KR102229902B1

KR102229902B1 - 페놀성화합물을 유효성분으로 하는 혼합 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102229902B1
Application number: KR1020190092744A
Authority: KR
Inventors: 이태범; 유병완; 김지효; 소양강; 황지영; 김세율
Original assignee: 재단법인 남원시화장품산업지원센터
Priority date: 2019-07-30
Filing date: 2019-07-30
Publication date: 2021-03-19
Also published as: KR20210014839A

Abstract

본 발명은 페놀성화합물을 유효성분으로 하는 혼합 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 페놀성화합물을 유효성분으로 하는 혼합 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물에 있어서, 상기 혼합 추출물은 레몬그라스 추출물 및 자소엽 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

Description

페놀성화합물을 유효성분으로 하는 혼합 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물{A skin hydration and skin barrier improvement cosmetic composition comprising a mixed extract containing an active ingredient of a phenolic compound}

본 발명은 페놀성화합물을 유효성분으로 하는 혼합 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 페놀성화합물을 유효성분으로 하고 히알루론산 생성능을 가지는 추출물을 포함하는 혼합 추출물을 함유함으로써 피부 보습 및 피부 장벽 개선 효과가 보다 효과적인 페놀성화합물을 유효성분으로 하는 혼합 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 체내 수분을 보유하고 외부인자의 침입으로부터 내부를 보호하는 필수적인 장벽 기능을 수행하면서 면역반응을 나타내는 대표적 장기이다.

여기서 피부보습을 유지하는 대표적인 인자인 히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 콜라겐, 엘라스틴과 함께 피부 3대 요소가운데 하나로, 친수성이 강해 물과 결합하여 겔을 형성하는 성질이 있어 피부 수분 유지에 중요한 역할을 하는 천연 보습제로 알려져 있다.

따라서 히알루론산의 합성을 유도하거나 분해를 억제하는 물질은 피부 보습과 노화 방지에 효과적이며, 특히 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase, HAS) 중 HAS2와 HAS3는 히알루론산 합성에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 최근 HAS의 유전자 발현 증가를 통해 히알루론산의 생산을 촉진시키고자 하는 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

또한, 필라그린(filaggrin)은 분해과정을 통해 pyrrocarboxylic acid나 trans-urocanic acid 등과 같은 천연보습인자(natural moisturizing factors, NMFs)를 형성하여 피부 보습에 중요한 역할을 수행함은 물론, 각질층 pH의 정상화, 항염작용 등도 수행한다. 이외에도 피부보습에 관련된 인자로서, aquaporin 3(AQP3)는 세포내외의 물과 글리세롤의 이동에 관여한다고 알려져 있다. 그리고 인간 표피각질형성세포는 세포막에 AQP3를 발현하고 있고, AQP3 넉아웃 마우스는 피부보습, 피부보호막손상, 상처치유능 저하 등의 피부문제를 나타내고 있다고 알려져 있다.

피부 중 표피층은 매우 복잡하고 역동적이며 자기재생적인 피부장벽으로 인체의 조직 가운데에서도 가장 역동적인 기관으로 끊임없는 표피세포의 형성, 분화 및 탈각과정이 끊임없이 반복되면서 표피의 항상성을 유지한다.

표피의 주요구성세포는 각질형성세포로 분화정도에 따라 각질층, 과립층, 유극층, 기저층 4개로 나뉘는데 분화과정에 따라 유전자의 발현이 다르게 나타난다. 기저층에서는 keratin 5와 14가 발현되는데 분화과정으로 이행하면 발현이 중단된다. 유극층에서는 keratin 1과 10이 합성되며, 유극층 및 과립층에서는 각질세포막 연관 단백질인 involucrin, loricrin, envoplakin 등이 합성되며, 과립층의 세포내에 존재하는 keratohyalin granule 안에 있는 profilaggrin은 filaggrin의 전구체로서 과립층의 세포가 각질층으로 이동하면서 filaggrin으로 변하게 된다. 또한, 피부보습과 표피분화에 핵심적인 역할을 한다고 알려진 단백질은 nuclear hormone receptor중에 하나인 PPAR-α에 의해 조절된다고 알려져 있다.

한편, 레몬그라스(Cymbopogon citratus (DC.) Stapf)는 볏과(Poaceae)의 여러해살이풀로 레몬향기가 나고 근육이완, 진통, 해열, 스트레스 조절 효과로 인하여 동서양에서 널리 섭취해 오고 있는 허브중의 하나이며 항산화, 항염증, 항균의 효과가 있다고 보고되고 있고, 자소엽(Perilla frutescens var. acuta (Odash.) Kudo)은 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 한 해살이 풀로써 차즈기 또는 차조기로 알려져 있으며 예로부터 발한, 해열, 기관지염, 위장염 등에 사용되어 왔으며 항산화, 항염, 항균 효과가 우수하다고 알려져 있다.

