KR102481239B1 - 세라마이드 생합성을 유도하는 해방풍 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해방풍 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 해방풍 추출물은 세라마이드 생합성을 유도하여 두피를 건강하게 하고, 탈모 방지, 개선 또는 완화 및 육모 촉진 효과를 발휘한다.

Description

세라마이드 생합성을 유도하는 해방풍 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물 {Composition for preventing hair loss and promoting hair growth with Glehnia littoralis extract to induce ceramide biosynthesis}

본 발명은 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것으로, 해방풍 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 모발은 생장기(3년), 퇴행기(3주), 휴지기(3개월)의 성장주기를 가진다. 탈모는 모발이 탈락하는 것을 말하며, 휴지기의 모발이 자연스럽게 탈락되는 자연탈모와 발열성 질병, 임신, 정신적 스트레스 등에 의해 생장기의 모발이 갑자기 휴지기에 들어가 다량 탈락되는 비정상적인 탈모로 구분된다.

모발의 성장은 보통 15~30세 사이에 가장 활발하고, 40~50세에 점진적으로 퇴보되며, 50세 이상이 되면 노화에 의한 자연스러운 탈모가 시작되어 70세 이후부터는 진행이 빨라진다. 모발은 보통 하루에 50~100개 정도로 탈락되어 정상적인 퇴행기 탈모가 일어나는데 이를 초과하여 탈모가 발생할 경우에는 원인과 증상에 따라 탈모를 의심할 수 있다.

남성형 탈모증은 사춘기 이후 비정상적인 탈모 현상을 일으키는 것으로, 연모화, 군모의 단모화, 모공의 위축 등 일종의 탈모 패턴을 형성한다. 남성형 탈모증은 20~30세쯤 주로 발생한다. 5알파 리덕타아제(5α-reductase)는 남성호르몬인 테스토스테론(Testosterone)을 디하이드로테스토스테론(Dehydro testosterone, DHT)으로 변화시키며, 선천적으로 5알파 리덕타아제(5α-reductase)가 부족하면 탈모 발생이 적다.

남성 탈모는 경모가 연모화 되면서 모발 탈락이 발생하는데 반해, 여성은 경모가 연모화 상태에서 멈추는 것이 특징이며, 여성은 탈모를 유발시키는 남성 호르몬인 안드로겐(androgen)보다 여성 호르몬인 에스트로겐(estrogen)을 많이 가지고 있기 때문에 남성들처럼 완전한 대머리가 되지 않는다.

대한민국 등록특허 제10-1359278호(2014.01.28.)에는 해조류 추출물을 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진을 위한 조성물이 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1420913호(2014.07.11.)에는 넓미역 추출물 함유 탈모방지 또는 발모개선용 조성물이 기재되어 있다.

본 발명은 천연 소재를 이용하여 탈모 방지, 개선 또는 완화 및 육모 촉진용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 해방풍(Glehnia littoralis) 추출물을 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 해방풍 추출물은, 바람직하게는 30~70 %(v/v) 에탄올을 이용하여 20~60 ℃에서 120~180 분 추출한 것이 좋다.

본 발명에 있어서, 상기 해방풍 추출물은, 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~30 중량% 포함되는 것이 좋다.

본 발명은 해방풍을 이용하여 탈모 방지, 개선 또는 완화 및 육모 촉진용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 해방풍 추출물을 멀티 라멜라 리포좀 제형으로 제조하여 피부 투과도를 증진 시켜 탈모 방지, 개선 또는 완화 및 육모 촉진 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명의 해방풍 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 세라마이드 생합성을 유도하여 탈모 방지, 개선 또는 완화 및 육모 촉진 효과를 발휘할 수 있다.

도 1은 에탄올 농도별 해방풍 추출물에 포함된 폴리페놀 함량을 분석한 결과 그래프이다.
도 2는 에탄올 농도별 해방풍 추출물에 포함된 플라보노이드 함량을 분석한 결과 그래프이다.
도 3은 추출 온도별 해방풍 추출물에 포함된 폴리페놀 함량을 분석한 결과 그래프이다.
도 4는 추출 온도별 해방풍 추출물에 포함된 플라보노이드 함량을 분석한 결과 그래프이다.
도 5는 추출 시간별 해방풍 추출물에 포함된 폴리페놀 함량을 분석한 결과 그래프이다.
도 6은 추출 시간별 해방풍 추출물에 포함된 플라보노이드 함량을 분석한 결과 그래프이다.
도 7은 해방풍 추출물의 모낭 세포 성장(증식) 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀을 전계방출 투과전자현미경(FE-TEM)으로 관찰한 결과이다.
도 9는 해방풍 추출물과 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀의 제형 안정성을 관찰한 결과이다.
도 10은 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀의 세포독성을 평가한 결과 그래프이다.
도 11은 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀의 NO 생성 억제능을 확인한 결과 그래프이다.
도 12는 skin pampa 시스템과 관련된 사진이다.
도 13은 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀을 포함하는 화장료 조성물 사용에 따른 세라마이드 함량을 비교한 결과이다.
도 14는 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀을 포함하는 화장료 조성물 사용에 따른 디하이드로세라마이드 함량을 비교한 결과이다.
도 15는 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀을 포함하는 화장료 조성물 사용에 따른 Sphingoid base and 1-phosphate 함량을 비교한 결과이다.

