KR102326592B1 - 드라이아이스를 이용한 천연물의 추출방법 및 이에 따라 수득된 추출물을 함유하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 드라이아이스를 이용한 천연물의 추출방법 및 이에 따라 수득된 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 추출방법은 천연물로부터 추출되는 활성성분의 양을 현저하게 증가시켜줄 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 추출방법이 적용될 수 있는 천연물에는 제한이 없으며, 활성성분 또는 추출물이 나타내는 효과에 따라 화장품, 식품, 의약외품, 의약품 등 다양한 분야에서 활용이 가능하다.
Description
본 발명은 드라이아이스를 이용한 천연물의 추출방법 및 이에 따라 수득된 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것이다.
종래에 화장품, 식품, 의약품 등에서 주로 사용되는 화학물질은 예상치 못한 독성과 같은 부작용을 발생시키거나, 사용량 또는 사용기간이 누적되면서 내성을 야기하여 목적하는 효과가 점점 저하되는 문제점이 발생하였다.
이에 따라, 화학물질의 대안으로서 천연물 추출물을 이용하려는 시도가 다수 행해지고 있다. 예를 들어, 흡연, 음주, 각종 환경오염물질 등에 과도하게 노출된 현대인에게는 산화적 스트레스를 경감시킬 수 있는 항산화제가 필요하다. 이에 대해 항산화 효과가 높은 활성성분을 포함하는 천연 추출물은 종래의 화학물질에서 나타나는 독성과 같은 부작용이 최소화되면서도 원하는 효과를 얻을 수 있어, 최근 큰 관심을 받고 있다.
다만, 천연물 추출물은 동일하거나 유사한 양의 화학물질에 비해 그 효과가 낮다는 문제점이 있다. 따라서, 천연물로부터 최대한 많은 양의 유용물질을 생산할 수 있는 추출 공정이 필요하다(Effect of Extraction Methods on Antioxidant Activities of Mori ramulus, J Korean Soc Food Sci Nutr 43(11), p.1709~1715 (2014)). 이와 같이 천연물 추출물을 얻기 위한 추출방법에는 예를 들어 열수 추출, 초고압 추출, 초음파 추출, 초임계 추출 등이 있다.
상기 열수 추출은 일반적으로 많이 이용되어 왔으나, 낮은 추출수율, 높은 에너지소비, 열에 의한 유용성분 파괴 등과 같은 단점이 있는 것으로 지적되었다. 상기 초고압 추출은 추출수율을 개선하기 위해 개발되었으나, 높은 압력에서 추출이 진행됨에 따라 생리활성 물질의 물리/화학적 성질을 변형시키는 문제가 있다. 상기 초음파 추출은 낮은 온도와 압력 하에서 생리활성물질의 손실을 최소화할 수 있는 기술로 주목받고 있으나, 시료에 따라 추출수율이 달라진다는 단점이 있다. 상기 초임계 추출은 초임계 이산화탄소(Supercritical Carbon Dioxide)를 용매로 이용하는 방법이다. 여기서, 초임계 이산화탄소란 임계온도(31℃) 및 임계압력(7.5MPa)을 초과한 상태의 이산화탄소로서, 기체와 액체의 성질을 동시에 가진 유체를 말한다. 따라서, 초임계 추출에서는 용매를 고온 및 고압 상태로 유지해야 하므로, 비용이 많이 들어간다는 단점이 있다.
따라서, 천연물을 효과적이고 경제적으로 추출할 수 있는 새로운 방법에 대한 요구는 여전히 당업계에서 크게 존재한다.
본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 인식하고 다양한 추출방법 및 조건을 적용하는 연구를 오랜 기간 동안 수행해온 결과, 놀랍게도 드라이아이스를 이용하여 추출한 천연물의 추출물은 다른 추출방법에 따라 수득된 추출물에 비해 활성성분의 함량이 현저하게 증대되는 것을 확인하였다. 이에 따라 본 발명에 이르게 되었으며, 본 발명의 추출방법에 따라 수득되는 추출물은 화장품, 식품, 의약품 등 다양한 산업분야에서 매우 유용하게 적용될 수 있다.
본 발명의 일 양태는 하기 단계를 포함하는 천연물의 추출방법을 제공한다:
a) 천연물에 용매를 첨가하는 단계; 및
b) 상기 a) 단계의 생성물에 드라이아이스를 첨가하여 추출하는 단계.
선택적으로, 상기 추출방법은 b) 단계 이후에 추출물을 분리하여 여과하는 c) 단계를 더 포함할 수 있다.
선택적으로, 상기 추출방법은 b) 단계에서 수득된 추출물 또는 c) 단계에서 수득된 여과물을 농축하는 d) 단계를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "천연물"이란, 자연계에서 발견되는 유기체 또는 유기체에 의해 생성되는 물질을 가리킨다. 바람직하게는, 상기 천연물은 생리활성(bioactivity)을 가지는 유기체 또는 유기체에 의해 생성되는 물질이다. 상기 유기체에 의해 생성되는 물질에는 천연 원료로부터 분리된 정제 물질, 유기체의 대사 산물, 유기체가 만들어낸 물질 등이 포함될 수 있다. 예를 들어, 벌이 나무의 분비물을 채취하여 벌의 타액과 밀랍을 함께 혼합하여 만들어낸 프로폴리스, 벌집 등이 예시될 수 있다.
상기 생리활성의 예에는 항바이러스, 항박테리아, 항진균, 항산화, 항노화, 피부 주름 개선, 피부 보습력 증가, 피부 탄력 개선, 피부 장벽 개선, 피부 미백, 피부 재생, 상처 치유, 부종 완화, 염증 억제, 아토피 개선, 면역력 증가, 또는 암, 자가면역질환, 당뇨병, 천식, 고혈압, 고지혈증, 대사질환, 비만, 동맥경화, 빈혈, 심혈관계질환, 중추신경계질환, 말초신경계질환 등 질환의 치료, 예방 또는 개선 활성이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 같이 천연물 또는 활성성분이 나타내는 활성 또는 효과가 무엇인지에 따라, 본 발명의 방법에 따라 수득되는 추출물이 적용될 수 있는 기술분야 및 용도가 달라질 수 있다.
상기 천연물은 식물, 과일, 광물, 동물, 및 이로부터 생성되는 분비물 및 대사산물 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 식물의 예에는 병풀, 장미, 녹차, 카렌둘라, 캐모마일, 로즈마리, 알로에, 선인장, 티트리, 어성초, 산자나무열매, 홍삼, 라벤더, 자소엽, 벚꽃, 쑥, 노니, 브로콜리, 천남성, 명아주, 차전초, 율피, 지황, 감초, 당귀, 천궁, 작약, 복령, 인삼, 상백피, 허브, 감잎, 뽕잎, 현미, 보리, 루이보스, 결명자, 민트, 페퍼민트, 민들레, 옥수수, 버섯, 오가피, 오미자, 복분자, 칡, 계피, 해바라기씨, 해조류 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 식물은 재배한 것, 채취한 것, 시판되는 것 등이 제한 없이 사용될 수 있다. 또한, 상기 식물은 꽃, 잎, 종자, 열매, 뿌리, 줄기, 껍질 등이 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 과일의 예에는 포도, 레몬, 깔라만시, 라임, 석류, 오렌지, 사과, 메론, 매실, 야자, 파인애플, 배, 망고, 감, 감귤, 수박, 복숭아, 대추 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 과일은 재배한 것, 채취한 것, 시판되는 것 등이 제한 없이 사용될 수 있다. 또한, 상기 과일은 과육, 종자, 껍질 등이 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 광물의 예에는 운석 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 운석은 당업계에서 일반적으로 이해되고 사용되는 의미를 갖는 것으로서 우주에서 지표로 낙하한 암석을 통틀어 지칭하며, 구성성분에 따라 석질운석(Stony meteorite), 석철운석(Stony iron meteorite), 철운석(Iron meteorite)으로 분류할 수 있다.