이와 같이 자소엽과 레몬그라스의 다양한 효능에도 불구하고 피부보습과 피부장벽에 대한 연구는 보고된 바 없다.

따라서, 본 발명에서는 남원 자원식물인 레몬그라스, 자소엽 등의 추출물이 피부보습과 피부장벽 개선에 효능을 나타내는 것을 확인하였고, 이에 상기 추출물을 이용하여 피부보습 및 피부장벽 개선 효과를 가지는 화장료 조성물을 개발하고자 한다.

상기와 같은 문제를 해결하고자, 본 발명은 페놀성화합물을 유효성분으로 하고 히알루론산 생성능을 가지는 추출물을 포함하는 혼합 추출물을 함유함으로써 피부 보습 및 피부 장벽 개선 효과가 보다 효과적인 페놀성화합물을 유효성분으로 하는 혼합 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물을 제공하는데 목적이 있다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 실시예에 따른 페놀성화합물을 유효성분으로 하는 혼합 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물은 페놀성화합물을 유효성분으로 하는 혼합 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물에 있어서, 상기 혼합 추출물은 레몬그라스 추출물 및 자소엽 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

여기서, 상기 레몬그라스 추출물은 Cholrogenic acid 및 p-Coumaric acid을 함유하고 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 자소엽 추출물은 Rosmarinic acid 및 Caffeic acid을 함유하고 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 레몬그라스 및 자소엽 추출물은 레몬그라스 및 자소엽을 각각 물 또는 유기용매 중 하나를 용매로 하여 추출한 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 혼합 추출물은 레몬그라스 추출물 및 자소엽 추출물을 1 내지 2 : 1 내지 2의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 혼합 추출물은 곤달비 추출물 및 산구절초 추출물을 더 포함할 수 있다.

이러한 상기 화장료 조성물은 유액, 크림, 화장수, 에센스, 팩, 현탁액, 페이스트, 젤, 파우더, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 로션, 연고, 겔, 패취, 미용액, 클렌징 폼, 클렌징 크림, 클렌징 워터, 비누, 샴푸, 린스, 분무제의 제형인 것을 특징으로 한다.

상기와 같은 본 발명의 실시예에 따른 페놀성화합물을 유효성분으로 하는 혼합 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물은 페놀성화합물을 유효성분으로 하고 히알루론산 생성능을 가지는 추출물을 포함하는 혼합 추출물을 함유함으로써, 추출물간의 보완 작용으로 피부 보습 및 피부 장벽 개선 효과가 보다 효과적일 수 있다.

도 1의 (a) 및 (b)는 레몬그라스 추출물을 제조한 제조예 1 및 2와 자소엽 추출물을 제조한 제조예 3 및 4의 세포 생존율을 측정한 그래프.
도 2는 제조예 1 내지 4의 히알루론산 생성능을 측정한 그래프.
도 3의 (a) 내지 (c)는 액체크로마토그래피로 분선한 혼합표준품의 크로마토그램(표준데이터), 제조예 2의 크로마토그램 및 제조예 4의 크로마토그램.
도 4의 (a) 내지 (d)는 HaCaT 세포에서 제조예 2 및 4의 농도에 따른 HAS1, HAS2, HAS3 및 AQP3의 발현 정도를 측정한 그래프.
도 5의 (a) 및 (b)는 HaCaT 세포에서 제조예 2 및 4의 농도에 따른 Fillagrin 및 Loricrin의 발현 정도를 측정한 그래프.
도 6의 (a) 및 (b)는 HaCaT 세포에서 제조예 2 및 4의 농도에 따른 PPAR-α의 발현 정도를 실험한 결과 사진 및 페놀성화합물에 따른 PPAR-α의 발현 정도를 실험한 결과 사진.
도 7의 (a) 및 (b)는 제조예 1, 3, 5, 7의 히알루론산 생성능 및 제조예 2, 4, 6, 8의 히알루론산 생성능을 측정한 그래프.

이하, 도면을 참조한 본 발명의 설명은 특정한 실시 형태에 대해 한정되지 않으며, 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있다. 또한, 이하에서 설명하는 내용은 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

이하의 설명에서 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용되는 용어로서, 그 자체에 의미가 한정되지 아니하며, 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

본 발명에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 또한, 이하에서 기재되는 "포함하다", "구비하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것으로 해석되어야 하며, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 실시예에 따른 페놀성화합물을 유효성분으로 하는 혼합 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물(이하 '화장료 조성물'이라 함)은 레몬그라스 추출물 및 자소엽 추출물을 포함하는 혼합 추출물을 포함하는데, 히알루론산 생성능을 가지며 서로 다른 페놀성화합물을 유효성분으로 가지는 레몬그라스 추출물 및 자소엽 추출물을 함께 사용함으로써, 피부 보습 및 피부 장벽 개선 효과가 보다 효과적인 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 혼합 추출물에 히알루론산 생성능을 가지는 곤달비 추출물 및 산구절초 추출물을 더 포함시켜 보습 효과가 더 향상될 수 있다.