피부는 외부로부터 개체를 보호하는 장벽 기능이라는 매우 중요한 역할을 수행한다. 장벽 기능은 화학 물질, 대기오염 물질, 건조한 환경, 자외선 등과 같은 외부로부터의 다양한 자극과 체내수분의 과도한 발산을 막는 보호 기능이다. 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층(Stratum corneum,horney layer)이 정상적으로 형성되어 있을 경우에만 그 기능을 유지할 수 있다.

피부는 조직학적으로 표피(epidermis), 진피(dermis), 피하지방(subcutis)의 3층으로 구성되어 있는데, 이중 가장 외부에 존재함으로써 피부노화의 측면에서 가장 중요한 역할을 하며 이에 따라 피부 미용 면에서도 가장 집중적인 연구의 대상이 되고 있는 것이 바로 표피이다. 표피에서도 최외각층인 각질층을 구성하는 성분은 각질세포와 피부지질이다. 피부지질은 피부의 장벽 기능을 담당하는데, 이와 같은 피부의 장벽기능은 각질의 세포분열과 분화를 조절하여 외부 유해물질로부터 피부를 보호하고 체내 물질의 유출을 방지하며 피부 수분증발을 방지하는 중요한 기능을 한다. 피부장벽기능을 담당하는 주된 지질은 표피의 각화세포(keratinocytes)가 분화되면서 생성되는 지질로서, 이 지질은 분화한 각질세포(corneocytes) 사이의 공간을 채우고 있어서 세포간의 결합력을 부여하는 역할도 하고 있다. 이러한 지질은 주로 세라마이드, 콜레스테롤 및 유리지방산으로 구성되어 있고 이들은 각각 지질층 지질 전체의 약40~65%, 10% 및 25%를 차지하며, 소량의 파이토스핑고신(phytosphingosine), 스핑고신(sphingosine)이 함께 존재한다.

한편, 피부 각질층 내 세라마이드 손실로 인해 피부장벽이 손상될 경우, 장벽 기능 저하로부터 지루성 두피염이나 건선 등이 발생할 수 있으며, 지루성 두피염이나 건선은 증상에 따라 탈모로 이어질 위험이 있다.

이에 본 발명은 해방풍(Glehnia littoralis) 추출물을 포함하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명은 해방풍(Glehnia littoralis)을 인체 두피에 적용하여 세라마이드를 생합성함에 따라 탈모 예방 또는 진행된 탈모증상을 완화시키는 화장료 조성물을 개발하고자 하였다. 본 발명의 해방풍 추출물은 세라마이드를 생합성에 따라 두피의 보습효과, 각질세포간 결합력 강화 등 두피를 건강하게 한다.

해방풍(Glehnia littoralis Fr. Schmidt et Miquel)은 바닷가 모래땅에서 잘 자라는 산형과의 풀로, 한국, 일본, 타이완, 중국 등에 분포한다. 초여름에 흰색의 꽃을 피우며, 뿌리가 주로 화장료 조성물로 사용된다. 해방풍은 부종 또는 피부염 예방 및 치료 효과가 있다고 알려져 있다.

본 발명은 해방풍의 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 효율적으로 추출할 수 있는 추출 조건을 확립하였다. 에탄올 농도, 추출 온도, 추출 시간에 따라 해방풍을 추출한 결과, 30~70 %(v/v) 에탄올을 이용하여 상온(20℃)~60℃에서 120~180분 추출할 경우 해방풍 추출물의 플라보노이드와 폴리페놀을 효율적으로 추출할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 70 %(v/v) 에탄올을 이용하여 60℃에서 120분 추출하는 것이 좋다.

본 발명의 해방풍 추출물은 모낭 세포 증식 효과가 뛰어나 탈모 방지, 개선 또는 완화 효과 및 육모 촉진 효과가 있는 것으로 확인되었다.

한편, 본 발명의 해방풍 추출물을 멀티 라멜라 리포좀에 포집하여 리포좀 제형으로 제조하였다. 제조된 리포좀의 입자는 수십 나노 크기의 구형 입자인 점을 확인하였다. 본 발명의 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀은 해방풍 추출물에 비해 제형 안정성이 우수하여 폴리페놀 포집률이 장기간 유지되는 점을 확인하였다.

한편, 본 발명의 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀은 RAW 264.7 세포에 대하여 10% 농도까지 90 % 이상의 세포생존률을 보였다. 또한, 본 발명의 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀은 NO 생성 억제 효과가 우수하였다.

본 발명의 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀의 피부 투과도를 측정한 결과, 해방풍 추출물에 비해 투과율이 증가하는 점을 확인하였으며, 이에 따라 리포좀 제형으로 적용할 경우 탈모 방지, 개선 또는 완화 효과 및 육모 촉진 효과가 더욱 효과적일 것으로 판단하였다.