상기 동물의 예에는 게, 바닷가재, 대하, 새우 등 갑각류, 또는 달팽이, 조개, 군부, 굴, 다슬기, 오징어, 문어 등 연체동물, 또는 염소, 개 등 포유류, 또는 연어, 잉어, 붕어, 가물치, 장어 등 어류, 또는 개구리, 도롱뇽 등 양서류, 또는 거북이, 뱀 등 파충류, 또는 메뚜기, 전갈, 지네 등 곤충류 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 동물은 살아있는 것, 죽은 것, 건조시킨 것, 분쇄한 것 등이 제한 없이 포함된다. 또한, 상기 동물은 동물의 껍질, 뿔, 내장, 오일, 고기, 알, 태반 등이 제한 없이 포함된다.
용어 "추출물"이란, 적절한 용매로 추출하여 수득한 결과물을 의미하는데, 상기 결과물은 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 등을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 추출방법에서 사용되는 용매로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가알코올; 클로로포름, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 페트롤륨에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합 형태가 포함될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 물이 추출용매로 사용될 수 있다.
용어 "드라이아이스"란, 고체 형태의 이산화탄소(CO2)를 말한다. 무색이며, 물에 녹으면 탄산(H2CO3)을 만드는 성질이 있다.
본 명세서에서 "활성성분"은 예컨대 생리학적, 생물학적, 의약품적, 화장품적, 식품적, 의약외품적 등의 측면에서 특정 활성 또는 효과를 나타내는 성분을 가리키며, 이 용어는 유효성분, 생리활성성분 및 유용물질과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 양태는 본 발명의 방법에 따라 수득된 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 추출방법은 다른 추출방법에 비해 천연물로부터 추출되는 활성성분의 양을 현저하게 증가시켜줄 수 있다. 따라서, 본 발명의 추출방법은 동일한 양의 천연물로부터 다른 추출방법에 비해 더 많은 양의 활성성분이 함유되어 있는 추출물을 생산할 수 있고, 이는 추출물에서 목적하는 효과를 극대화시킬 수 있도록 해준다.
상기 조성물은 조성물에 포함되는 추출물이 갖는 활성, 추출물이 적용되는 기술분야 등에 따라 화장품 조성물, 식품 조성물, 의약외품 조성물, 의약품 조성물 등일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 수득된 병풀 추출물은 다른 방법에 따라 수득되는 병풀 추출물에 비해 피부 노화 개선 효과가 현저하게 더 높으며, 이는 피부에 도포하는 제형으로 제조되어 화장품으로 생산되거나, 또는 경구로 섭취하는 제형으로 제조되어 식품으로 생산될 수도 있다. 또다른 예로서, 본 발명의 방법에 따라 수득된 티트리 추출물은 다른 방법에 따라 수득되는 티트리 추출물에 비해 항균 효과가 현저하게 더 높으며, 이는 피부에 도포하는 제형으로 제조되어 손소독제로 생산되거나, 또는 경구로 섭취하는 제형으로 제조되어 의약품으로 생산될 수도 있다.
상기 조성물은 본 발명의 방법에 따라 수득된 추출물을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 수득된 추출물을 포함하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체가 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
상기 약학 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
상기 약학 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 상기 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
상기 약학 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 약학 조성물의 용량은 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량을 고려하여, 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자가 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 상기 약학 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 방법에 따라 수득된 추출물을 포함하는 식품은 건강기능성 식품일 수 있다. 용어 "건강기능성 식품"이란, 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 의미한다. 여기서 "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.
상기 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료, 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 식품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 상기 식품 조성물은 효능 증진을 위해 추출물 외에 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 필수 성분으로서 추출물을 지시된 비율로 함유하는 외에는 액체 성분에 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 식품 조성물에 포함되는 추출물의 양은 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품 조성물은 환제, 정제, 과립, 분말, 캡슐, 액상의 용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형일 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 수득된 추출물을 포함하는 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 화장품 조성물에 유효성분으로 포함되는 추출물의 함량은 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치), 사용 기간, 제형의 종류, 투여 경로, 대상체의 상태 등 다양한 요인을 고려하여 적합하게 결정될 수 있다. 상기 화장품 조성물은 일반적인 유화 제형, 가용화 제형 등의 형태로 제조될 수 있다. 또는, 상기 화장품 조성물은 패치류, 연고류, 피부접착용 겔류, 크림류, 팩류, 화장수류, 에센스류, 스프레이류, 마스크류, 파운데이션류, 메이크업베이스류, 세정제류, 수(W)형, 유(O)형, 실리콘(S)형, 수중유(O/W)형, 유중수(W/O)형, 실리콘중수(W/S)형, 수중실리콘(S/W)형, 고체상, 액상 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있다.
상기 화장품 조성물은 효능 증진을 위해 추출물 이외에 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 추가 성분은 추출물의 효능을 상쇄시키거나 감소시키지 않는다면 제한이 없다. 선택적으로, 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제, 담체 등을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 안정화제, 유화제, 점증제, 보습제, 액정 막강화제, pH 조절제, 항균제, 수용성 고분자, 피막제, 금속 이온 봉쇄제, 아미노산, 유기 아민, 고분자 에멀션, pH 조정제, 피부 영양제, 산화 방지제, 산화 방지조제, 방부제, 향료 등에서 선택되는 하나 이상의 수성 첨가제; 및 유지류, 왁스류, 탄화 수소유, 고급 지방산유, 고급 알콜, 합성 에스테르유 및 실리콘유 등에서 선택되는 하나 이상의 유성 첨가제 등이 추가될 수 있다.
본 발명에 따른 추출방법은 천연물로부터 추출되는 활성성분의 양을 현저하게 증가시켜줄 수 있다. 즉, 동일한 양의 천연물로부터 본 발명의 추출방법은 다른 추출방법에 비해 더 많은 양의 활성성분이 함유되어 있는 추출물을 생산할 수 있다. 이는 추출물에서 목적하는 효과 또는 활성성분이 나타내는 생리활성을 극대화시킬 수 있도록 해준다.
따라서, 본 발명에 따른 추출방법은 추출물의 생산 비용 및 시간 측면에서 매우 유리하다.
특히, 본 발명에 따른 추출방법이 적용될 수 있는 천연물에는 제한이 없으며, 활성성분 또는 추출물이 나타내는 효과에 따라 화장품, 식품, 의약외품, 의약품 등 다양한 분야에서 활용이 가능하다.
도 1은 열수 추출방법, 초음파 추출방법, 초고압 추출방법, 초임계 추출방법, 및 본 발명의 드라이아이스 추출방법에 따라 각각 수득된 병풀 추출물에서 지표물질로 사용되는 Madecassoside의 함량을 비교한 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 드라이아이스 추출물 제조
천연물 시료로서 병풀, 장미, 녹차, 카렌둘라, 캐모마일, 로즈마리, 알로에, 선인장, 티트리, 어성초, 산자나무열매, 홍삼, 라벤더, 자소엽, 벚꽃, 쑥, 노니, 브로콜리, 프로폴리스 및 게껍질을 각각 건조시켰다. 건조된 각각의 천연물 시료 60 g을 각각 비이커에 담아 물 540 g을 첨가하였다. 그 후, 드라이아이스 20g를 첨가하고 25℃에서 1시간 동안 정치하여 추출하였다.
추출 처리가 완료된 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분 동안 원심분리하여 원물 및 추출물을 분리하였다. 이에 따라 분리된 추출물을 0.8 μm, 0.45 μm 필터로 순차적으로 여과하였다. 이와 같이 수득된 여과액을 후술하는 시험예에서 사용하였다.
비교예 1. 열수 추출물 제조
천연물 시료로서 병풀, 장미, 녹차, 카렌둘라, 캐모마일, 로즈마리, 알로에, 선인장, 티트리, 어성초, 산자나무열매, 홍삼, 라벤더, 자소엽, 벚꽃, 쑥, 노니, 브로콜리, 프로폴리스 및 게껍질을 각각 건조시켰다. 건조된 각각의 천연물 시료 60 g을 각각 둥근 플라스크에 담아 물 540 g을 첨가하였다. 그 후, 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 80℃ 조건으로 1시간 동안 열수(환류) 처리하였다.
