KR102011639B1 - 해방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 조성물 - Google Patents

해방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 해방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선용 조성물에 관한 것으로, 추출 용매 및 부위별 해방풍 추출물을 비교한 결과, 해방풍 잎 추출물, 특히 해방풍 잎 에탄올 추출물의 추출수율, 폴리페놀 함량, 플라보노이드 함량, 페놀성 화합물 및 페놀성 배당체의 함량이 우수하고, 해방풍 잎 에탄올 추출물의 항산화 효과, 티로시나아제 활성 억제효과 및 엘라스타아제 활성 억제효과가 해방풍 씨앗 및 뿌리에 비해 우수한 것을 확인하였으므로, 본 발명의 조성물은 항산화, 미백 및 주름개선용 기능성 화장품, 미백 및 주름개선용 건강기능식품 또는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

해방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 조성물{Composition for anti-oxidant, skin whitening and anti-wrinkle effect comprising Glehnia Radix leaf extract as effective component}
본 발명은 해방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선용 조성물에 관한 것이다.
경제 성장에 따라 평균 수명이 증가하면서 미용에 대한 관심이 꾸준히 증가하고 있으며, 노화 방지와 건강 유지를 위한 기능성 생리활성 물질에 대한 연구가 광범위하게 수행되고 있다. 노화는 나이가 들어감에 따라 호르몬 분비 감소, 면역 세포의 기능 및 활성 감소에 따른 피부의 구조와 생리적인 기능 쇠퇴로 인한 내인적 노화(intrinsic aging)와 환경오염, 약물 및 지속적인 자외선 노출에 의한 광노화로 구분된다. 최근 환경오염으로 인해 피부의 자외선 노출이 증가하고 있어 피부 노화에 의한 피부 색소의 침착과 주름이 심해지고 있다.
또한, 생물체는 대사과정 중 생화학 반응과 외부 환경에 의해 인체 내 유해한 활성산소종(reactive oxygen species)이 생성되며, 이는 산화적 스트레스로 작용하여 세포조직의 심각한 손상을 일으키며 염증, 피부 노화 및 암 등 다양한 질환의 원인이 된다. 그러므로 활성 산소종을 제거하는 항산화 활성의 중요성이 강조되고 있으며, 산화적 스트레스 및 피부 노화를 예방 및 개선하기 위한 강력한 항산화 활성, 피부 미백 및 주름개선 효과를 가지는 기능성 소재 개발을 위한 연구가 필요하다.
이에 본 발명은 보다 안전하고 효과적인 항산화, 미백 및 주름개선용 소재를 발견하고자 하였으며, 특히 합성물질의 안정성 문제를 극복할 수 있고, 다양한 생리활성 기능을 가지고 있어 최근 의약품 및 기능성 제품의 원료로 많이 사용되고 있는 천연물 소재에 주목하였다.