한편, 피토스핑고신(phytosphingosine)은 스핑고이드 염기(Sphingoid base)의 일종으로 세라마이드와 같은 스핑고리피드의 기본 구성 물질을 이루는 성분이다. 즉, 피토스핑고신은 세라마이드를 구성하는 스핑고이드의 일종으로, 피토스핑고신에 지방산이 결합하면 세라마이드를 이루게 된다.

본 발명의 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀을 이용하여 헤어 토닉을 제조하고 이를 두피에 적용하여 두피 각질세포 내의 세라마이드, 디하이드로세라마이드, Sphingoid base and 1-phosphate의 함량을 측정한 결과, 도포 전과 비교하여 모두 함량이 증가하는 점을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명의 해방풍 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 세라마이드 생합성을 유도하여 탈모 완화 또는 방지, 육모 촉진 효과가 있음을 확인하였다. 또한 본 발명의 화장료 조성물 이용시 모든 대상자에게서 두피 이상 반응은 관찰되지 않았다.

한편, 본 발명의 해방풍 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 있어서, 상기 해방풍 추출물은, 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~30 중량% 포함되는 것이 좋다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물은, 일 예로, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형 중 선택되는 어느 하나의 기초 화장료 제형; 스킨; 로션; 아이크림; 수딩젤; 연고; 마스크팩용 제형; 바디워시용 제형; 필링젤; 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스; 파운데이션; 스킨커버; 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류 중 선택되는 어느 하나의 색조화장료 제형; 두피용 제형; 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제, 염료 등을 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며, 예컨대 조성물 총 중량에 대해 0.001 내지 30 중량% 이다. 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실라카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 일례로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소리비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

또한 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성부능로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형 또는 비누일 경우에는, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 일례로, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 젤이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

이하, 본 발명에 대해 하기 실시예 및 실험예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 모두 포함한다.

[실시예 1 : 에탄올 농도별 해방풍 추출물의 제조]

해방풍(뿌리) 건조 중량 대비 10배수의 에탄올을 가하여 상온에서 3시간 추출하였다. 에탄올은 각각 0%(v/v), 30%(v/v), 50%(v/v) 및 70%(v/v) 에탄올을 사용하였으며, 추출액을 3,500 rpm 조건으로 10분간 원심분리 후 상층액을 실린지 필터(0.45 ㎛)로 여과하였다.

[실험예 1 : 에탄올 농도별 해방풍 추출물의 폴리페놀, 플라보노이드 함량 분석]

상기 실시예 1에서 제조한 각각의 해방풍 추출물에 포함된 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 분석하였다.

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 법에 따라 추출물 추출물 5 μL에 Folin-Ciocalteau phenol reagent 10 μL 와 증류수 100 μL을 가한 후 3분간 실온에서 혼합하고, 혼합액에 20% Na₂CO₃ 용액을 100 μL 가한 다음 실온에서 1시간 동안 반응 후 spectrophotometer를 이용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid를 25~800 μg/mL 농도 범위로 제조하여 시료와 동일한방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로 부터 시료 추출물의 총 폴리페놀 함량을 산출하였다.

도 1에서 보듯이, 해방풍 추출물에 포함된 폴리페놀 함량은 에탄올 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났으며, 70 %(v/v) 에탄올을 이용하여 추출한 해방풍 추출물에 폴리페놀이 가장 많이 포함되어 있는 것으로 나타났다. 한편, 열수를 이용하여 해방풍을 추출한 경우 폴리페놀 함량은 12.19 mg/g인 것으로 나타났다.

한편, 총 플라보노이드는 Moreno 등의 방법에 따라 추출물 25 μL에 에탄올 75 μL, 증류수 140 μL, 1M 초산칼륨 5 μL 및 10% aluminum nitrate 5 μL를 차례로 가하여 혼합하고 실온에서 40분간 반응 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. Quercetin(Sigma Co., USA)를 표준물질로 하여 1~500 μg/mL의 농도 범위에서 얻어진 표준 검량선으로 부터 추출물의 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.

도 2에서 보듯이, 해방풍 추출물에 포함된 플라보노이드 함량은 에탄올 농도가 증가함에 따라 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타났으며, 70 %(v/v) 에탄올을 이용하여 추출한 해방풍 추출물에 플라보노이드가 가장 많이 포함되어 있는 것으로 나타났다.

[실시예 2 : 추출 온도별 해방풍 추출물의 제조]

해방풍(뿌리) 건조 중량 대비 10배수의 70 %(v/v) 에탄올을 가하여 3시간 추출하였다. 추출 온도는 각각 상온, 40℃, 60℃, 80℃로 하였다. 각각의 추출액을 3,500 rpm 조건으로 10분간 원심분리 후 상층액을 실린지 필터(0.45 ㎛)로 여과하였다.

