제조예 1>
복분자 미성숙과 추출물 200 ㎎
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B 1 0.13 ㎎
비타민 B 2 0.15 ㎎
비타민 B 6 0.5㎎
비타민 B 12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
이하 첨부된 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이러한 도면과 하기 실시예는 본 발명의 기술적 사상의 내용과 범위를 쉽게 설명하기 위한 예시일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 한정되거나 변경되는 것은 아니다. 또한 이러한 예시에 기초하여 본 발명의 기술적 사상의 범위 안에서 다양한 변형과 변경이 가능함은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
(실시예 1) 복분자 미성숙과 추출물의 제조
개화후 30일에 채취한 복분자 미성숙과(광양산)를 동결건조기에 4-5일 동안 건조 하였다. 건조된 미성숙과를 물을 이용하여 상온에서 추출하였다. 추출된 용액을 감안농축 및 동결 농축기를 이용하여 복분자 미성숙과 추출물을 수득하였다.
(실시예 2)
실시예 1과 동일하게 실시하되, 복분자 미성숙과 추출시 30부피%의 에탄올 수용액을 이용하였다.
(실시예 3)
실시예 1과 동일하게 실시하되, 복분자 미성숙과 추출시 70부피%의 에탄올 수용액을 이용하였다.
(비교예 1)
개화후 45~70일에 채취한 복분자 성숙과(광양산)를 동결건조기에 4-5일 동안 건조 하였다. 건조된 성숙과를 물을 이용하여 상온에서 추출하였다. 추출된 용액을 감안농축 및 동결 농축기를 이용하여 복분자 성숙과 추출물을 수득하였다.
(비교예 2)
비교예 1과 동일하게 실시하되, 복분자 미성숙과 추출시 30부피%의 에탄올 수용액을 이용하였다.
(비교예 3)
비교예 1과 동일하게 실시하되, 복분자 미성숙과 추출시 70부피%의 에탄올 수용액을 이용하였다.
(실험예 1) 지표 물질 분석
비교예1~3에 따른 복분자 성숙과 추출물 및 실시예1~3에 따른 미성숙과 추출물을 HPLC를 이용하여 엘라그산(ellagic acid)의 함량을 측정하였다.
구분 엘라그산 함량
(μg/ml)
복분자 성숙과 추출물 비교예1 5.66±1.45
비교예2 5.66±1.77
비교예3 6.18±1.87
복분자 미성숙과 추출물 실시예1 24.11±1.00
실시예2 21.28±1.76
실시예3 25.11±2.15
상기 표 1을 참조하면, 복분자 미성숙과 추출물의 엘라그산 함량이 복분자 성숙과 추출물에 비하여 현저히 높은 것으로 분석되었다.
(실험예 2) 세포 독성 측정
세포 독성 측정은 Carmichael(1987)의 방법에 따라 측정하였다. 마우스 대식세포(RAW 264.7 cell)를 96 웰 플레이트에 1×105 cells/well이 되도록 0.10mL 분주하고, 실시예1~3에 따른 복분자 미성숙과 추출물 및 비교예1~3에 따른 복분자 성숙과 추출물을 25, 50, 100, 200, 300 및 400㎍/ml의 농도로 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 혼합하여 0.005mL 첨가한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터(MCO-17 AIC, Sanyo, Tokyo, Japan)에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 DMSO를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다.
다음으로, LPS(1 ㎍/ml)를 함유한 DMEM 배지에 다시 24시간 동안 배양하였다.
이후에, 0.02ml의 MTS((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy -phenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, Promega, Madison, WI, USA)를 첨가하여 4시간 더 배양한 후 ELISA reader( Biotek instrument, WT, USA)로 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 독성은 시료 용액의 무첨가군의 흡광도를 기준으로 시료 용액 첨가군의 흡광도 비율로 나타내었으며, 측정 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하면, 실시예1~3에 따른 복분자 미성숙과 추출물은 400㎍/ml 미만의 농도에서 세포 독성이 나타나지 않았으나, 400㎍/ml이상일 경우 세포 생존율이 감소하는 것으로 확인되었다. 따라서, 복분자 미성숙과 추출물은 400㎍/ml 미만의 농도로 사용되는 것이 보다 바람직할 것으로 판단된다.