먼저, 혼합 추출물에 포함되는 레몬그라스 추출물은 히알루론산 생성능을 가지며, 클로로겐산(Cholrogenic acid) 및 p-쿠마르산(p-Coumaric acid)을 함유하고 있어, 피부 보습에 관련된 HAS1, HAS2, HAS3 및 AQP3을 발현시킬 수 있고, 피부 장벽에 관련된 filaggrin 및 loricrin을 발현시킬 수 있으며, 피부 보습과 표피분화 조절에 관여하는 PPAR-α의 발현도 증가시킬 수 있다.

또한, 자소엽 추출물은 히알루론산 생성능을 가지며, 로즈마린산(Rosmarinic acid) 및 커피산(Caffeic acid)을 함유하고 있어, 피부보습에 관련된 HAS2 및 HAS3을 발현시킬 수 있고, 피부 장벽에 관련된 filaggrin을 발현시킬 수 있으며, 피부 보습과 표피분화 조절에 관여하는 PPAR-α의 발현도 증가시킬 수 있다.

이와 같이 레몬그라스 추출물 및 자소엽 추출물은 동일하게 피부 보습 및 피부 장벽 개선 효과를 가지나, 서로 다른 페놀성화합물을 포함하고 있어 발현시키는 인자 종류와 발현 정도에 차이가 있다. 이에 본 발명에서는 상기와 같은 두 추출물을 함께 혼합 추출물로 사용하여 피부 보습 및 피부 장벽 개선 효과가 보다 우수하게 나타나도록 한다.

이러한 레몬그라스 추출물 및 자소엽 추출물은 레몬그라스 및 자소엽을 각각 물 또는 유기용매 중 하나를 용매로 하여 추출하는 것으로 제조할 수 있다.

여기서 사용되는 레몬그라스 및 자소엽은 전라북도 남원시에서 채취한 것으로, 35 내지 45℃에서 60시간 내지 84시간 건조한 것을 사용할 수 있고, 40℃에서 72시간 건조시킨 것을 사용하는 것이 바람직하다.

이때, 건조 온도가 35℃ 미만일 경우 건조시간이 너무 오래걸리거나 수분 증발이 잘 이루어지지 않아 추출 효율이 저하될 수 있으며, 45℃를 초과할 경우 타거나 유효성분에 파괴, 변형 등이 일어날 수 있다.

또한, 건조 시간이 60시간 미만일 경우 건조가 잘 이루어지지 않고, 84시간을 초과할 경우 이미 건조가 충분히 이루어져 있기 때문에 비효율적이며 오히려 추출 효율이 저하될 수 있다.

유기용매는 에탄올 또는 1,3-부틸렌글리콜(1,3-butylene glycol)이 바람직하나, 메탄올, 이소프로탄올, 부탄올 등도 사용할 수 있다. 또한, 에탄올을 사용할 경우 50% 에탄올을 사용하는 것이 바람직하나, 이는 본 발명의 실시예에 불과하므로 한정되지는 않는다.

더욱 구체적으로, 레몬그라스 추출물 또는 자소엽 추출물은 원료(레몬그라스 또는 자소엽)에 원료 중량의 18 내지 23배에 해당하는 용매를 첨가하고 가열한 후 여과하여 농축시키고 동결건조하여 제조될 수 있고, 원료 중량에 대하여 20배에 해당하는 용매를 사용하는 것이 바람직하다.

이때, 용매가 원료에 대해 18배 미만일 경우 유효성분이 완전히 침출되지 않고 약간만 증발해도 추출액이 농축되고, 추출액의 유효성분이 과다한 열에 의해 국소적으로 파괴될 수 있으며, 23배를 초과할 경우 유효성분의 용출량은 증가할 수 있으나 동결건조 시 비효율적이다.

한편, 용매로 물을 사용할 경우 추출 시 95 내지 105℃에서 230 내지 250분 동안 가열할 수 있고, 유기용매를 사용할 경우 추출 시 75 내지 85℃에서 230 내지 250분 동안 가열할 수 있으며, 바람직하게는 물을 사용할 경우 100℃에서 240분, 유기용매를 사용할 경우 80℃에서 240분 동안 가열할 수 있다.

이때, 물을 사용할 때 온도가 95℃, 시간이 230분, 유기용매를 사용할 때 75℃, 230분 미만이면 유효성분이 완전하게 추출되지 못할 수 있고, 물을 사용할 때 온도가 105℃, 시간이 250분, 유기용매를 사용할 때 85℃, 250분을 초과하면 유효성분이 파괴될 수 있으며, 더 이상 추출되는 유효성분 수율이 더 증가하지 않으므로 더 이상의 추출은 의미가 없다.