[실험예 2 : 추출 온도별 해방풍 추출물의 폴리페놀, 플라보노이드 함량 분석]

상기 실시예 2에서 제조한 각각의 해방풍 추출물에 포함된 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 분석하였다. 폴리페놀과 플라보노이드는 상기 실험예 1과 동일하게 분석하였다.

도 3에서 보듯이, 해방풍 추출물에 포함된 폴리페놀 함량은 60℃에서 추출한 해방풍 추출물에 가장 많은 것으로 나타났으며, 도 4에서 보듯이, 해방풍 추출물에 포함된 플라보노이드 함량도 60℃에서 추출한 해방풍 추출물에 가장 많은 것으로 나타났다.

[실시예 3 : 추출 시간별 해방풍 추출물의 제조]

해방풍(뿌리) 건조 중량 대비 10배수의 70 %(v/v) 에탄올을 가하여 추출하였다. 추출 시간은 각각 30분, 60분, 120분, 180분으로 하였다. 각각의 추출액을 3,500 rpm 조건으로 10분간 원심분리 후 상층액을 실린지 필터(0.45 ㎛)로 여과하였다.

[실험예 3 : 추출 시간별 해방풍 추출물의 폴리페놀, 플라보노이드 함량 분석]

상기 실시예 3에서 제조한 각각의 해방풍 추출물에 포함된 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 분석하였다. 폴리페놀과 플라보노이드는 상기 실험예 1과 동일하게 분석하였다.

도 5에서 보듯이, 해방풍 추출물에 포함된 폴리페놀 함량은 120분 추출한 해방풍 추출물에 가장 많은 것으로 나타났으며, 180분 추출한 해방풍 추출물에도 비교적 다량의 폴리페놀이 포함되어 있었다. 또한, 도 6에서 보듯이, 해방풍 추출물에 포함된 플라보노이드 함량은 120분 추출한 해방풍 추출물에 가장 많은 것으로 나타났으며, 180분 추출한 해방풍 추출물에도 비교적 다량의 플라보노이드가 포함되어 있었다.

[실험예 4 : 최적 추출 조건에 따른 해방풍 추출물의 폴리페놀 함량 분석]

상기 실험 결과를 종합하여, 해방풍 추출물은 70 %(v/v) 에탄올을 이용하여 60 ℃에서 120분 추출할 경우 폴리페놀이 가장 많이 포함될 것으로 판단되었다.

상기 추출 조건에 따라 추출한 해방풍 추출물의 폴리페놀 함량을 상기 실험예 1과 동일하게 분석한 결과, 총 폴리페놀 함량은 19.88 mg/g으로 나타났다.

[실험예 5 : 해방풍 추출물의 모낭 세포 성장 효능 평가]

본 실험에서는 70 %(v/v) 에탄올을 이용하여 60 ℃에서 120분 추출하여 제조한 해방풍 추출물의 모낭 세포 성장 효능을 평가하였다. 대조군으로는 추출용매로 증류수를 사용하고, 이외의 추출 조건은 동일하게 하였다.

모낭에서의 모유두 진피 세포(dermal papilla cell)는 모낭의 형성, 재생 및 모발의 성장에서 중요한 역할을 한다. 특히 모발주기에서 성장기로의 유도 및 유지에 모유두 진피 세포의 성장 증식이 필요하다. 본 실험에서는 Human hair follicle dermal papilla cells을 사용하여 실험하였다.

Dulbecco's Modifide Eagle's Medium(DMEM) 배지를 사용하여 37℃, 5%, CO₂ 항온기에서 배양하고 3일에 한번 씩 계대하여 필요한 세포주를 확보하였다. 모유두 진피 세포를 5ⅹ10³ cells/ml을 96 well plate에 넣고 24시간 배양 후 serum free DMEM 배지로 교환하여 다시 24시간 배양한 다음 시료를 농도별로 처리하였다. 이를 72시간 동안 배양한 후 WST assay로 측정하였다.

실험 결과를 도 7에 나타내었다. 시료 미처리군에 비하여 모든 시료에서 모낭 세포의 증식이 관찰되었으나, 대조군에 비해 본 발명의 70 %(v/v) 에탄올 해방풍 추출물은 농도 의존적으로 모낭 세포의 증식이 이루어지는 점을 확인할 수 있었다. 대조군(열수 추출)은 미처리군에 비해 121 % 이상 증식하는 반면, 본 발명의 70 %(v/v) 에탄올 해방풍 추출물 미처리군에 비해 167 % 이상 증식하는 점을 확인하였다. 특히, 70 %(v/v) 에탄올 해방풍 추출물을 100 ㎍/㎖ 처리할 경우 모낭 세포의 증식이 가장 효과적으로 나타나는 점을 확인하였다.

[실시예 4 : 해방풍 추출물을 함유하는 멀티 라멜라 리포좀 제조]

상기 실험 결과에 따라, 폴리페놀이 가장 많이 함유된 해방풍 추출물을 이용하여 멀티 라멜라 리포좀을 제조하였다. 해방풍 추출물은 해방풍(뿌리)을 70 %(v/v) 에탄올을 이용하여 60 ℃에서 120분 추출하여 제조하였다.