열수(환류) 처리가 완료된 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분 동안 원심분리하여 원물 및 추출물을 분리하였다. 이에 따라 분리된 추출물을 0.8 μm, 0.45 μm 필터로 순차적으로 여과하였다. 이와 같이 수득된 여과액을 후술하는 시험예에서 사용하였다.
비교예 2. 초음파 추출물 제조
천연물 시료로서 병풀, 장미, 녹차, 카렌둘라, 캐모마일, 로즈마리, 알로에, 선인장, 티트리, 어성초, 산자나무열매, 홍삼, 라벤더, 자소엽, 벚꽃, 쑥, 노니, 브로콜리, 프로폴리스 및 게껍질을 각각 건조시켰다. 건조된 각각의 천연물 시료 60 g을 각각 비이커에 담아 물 540 g을 첨가하였다. 그 후, 초음파 장치(5510R-DTH, BARANSON, USA)를 이용하여 20 kHz, 750 W, 25℃ 조건으로 1시간 동안 초음파 처리하였다.
초음파 처리가 완료된 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분 동안 원심분리하여 원물 및 추출물을 분리하였다. 이에 따라 분리된 추출물을 0.8 μm, 0.45 μm 필터로 순차적으로 여과하였다. 이와 같이 수득된 여과액을 후술하는 시험예에서 사용하였다.
비교예 3. 초고압 추출물 제조
천연물 시료로서 병풀, 장미, 녹차, 카렌둘라, 캐모마일, 로즈마리, 알로에, 선인장, 티트리, 어성초, 산자나무열매, 홍삼, 라벤더, 자소엽, 벚꽃, 쑥, 노니, 브로콜리, 프로폴리스 및 게껍질을 각각 건조시켰다. 건조된 각각의 천연물 시료 60 g을 각각 진공백에 담아 물 540 g을 첨가한 후, 침지된 시료를 진공기(IS-100, Namwoong, Korea)를 이용하여 진공처리를 하였다. 이어서, 초고압 장치(TFS-2L, TOYO KOATSU CO., LTD., Japan)를 이용하여 100 MPa(1,000 bar), 25℃, 물(완충용매) 조건으로 1시간 동안 2중 액상 초고압 처리를 하였다.
초고압 처리가 완료된 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분 동안 원심분리하여 원물 및 추출물을 분리하였다. 이에 따라 분리된 추출물을 0.8 μm, 0.45 μm 필터로 순차적으로 여과하였다. 이와 같이 수득된 여과액을 후술하는 시험예에서 사용하였다.
비교예 4. 초임계 추출물 제조
천연물 시료로서 병풀, 장미, 녹차, 카렌둘라, 캐모마일, 로즈마리, 알로에, 선인장, 티트리, 어성초, 산자나무열매, 홍삼, 라벤더, 자소엽, 벚꽃, 쑥, 노니, 브로콜리, 프로폴리스 및 게껍질을 각각 건조시켰다. 건조된 각각의 천연물 시료 60 g을 초임계추출 장치(SCW-P) 챔퍼에 담아 물 540 g을 첨가하여 400 bar 조건으로 초임계추출하였다.
초임계(물 용매) 처리가 완료된 후, 원심분리기(Supra 22K, Hanil, Korea)를 이용하여 8,000 rpm, 15℃ 조건으로 20분 동안 원심분리하여 원물 및 추출물을 분리하였다. 이에 따라 분리된 추출물을 0.8 μm, 0.45 μm 필터로 순차적으로 여과하였다. 이와 같이 수득된 여과액을 후술하는 시험예에서 사용하였다.
시험예 1. 추출수율
본 시험예에서는 추출방법에 따른 추출수율을 비교하고자 하였다.
앞서 실시예와 비교예에서 각각 수득된 여과액을 건조감량기(Satorius, Germany)에 의해 105℃에서 3시간 동안 건조시켜, 고형화된 농축파우더를 수득하였다. 수득된 농축파우더량(g)/투입원물량(g) x 100 계산식을 통해 추출수율(%)을 산출하였다.
실시예와 비교예에서 각각의 천연물에 대해 산출된 추출수율(%)을 하기 표 1에 나타내었다.
| 비교예 1 (열수추출) |
비교예 2 (초음파추출) |
비교예 3 (초고압추출) |
비교예 4 (초임계추출) |
실시예 1 (드라이아이스 추출) |
|
| 병풀 | 1.7 | 0.7 | 2.2 | 2.4 | 5.8 |
| 장미 | 1.5 | 1.0 | 3.1 | 3.1 | 6.5 |
| 녹차 | 5.1 | 2.3 | 6.8 | 5.2 | 8.9 |
| 카렌둘라 | 2.2 | 2.4 | 3.9 | 3.5 | 7.6 |
| 캐모마일 | 0.7 | 0.2 | 1.3 | 1.9 | 3.8 |
| 로즈마리 | 1.3 | 0.4 | 1.9 | 3.2 | 5.0 |
| 알로에 | 2.3 | 0.2 | 3.8 | 4.1 | 7.4 |
| 선인장 | 1.4 | 1.4 | 2.8 | 3.4 | 6.5 |
| 티트리 | 0.3 | 0.1 | 0.8 | 0.8 | 2.7 |
| 어성초 | 2.5 | 1.7 | 3.3 | 2.6 | 7.8 |
| 산자나무열매 | 1.9 | 0.5 | 2.7 | 3.6 | 5.9 |
| 홍삼 | 2.8 | 1.0 | 4.6 | 3.2 | 6.1 |
| 라벤더 | 0.4 | 0.1 | 0.7 | 1.3 | 2.8 |
| 자소엽 | 2.3 | 2.0 | 5.1 | 4.3 | 8.4 |
| 벚꽃 | 0.2 | <0.1 | 0.2 | 0.2 | 1.2 |
| 쑥 | 2.1 | 0.9 | 2.4 | 2.9 | 5.2 |
| 노니 | 2.1 | 2.8 | 3.6 | 4.2 | 6.6 |
| 브로콜리 | 0.3 | 0.2 | 0.8 | 1.1 | 1.7 |
| 프로폴리스 | 1.1 | 0.5 | 1.5 | 2.8 | 21.4 |
| 게껍질 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.3 | 2.6 |
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 20종의 모든 천연물에 대해 드라이아이스 추출방법에 따른 수율이 열수추출, 초음파추출, 초고압추출 및 초임계추출에 따른 수율보다 현저하게 높게 확인되었다.
시험예 2. 항산화 활성성분 함량
페놀성 물질과 플라보노이드는 항산화 효과를 나타내는 활성성분인 것으로 당업계에 이미 잘 알려져 있다. 이에 따라, 식물과 같은 천연물로부터 페놀성 물질과 플라보노이드를 높은 수율과 순도로 추출하고 정제하려는 연구가 다수 이루어지고 있다. 본 시험예에서는 19종의 천연물, 즉 병풀, 장미, 녹차, 카렌둘라, 캐모마일, 로즈마리, 알로에, 선인장, 티트리, 어성초, 산자나무열매, 홍삼, 라벤더, 자소엽, 벚꽃, 쑥, 노니, 브로콜리 및 프로폴리스를 다른 방법으로 추출한 경우, 추출물 내 페놀성 물질과 플라보노이드의 함량을 비교하였다. 또한, 게껍질에 대해서는 추출물 내 키토산의 함량을 비교하였다.
먼저, 페놀성 화합물의 총 함량은 다음과 같이 측정하였다.