레몬그라스 추출물 및 자소엽 추출물은 상기에서 설명한 바와 같이 물 또는 유기용매 중 하나를 용매로 하여 추출될 수 있으나, 히알루론산 생성능, 피부 보습 및 피부 장벽에 관련된 인자 발현 정도를 고려하면 유기용매를 용매로 사용하여 추출되는 것이 보다 바람직하다.

이와 같이 추출된 레몬그라스 추출물 및 자소엽 추출물을 배합하여 혼합 추출물이 제조될 수 있는데, 각 추출물의 바람직한 배합비로 혼합함으로써 상호 및 보완작용으로 각 추출물을 단독으로 사용하는 것 보다 화장료 조성물의 피부 보습 및 피부 장벽 개선 효과가 우수할 수 있다.

즉, 레몬그라스 추출물 및 자소엽 추출물이 혼합되어 이루어진 혼합 추출물은 레몬그라스 추출물 및 자소엽 추출물을 1 내지 2 : 1 내지 2의 중량비로 포함할 수 있고, 2 : 1의 중량비로 포함하는 것이 보다 바람직하다.

이러한 중량비로 포함될 경우에 가장 바람직한 피부 보습 및 피부 장벽 개선 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 혼합 추출물은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여, 2 내지 5중량%가 포함될 수 있고, 5중량%가 가장 바람직하다.

이때, 화장료 조성물 전체 중량에 대하여, 혼합 추출물이 2 중량% 미만일 경우 피부 보습 및 피부 장벽 개선 효과가 미미하고, 5중량%를 초과할 경우 피부 안전성에 문제가 발생할 수 있으며 관능적인 특성에 영향을 줄 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 화장료 조성물의 혼합 추출물은 피부 보습 효과를 더 향상시키기 위해 곤달비 추출물 및 산구절초 추출물을 더 포함할 수 있다.

곤달비 추출물 및 산구절초 추출물은 히알루론산 생성능을 가지고 있어, 피부 수분 유지에 도움을 줄 수 있으며, 피부 보습 및 노화 방지에 효과적이다.

이와 같은 곤달비 추출물 및 산구절초 추출물도 상기에서 설명한 추출물과 동일한 방법으로, 곤달비 및 산구절초를 각각 물 또는 유기용매 중 하나를 용매로 하여 추출하는 것으로 제조할 수 있다. 각 조건은 상기에서 설명한 바와 동일하므로 자세한 설명은 생략하도록 한다.

이때 사용되는 곤달비는 전라북도 남원에서 자란 것으로, 깊은 산의 습지에서 자라고 풀 전체에 털이 없고 뿌리줄기가 굵으며, 뿌리에 달린 잎은 꽃이 필 때까지 남아 있는데 길이 24cm, 나비 20cm 정도이다. 잎 뒷면 맥을 따라 털이 나며 가장자리에 뾰족한 톱니가 있다. 잎자루는 길이 40cm 정도로 날개가 없고 밑쪽이 넓다. 줄기에 달린 잎은 3개로 아래쪽 것은 뿌리에 달린 잎과 거의 같으나, 위쪽으로 갈수록 잎자루가 짧아져서 잎집이 되고 잎도 작아진다.

산구절초는 전라북도 남원에서 자란 것으로, 산기슭 풀밭에서 자라는데 높이 50cm 정도로 땅속줄기가 옆으로 길게 벋으면서 번식한다. 뿌리에 달린 잎과 밑부분의 잎은 1회깃꼴로 갈라진다. 생약 산구절초는 줄기와 잎을 말린 것이며, 한방과 민간에서는 꽃이 달린 풀 전체를 치풍·부인병·위장병에 처방되고 있다.

여기서 히알루론산 생성능을 고려하면 곤달비 추출물은 물을 용매로 사용하여 추출되는 것이 보다 바람직하고, 산구절초 추출물은 유기용매를 용매로 사용하여 추출되는 것이 보다 바람직하다.

이러한 곤달비 추출물 및 산구절초 추출물은 혼합 추출물에 각각 0.5 내지 1 중량부로 더 포함될 수 있다.

이때, 곤달비 추출물 및 산구절초 추출물이 각각 상기 범위 미만일 경우 곤달비 추출물 및 산구절초 추출물의 함유에 따른 보습 기능 상승 효과가 미미하고, 초과할 경우 중량 대비 상승 효과가 낮고, 피부 안전성에 문제가 발생할 수 있다.

즉, 혼합 추출물은 레몬그라스 추출물, 자소엽 추출물, 곤달비 추출물 및 산구절초 추출물을 1 내지 2 : 1 내지 2 : 0.5 내지 1 : 0.5 내지 1의 중량비로 포함할 수 있고, 2 : 1: 1 : 1의 중량비로 포함하는 것이 바람직하다.