한편, 해방풍(Glehnia Radix cum Rhizoma)은 빈방풍 또는 해사삼이라고도 하며, 해변가의 사구에서 자란다. 예로부터 한방에서 결핵성 기침, 두통, 중풍, 신경통 등에 효과가 있다고 하였으며, 기관지염의 예방 및 관절염 치료에도 사용되고 있다. 해방풍에 관한 연구로는 해방풍 추출물이 중추신경계에 미치는 영향 및 항염증 작용, 해방풍의 수용성 추출물 및 유기용매 추출물의 항산화 활성, 해방풍 추출물의 LPS로 유발된 세포의 염증 억제 작용 등이 있으나, 해방풍 잎 추출물의 피부 미백 및 주름개선효과 등 피부의 기능성에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
한편, 한국등록특허 제1764806호에는 석송 및 쇠뜨기 복합추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 주름개선 및 피부 미백용 화장료 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 해방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선용 조성물에 관해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 해방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선용 조성물을 제공하고, 해방풍 부위별 및 용매별 추출물을 비교하여, 해방풍 잎 추출물의 항산화 효과가 해방풍 씨 및 해방풍 뿌리 추출물에 비해 우수하며, 해방풍 잎 에탄올 추출물이 해방풍 잎 물 또는 메탄올 추출물에 비해 항산화 효과가 증진되는 것을 확인하였고, 해방풍 잎 에탄올 추출물이 해방풍 씨앗 또는 뿌리의 에탄올 추출물에 비해 미백 및 주름개선효과가 우수하다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 해방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 해방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 해방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 해방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선용 조성물에 관한 것으로, 추출 용매 및 부위별 해방풍 추출물을 비교한 결과, 해방풍 잎 추출물, 특히 해방풍 잎 에탄올 추출물의 추출수율, 폴리페놀 함량, 플라보노이드 함량, 페놀성 화합물 및 페놀성 배당체의 함량이 우수하고, 해방풍 잎 에탄올 추출물이 해방풍 씨앗 및 뿌리 에탄올 추출물에 비해 증진된 DPPH 라디칼 소거활성, FRAP 활성, 티로시나아제 활성 억제효과 및 엘라스타아제 활성 억제효과를 나타내고, H2O2에 의한 산화적 손상으로부터 세포를 보호하는 효과가 뛰어나므로, 본 발명의 해방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선용 조성물은 항산화, 미백 및 주름개선용 기능성 화장료 조성물, 항산화, 미백 및 주름개선용 건강기능식품 조성물 또는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료를 위한 약학 조성물로 사용할 수 있다.
도 1은 해방풍 부위별 에탄올 추출물의 티로시나아제 저해활성을 확인한 결과이다. 아스코르브산은 양성대조군으로 사용되었고, EL은 해방풍 잎 에탄올 추출물, ES는 해방풍 씨앗 에탄올 추출물, ER은 해방풍 뿌리 에탄올 추출물을 처리한 군이다. 도면의 문자 a 내지 j는 서로 유의미한 차이가 있음을 나타내며, p<0.05이다.
도 2는 해방풍 부위별 에탄올 추출물의 엘라스타아제 저해활성을 확인한 결과이다. 우르솔산은 양성대조군으로 사용되었고, EL은 해방풍 잎 에탄올 추출물, ES는 해방풍 씨앗 에탄올 추출물, ER은 해방풍 뿌리 에탄올 추출물을 처리한 군이다. 도면의 문자 a 내지 j는 서로 유의미한 차이가 있음을 나타내며, p<0.05이다.
도 3은 해방풍 부위별 에탄올 추출물의 세포 독성을 확인한 결과이다. control은 음성대조군이고, EL은 해방풍 잎 에탄올 추출물, ES는 해방풍 씨앗 에탄올 추출물, ER은 해방풍 뿌리 에탄올 추출물을 처리한 군이다. 도면의 문자 a 내지 c는 서로 유의미한 차이가 있음을 나타내며, p<0.05이다.
도 4는 산화적 스트레스 환경에서 해방풍 부위별 에탄올 추출물 처리시 세포보호 정도를 확인한 결과이다. control-는 음성대조군이고, control+는 H2O2를 처리한 양성대조군이고, EL은 H2O2 및 해방풍 잎 에탄올 추출물, ES는 H2O2 및 해방풍 씨앗 에탄올 추출물, ER은 H2O2 및 해방풍 뿌리 에탄올 추출물을 처리한 군이다. 도면의 문자 a 내지 k는 서로 유의미한 차이가 있음을 나타내며, p<0.05이다.