(실험예 3) 항산화활성 측정
항산화 활성은 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH) 및 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS) 소거능으로 측정하였다.
DPPH 소거활성은 공지된 논문(Blois ML, Nature, 181 (1958) 1199-1224)의 방법을 이용하여 측정하였다. DPPH(Sigma, MO, USA)에 대한 시료 용액과의 전자 공여 효과에 의해 DPPH 라디칼이 감소하는 정도를 분광광도계(Biotek instrument, WT, USA)로 측정하였다.
실시예1~3에 따른 복분자 미성숙과 추출물 및 비교예1~3에 따른 복분자 성숙과 추출물을 0.15 mM DPPH 용액 0.2 ml를 가하고, 볼텍스를 이용하여 혼합한 후 암실에서 30분 동안 반응시켜 517 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
다음으로, ABTS 소거활성 측정 방법을 설명한다. 먼저, ABTS 7mM과 과황화칼륨(potassium persulfate) 2.45 mM을 증류수에 용해하고, 12시간 동안 암실에 방치하여 ABTS 양이온 라디칼을 생성시켰다. 라디칼이 형성된 ABTS 용액 1ml에 실시예1~3에 따른 복분자 미성숙과 추출물 및 비교예1~3에 따른 복분자 성숙과 추출물(200㎍/ml) 3 ml를 가하여 6분 동안 반응시킨 후, 734 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 흡광도 측정 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
구분 복분자
종류		 추출용매 IC50 값(㎍/ml)
에탄올 부피% DPPH ABTS
비교예1 성숙과 0 208.2±17.1 96.6±8.3
비교예2 성숙과 30 78.7±2.9 67.0±1.6
비교예3 성숙과 70 178.8±2.0 97.5±2.7
실시예1 미성숙과 0 24.0±1.0 21.6±1.1
실시예2 미성숙과 30 16.0±0.5 15.9±0.4
실시예3 미성숙과 70 32.2±1.1 27.6±1.6
상기 표 2를 참조하면, 복분자 성숙과 추출물(비교예1~3)보다 복분자 미성숙과 추출물(실시예1~3)의 항산화 효과가 우수한 것을 알 수 있다. 또한, 추출용매로 30부피% 에탄올 수용액을 사용할 때, 항산화 효과가 가장 우수한 것을 확인할 수 있다.
(실험예 4) NO 억제 활성 평가
LPS로 자극된 RAW264.7세포주에서 생성되는 NO에 대한 복분자 성숙과 및 미성숙과 추출물의 억제효과를 알아보기 위하여 RAW264.7 세포주를 LPS로 1시간 전처리하고, LPS로 24시간 자극하였다. 상층의 배지로 방출되는 아질산염(nitrite) 생성량을 측정하여 NO 생성량을 분석하였다.
도 2를 참조하면, 복분자 성숙과 추출물(비교예1~3)과 복분자 미성숙과 추출물(실시예1~3) 모두 NO 억제 효과가 있으나, 복분자 성숙과 추출물(비교예1~3) 보다 복분자 미성숙과 추출물(실시예1~3)의 NO 억제 효과가 우수한 것을 확인할 수 있다.
특히, 실시예2에 따른 복분자 미성숙과 추출물은 100, 200㎍/ml 농도로 처리될 때 가장 우수한 NO 억제 효과를 나타내었다.
(실험예 5)
RAW264.7 세포주를 10 cm 디쉬에 세포가 80%가 되게 배양하고, LPS(1 ㎍/ml)를 처리하였다. 그 후 복분자 성숙과 추출물(비교예1~3) 및 복분자 미성숙과 추출물(실시예1~3)을 세포에 처리하고 24시간 동안 더 배양한 후 RIPA버퍼를 이용하여 단백질을 거두었다. SDS-PAGE 전기영동장치를 이용하여 단백질 크기대로 분리한 후, PVDF 멤브레인에 단백질을 트랜스퍼해주고 5% 스킨 밀크를 이용하여 멤브레인을 블락킹하였다. 각 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 1차 항체를 TBST(Tris-buffered saline, 0.1% Tween 20)에 적정농도로 희석하여 4℃에서 멤브레인에 밤새 반응시켰다. TBST 용액을 활용하여 30분간 1차 항체를 씻어주고 2차 항체를 1시간 동안 반응시켰다. 화학발광 이미지 시스템 (Chemiluminescence image system, Dacinch-K, Seoul, Korea)을 이용하여 각 단백질의 발현정도를 측정하였다. β-actin과 GAPDH은 각 단백질의 대조군으로서 분석에 포함시켰다.