이와 같이 제조된 화장료 조성물은 유액, 크림, 화장수, 에센스, 팩, 현탁액, 페이스트, 젤, 파우더, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 로션, 연고, 겔, 패취, 미용액, 클렌징 폼, 클렌징 크림, 클렌징 워터, 비누, 샴푸, 린스, 분무제의 제형과 같이 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 페놀성화합물을 유효성분으로 하는 혼합 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물은 페놀성화합물을 유효성분으로 하고 히알루론산 생성능을 가지는 추출물을 포함하는 혼합 추출물을 함유함으로써, 추출물간의 보완 작용으로 피부 보습 및 피부 장벽 개선 효과가 보다 효과적일 수 있다.

이하, 실시되는 실험 예들은 이해를 돕기 위하여 제시되는 것으로서, 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 하기 실험 예들에 한정되는 것은 아니다.

또한, 하기에서 화장료 조성물의 효과를 알아보기 위해 용매로 물 및 에탄올을 사용하여 제조예, 실시예 및 실험예를 설명하였으나, 실질적으로 화장료 조성물을 제조 시엔 1,3-부틸렌글리콜(1,3-butylene glycol)가 주로 사용될 수 있다.

[제조예 1] 레몬그라스 추출물 제조 1

건조시킨 레몬그라스 100g에 물 2L를 첨가하고 100℃로 4시간 동안 가열하고 여과한 후 농축시키고 동결건조하여 제조하였다.

[제조예 2] 레몬그라스 추출물 제조 2

건조시킨 레몬그라스 100g에 50%에탄올 2L를 첨가하고 80℃로 4시간 동안 가열하고 여과한 후 농축시키고 동결건조하여 제조하였다.

[제조예 3] 자소엽 추출물 제조 1

건조시킨 자소엽 100g에 물 2L를 첨가하고 100℃로 4시간 동안 가열하고 여과한 후 농축시키고 동결건조하여 제조하였다.

[제조예 4] 자소엽 추출물 제조 2

건조시킨 자소엽 100g에 50%에탄올 2L를 첨가하고 80℃로 4시간 동안 가열하고 여과한 후 농축시키고 동결건조하여 제조하였다.

[제조예 5] 곤달비 추출물 제조 1

건조시킨 곤달비 100g에 물 2L를 첨가하고 100℃로 4시간 동안 가열하고 여과한 후 농축시키고 동결건조하여 제조하였다.

[제조예 6] 레몬그라스 추출물 제조 2

건조시킨 곤달비 100g에 50%에탄올 2L를 첨가하고 80℃로 4시간 동안 가열하고 여과한 후 농축시키고 동결건조하여 제조하였다.

[제조예 7] 산구절초 추출물 제조 1

건조시킨 산구절초 100g에 물 2L를 첨가하고 100℃로 4시간 동안 가열하고 여과한 후 농축시키고 동결건조하여 제조하였다.

[제조예 8] 산구절초 추출물 제조 2

건조시킨 산구절초 100g에 50%에탄올 2L를 첨가하고 80℃로 4시간 동안 가열하고 여과한 후 농축시키고 동결건조하여 제조하였다.

[ 실험예 1] 레몬그라스 및 자소엽 추출물의 세포독성 검사

제조예 1 내지 4의 세포독성을 검사하기 위해 하기와 같이 실험하여 세포 생존율을 측정하였다.

6 well plate에 HaCaT 세포를 5×103 cells로 분주한 후 24시간 동안 5% CO₂, 37℃ 조건에서 부착 및 안정화를 시킨 후, 레몬그라스와 자소엽 추출물인 제조예 1 내지 4를 각각 농도별(6.25∼200㎍/ml)로 처리하여 48시간 동안 배양하였다.

WST-1 assay는 cell viability assay kit(EZ-Cytox, Dogen, Seoul, Korea)를 이용하였고, 모든 well에 EZ-Cytox 용액 10㎕를 가해주고 다시 37℃, 5% CO₂에서 2시간 배양한 뒤 흡광도 측정을 위해 1분 정도 부드럽게 shaking을 한 뒤 microplate reader(Tecan, Seestrasse, M

nnedorf, Switzerland)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과는 도 1과 같다.

도 1의 (a) 및 (b)는 레몬그라스 추출물을 제조한 제조예 1 및 2와 자소엽 추출물을 제조한 제조예 3 및 4의 세포 생존율을 측정한 그래프이다.

도 1의 (a)를 보면 알 수 있듯이, 레몬그라스 물 추출물인 제조예 1과 레몬그라스 에탄올 추출물인 제조예 2 모두 75㎍/ml의 농도까지는 세포독성을 보이지 않았으나, 100㎍/ml, 200㎍/ml의 농도에서는 약간의 세포독성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 1의 (b)를 보면 알 수 있듯이, 자소엽 물 추출물인 제조예 3과 자소엽 에탄올 추출물인 제조예 4 모두 75㎍/ml의 농도까지는 세포독성을 보이지 않았으나, 100㎍/ml, 200㎍/ml의 농도에서는 약간의 세포독성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실험예 2] 레몬그라스 및 자소엽 추출물의 용매에 따른 히알루론산 생성능 평가

레몬그라스 추출물 및 자소엽 추출물의 용매에 따른 히알루론산 생성능을 평가하기 위하여, 제조예 1 내지 4의 히알루론산 생성능을 하기와 같이 측정하였다.