뱅함법(Bangham method, BM)을 응용하여 해방풍 추출물을 함유하는 리포좀을 제조하였다. 뱅함법은 레시틴을 지용성 성분을 함유한 유기용매에 녹여 교반하고 감압농축기로 감압 조건으로 건조하여 플라스크의 내부에 지질 막(lipid film)이 형성되도록 하고, 수용성 성분을 녹인 증류수 또는 버퍼(buffer) 용액으로 수화한 후 균질화하여 리포좀을 제조하는 방법이다.

리포좀 제조에 사용된 인지질은 대두(soybean)에서 추출한 지질을 수소 첨가시켜 불포화 성분을 제거한 레시틴으로 포스파티딜콜린(phosphatidyl choline) 성분이 95 %이상인 Emulmetik 950 (Lucas Meyer사)을 사용하였다. 인지질과 소듐디옥시콜레이트(sodium deoxycholate)를 9:1 비율로 혼합한 후 동량의 에탄올을 첨가하여 60 ℃ 항온조에서 완전히 용해시켜 투명한 졸 용액을 만들었다. 이를 상온에서 굳힌 후 다시 60 ℃ 항온조에 가져가 투명한 졸 용액이 되면 해방풍 추출물을 넣고 10 분 이상 자석 교반시켰다. 감압농축기로 50 ℃에서 감압 조건으로 플라스크 내부에 지질막(lipid film)이 형성되도록 완전히 건조하였다. 지질막에 증류수를 첨가하여 수화한 후 homogenizing 2000 rpm, 10 분 동안 균질화하여 최종 인지질 함량 2 %의 멀티 라멜라 리포좀을 완성하였다.

제조한 리포좀을 전계방출 투과전자현미경(FE-TEM)으로 입자의 크기와 형태를 관찰하였다. 완성된 리포좀 제형의 입자를 TEM으로 확인한 결과, 도 8에서 보듯이, 수십 나노 크기의 구형 입자를 확인할 수 있다.

[실험예 6 : 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀의 폴리페놀 포집률 측정]

본 실험에서는 상기 실시예 4에서 제조한 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀의 폴리페놀 포집률을 측정하였다.

완성된 리포좀 현탁액에서 1 mL을 취하여 sephadex G-50 컬럼을 이용하여 포집되지 않은 폴리페놀을 제거하였다. 그 후 과량의 에탄올을 첨가하여 리포좀의 막을 파괴시킨 후 에탄올을 감압 농축기를 이용하여 증발시켰다. 에탄올 1 mL을 넣어서 용해하여 리포좀에 포집된 폴리페놀의 함량을 측정하고 초기 추출물의 폴리페놀 함량 용해액의 폴리페놀의 함량 측정하여 포집 효율을 확인하였다. 포집 효율은 폴리페놀의 함량 값을 다음에 나타난 식에 대입하여 리포좀의 포집 효율을 계산하였다.

▶ 포집 효율(%) = {(리포좀에 포집된 폴리페놀 함량)/(초기 추출물의 폴리페놀 함량)} × 100

초기 추출물의 폴리페놀 함량은 14.82 ㎎/㎖이며, 리포좀에 포집된 폴리페놀 함량은 11.91 ㎎/㎖로, 리포좀 포집률은 80.36 %로 계산되었다.

[실험예 7 : 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀의 안정성 시험]

본 실험에서는 상기 실시예 4에서 제조한 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀의 안정성을 시험하였다.

리포좀의 안정성을 확인하기 위해 70 %(v/v) 에탄올을 이용하여 60 ℃에서 120분 추출하여 제조한 해방풍 추출물과, 상기 실시예 4에서 제조한 해방풍 추출물을 포함하는 리포좀을 각각 보관 튜브에 차광하여 45℃에서 보관하며 3달간 안정성을 확인하였다. 안정성 시험은 sephadex G-50 컬럼을 이용하여 포집되지 않은 폴리페놀을 제거하고, 리포좀에 포집된 폴리페놀 함량과 해방풍 추출물의 폴리페놀 함량을 비교하여 리포좀의 안정성을 확인하였다.

도 9에서 보듯이, 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀은 폴리페놀 포집률이 99 % 이상으로, 제형 변화 없이 안정적으로 유지되는 점을 확인하였다. 반면, 해방풍 추출물은 시간의 경과에 따라 점차 감소하는 경향을 보였다.

[실험예 8 : 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀의 세포독성 평가]

본 실험에서는 상기 실시예 4에서 제조한 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀의 세포독성을 평가하였다.

RAW 264.7 세포에서 리포좀의 세포독성을 조사하기 위해 0.5 % ~ 10 % 농도로 세포 배양액에 처리하여 24시간 배양한 후 MTT assay를 실시하였다. 도 10에서 보듯이, 리포좀을 다양한 농도로 세포에 처리한 결과 리포좀 10% 농도까지 90 % 이상의 세포생존률을 확인하였다.