도3a 및 도3b를 참조하면, TNF-α의 발현은 LPS 처리에 의해 유도되는 것을 알 수 있다. 복분자 성숙과 추출물은 TNF-α의 발현 억제 효과가 없었으나, 복분자 미성숙과 추출물(실시예2, 실시예3)은 TNF-α의 발현을 현저히 억제할 수 있는 것을 알 수 있다.
또한, 도3a 및 도3c를 참조하면, IL-6의 발현은 LPS 처리에 의해 유도되는 것을 알 수 있다. 복분자 성숙과 추출물(비교예1~3)보다 복분자 미성숙과 추출물(실시예1~3)이 IL-6 발현 억제 효과가 우수하였으며, 특히 실시예3은 IL-6 발현 억제 효과가 가장 우수하였다.
또한, 도3a 및 도3d를 참조하면, IL-1β의 발현은 LPS 처리에 의해 유도되는 것을 알 수 있다. 복분자 성숙과 추출물(비교예1~3)보다 복분자 미성숙과 추출물(실시예1~3)이 IL-1β 발현 억제 효과가 우수하였으며, 특히 실시예1 및 실시예2는 IL-1β 발현 억제 효과가 가장 우수하였다.
또한, 도4a 및 도4b를 참조하면, COX-2의 발현은 LPS 처리에 의해 유도되는 것을 알 수 있다. 복분자 성숙과 추출물(비교예1~3)보다 복분자 미성숙과 추출물(실시예1~3)이 COX-2 발현 억제 효과가 우수하였으며, 특히 실시예2는 COX-2 발현 억제 효과가 가장 우수하였다.
또한, 도4a 및 도4c를 참조하면, iNOS의 발현은 LPS 처리에 의해 유도되는 것을 알 수 있다. 비교예1 및 비교예2에 따른 복분자 성숙과 추출물보다 비교예3에 따른 복분자 성숙과 추출물 및 실시예1~3에 따른 복분자 미성숙과 추출물의 iNOS 발현 억제 효과가 우수하였다.
또한, 도5를 참조하면, p65, p-p6, IkB-α 및 p-IkB-α의 발현은 LPS 처리에 의해 유도되는 것을 알 수 있다. 이들 단백질에 대한 발현 억제 효과는 복분자 성숙과 추출물(비교예1~3)보다 복분자 미성숙과 추출물(실시예1~3)이 우수하였으며, 특히, 실시예1 및 실시예2에 따른 복분자 미성숙과 추출물은 p65, p-p65의 발현 억제 효과가 가장 우수하였다.

Claims (10)

  1. 복분자 미성숙과(immature Rubus coreanus fruit) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물로서,
    상기 복분자 미성숙과는 개화후 28~35일에 채취한 복분자 미성숙과이고,
    상기 복분자 미성숙과 추출물은 30부피% 에탄올 수용액으로 추출된 것인고,
    상기 복분자 미성숙과 추출물은 엘라그산(ellagic acid)을 19~27μg/ml 함량으로 포함하며,
    상기 복분자 미성숙과 추출물을 80~230 ㎍/ml의 농도로 포함하는 항염증용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2) 및 유도형 일산화질소 생성효소(inducible NO synthase)에 억제 활성을 나타내는 항염증용 조성물.
  9. 제1항 또는 제8항 중 어느 한 항에 따른 항염증용 조성물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 의약품.
  10. 제1항 또는 제8항 중 어느 한 항에 따른 항염증용 조성물을 포함하는 항염증용 건강기능식품.
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