6 well plate에 HaCaT 세포를 6×10⁵ cells로 분주한 후 24시간 동안 배양하고, FBS free 배지로 2번 세척한 후 FBS free 배지로 교체하고 제조예 1 내지 4를 각각 48시간동안 처리하였다. 48시간 후에 350㎕의 media를 걷어 내었고 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액을 걷어내어 HA sandwich ELISA kit(echelon, Salt Lake City, UT, USA)를 이용하였으며 제조사에서 제공한 방법에 의해 진행하였다.

양성대조군은 1μM all-trans retinoic acid(ATRA)를 사용하였다.

그 결과는 도 2와 같다.

도 2는 제조예 1 내지 4의 히알루론산 생성능을 측정한 그래프이다.

도 2를 보면 알 수 있듯이, 제조예 1 내지 4 모두 히알루론산 생성능이 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 양성대조군 ATRA에 비해 레몬그라스 에탄올 추출물인 제조예 2에서 히알루론산 생성능이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 자소엽 에탄올 추출물인 제조예 4는 양성대조군 ATRA에 비해 다소 히알루론산 생성능이 낮았으나 유사하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 레몬그라스 추출물 및 자소엽 추출물은 물 또는 유기용매로 추출될 수 있으나, 유기용매로 추출되는 것이 바람직할 것으로 판단된다. 이에 하기 실험에서는 유기용매로 추출된 제조예 2 및 4만 이용하여 실험을 진행하였다.

[ 실험예 3] 레몬그라스 및 자소엽 추출물의 페놀성화합물 분석

레몬그라스 추출물 및 자소엽 추출물의 페놀성화합물을 검출하기 위하여, 제조예 2 및 4를 HPLC를 이용하여 동시 다분석을 실시하였다.

제조예 2 및 4 10㎎ 또는 표준품 1㎎을 취하여 50% 에탄올 1 ㎖에 용해하였고, 제조예 2 및 4 10㎕를 HPLC에 주입하고 0.8㎖/min 속도로 분석하였다.

이동상으로는 water(0.1% formic acid)와 acetonitrile(0.1% formic acid)를 사용하였고, column은 Shim-pack VP-ODS(4.6 ㎜ x 250 ㎜, 5 ㎛)(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 흡광도 280 ㎚에서 분석하였다.

19종 표준품은 gallic acid, 갈산(gallic acid), 클로로겐산(chlorogenic acid), 메틸 갈레이트(methyl gallate), 커피산(caffeic acid), 에피갈로카테인 갈레이트(EGCG), 시링산(syringic acid), p-쿠마르산(p-coumaric acid), 루틴(rutin), 엘라그산(ellagic acid), 페룰산(ferulic acid), 아스트라갈린(astragalin), 퀘르시트린(quercitrin), 로즈마린산(rosmarinic acid), 미리세틴(myricetin), 루테올린(luteolin), 퀘르세틴(quercetin), 아피제닌(apigenin), 캠퍼롤(kaempferol) 및 헤스페레틴(hesperetin)(Sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA)을 이용하였다. 19종 페놀성 화합물의 retention time과 최대흡수파장은 표 1과 같다.

페놀성화합물 분석 결과는 도 3과 같다.

도 3의 (a) 내지 (c)는 액체크로마토그래피로 분선한 혼합표준품의 크로마토그램(표준데이터), 제조예 2의 크로마토그램 및 제조예 4의 크로마토그램이다.

도 3을 보면 알 수 있듯이, 제조예 2(레몬그라스 에탄올 추출물)는 클로로겐산(Cholrogenic acid) 및 p-쿠마르산(p-Coumaric acid)을 함유하고 있으며, 제조예 4(자소엽 에탄올 추출물)는 로즈마린산(Rosmarinic acid) 및 커피산(Caffeic acid)을 함유하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실험예 4] 레몬그라스 및 자소엽 추출물의 피부 보습 및 피부 장벽 개선 효능1

피부 보습 및 피부 장벽 개선 효능을 확인하기 위해서 제조예 2 및 4의 유전자 발현 정도를 하기와 같은 방법으로 측정하였다.