추출액 1 mL에 증류수 10 mL을 첨가한 후, 2 mL의 Folin-Ciocalteu phenol reagent(Sigma)를 첨가하여 혼합하고, 실온에서 5분 동안 반응시켰다. 이 반응물에 20% 탄산나트륨을 2 mL 첨가하여 혼합하고, 상온에서 1시간 반응시켰다. 그 후, microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 680 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 지표물질은 갈릭산(gallic acid, Sigma, USA)을 사용하였으며, 지표물질의 농도별 검정곡선을 만들어 각 시료의 흡광도 값을 대입하여, 페놀성 물질의 총 함량(㎍/㎎ 추출물)을 산출하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
| 비교예 1 (열수추출) |
비교예 2 (초음파추출) |
비교예 3 (초고압추출) |
비교예 4 (초임계추출) |
실시예 1 (드라이아이스 추출) |
|
| 병풀 | 68 | 52 | 89 | 110 | 153 |
| 장미 | 21 | 25 | 43 | 58 | 123 |
| 녹차 | 114 | 62 | 132 | 193 | 518 |
| 카렌둘라 | 38 | 15 | 42 | 59 | 110 |
| 캐모마일 | 43 | 38 | 64 | 79 | 132 |
| 로즈마리 | 36 | 15 | 43 | 83 | 245 |
| 알로에 | 11 | 4 | 27 | 27 | 89 |
| 선인장 | 18 | 14 | 29 | 34 | 103 |
| 티트리 | 33 | 36 | 58 | 60 | 117 |
| 어성초 | 53 | 25 | 62 | 81 | 138 |
| 산자나무열매 | 50 | 32 | 58 | 60 | 184 |
| 홍삼 | 81 | 49 | 100 | 127 | 164 |
| 라벤더 | 57 | 32 | 83 | 111 | 179 |
| 자소엽 | 84 | 22 | 99 | 101 | 143 |
| 벚꽃 | 13 | 8 | 23 | 39 | 50 |
| 쑥 | 132 | 80 | 154 | 134 | 248 |
| 노니 | 31 | 19 | 48 | 69 | 129 |
| 브로콜리 | 8 | 5 | 6 | 8 | 11 |
| 프로폴리스 | 54 | 68 | 77 | 83 | 142 |
플라보노이드의 총 함량은 다음과 같이 측정하였다.
추출액 1.5 mL에 동량의 메탄올에 용해된 2% AlCl3·6H2O을 혼합하고, 상온에서 10분 동안 반응시켰다. 그 후, microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 367 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 지표물질은 카테킨(catechin, Sigma, USA)을 사용하였으며, 지표물질의 농도별 검정곡선을 만들어 각 시료의 흡광도 값을 대입하여, 플라보노이드의 총 함량(㎍/㎎ 추출물)을 산출하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
| 비교예 1 (열수추출) |
비교예 2 (초음파추출) |
비교예 3 (초고압추출) |
비교예 4 (초임계추출) |
실시예 1 (드라이아이스 추출) |
|
| 병풀 | 83 | 60 | 90 | 128 | 164 |
| 장미 | 21 | 23 | 57 | 57 | 138 |
| 녹차 | 153 | 88 | 150 | 210 | 603 |
| 카렌둘라 | 32 | 13 | 45 | 54 | 97 |
| 캐모마일 | 59 | 50 | 83 | 91 | 148 |
| 로즈마리 | 32 | 18 | 49 | 73 | 293 |
| 알로에 | 8 | 7 | 32 | 42 | 108 |
| 선인장 | 21 | 15 | 28 | 35 | 96 |
| 티트리 | 45 | 39 | 66 | 65 | 124 |
| 어성초 | 64 | 27 | 62 | 97 | 184 |
| 산자나무열매 | 73 | 30 | 71 | 91 | 200 |
| 홍삼 | 76 | 57 | 115 | 118 | 183 |
| 라벤더 | 64 | 18 | 72 | 132 | 183 |
| 자소엽 | 88 | 20 | 82 | 95 | 139 |
| 벚꽃 | 11 | 5 | 28 | 27 | 56 |
| 쑥 | 120 | 76 | 168 | 166 | 463 |
| 노니 | 33 | 10 | 44 | 81 | 173 |
| 브로콜리 | 3 | 6 | 7 | 8 | 15 |
| 프로폴리스 | 23 | 32 | 75 | 88 | 143 |
다음으로, 키토산의 함량은 HPLC를 이용한 분석법(Xun Yan at al., Chitosan analysis using acid hydrolysis and HPLC/UV, 2011, Carbohydrate Polymers, 87, P1774-1778)을 적용하여 측정하였다.
추출액을 12M HCl을 이용하여 Autoclave(Ilshin, 90℃, 10hr)에서 전처리를 한 후, 전처리 용액 1 ml을 붕산나트륨 3.8g과 3차증류수 30 mL로 용해시켰다. 이어서, 붕산염 버퍼를 이용하여 50 ml, pH 7.0으로 조정하였다. 그 후, 1% FMOC-OSu in Acetone 시약을 첨가하여 볼텍스 믹서로 잘 혼합하고, 4시간 동안 암실에서 반응시키고 HPLC로 분석하였다. HPLC-DAD(UV)는 Agilent 1200 series를 이용한 UV 멀티파장 디텍터로 분석하였으며, 용매는 단상으로 0.05% TFA in DW / Acetonitrile = 1:1 (v/v)를 사용하여 키토산에서 전환된 N-아세틸-글루코사민의 양을 표준품의 Standard curve(글루코사민(99%, Sigma)) 양과 비교하여 산출하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
| 비교예 1 (열수추출) |
비교예 2 (초음파추출) |
비교예 3 (초고압추출) |
비교예 4 (초임계추출) |
실시예 1 (드라이아이스 추출) |
|
| 키토산 함량 (㎍/㎎ 추출물) |
0 | 0 | 0 | 0.5 | 25.8 |
상기 표 2 및 3에 나타난 바와 같이, 항산화 효과를 나타내는 활성성분으로서 페놀성 물질과 플라보노이드는 열수 추출물, 초음파 추출물, 초고압 추출물 및 초임계 추출물에 비해 드라이아이스 추출물에서 그 함량이 훨씬 더 높았으며, 이와 같은 결과는 19종의 천연물에서 모두 확인할 수 있었다. 이러한 결과는, 열수 추출물, 초음파 추출물, 초고압 추출물, 초임계 추출물 및 드라이아이스 추출물을 동일한 양으로 사용하는 경우, 드라이아이스 추출물 내 항산화 활성성분의 함량이 가장 높다는 것을 의미한다.
또한, 상기 표 4에서 볼 수 있듯이, 게껍질에서 추출되는 키토산은 열수 추출물, 초음파 추출물 및 초고압 추출물에서는 전혀 얻을 수 없었으며, 초임계 추출물에 비해 드라이아이스 추출물에서 그 함량은 약 50배 이상인 것으로 확인되었다.
시험예 3. 항산화 효과
병풀 추출물은 피부 노화 개선용 조성물에 함유되어 화장품 등의 분야에서 자주 사용되고 있다. 본 시험예에서는 병풀 추출물로부터 얻을 수 있는 피부 노화 개선 효과의 추출방법에 따른 차이를 비교하기 위하여, 병풀 추출물의 항산화능을 확인하였다. 구체적으로, 자유라디칼소거시험(비효소적 항산화 효과시험)과 활성산소소거시험(효소적 항산화 효과시험)을 실시하였다.
(1) 자유라디칼 소거 시험 (비효소적 항산화 효과 시험)
항산화 효과를 확인하기 위해 당업계에서 자주 사용되는 자유라디칼 소거 시험은 안정한 2,2-디페닐-1-피크릴-히드라질(DPPH)의 흡광도가 540 nm에서 최대값을 나타내는 원리에 기초한 것이다. 따라서, 자유라디칼 DPPH가 시료에 의해 소거되어 보라색에서 투명한 색이 될수록, 즉 자유라디칼 소거율이 증가될수록, 540 nm에서의 흡광도는 감소하게 된다.
0.1 mM DPPH(Sigma) 용액 1 mL에 상기 실시예 및 비교예의 시료를 메탄올에 희석시킨 용액 1 mL를 혼합하였다. 이어서, 37℃에서 15분 동안 방치한 후, microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
대조군은 DPPH 1 ml와 메탄올 1 ml를 넣어 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였으며, 메탄올 1 ml와 시료 1 ml를 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻도록 설정하였다.