본 발명은 해방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 해방풍 잎 추출물은 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 이용하여 추출한 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 에탄올을 용매로 이용하여 추출하는 것이지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 해방풍 잎 추출물의 티로시나아제 저해 활성 및 엘라스타아제 저해 활성은 해방풍 씨앗 또는 뿌리 추출물에 비해 증진되는 효과가 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 항산화, 미백 및 주름개선용 화장료 조성물은 스킨, 스킨 소프트너, 스킨 토너, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징워터, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더 중에서 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 해방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 해방풍 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "멜라닌 색소 과다 침착(hyperpigmentation)"은 피부 또는 손발톱의 특정 부위에서 멜라닌의 과도한 증가에 의해 다른 부위에 비해 검게 또는 어둡게 되는 것을 의미한다. 상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른흑피증(cyanic melasma), 약물 사용 후의 과다 색소 침착; 찰상, 화상 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착; 또는 임신성 갈색반(gravidic chloasma) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 약학조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있으며, 이러한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학조성물이 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 치료 또는 예방을 위해 적용되는 점을 감안하면, 피부에 국소적으로 도포되어 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며, 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.
본 발명의 약학조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 주사제, 크림, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예 1. 추출 용매 및 부위별 해방풍 추출물의 제조
본 발명에 사용한 해방풍은 경상북도 울진군 농업기술센터로부터 제공받았다. 해방풍 잎, 뿌리 및 씨앗은 각각 분리하여 45℃에서 24시간 건조하였으며, 분쇄기(RT-04, Hanli Co., Sejong, Korea)로 분쇄하여 표준망체(60 mesh, Chung Gye Sang Cong Sa, Seoul, Korea)를 통과시킨 분말을 추출용 시료로 사용하였다.
해방풍 부위별 추출물을 제조하기 위해 해방풍 잎, 뿌리 및 씨앗 각각의 부위별 분말 30g에 고형분 대비 10배(w/v)의 증류수, 70%(v/v) 에탄올 또는 70%(v/v) 메탄올을 첨가하였다. 증류수는 100℃에서 4시간, 70%(v/v) 에탄올 또는 70%(v/v) 메탄올은 80℃에서 4시간 동안 환류냉각추출기(CA-1112, Eyela Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 추출하였고, 각각의 추출물은 불순물을 제거하기 위해 여과지(Whatman No. 2)를 이용하여 여과하였다. 여과된 용액은 감압농축기(Model N-1N, Eyela Co., Tokyo, Japan)로 농축한 다음, 동결건조기(Free Zone 2.5, Labconco Co., Kansas, MO, USA)로 건조하여 -70℃ 이하의 암소에 보관하면서 분석용 시료로 사용하였다.
실시예 1. 추출 용매 및 부위별 해방풍 추출물의 추출 수율, 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 확인
추출 용매 및 부위별 해방풍 추출물의 추출 수율은 동결건조(Free Zone 2.5, Labconco Co.)한 후 건물 중량을 구하였고, 제조예 1의 추출 용매 및 부위별 해방풍 추출물 시료 제조에 사용한 원료 건물량에 대한 백분율로 나타내었다.
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법에 따라 측정하였다. 시료 1㎖와 1 N 폴린 시오칼투 시약(Folin Ciocalteu reagent) 1㎖를 혼합한 다음, 20%(w/v) Na2CO3 1㎖를 첨가하여 실온의 암소에서 30분 동안 반응시킨 후, 분광광도계(Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd., Cambridge, UK)를 이용하여 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 탄닌산(tannic acid, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)을 이용하여 표준곡선을 작성하여 계산하였다.
총 플라보노이드 함량은 Jia 등의 방법을 응용하여 측정하였다. 시료 1㎖와 5%(w/v) NaNO2 150㎕를 실온에서 6분 동안 혼합 및 반응시킨 후, 10%(w/v) AlCl3 300㎕와 혼합하여 다시 실온에서 5분 동안 반응시킨 다음, 1 N NaOH 1㎖와 혼합하여 분광광도계(Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd.)를 이용하여 510nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드함량은 루틴(rutin, Sigma-Aldrich Co.)으로 표준곡선을 작성하여 계산하였다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이 추출 용매 및 부위별 해방풍 추출 수율은 33.20∼59.40%로 해방풍 잎, 뿌리 및 씨앗 순으로 추출 수율이 높게 나타났으며, 그 중 해방풍 잎 에탄올 추출물에서 59.40%로 가장 높은 추출 수율을 나타내었다.