[실험예 9 : 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀의 NO 생성 억제능 측정]

본 실험에서는 상기 실시예 4에서 제조한 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀의 NO 생성 억제능을 측정하였다.

NO의 농도는 배양액 내의 NO농도를 griess reagent system을 이용하여 측정하였으며, RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1.5×10⁵ cells/well로 분주하여 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체한 후 리포좀을 다양한 농도로 처리하였고 LPS 1μg/ml의 농도를 처리하여 다시 24 시간 배양하였다. 배양액 100 μl에 N1 buffer 50 μl를 각 well에 처리하여 10 분간 상온에서 반응 한 후, N2 buffer 50 μl를 각 well에 처리하고 10 분간 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였고, Nitrite standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.

도 11에서 보듯이, 대조군인 LPS 처리군과 비교하여 본 발명의 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀을 처리한 경우 NO 생성이 감소하는 점을 확인하였으며, 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀의 농도가 증가함에 따라 NO 생성이 감소하는 경향을 나타내는 점을 확인하였다.

[실험예 10 : 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀의 피부 투과도 측정]

본 실험에서는 해방풍 추출물(70 %(v/v) 에탄올을 이용하여 60 ℃에서 120분 추출하여 제조한 해방풍 추출물)을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀의 피부 투과도를 측정하고자 하였다.

피부 투과도 실험은 skin pampa 시스템(도 12)을 이용하여 진행하였다. 프리즈마 버퍼(prisma buffer)로 블랭크(blank)를 준비하고 분석(reading)하였다. Deep well plate에 샘플을 준비하는 과정으로, deep well plate에 프리즈마 버퍼(prisma buffer) 1,000㎕를 pH-map에 따라 넣고, 스톡 플레이트(stock plate)의 뚜껑을 열고 8 channel pipette을 이용하여 샘플을 5㎕ 취하여 deep well plate로 옮겼다. 그 후, pipette을 500㎕로 맞춘 후 4~6번 섞고, 솔루션(Solution)의 농도를 측정하거나 계산하여 에세이(asaay)의 <reference>로써 결과를 이용하였다.

스킨 테스트 에세이(skin test assay)를 위해 도너 플레이트(donor plate)를 준비하는 과정으로, deep well plate로부터 샘플 용액(sample solution) 200㎕를 도너판(donor plate)을 옮기고, 뚜껑을 덮었다. 이때, PAMPA 샌드위치(PAMPA sandwich)의 상판(top plate)은 어셉터 플레이트(acceptor plate)이고, PAMPA 샌드위치(PAMPA sandwich)의 하판(bottom plate)은 도너판(donor plate)이다.

어셉터 플레이트(acceptor plate)와 PAMPA 샌드위치를 준비하는 과정으로, 8 channel pipette을 200㎕로 맞추고, 웰(Well)을 수화(hydration)하고 도너 플레이트(donor plate)의 에세이(assay)를 준비한 후, 상판(top plate)을 수화 용액 저장고(hydration solution reservoir)로부터 서포트 플레이트(support plate)로 옮겼다. 그리고 어셉터 플레이트(acceptor plate)의 각 웰(well)에 pH 7.4의 프리즈마 버퍼(prisma buffer) 200㎕를 넣고, 도너 플레이트(donor plate)의 뚜껑을 벗긴 후, 버블(bubble)이 생기지 않게 주의하면서 acceptor plate bottom row(H)부터 도너 플레이트(donor plate) 위에 천천히 올려놓았다. 이 때, 샌드위치(sandwich)가만들어지고 나면 어셉터 플레이트(acceptor plate) 위에 뚜껑을 덮고, 스킨 멤브레인(skin membrane)이 마르는 것을 방지하기 위하여 4~5분 이내에 끝내고 실험을 시작하여야 한다. 그리고 증발을 최소화하기 위하여 높은 상대 습도를 유지하기 위한 젖은 스펀지가 있는 습도 챔버(humidity chamber)나 gut-box에 샌드위치(sandwich)를 놓되, 샌드위치 플레이트(sandwich plate)은 절대로 기울이면 안 된다. 그리고 RT에서 5hr 동안 휘젓지 않은 상태로 배양(incubation)하였다.

다음으로 도너(Donor)/어셉터(acceptor) 분석(reading)하는 과정으로서, 배양(incubation)을 끝내고, 습도 챔버(humidity chamber)로부터 PAMPA 샌드위치(PAMPA sandwich)를 꺼낸 후 덮개(lid)를 열고 8 channel pipettor를 이용하여 어셉터 판(acceptor plate)으로부터 150㎕ 씩 UV 플레이트(UV plate)으로 옮긴 후 스펙트로포토미터(spectrophotometer)에서 250~498nm 범위로 설정하고 분석(reading)하였다

해방풍 추출물과 멀티라멜라 리포좀 제형의 투과도를 확인하고자, 피부 투과 전 후 폴리페놀 함량을 비교하였다. 아래 표 1에서 보듯이, 해방풍 추출물의 투과율은 1.68 %, 리포좀의 투과율은 2.80 %로 리포좀 제형의 투과율이 약 1.67배 증가하는 점을 확인하였으며, 이는 해방풍 추출물(리포좀 제형이 아닌)에 비해 투과도가 66 %이상 증가한 것으로 판단되었다.