하기 식 1을 이용하여 자유라디칼소거율을 산출하였다. 하기 표 5에서, SC50은 자유라디칼을 50% 소거하기 위해 필요한 시료의 농도를 가리킨다. 여기서, SC50 값이 작을수록 항산화 활성이 높다는 것을 의미한다.
[식 1]
자유라디칼소거율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100)
| 비교예 1 (열수추출) |
비교예 2 (초음파추출) |
비교예 3 (초고압추출) |
비교예 4 (초임계추출) |
실시예 1 (드라이아이스 추출) |
|
| 병풀 추출물의 자유라디칼소거율 SC50 (mg/mL) | 2.3 | 3.2 | 1.7 | 1.3 | 0.2 |
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 다른 추출방법에 비해 드라이아이스 추출방법을 적용하였을 때 병풀 추출물의 SC50 값이 유의적으로 더 작다는 것이 확인되었다. 이는 드라이아이스 추출방법에 의해 수득된 추출물의 항산화 활성이 가장 높다는 것을 의미한다.
(2) 활성산소 소거 시험 (효소적 항산화 효과 시험)
활성산소 소거 시험은 잔틴/잔틴산화효소(xanthine/xanthine oxidase, Sigma)의 효소 반응에 의해 활성산소가 발생되는 원리에 기초한 것이다. 활성산소에 의한 니트로블루 테트라졸륨(nitroblue tetrazolium, NBT)의 산화를 이용하여 흡광도 변화를 측정함으로써, 활성산소의 소거능을 확인할 수 있다.
Na2CO3 2.4 mL, 잔틴(Sigma) 0.1 mL, EDTA 0.1 mL, BSA(소혈청알부민, Sigma) 0.1 mL, NBT 0.1 mL 및 시료 0.1 mL을 혼합하고, vortex mixer(Type 37600 Mixer, Mini mix, USA)를 이용하여 voltexing한 후 25℃에서 10분 동안 방치하였다. 이어서, 잔틴산화효소 0.1mL를 넣고 25℃에서 20분 동안 반응시켰다. 6 mM CuCl2를 넣어 반응을 정지시킨 후, microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
대조군은 시료 용액 대신 3차 증류수를 넣어 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였으며, 잔틴산화효소 용액 대신 3차 증류수를 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻도록 설정하였다.
하기 식 2를 이용하여 활성산소소거율을 산출하였다. 하기 표 6에서, IC50은 활성산소를 50% 소거하기 위해 필요한 시료의 농도를 가리킨다. 여기서, IC50 값이 작을수록 항산화 활성이 높다는 것을 의미한다.
[식 2]
활성산소소거율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100)
| 비교예 1 (열수추출) |
비교예 2 (초음파추출) |
비교예 3 (초고압추출) |
비교예 4 (초임계추출) |
실시예 1 (드라이아이스 추출) |
|
| 병풀 추출물의 활성산소소거율 IC50 (mg/mL) | 2.8 | 5.4 | 1.5 | 1.9 | 0.3 |
상기 표 6에 나타난 바와 같이, 다른 추출방법에 비해 드라이아이스 추출방법을 적용하였을 때 병풀 추출물의 IC50 값이 유의적으로 더 작다는 것이 확인되었다. 이는 드라이아이스 추출방법에 의해 수득된 추출물의 항산화 활성이 가장 높다는 것을 의미한다.
시험예 4. 지표물질의 함량
병풀 추출물의 활성성분 중에서 지표물질로 사용되는 Madecassoside의 함량을 추출방법에 따라 달라지는지 확인하였다.
이를 위해, HPLC(High pressure liquid chromatography)를 이용하여 병풀 추출물의 성분 함량을 분석하였다. 용매는 HPLC급 시약을 사용하였으며, 시료는 각 용매에 용해시키고 0.2 μm 필터로 여과하는 전처리를 하였다. 그 후, HPLC(Agilent 1200series, Agilent, USA) 기기를 사용하여 UV 254~340 nm 영역에서 성분 함량을 측정하였다. C18 컬럼(Zorbax XDB-C18 4.6 x 250mm, Agilent, USA)을 사용하여 2% 아세트산 용매와 아세토니트릴(ACN) 용매를 사용한 기울기 용법으로 분석하였다.
그 결과를 나타낸 도 1에서 볼 수 있듯이, 병풀 추출물의 활성성분 중에서 지표물질로 사용되는 Madecassoside의 함량은 열수 추출물, 초음파 추출물, 초고압 추출물 및 초임계 추출물에 비해 드라이아이스 추출물에서 현저하게 훨씬 더 높은 것으로 확인되었다.
시험예 5. 항균 효과
티트리 추출물은 오래 전부터 항균과 살균 작용이 있다는 것이 밝혀졌으며, 소독제, 손세정제, 화장품 등의 분야에서 자주 사용되고 있다. 본 시험예에서는 고체 배양 희석법(Agar Serial Dilution Method)에 의한 최소 저해 농도를 측정함으로써, 티트리 추출물이 나타내는 항균력의 추출방법에 따른 차이를 비교하였다.
그람양성균으로 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus, KCTC 6910), 그람음성균으로 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa, KCTC 1637) 및 대장균(E. Coli, KCTC 1039), 효모로는 칸디다 알비칸스(Candida albicans, KCTC 7965), 사상균으로 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger, KCTC 6910)의 총 5종의 균주를 사용하였으며, 모두 한국생명공학연구원으로부터 분양받았다.
박테리아의 경우 트립틱소이 한천배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 전배양하였으며, 효모의 경우 포테이토덱스트로스 한천배지에 접종하여 25℃에서 2일 동안 전배양하였으며, 사상균의 경우 포테이토덱스트로스 한천배지에 접종하여 25℃에서 7일 동안 전배양한 후, 도말봉을 이용하여 배지 표면에 형성된 사상균의 포자를 회수하여 멸균된 식염수에 희석하여 사용하였다.
멸균된 패트리 디쉬에 5% 디메틸술폭시드(DMSO) 생리식염수용액으로 희석한 각각의 추출물을 2 mL씩 첨가하였다. 대조군으로 5% DMSO 생리식염수용액 2 mL를 사용하였다. 각 패트리 디쉬에 멸균하고 48℃로 냉각한 트립틱소이 한천배지 및 포테이토덱스트로스 한천배지를 18 mL씩 첨가하여 교반한 후, 정치하여 응고시켰다.
그 후, 전배양시킨 각각의 균을 페트리 디쉬에 도말하였다(도말 최종농도: 박테리아 약 1×106 CFU/mL, 효모 약 1×105 CFU/mL, 사상균 약 1×104 CFU/mL). 박테리아는 37℃에서 24시간, 효모는 25℃에서 3일, 사상균은 25℃에서 7일 배양한 후, 각 구획 내에서 콜로니의 형성 여부를 관찰하였다.
성장이 되지 않은 평판의 최소 시료 농도(즉, 최소저해농도 MIC(Minimum inhibitory concentration))를 확인하여, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 이때, 최소저해농도는 그 값이 작을수록 항균 효과가 높다는 것을 의미한다.
| 비교예 1 (열수추출) |
비교예 2 (초음파추출) |
비교예 3 (초고압추출) |
비교예 4 (초임계추출) |
실시예 1 (드라이아이스 추출) |
|
| S. aureus | 500 | 800 | 300 | 250 | 20 |
| P. aeruginosa | 500 | 500 | 250 | 100 | 10 |
| E. Coli | 300 | 300 | 250 | 200 | 50 |
| C. albicans | 1,000 | >1,000 | 500 | 250 | 50 |
| A. niger | 500 | 800 | 250 | 200 | 50 |
상기 표 7에 나타난 바와 같이, 다른 추출방법에 비해 드라이아이스 추출방법을 적용하였을 때 티트리 추출물은 각종 박테리아, 효모, 사상균에 대해 모두 강력한 항균 효과를 나타냈다.
시험예 6. 미백 효과
장미 추출물은 멜라닌 생성 억제 효과를 갖고 있어 미백 기능이 있는 것으로 알려져 있다. 본 시험예에서는 추출방법에 따라 장미 추출물로부터 얻을 수 있는 미백 효과가 달라지는 점을 확인하였다.