식물에 많이 분포되어 있는 페놀성 물질은 항산화 기능을 갖는 것으로 알려져 있다. 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량은 각각 1.13∼5.34g/100g 및 0.18∼1.26g/100g으로 해방풍 잎, 씨앗 및 뿌리 순으로 높은 함량을 나타내었으며, 해방풍 잎 에탄올 추출물에서 각각 5.34g/100g 및 1.26g/100g으로 가장 높은 함량을 나타냈다.
해방풍 추출 용매 추출 수율
(%)		 총 폴리페놀 함량
(갈릭산, g/100g)		 총 플라보노이드 함량
(루틴, g/100g)
잎 물 41.89±1.05e 3.48±0.11e 0.86±0.02d
에탄올 59.40±0.53a 5.34±0.10a 1.26±0.02a
메탄올 54.24±1.04b 4.81±0.10b 1.15±0.02b
씨앗 물 33.20±0.11h 3.30±0.14fg 0.77±0.05e
에탄올 36.87±0.06f 4.03±0.05c 1.00±0.20c
메탄올 35.33±0.04fg 3.84±0.07d 0.84±0.07d
뿌리 물 45.33±0.04d 1.13±0.28i 0.18±0.01h
에탄올 47.45±0.22c 3.37±0.11ef 0.45±0.02f
메탄올 47.18±0.19c 3.18±0.57h 0.33±0.04g
열 내의 문자 a 내지 i는 서로 유의미한 차이가 있음을 나타내며, p<0.05이다.
실시예 2. 추출 용매 및 부위별 해방풍 추출물의 페놀성 화합물 함량 및 페놀성 배당체 함량 확인
추출 용매 및 부위별 해방풍 추출물의 페놀성 화합물 함량 및 페놀성 배당체 함량은 HPLC(Waters, Milford, MA, USA)를 이용하여 분석하였다. 각각의 시료를 희석하고 실린지 필터(syringe filter, 0.45μm)를 이용하여 여과한 후, HPLC에 10㎕씩 주입하여 분석에 사용하였다. 페놀성 화합물 HPLC 분석 조건은 하기 표 2와 같으며, 표준물질로 클로로겐산(chlorogenic acid), 카페산(caffeic acid) 및 루틴(rutin)을 이용하였다.
페놀성 배당체 HPLC 분석 조건은 하기 표 3과 같으며, 표준물질은 아데노신(adenosine), 베르갑텐(bergapten) 및 임페라토린(imperatorin)을 이용하였다.
페놀성 화합물 HPLC 분석 조건
항목 조건
기기 HPLC(Waters, Milford, MA, USA)
컬럼 Thermo Acclaim PolarAdvantage Ⅱ C18 5㎛ 120Å(4.6×250mm)
이동상(등용매) (A) 1%(v/v) 포름산
(B) 100% 아세토니트릴
시간(min) (A)(%) (B)(%)
0 100 0
10 87 13
20 58.5 41.5
25 30 70
35 90 10
유량 0.5㎖/min
컬럼 온도 30℃
샘플 온도 25℃
주입량 10㎕
검출기 UV 검출기
파장 클로로겐산:322nm
카페산:325nm
루틴:393nm
페놀성 배당체 HPLC 분석 조건
항목 조건
기기 HPLC(Waters, Milford, MA, USA)
컬럼 Thermo Acclaim PolarAdvantage Ⅱ C18 5㎛ 120Å(4.6×250mm)
이동상(등용매) 60%(v/v) 아세토니트릴
유량 1㎖/min
컬럼 온도 30℃
샘플 온도 25℃
주입량 10㎕
검출기 UV 검출기
파장 아데노신:210nm
베르갑텐:254nm
임페라토린:254nm
HPLC 분석결과, 추출 용매 및 부위별 해방풍 추출물의 페놀성 화합물 함량은 표 4와 같다.