6 well plate에 HaCaT 세포를 6Х10⁵cells로 분주한 후 24시간 동안 배양하고, FBS free 배지로 2번 세척한 후 FBS free 배지로 교체하고 제조예 2 및 4를 각각 농도별(50, 100, 200㎍/ml)로 처리하여 48시간동안 배양하였다. 48시간 후에 세포에서 RNA를 추출하기 위해 total RNA extraction reagent인 tri reagent(RNAiso PLUS, Takara, Otsu, Japan)를 이용하였다. Tri reagent 1mL을 세포에 넣은 후 15초 동안 vortex하였다. 이어 15,000rpm에서 15분 동안 원심분리한 후 chloroform 200㎕를 넣고 20초간 vortex한 후 원심 분리한 다음 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다. 차가운 isopropanol 동량을 넣고 상온에서 10분 동안 방치하였다. 이를 다시 15,000rpm에서 20분간 원심 분리하여 RNA 침전물을 얻었다. RNA 침전물을 75% ethanol로 씻은 후, 침전물을 실온에서 건조시켜 0.1% diethyl pyrocarbonate(DEPC) water에 녹였다. RNA 농도(1 OD=40㎍/mL)는 Evloution 260 Bio UV-Vis spectrophotometer(Thermo Scientific, CA, USA)를 이용하여 260nm에서 측정한 후, reverse transcription kit(RNA to cDNA EcoDry Premix (Oligo dT), Clontech, USA)를 이용하여 1㎍ RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 멸균된 3차증류수로 5배 희석한 후 실시간 PCR은 Fast Start DNA MasterPLUS SYBR Green I kit (Roche, Mannheim, Germany)을 이용하여 Light Cycler 2.0 (Roche)에서 증폭하였다.

사용한 primer와 PCR 조건은 하기 표 2 및 3과 같으며 유전자의 정량분석은 Light Cycler Software 4.0 (Roche)을 이용하였다.

피부보습과 피부장벽에 대한 양성대조군은 각각 1μM ATRA과 2mM의 calcium chloride(CaCl₂)를 사용하였다.

그 결과는 도 4 및 5와 같다.

도 4의 (a) 내지 (d)는 HaCaT 세포에서 제조예 2 및 4의 농도에 따른 HAS1, HAS2, HAS3 및 AQP3의 발현 정도를 측정한 그래프이며, 도 5의 (a) 및 (b)는 HaCaT 세포에서 제조예 2 및 4의 농도에 따른 Fillagrin 및 Loricrin의 발현 정도를 측정한 그래프이다.

도 4를 보면 알 수 있듯이, 제조예 2(레몬그라스 에탄올 추출물)는 피부 보습과 관련된 유전자인 HAS1, HAS2, HAS3 및 AQP3의 발현이 모두 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 제조예 4(자소엽 에탄올 추출물)는 HAS2와 HAS3의 발현이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

도 5를 보면 알 수 있듯이, 제조예 2(레몬그라스 에탄올 추출물)는 피부 장벽과 관련된 유전자인 Fillagrin 및 Loricrin의 발현이 모두 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 제조예 4(자소엽 에탄올 추출물)는 Fillagrin의 발현이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실험예 6] 레몬그라스 및 자소엽 추출물의 피부 보습 및 피부 장벽 개선 효능2

60mm dish에 HaCaT 세포를 1Х10⁶ cells로 분주한 후 24시간 동안 배양하고, FBS free 배지로 2번 세척한 후 FBS free 배지로 교체하고 제조예 2 및 4를 각각 농도별(50, 100, 200㎍/ml)로 처리하여 48시간동안 배양하였다. 48시간 후에 lysis buffer로 단백질을 추출하고 Bradford 방법을 이용하여 단백질을 정량하였다. 이후 SDS-PAGE gel에 20㎍을 loading한 후 PVDF membrane에 transfer한 후 blocking, 1차 항체(PPAR-α 1:1000,

-actin 1:2500), 2차 항체(anti-rabbit 1:5000) 및 ECL Western Blotting Substrate(Promega Corp., Madison, WI, USA)로 PPAR-α 단백질의 발현 정도를 확인하였다.

양성대조군은 1μM ATRA과 2 mM의 CaCl₂를 사용하였고, 페놀성 단일 화합물의 농도는 20μM을 사용하였다.

그 결과는 도 6과 같다.

도 6의 (a) 및 (b)는 HaCaT 세포에서 제조예 2 및 4의 농도에 따른 PPAR-α의 발현 정도를 실험한 결과 사진 및 페놀성화합물에 따른 PPAR-α의 발현 정도를 실험한 결과 사진이다.

도 6의 (a)를 보면 알 수 있듯이, 제조예 2 및 4 모두 피부 보습과 표피분화 조절에 관여하는 PPAR-α의 발현이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

도 6의 (b)를 참고하면, 클로로겐산(Cholrogenic acid) 및 p-쿠마르산(p-Coumaric acid)에서 PPAR-α의 발현이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있어, 제조예 2는 클로로겐산(Cholrogenic acid) 및 p-쿠마르산(p-Coumaric acid)를 함유하고 있기 때문에 높은 PPAR-α의 발현이 나타나는 것으로 판단할 수 있다.