이를 위해, 티로시나아제(tyrosinase) 효소의 활성 저해율을 측정하였다. 상기 티로시나아제는 생체내에서 티로신(tyrosine)의 산화 과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되도록 하는 효소이다. 생체내에서 티로시나아제에 의해 티로신이 산화되면 멜라닌이 형성되고, 이러한 멜라닌이 피부 상층부로 이동하면서 피부가 검게 변하고 기미, 주근깨 등이 생성된다. 따라서, 티로시나아제의 활성 저해율을 측정함으로써 미백 효과를 검정할 수 있다(Pomerantz S. H., J. Biochem., 24:161-168, 1966).
시료 0.9 mL, 0.1 M 인산완충액(pH 6.8) 1.0 mL 및 1.5 mM L-티로신 용액 1.0 mL을 혼합하고, 37℃에서 10분 동안 유지하였다. 머쉬룸티로시나아제(1,500 units/mL) 0.1 mL를 첨가하여 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후, UV-vis spectrophotometer(Smartspec Plus, Biorad, USA)를 사용하여 475 nm에서 흡광도를 측정함으로써 티로시나아제 저해율을 산출하였다.
대조군은 시료 대신 완충액을 사용하여 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였으며, 티로시나아제 대신 완충액을 사용하여 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻도록 설정하였다. 또한, 종래에 미백 효과가 뛰어나다고 알려져 미백 화장품의 원료로 사용되는 arbutin(Arbutin synthetic, Sigma)을 양성 대조군으로 사용하였다.
하기 식 3을 이용하여 티로시나아제 저해율을 산출하였다. 하기 표 8에서, IC50은 티로시나아제 활성을 50% 저해하는데 필요한 시료의 농도를 가리킨다. 여기서, IC50 값이 작을수록 티로시나아제 저해율이 높다는 것을 의미한다. 양성 대조군의 IC50 값은, arbutin을 다양한 농도로 사용하여 티로시나아제 저해율들을 수득한 후, 이들을 회귀 커브에 적용하여 산출하였다.
[식 3]
티로시나아제 저해율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100)
| 비교예 1 (열수추출) |
비교예 2 (초음파추출) |
비교예 3 (초고압추출) |
비교예 4 (초임계추출) |
실시예 1 (드라이아이스 추출) |
양성 대조군 (Arbutin) | |
| 티로시나아제 저해율 IC50 (μg/ml) | 486 | 550 | 239 | 200 | 25 | 30 |
상기 표 8에 나타난 바와 같이, 다른 추출방법에 비해 드라이아이스 추출방법을 적용하였을 때 장미 추출물의 티로시나아제 저해율이 가장 높았으며, 이는 장미를 드라이아이스 추출방법에 의해 추출하는 것이 미백 효과가 가장 우수하다는 것을 의미한다. 또한, 종래에 미백 화장품의 원료로 자주 사용되는 arbutin과 비교했을 때, 열수추출, 초음파추출, 초고압추출, 초임계추출 중 어느 것도 유사한 수준의 티로시나아제 저해 효과를 나타내지 못한 반면, 드라이아이스 추출은 오히려 티로시나아제 저해 효과가 더 우수한 수준으로 나타났다.
시험예 7. 주름 개선 효과
홍삼 추출물은 피부 주름을 예방하고 개선하여 피부 노화를 방지하는 안티에이징 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 본 시험예에서는 추출방법에 따라 홍삼 추출물로부터 얻을 수 있는 피부 주름 개선 효과가 달라지는 점을 확인하였다.
이를 위해, 엘라스타아제(elastase) 효소의 활성 저해율을 측정하였다. 엘라스틴은 피부 진피 내 매트릭스 층을 구성하는 성분으로서, 피부가 노화됨에 따라 엘라스틴이 분해되고 진피 내 매트릭스 층이 무너지면서 주름이 생기게 된다. 따라서, 엘라스틴을 분해하는 효소인 엘라스타아제의 활성을 측정함으로써 피부 주름의 억제 및 개선 효과를 검정할 수 있다. 엘라스타아제의 기질인 N-숙시닐-(Ala)3 p-니트로아닐린(N-succinyl-(Ala)3 p-nitroaniline, Sigma)을 이용하여 p-니트로아닐린이 분해되면서 생기는 색의 변화를 405 nm에서 흡광도를 측정함으로써 엘라스타아제 활성 저해율을 산출하였다.
완충액은 pH 8.0, 0.267 M Trizma-HCl (Sigma), 기질액은 8.8 mM N-숙시닐-(Ala)3 p-니트로아닐린, 효소액은 돼지 췌장 엘라스타아제 10 μg/mL (Elastase, Sigma, USA)를 사용하였다. 완충액 60 μL, 기질액 20 μL와 홍삼 추출물 각각을 농도별로 3차 증류수에 희석시킨 시료액 100 μL를 혼합한 후, 효소액 20 μL를 첨가하고 25℃ 항온수조에서 15분 동안 반응시켰다. 그 후, p-니트로아닐린의 생성량을 microplate reader(UVT-06685, Thermo max, USA)를 사용하여 475 nm에서 흡광도를 측정함으로써, 엘라스타아제 활성 저해율을 산출하였다.
대조군은 추출물 대신 3차 증류수를 사용하여 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였으며, 효소액 대신 3차 증류수를 사용하여 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻도록 설정하였다. 또한, 엘라스타아제를 특이적으로 저해하는 phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF, Sigma, USA)를 양성 대조군으로 사용하였다.
하기 식 4를 이용하여 엘라스타아제 저해율을 산출하였다. 하기 표 9에서, IC50은 엘라스타아제 활성을 50% 저해하는데 필요한 시료의 농도를 가리킨다. 여기서, IC50 값이 작을수록 엘라스타아제 저해율이 높다는 것을 의미한다. 양성 대조군의 IC50 값은, PMSF를 다양한 농도로 사용하여 엘라스타아제 저해율들을 수득한 후, 이들을 회귀 커브에 적용하여 산출하였다.
[식 4]
엘라스타아제 저해율(%) = 100 - ((시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100)
| 비교예 1 (열수추출) |
비교예 2 (초음파추출) |
비교예 3 (초고압추출) |
비교예 4 (초임계추출) |
실시예 1 (드라이아이스 추출) |
양성 대조군 (PMSF) | |
| 엘라스타아제 저해율 IC50 (mg/ml) | 5.5 | >10 | 4.0 | 3.7 | 0.28 | 0.07 |
상기 표 9에 나타난 바와 같이, 다른 추출방법에 비해 드라이아이스 추출방법을 적용하였을 때 홍삼 추출물의 엘라스타아제 저해율이 가장 높았으며, 이는 홍삼을 드라이아이스 추출방법에 의해 추출하는 것이 피부 주름 개선 효과가 가장 우수하다는 것을 의미한다.
시험예 8. 피부 재생 효과
쑥 추출물은 피부 재생을 촉진시키고 주름을 개선하여 피부 노화를 방지하는 안티에이징 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 본 시험예에서는 추출방법에 따라 쑥 추출물로부터 얻을 수 있는 피부 재생 및 주름 개선 효과가 달라지는 점을 확인하였다.
이를 위해, 콜라겐의 합성율을 측정하였다. 콜라겐은 엘라스틴과 함께 피부 내 진피 매트릭스 층을 이루는 구성성분이다. 피부가 노화됨에 따라 진피 내 매트릭스 층을 이루고 있는 구성성분들이 분해되면서 주름이 생성되는데, 진피 매트릭스 층의 구성성분인 콜라겐의 합성율을 확인함으로써, 피부 재생을 촉진시키는 효과를 확인할 수 있다.
사람의 정상 섬유아세포(human dermal fibroblast)를 24-웰 마이크로플레이트에 접종시키고(1x105 세포/웰), 37℃, 5% 농도의 CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 각 추출물 시료들을 농도별로 첨가한 무혈청 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 콜라겐 합성량은 효소면역측정법을 이용하여 다음과 같이 수행하였다.