클로로겐산은 피부 미백, 피부 노화 방지, 지방 흡수 억제, 정상혈당 유지 및 항암 효능이 있으며, 카페산은 피부 부기완화, 피부 주름예방, 피부 트러블 진정효과, 가려움증완화 및 항산화효능이 있다. 또한, 루틴은 콜라겐 파괴억제, 항염효능, 동맥경화 등의 심장질환예방, 당뇨병 및 비만예방의 효능이 있다.
해방풍 추출 용매 및 부위별 추출물에서 클로로겐산은 1.83∼7.81mg/100g, 카페산은 0.57∼1.70mg/100g, 루틴은 10.37∼35.23mg/100g으로 나타났으나, 해방풍 씨앗에서는 루틴이 검출되지 않았다. 클로로겐산, 카페산 및 루틴은 해방풍 잎 에탄올 추출물에서 각각 7.81mg/100g, 1.70mg/100g 및 35.23mg/100g으로 가장 높은 함량을 나타내었다.
추출 용매 및 부위별 해방풍 추출물의 페놀성 배당체 함량은 표 5와 같다. 아데노신은 주름개선 효과가 탁월하고 사용의 용이성이 우수하여 주름개선 화장품 시장에서 주요 성분으로 관심을 받고 있으며, 그 외에도 피부 미백, 항염, 상처치유 및 면역력 증강 등의 기능성이 있다. 베르갑텐은 항산화 및 항염 효능이 있으며, 임페라토린은 주름개선, 피부 재생 효능 및 항균활성이 있다. 상기의 페놀성 배당체 3종은 주로 식물 및 과일에 함유되어 있는 천연물질로서, 화장품 성분으로 많이 사용되고 있다. 해방풍 부위별 추출물에서 아데노신은 12.25∼27.53mg/100g, 베르갑텐은 4.07∼12.80mg/100g, 임페라토린은 2.30∼12.08mg/100g으로 나타났으며, 페놀성 배당체 3종 모두 해방풍 씨앗에서는 검출되지 않았다.
아데노신(adenosine), 베르갑텐(bergapten) 및 임페라토린(imperatorin)은 해방풍 잎 에탄올 추출물에서 각각 27.53mg/100g, 12.80mg/100g 및 12.08mg/100g으로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 해방풍 잎 및 뿌리 순으로 높은 함량을 나타내었다.
표 4 및 표 5에 나타난 바와 같이 해방풍 부위에 따른 추출물 모두 에탄올에서 페놀화합물이 많이 함유되어 있는 것으로 확인하여, 추후 실험은 해방풍 부위별 에탄올 추출물을 이용하였다.
추출 용매 및 부위별 해방풍 추출물의 페놀성 화합물 함량
해방풍 추출 용매 클로로겐산
(mg/100g)		 카페산
(mg/100g)		 루틴
(mg/100g)
잎 물 2.57±0.08f 1.18±0.37b 10.37±0.09ef
에탄올 7.81±0.36a 1.70±0.15a 35.23±0.57a
메탄올 6.10±0.75b 1.26±0.24b 28.40±0.73b
씨앗 물 2.12±0.09g 0.85±0.27d ND
에탄올 5.52±0.12c 1.02±0.03c ND
메탄올 4.95±0.55cd 0.91±0.11c ND
뿌리 물 1.83±0.49h 0.57±0.30e 11.12±0.08e
에탄올 3.93±0.28e 0.83±0.19d 24.26±0.58c
메탄올 2.49±0.16f 0.60±0.34e 19.22±0.31d
열 내의 문자 a 내지 h는 서로 유의미한 차이가 있음을 나타내며, p<0.05이다. ND(Not detected)는 검출되지 않았음을 의미한다.