	폴리페놀 함량 (㎍/㎖)		투과율 (%)
	투과 전	투과 후
해방풍 추출물	13544	228	1.68 %
해방풍 추출물을 함유하는 멀티 라멜라 리포좀	12197	341	2.80 %

[제조예 1~3 : 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀을 이용한 헤어 토닉]

해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀을 이용하여 헤어 토닉을 제조하였다.

아래 표 2의 A상을 비커에 칭량하여 아지믹서로 20분간 용해하였다. 용해 중에 B상을 50도씨로 가열하여 완전히 녹인 뒤, 온도가 상온으로 내려가면 C상을 첨가하였다. B상과 C상이 완전히 혼합되면 A상에 모두 첨가하여 아지믹서로 10분간 혼합하였다.

	원료명	함량(%)
A	정제수	73.03	64.03	64.83
	부틸렌글라이콜	3.00	4.00	3.00
	글리세린	5.00	3.00	3.00
	파이토스핑고신(1%)	2.00	2.00	2.00
	덱스판테놀	0.5	0.5	0.5
	흑미강추출물	1.00	1.00	1.00
	소듐파이테이트	0.10	0.10	0.10
	아질산나트륨	0.20	0.20	0.20
B	에탄올	10.00	20.00	20.00
	피이지-40 하이드로제네이티드 캐스터오일	1.50	1.50	1.50
	페퍼민트오일	0.10	0.30	0.30
	L-멘톨	0.30	0.10	0.30
	살리실산	0.25	0.25	0.25
C	해방풍 함유 리포좀	2.00	2.00	2.00
	1,2-헥산다이올	1.00	1.00	1.00
	에칠헥실글리세린	0.02	0.02	0.02
합계		100.00	100.00	100.00
		제조예 1	제조예 2	제조예 3

상기 제조예 1 내지 3에 따라 제조된 헤어 토닉의 사용감 테스트 결과, 제조예 3의 사용감이 가장 시원하고, 끈적임이 적었다.

[제조예 4~6 : 해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀을 이용한 샴푸]

해방풍 추출물을 포함하는 멀티 라멜라 리포좀을 이용하여 샴푸를 제조하였다.

아래 표 3의 B상을 비커에 칭량하여 아지믹서로 20분간 완전히 용해시켰다. 그 후 B상에 A상의 원료를 칭량하여 80도씨에서 1시간 동안 가열하여 완전히 용해시켰다. 이를 상온까지 냉각시켜 C상의 원료를 투입하여 서서히 용해시켰다.

	원료명	함량(%)
A	정제수	31.08	43	33.1
	라우릴글루코사이드	10.00	5.00	10.00
	코코글루코사이드	20.00	10.00	20.00
	데실글루코사이드	10.00	15.00	10.00
	소듐코코암포아세테이트	10.00	10.00	10.00
	글리세린	2.00	2.00	2.00
	꿀	1.00	1.00	1.00
	카렌듈라꽃추출물	1.00	1.00	1.00
	글리세릴카프릴레이트	0.50	0.50	0.50
B	흑미강추출물	10.00	10.00	10.00
	구아하이드록시프로필트라이모늄클로라이드	0.30	0.30	0.20
C	씨트릭애씨드	1.10	1.10	1.10
	해방풍 함유 리포좀	2.00	0.60	0.60
	1,2-헥산다이올	1.00	0.50	0.50
	에칠헥실글리세린	0.02	0.00	0.00
					합계		100.00	100.00	100.00
제조예 4	제조예 5	제조예 6

상기 제조예 4 내지 6에 따라 제조된 샴푸의 사용감 테스트 결과, 제조예 5가 거품 발생 정도가 좋고, 부드러운 촉감이 우수하며, 두피 각질 제거 및 보습 효과가 좋아 사용감이 가장 우수한 것으로 나타났다.

[실험예 11 : 본 발명의 해방풍 추출물을 이용한 화장료 조성물의 인체 두피 적용]

본 실험에서는 상기 제조예 3을 인체 두피에 적용하여 탈모 완화 효과를 관찰하고자 하였다.

(1) 인체 두피 각질 채취

대상자는 Basic and specific (BASP) 분류에 의해 basic type은 M2, C2 또는 U1 이상, specific type 은 V1 또는 F1 이상으로 진단된 18~54 세의 안드로겐성 탈모증 여성 및 남성 지원자를 대상으로 통계적 비교 분석이 가능한 유효 데이터를 확보할 수 있도록 총 5명을 선정하였다. 실험은 4주동안 이루어졌으며, 이중맹검 및 무작위 배정에 따라 시험제품을 사용할 그룹과 대조제품을 사용 할 그룹을 지정하여 4주간 1일 1회 (저녁) 두피 전체에 사용하도록 하였다. 또한, 시험제품이 헤어토닉인 특성상 본 연구기간 동안 측정부위 및 탈모 증상 완화에 영향이 없는 일반 샴푸 및 린스만을 사용하도록 제한 하였다.