24시간 동안 배양한 배지를 96-웰 마이크로플레이트에 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 세척 버퍼(PBS-T; 0.05% Tween 20 in phosphate buffered saline)로 3회 세척하고, 블로킹 용액(5% skin milk, Fluka)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 용액을 제거하고 세척 버퍼로 3회 세척하고, 일차항체(rabbit anti-collagen type I, Sigma)를 PBS-T에 희석하여 100 μL씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척한 후, 이차항체(anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate, Sigma)를 PBS-T에 희석하여 100 μL씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척한 후, 기질용액(alkaline phosphatase substrate solution, Sigma)을 100 μL씩 첨가하고, 항온 25℃에서 발색시켰다. 이어서, microplate reader(UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
대조군은 추출물 시료를 처리하지 않은 세포 배양액에 대해 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였으며, 3회 측정값의 평균을 구하였다. 또한, 콜라겐 합성을 촉진하는 효과가 있는 것으로 잘 알려져 있는 아스코르브산을 양성 대조군으로 사용하였으며, 3회 측정값의 평균을 구하였다.
하기 식 5를 이용하여 콜라겐 합성율(%)을 산출하고, 하기 10에 나타내었다.
[식 5]
콜라겐 합성율(%) = 100 + {((대조군의 흡광도 - 시료의 흡광도) / 대조군의 흡광도) x 100}
| 시료 농도 | 비교예 1 (열수추출) |
비교예 2 (초음파추출) |
비교예 3 (초고압추출) |
비교예 4 (초임계추출) |
실시예 1 (드라이아이스 추출) |
양성 대조군 (아스코르브산) |
| 0 μg/mL | 100.00% | 100.00% | 100.00% | 100.00% | 100.00% | 100.00% |
| 1 μg/mL | 98.43% | 100.70% | 101.48% | 100.32% | 106.21% | 108.45% |
| 10 μg/mL | 105.44% | 103.92% | 109.87% | 112.05% | 143.60% | 123.57% |
| 100 μg/mL | 113.47% | 109.80% | 121.81% | 124.35% | 189.24% | 131.58% |
상기 표 10에 나타난 바와 같이, 다른 추출방법에 비해 드라이아이스 추출방법을 적용하였을 때 쑥 추출물의 콜라겐 합성율이 가장 높았으며, 이는 쑥을 드라이아이스 추출방법에 의해 추출하는 것이 피부 재생 및 주름 개선 효과가 가장 우수하다는 것을 의미한다.
시험예 9. MMP-1 발현 억제 효과
알로에 추출물은 항산화 및 항균 특성 외에도, 자외선 화상 치료, 콜라겐 생성 증가, 피부 탄력 향상 등 다양한 특성을 갖고 있는 것으로 알려져 있다. 본 시험예에서는 추출방법에 따른 알로에 추출물의 효과의 차이를 확인하고자 하였다.
콜라겐을 분해하는 효소 MMP(Matrix metalloproteinase)는 자외선 조사에 의해 그 발현이 촉진될 수 있으며, 이에 따라 콜라겐 분해가 활성화되고 또한 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성되는 결과에 이르게 된다. 따라서, UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1의 농도를 측정함으로써, 시료에 의한 MMP-1 발현 억제 효과를 검정하기 위해 다음과 같이 효소면역분석법(ELISA)을 실시하였다.
UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5 J/cm2의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량 및 배양 시간을 결정하기 위하여, 예비 실험을 통해 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확인하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA 환경에서 같은 시간 동안 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 상태 그대로이며, UVA를 조사한 후 시료가 들어간 배지로 교환하여 24시간 동안 배양한 후 배지를 회수하여 96-웰에 코팅하였다.
일차항체로서 MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체와 MMP-2 (Ab-3) 단일클론항체를 처리하고, 37℃에서 60분 동안 반응시켰다. 이차항체인 항마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 동안 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1 mg/ml ρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine buffer)을 상온에서 30분간 반응시켰다. 그 후, microplate reader(UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
이때, 음성 대조군으로서 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였으며, 양성 대조군으로서 MMP-1 발현 억제 효과가 뛰어나다고 알려진 레티놀을 사용하였다. 시료 처리농도 0.1%를 기준으로 MMP-1 발현 억제율(%)을 하기 표 11에 나타내었다.
| 비교예 1 (열수추출) |
비교예 2 (초음파추출) |
비교예 3 (초고압추출) |
비교예 4 (초임계추출) |
실시예 1 (드라이아이스 추출) |
양성 대조군 (레티놀) | |
| MMP-1 발현 억제율(%) | 5% | 3% | 8% | 12% | 39% | 41% |
상기 표 11에 나타난 바와 같이, 다른 추출방법에 비해 드라이아이스 추출방법을 적용하였을 때 알로에 추출물의 MMP-1 발현 억제율이 가장 높았으며, 양성 대조군으로서 사용된 레티놀의 MMP-1 발현 억제율과 유사한 수준이었다. 이는 알로에를 드라이아이스 추출방법에 의해 추출하는 것이 MMP 효소의 발현을 효율적으로 억제하여 콜라겐 분해를 막을 수 있으며, 이에 따라 피부 탄력 저하 및 주름 형성을 억제할 수 있다는 것을 의미한다.
시험예 10. 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과
선인장 추출물을 이용하여 추출방법에 따른 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과를 확인하기 위해 다음과 같이 실험하였다.
섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 플레이트에 1x105개씩 분주한 후, 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고, 각 웰에 500 μL의 PBS를 첨가하였다. 그 후, 자외선 B(UVB) 램프(Model: F15T8, UVB 15W, Sankyo Dennki, Japan)를 이용하여 섬유아세포에 자외선 10 mJ/cm2를 조사하였다. 이어서, PBS를 제거하고, 세포배양 배지(10% FBS가 첨가된 DMEM 배지) 1 mL를 첨가하였다.
여기에 각 시료를 농도 0.1% 기준으로 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 이어서, 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500 μL와 MTT 용액(2.5 mg/mL) 60 μL를 첨가한 후, 2시간 동안 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500 μL씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고, 상등액 100 μL를 96-웰 플레이트로 옮겼다. 그 후, microplate reader(UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 565 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
하기 식 6에 의해 세포생존율(%)을 산출하였으며, 하기 식 7에 의해 자외선에 의한 세포독성 완화율(%)을 산출하였다. 시료 처리농도 0.1%를 기준으로 자외선에 의한 세포독성 완화율(%)을 하기 표 12에 나타내었다.
[식 6]
세포생존율(%) = 〔(St-Bo)/(Bt-Bo)〕x 100
· Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한, 웰의 565 nm 흡광도
· Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한, 웰의 565 nm 흡광도
· St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한, 웰의 565 nm 흡광도
[식 7]
자외선에 의한 세포독성 완화율(%) = 〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕x 100
· Bo : 자외선을 조사하지 않고 시료도 처리하지 않은 웰의 세포생존율
· Bt : 자외선을 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율
· St : 자외선을 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율
| 비교예 1 (열수추출) |
비교예 2 (초음파추출) |
비교예 3 (초고압추출) |
비교예 4 (초임계추출) |
실시예 1 (드라이아이스 추출) |
|
| 선인장 추출물의 세포독성 완화율(%) | 13% | 10% | 15% | 21% | 67% |
상기 표 12에 나타난 바와 같이, 다른 추출방법에 비해 드라이아이스 추출방법을 적용하였을 때 선인장 추출물의 자외선 조사에 의한 세포독성 완화율이 가장 높았다. 이는 선인장을 드라이아이스 추출방법에 의해 추출하는 것이 자외선에 의한 세포독성을 가장 효과적으로 방어할 수 있다는 것을 의미한다.
시험예 11. 자외선조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과
노니 추출물을 이용하여 추출방법에 따른 자외선조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 확인하기 위해 다음과 같이 실험하였다.