추출 용매 및 부위별 해방풍 추출물의 페놀성 배당체 함량
해방풍 추출 용매 아데노신
(mg/100g)		 베르갑텐
(mg/100g)		 임페라토린
(mg/100g)
잎 물 18.69±0.08c 7.22±0.19b 6.37±0.07c
에탄올 27.53±0.84a 12.80±0.00a 12.08±0.01a
메탄올 20.47±0.29b 12.51±0.02a 11.50±0.04a
씨앗 물 ND ND ND
에탄올 ND ND ND
메탄올 ND ND ND
뿌리 물 12.25±0.84e 4.07±0.36d 2.30±0.28e
에탄올 14.54±0.79d 7.26±0.24b 7.70±0.47b
메탄올 12.31±0.59e 7.07±0.32c 5.52±0.19d
열 내의 문자 a 내지 e는 서로 유의미한 차이가 있음을 나타내며, p<0.05이다. ND(Not detected)는 검출되지 않았음을 의미한다.
실시예 3. 부위별 해방풍 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성 및 FRAP 활성 확인
DPPH 라디칼 소거활성은 DPPH(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) 12mg을 99.9% 에탄올 100㎕에 용해하여 DPPH 용액을 제조한 후, 100㎖의 증류수를 첨가하고 517nm 파장에서의 흡광도 값을 약 1.5로 조정하여 실험하였다. 제조예 1의 부위별 해방풍 에탄올 추출물 시료 0.5㎖와 DPPH 용액 5㎖를 혼합하여 실온에서 15분 동안 반응시킨 후, 분광광도계(Ultrospec 2100pro, Biochrom Ltd.)로 흡광도를 측정하고 계산하였다.
FRAP는 Benzie와 Strain의 방법에 따라 측정하였다. FRAP 용액은 25㎖ 아세테이트 용액(acetate buffer, 300mM, pH 3.6), 40mM HCl에 용해한 10mM 2,4,6-트리스(2-피리딜)-s-트리아진(TPTZ, Sigma-Aldrich Co.) 2.5㎖ 및 20mM 염화제2철(ferric chloride, FeCl3) 2.5㎖를 혼합하여 제조한 후, 37℃에서 10분 동안 가온하였다. 시료 30㎕와 제조된 FRAP 용액 900㎕ 및 증류수 90㎕를 혼합한 후 상온에서 30분간 반응시키고, 그 후 분광광도계(Ultraspec 2100pro, Biochrom Ltd.)를 이용하여 510nm에서 흡광도를 측정하였다. FRAP는 FeSO4·7H2O(Sigma-Aldrich Co.)로 표준곡선을 작성하여 계산하였다.
천연물의 항산화 활성은 활성 라디칼에 전자를 공여하고, 식품 중의 지방질 산화를 억제하는 효과가 있다. 인체 내에서는 활성 라디칼에 의한 노화를 억제시키는 역할을 하고 있으며, 라디칼 소거작용은 인체의 질병과 노화를 방지하는데 대단히 중요한 역할을 한다.
해방풍 부위별 추출물 1,000㎍/㎖의 DPPH 라디칼 소거활성 및 FRAP 활성은 표 6에 나타난 바와 같다.
해방풍 부위별 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성은 70.23∼91.82%로 나타났으며, 해방풍 잎 에탄올 추출물에서 91.82%로 가장 높은 소거활성을 나타내었으며, 그 다음으로 씨앗 및 뿌리 순으로 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었다.
해방풍 부위별 추출물의 FRAP 활성은 556.08∼1,389.25μM로 나타났다. 해방풍 잎 에탄올 추출물에서 1,389.25μM로 가장 높은 활성을 나타내었으며, 그 다음으로 씨앗 및 뿌리 순으로 FRAP 활성을 나타내어 DPPH radical 소거활성과 유사한 경향을 나타내었다.