유효성 평가는 제품 사용 전과 제품 사용 전(0 주) 및 4주 후 시점에서 전두부를 0.5x0.5cm의 넓이로 삭모한 후, 피부 각질 채취용 테이프를 이용하여 두피의 각질을 각각 채취하여 실험하였다. 채취한 테이프를 800 ㎕ 클로로포름과 400 ㎕의 메탄올 그리고 0.1 M의 염산 300 ㎕가 담겨있는 튜브에 넣고 30분간 추출 후 원심분리를 통하여 클로로포름 층을 새로운 튜브로 옮기고 진공농축기를 이용하여 건조하였다. 50 또는 100 ㎕의 메탄올에 재용해하여 LC-MS를 이용하여 스핑고지질 대사체인 세라마이드, 파이토스핑고신 및 파이토스핑고신 일인산을 분석하였다.

(2) 스핑고지질 대사체 분석

채취한 두피의 각질 세포를 모아 lysis 시킨 후 단백질 정량하여 100 ㎍에 해당하는 lysate에 400 ㎕ 메탄올, 0.1 M 염산 300 ㎕ 그리고 800 ㎕ 클로로포름을 넣고 30분 동안 추출 후 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 클로로포름층을 새로운 튜브로 회수하여 진공원심분리 농축기를 사용하여 건조 후 100 ㎕ 메탄올에 재용해하여 LC-MS/MS 분석을 하였다.

LC-MS/MS 분석 조건은 이동상 A: 2 mM ammonium formate in DI (1% formic acid), B: 1 mM ammonium formate in methanol (1% formic acid)을 사용하여 gradient 조건에서 0.3 mL/min 유속으로 분리하였다. Kintex C18 (100 x 2.1 mm, 2.6 μm) 컬럼을 사용하였으며 스핑고지질은 selected reaction monitoring (SRM) 모드를 사용하여 스핑고지질을 검출하였다. 이온화 조건은 ESI voltage 3.5 kV, Capillary 온도는 300 ℃이다. 표준용액으로는 N-acyl chain length에 따른 각각의 스핑고지질 표준품을 0.00781 ~ 1 μM 농도로 제조하여 검정곡선 작성에 사용하였다. 각 시료와 표준품에 100 pmol의 d18:1/C18:0-d7 첨가하여 내부표준물질로 사용하였다. 세라마이드 분석을 위한 그래디언트(gradient) 조건은 아래 표 4와 같다.

Time (min)	A (%)	B (%)
0	10	90
6	0	100
18	0	100
18.5	10	90
20	10	90

(3) 스핑고지질 대사체 분석 결과

채취한 두피의 각질세포내 세라마이드 함량을 분석한 결과, 도 13에서 보듯이, 모든 실험군에서 세라마이드 함량이 도포전과 비교하여 도포 4주 후에 유의적으로 증가한 것을 확인하였다. 총 세라마이드의 함량 또한 유의적으로 증가하는 결과를 보였다.

또한, 채취한 두피의 각질세포내 디하이드로세라마이드(Dihydroceramide) 함량을 분석한 결과, 도 14에서 보듯이, 모든 실험군에서 디하이드로세라마이드 함량이 도포전과 비교하여 도포 4주 후에 유의적으로 증가한 것을 확인하였다. 총 디하이드로세라마이드의 함량 또한 유의적으로 증가하는 결과를 보였다.

또한, 채취한 두피의 각질세포내 스핑고이드 염기(Sphingoid bases)와 일인산염(1-phosphate) 함량을 분석한 결과, 도 15에서 보듯이, 모든 실험군에서 Sphingoid bases and 1-phosphate 함량이 도포전과 비교하여 도포 4주 후에 유의적으로 증가한 것을 확인하였다. 총 Sphingoid bases and 1-phosphate의 함량 또한 유의적으로 증가하는 결과를 보였다.

이에 따라, 본 발명의 해방풍 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 세라마이드 생합성을 유도하여 탈모 완화 또는 방지, 육모 촉진 효과가 있음을 확인하였다. 또한 본 발명의 화장료 조성물 이용시 모든 대상자에게서 두피 이상 반응은 관찰되지 않았다.

Claims (3)

1. 해방풍(Glehnia littoralis) 추출물이 포집된 멀티 라멜라 리포좀을 포함하며,
   상기 해방풍 추출물은 30~70 %(v/v) 에탄올을 이용하여 40~60 ℃에서 120~180 분 추출한 것으로 모낭 세포 증식 효과가 있으며,
   상기 멀티 라멜라 리포좀은 세라마이드 생합성을 유도하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 화장료 조성물.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 해방풍 추출물은,
   화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~30 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 육모 촉진용 화장료 조성물.
   

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