사람의 표피 조직에서 분리한 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 플레이트에 5x104개씩 분주한 후, 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고, 각 웰에 500 μL의 PBS를 첨가하였다. 그 후, 자외선 B(UVB) 램프(Model: F15T8, UVB 15W, Sankyo Dennki, Japan)를 이용하여 섬유아세포에 자외선 10 mJ/cm2를 조사하였다. 이어서, PBS를 제거하고, 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350 μL를 첨가하였다.
여기에 각 시료를 농도 0.1% 기준으로 처리한 후, 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150 μL 취하여 IL-1α을 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)에 의해 정량함으로써, 시료의 염증성 사이토카인 발현 억제 효과를 판단하였다.
하기 식 8에 의해 염증성 사이토카인 IL-1α의 발현 억제율을 산출하고, 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.
[식 8]
염증성 사이토카인 발현 억제율(%) = 〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕x 100
· Bo : 자외선을 조사하지 않고 시료도 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량
· Bt : 자외선을 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량
· St : 자외선을 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α 생성량
| 비교예 1 (열수추출) |
비교예 2 (초음파추출) |
비교예 3 (초고압추출) |
비교예 4 (초임계추출) |
실시예 1 (드라이아이스 추출) |
|
| 노니 추출물의 염증성 사이토카인 발현 억제율(%) | 17% | 9% | 24% | 27% | 53% |
상기 표 13에 나타난 바와 같이, 다른 추출방법에 비해 드라이아이스 추출방법을 적용하였을 때 노니 추출물의 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현의 억제율이 가장 높았다. 이는 노니를 드라이아이스 추출방법에 의해 추출하는 것이 자외선에 의한 염증 발생을 가장 효과적으로 방어할 수 있다는 것을 의미한다.
이하, 본 발명의 방법에 따라 수득된 추출물이 화장품에 포함되는 제형으로서, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 에센스 및 팩을 예시한다.
다만, 본 발명의 방법에 따라 수득된 추출물은 화장품, 식품, 의약외품, 의약품 등 적용되는 분야에 따라 당업계의 통상의 기술자가 적절하게 설계하고 변형할 수 있는 것으로 이해되어야 하며, 하기 예시에 제한되는 것으로 해석해서는 안 된다.
| 성분 | 중량(%) | |
| 1 | 글리세린 | 5.00 |
| 2 | 1,3-부틸렌 글라이콜 | 3.00 |
| 3 | PEG 1500 | 1.00 |
| 4 | 알란토인 | 0.10 |
| 5 | DL-판테놀 | 0.30 |
| 6 | EDTA-2Na | 0.02 |
| 7 | 벤조페논-9 | 0.04 |
| 8 | 에탄올 | 10.00 |
| 9 | 옥틱도데세스-16 | 0.20 |
| 10 | 폴리솔베이트 20 | 0.20 |
| 11 | 드라이아이스 추출물 | 5.0 |
| 12 | 방부제, 방향제, 색소 | 미량 |
| 13 | 증류수 | 잔량 |
| 성분 | 중량(%) | |
| 1 | 글리세린 | 2.00 |
| 2 | 1,3-부틸렌 글라이콜 | 2.00 |
| 3 | 알란토인 | 0.10 |
| 4 | DL-판테놀 | 0.30 |
| 5 | EDTA-2Na | 0.02 |
| 6 | 벤조페논-9 | 0.04 |
| 7 | 에탄올 | 15.00 |
| 8 | 폴리솔베이트 20 | 0.20 |
| 9 | 드라이아이스 추출물 | 3.0 |
| 10 | 구연산 | 미량 |
| 11 | 방부제, 방향제, 색소 | 미량 |
| 12 | 증류수 | 잔량 |
| 성분 | 중량(%) | |
| 1 | 세테아릴 알콜 | 1.00 |
| 2 | 글리세릴스테아레이트 | 0.50 |
| 3 | 폴리소르베이트 60 | 1.00 |
| 4 | 소르비탄세스퀴올리에이트 | 0.30 |
| 5 | 세틸옥타노에이트 | 6.00 |
| 6 | 스쿠알란 | 4.00 |
| 7 | 샤플라워오일 | 4.00 |
| 8 | 부틸렌글라이콜 | 4.00 |
| 9 | 글리세린 | 4.00 |
| 10 | 카보머 | 0.10 |
| 11 | 트리에탄올아민 | 0.10 |
| 12 | 드라이아이스 추출물 | 1.00 |
| 13 | 방부제, 방향제, 색소 | 미량 |
| 14 | 증류수 | 잔량 |
| 성분 | 중량(%) | |
| 1 | 글리세린 | 10.00 |
| 2 | 베타인 | 5.00 |
| 3 | PEG 1500 | 2.00 |
| 4 | 알란토인 | 0.10 |
| 5 | DL-판테놀 | 0.30 |
| 6 | EDTA-2Na | 0.02 |
| 7 | 벤조페논-9 | 0.04 |
| 8 | 히드록시에틸 셀룰로오스 | 0.10 |
| 9 | 카르복시비닐 폴리머 | 0.20 |
| 10 | 트리에탄올아민 | 0.18 |
| 11 | 옥틸도데칸올 | 0.30 |
| 12 | 옥틸도데세스-16 | 0.40 |
| 13 | 에탄올 | 6.00 |
| 14 | 드라이아이스 추출물 | 5.00 |
| 15 | 방부제, 방향제, 색소 | 미량 |
| 16 | 증류수 | 잔량 |
| 성분 | 중량(%) | |
| 1 | 폴리비닐 알콜 | 15.00 |
| 2 | 셀룰로오스 검 | 0.15 |
| 3 | 글리세린 | 3.00 |
| 4 | PEG 1500 | 2.00 |
| 5 | 시이크데스트린 | 0.15 |
| 6 | DL-판테놀 | 0.30 |
| 7 | 알란토인 | 0.10 |
| 8 | 글리시리진산 모노암모늄 | 0.20 |
| 9 | 니코틴 아미드 | 0.40 |
| 10 | 에탄올 | 5.00 |
| 11 | PEG 40 경화피마자유 | 0.30 |
| 12 | 드라이아이스 추출물 | 1.00 |
| 13 | 방부제, 방향제, 색소 | 미량 |
| 14 | 증류수 | 잔량 |
Claims (8)
- 식물, 과일, 광물, 동물, 및 이로부터 생성되는 분비물 및 대사산물 중에서 선택되는 하나 이상인 천연물의 추출방법으로서, 하기 단계를 포함하는 추출방법:
a) 천연물에 용매 물을 첨가하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 생성물에 드라이아이스를 첨가하여 추출하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 수득된 추출물을 분리하여 여과하는 단계. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 b) 단계에서 수득된 추출물 또는 상기 c) 단계에서 수득된 여과물을 농축하는 d) 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 추출방법. - 삭제
- 제1항에 따라 수득된 추출물을 포함하는 화장품 조성물.
- 제1항에 따라 수득된 추출물을 포함하는 식품 조성물.
- 제1항에 따라 수득된 추출물을 포함하는 의약외품 조성물.
- 제1항에 따라 수득된 추출물을 포함하는 의약품 조성물.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200055124A KR102326592B1 (ko) | 2020-05-08 | 2020-05-08 | 드라이아이스를 이용한 천연물의 추출방법 및 이에 따라 수득된 추출물을 함유하는 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200055124A KR102326592B1 (ko) | 2020-05-08 | 2020-05-08 | 드라이아이스를 이용한 천연물의 추출방법 및 이에 따라 수득된 추출물을 함유하는 조성물 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102326592B1 true KR102326592B1 (ko) | 2021-11-12 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200055124A KR102326592B1 (ko) | 2020-05-08 | 2020-05-08 | 드라이아이스를 이용한 천연물의 추출방법 및 이에 따라 수득된 추출물을 함유하는 조성물 |
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2020
- 2020-05-08 KR KR1020200055124A patent/KR102326592B1/ko active IP Right Grant
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| J301 | Trial decision |
Free format text: TRIAL NUMBER: 2021101001088; TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20210430 Effective date: 20210929 |
|
| GRNO | Decision to grant (after opposition) | ||
| GRNT | Written decision to grant |