DPPH 라디칼 소거활성 및 FRAP 활성
추출 용매 해방풍 DPPH 라디칼 소거 활성(%) FRAP 활성(μM)
에탄올 잎 91.82±0.09a 1,389.25±0.00a
씨앗 82.41±0.13b 892.80±0.07b
뿌리 70.23±0.21c 556.08±0.02c
열 내의 문자 a 내지 c는 서로 유의미한 차이가 있음을 나타내며, p<0.05이다.
실시예 4. 부위별 해방풍 추출물의 티로시나아제( tyrosinase ) 저해활성 및 엘라스타아제(Elastase) 저해활성 확인
티로시나아제 저해활성 측정은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 반응군은 0.175M 인산나트륨 용액(pH 6.8) 0.5㎖에 10mM L-DOPA를 녹인 기질액 0.2㎖와 제조예 1의 해방풍 부위별 에탄올 추출물 시료용액 0.1㎖을 혼합한 혼합액에 버섯 티로시나아제(110U/㎖) 0.2㎖를 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA 크롬을 475nm에서 측정하였다. 티로시나아제 저해활성은 하기 식 1과 같이 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율을 이용하여 나타내었다.
[식 1]
티로시나아제 저해활성(%)=(1-시료첨가군의 흡광도/무첨가군의 흡광도)×100
엘라스타아제 저해활성 측정은 James 등의 방법에 따라 제조예 1의 해방풍 부위별 에탄올 추출물 시료를 0.2M Tris-Cl 완충용액(pH 8.0)으로 희석배수에 따라 희석하고(10∼1,000㎍/㎖), 희석된 시료 20㎕에 완충용액 200㎕를 가한 다음, 0.8mM N-succinyl-(Ala)3-ρ-nitroanilide 20㎕를 가하였다. 상기 혼합물을 25℃에서 10분간 배양한 다음, 1.0㎍/㎖의 돼지 췌장 엘라스타아제(porcine pancreatic elastase, PPE)를 20㎕씩 첨가하였다. 반응 혼합물은 다시 25℃에서 20분간 배양한 후, 냉침으로 반응을 정지시키고 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 제조예 1의 시료 대신 증류수를 가해 효소의 활성을 측정하였다. 엘라스타아제 저해활성은 하기 식 2와 같이 계산하였다.
[식 2]
엘라스타아제 저해활성(%)= [1-(B-C)/(A-D)]×100
A: 시료 대신 증류수를 넣고 효소를 첨가하여 반응한 후의 흡광도
B: 효소를 첨가하여 반응한 후 시료의 흡광도
C: 효소 대신 증류수를 첨가하여 반응한 후 시료의 흡광도
D: 시료와 효소 대신 각각 증류수를 첨가해 반응한 후의 흡광도
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 해방풍 부위별 에탄올 추출물의 티로시나아제 저해활성은 농도에 비례하여 증가하였으며, 해방풍 잎 에탄올 추출물(EL)의 저해효과가 씨앗 및 뿌리 추출물에 비해 현저히 증진되는 것을 확인하였다.
또한, 도 2에 나타난 바와 같이 해방풍 부위별 에탄올 추출물의 엘라스타아제 저해활성은 농도에 비례하여 증가하였으며, 해방풍 잎 에탄올 추출물(EL)의 저해효과가 씨앗 및 뿌리 추출물에 비해 현저히 증진되는 것을 확인하였다.
실시예 5. 부위별 해방풍 추출물의 세포독성 및 산화적 스트레스에 대한 세포 보호효과 확인
부위별 해방풍 추출물의 세포독성은 인간 폐상피세포주인 L-132 세포를 이용하였다. L-132 세포는 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다.
세포배양은 DMEM 배지(Welgene, Daegu, Korea)를 이용하여 각각 10%(v/v) 소 태아 혈청(fetal bovine serum, Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA), 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, Gibco BRL Co.)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기(MCO-18 AIC, Sanyo Co., Osaka, Japan)에서 배양하였다.
L-132 세포의 세포독성은 MTT 분석방법으로 측정하였으며, 배양된 세포를 96웰 플레이트에 각 웰 당 1×104개/100㎕의 세포수로 접종하여 24시간 배양하고 이후 새로운 배지로 교체하고, 제조예 1의 부위별 해방풍 에탄올 추출물 시료를 농도별로 처리한 다음 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS 완충용액에 녹인 MTT(methyl thiazol-2-YL-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, 5mg/㎖, Sigma-Aldrich Co.) 용액을 각 웰에 10㎕씩 첨가하고 다시 4시간 동안 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 이후 상등액을 완전히 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide, Jensei Chemical Co., Tokyo, Jpan) 100㎕를 각 웰에 첨가하여 10분간 반응시켜 포르마잔(formazan) 결정을 완전히 용해한 다음, 마이크로플레이트 리더(microplate reader, UVM-340, Asys Co., Biochrom, Cambridge, UK)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
L-132 세포를 이용한 세포내 항산화 활성을 통한 세포보호효과는 Hwang의 방법을 응용하여 측정하였다. 배양된 세포를 96웰 플레이트에 각 웰 당 1×104개/100㎕의 세포수로 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 새로운 배지로 교환하고 H2O2(Duksan pure chemicals Co., Ltd., Ansan, Korea) 1mM 및 제조예 1의 부위별 해방풍 추출물 시료를 농도별로 처리한 다음 6시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후, PBS 완충용액에 녹인 MTT 용액을 각 웰에 10㎕씩 첨가하고 2시간 동안 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 이후 상등액을 모두 제거하고 DMSO 100㎕를 각 웰에 첨가하여 10분간 반응시켜 포르마잔 결정을 용해한 다음 마이크로플레이트 리더(microplate reader, UVM-340, Asys Co., Biochrom, Cambridge, UK)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
해방풍 부위별 에탄올 추출물의 L-132 세포에 대한 세포독성 측정결과, 도 3에 나타난 바와 같이 100~1000㎍/㎖까지의 모든 부위별 에탄올 추출물 처리 농도에서 세포 생존율이 90% 이상으로 세포독성이 거의 없음을 확인하였다.
세포내 항산화 활성을 통한 세포보호효과는 세포독성이 나타나지 않은 100~1000㎍/㎖의 농도에서 측정하였으며, 도 4에 나타난 바와 같이 H2O2를 처리하여 산화적 스트레스를 유발한 대조군(control+)의 세포 생존율이 H2O2를 처리하지 않은 음성대조군(control-) 100%를 기준으로 55.00%로 나타난 것에 비해, 제조예 1의 부위별 해방풍 에탄올 추출물을 처리하였을 경우, 시료의 농도에 비례하여 세포 생존율이 증가하는 경향을 확인하였다. 특히 해방풍 잎 에탄올 추출물(EL)에서 산화적 스트레스에 의한 세포보호효과가 우수한 것을 확인하였다.

Claims (6)

  1. 해방풍 잎 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선용 화장료 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 해방풍 잎 에탄올 추출물은 티로시나아제 저해 활성 및 엘라스타아제 저해 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항산화, 미백 및 주름개선용 화장료 조성물.
  4. 해방풍 잎 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 미백 및 주름개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 해방풍 잎 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 멜라닌 색소 과다 침착 질환은 주근깨, 노인성 반점, 간반, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 푸른흑피증(cyanic melasma), 약물 사용 후의 과다 색소 침착; 찰상, 화상 또는 피부염으로 인한 염증 후 과다 색소 침착; 및 임신성 갈색반(gravidic chloasma) 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 멜라닌 색소 과다 침착 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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KR102481239B1 (ko) * 2020-08-11 2022-12-27 청담씨디씨제이앤팜 유한책임회사 세라마이드 생합성을 유도하는 해방풍 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물

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한국미용학회지, 제18권 제4호 (2012), pp. 832-836. 1부.*

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