[ 실험예 7] 추가 추출물의 히알루론산 생성능 평가

피부 보습 효과를 보다 더 높이기 위해 혼합 추출물에 추가하는 곤달비 및 산구절초 추출물의 적합성을 판단하기 위해, 제조예 1 내지 8의 히알루론산 생성능을 하기와 같은 방법으로 측정하였다.

6 well plate에 HaCaT 세포를 6×10⁵ cells로 분주한 후 24시간 동안 배양하고, FBS free 배지로 2번 세척한 후 FBS free 배지로 교체하고 제조예 1 내지 8을 각각 48시간동안 처리하였다. 48시간 후에 350㎕의 media를 걷어 내었고 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액을 걷어내어 HA sandwich ELISA kit(echelon, Salt Lake City, UT, USA)를 이용하였으며 제조사에서 제공한 방법에 의해 진행하였다.

양성대조군은 1μM all-trans retinoic acid(ATRA)를 사용하였다.

그 결과는 도 7과 같다.

도 7의 (a) 및 (b)는 제조예 1, 3, 5, 7의 히알루론산 생성능 및 제조예 2, 4, 6, 8의 히알루론산 생성능을 측정한 그래프이다.

도 7를 보면 알 수 있듯이, 제조예 1 내지 8 모두 히알루론산 생성능을 가지는 것을 확인할 수 있어, 곤달비 추출물 및 산구절초 추출물을 혼합 추출물에 포함시키기에 적합하다고 판단된다.

한편, 제조예 5(곤달비 물 추출물)이 제조예 6(곤달비 에탄올 추출물) 보다 히알루론산 생성능이 높게 나타났으므로, 곤달비 추출물은 물 또는 유기용매로 추출될 수 있으나, 물로 추출되는 것이 바람직할 것으로 판단된다.

또한, 제조예 7(산구절초 물 추출물)보다 제조예 8(산구절초 에탄올 추출물)의 히알루론산 생성능이 높게 나타났으므로, 산구절초 추출물은 물 또는 유기용매로 추출될 수 있으나, 유기용매로 추출되는 것이 바람직할 것으로 판단된다.

[ 실시예 ] 혼합 추출물 제조

제조예 2, 4, 5 및 8에서 제조된 추출물을 표 4의 중량 비율과 같이 혼합하여 실시예 1 및 2의 혼합 추출물을 제조하였다.

	실시예 1	실시예 2
레몬그라스 추출물(제조예 2)	2	2
자소엽 추출물(제조예 4)	1	1
곤달비 추출물(제조예 5)	-	1
산구절초 추출물(제조예 8)	-	1

[ 제형예 1 내지 4] 로션 제조

제조예 2, 4, 실시예 1 및 2의 추출물을 각각 이용하여 화장료 조성물인 제형예 1 내지 4를 제조하였고 하기 표 5에 나타내었다.

INCI명	함량(%)
water	67.98
Glycerin	3.00
Butylene Glycol	2.00
Cetearyl Olivate, Sorbitan Olivate	1.00
Betaine	0.10
Disodium EDTA	0.02
Xanthan Gum	5.00
Carbomer	5.00
Cetearyl Alcohol	1.00
Glyceryl Stearate, PEG-100 Stearate	0.70
Polysorbate 20	0.20
Caprylic/Capric Triglyceride	5.00
Cyclopentasiloxane, Cyclohexasiloxane	3.00
Triethanolamine	1.00
추출물	5.00
	100

[ 실험예 8] 피부 보습 효능 확인

제조예 2, 4, 실시예 1 및 2를 이용하여 화장료 조성물을 제조한 제형예 1 내지 4의 피부 보습 효능을 확인하기 위하여 건강한 30세에서 50세의 여성 90명을 대상으로 시험하였다.

피부 보습 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 제형예 1 내지 4를 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 2주간 도포하였다.

실험이 시작되기 전, 측정하고자 하는 2부위를 정하고 피부의 수분량을 각각 3회에 걸쳐 측정한 후 2주간 도포(2회/일) 한 후, 피부 수분함량 측정 장치를 이용하여 각질층 바로 아래의 표피층의 수분을 측정하였다. 상기 측정결과는 표 6과 같다.

	초기 평균	2주 후 평균	수분 증가량(%)
제형예 1	36	47	31
제형예 2	35	45	28
제형예 3	37	51	42
제형예 4	39	55	45

상기 표 6을 보면 알 수 있듯이, 제형예 1 및 2가 피부 보습 효능을 나타내고 있는 것을 확인할 수 있으나, 제형예 3 및 4에서 보다 높은 피부 보습 효능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.즉, 레몬그라스 추출물, 자소엽 추출물을 단독으로 사용하는 것 보다 혼합하여 사용할 경우 피부 보습 효과가 좀더 높은 것으로 판단된다.

또한, 레몬그라스 추출물, 자소엽 추출물, 곤달비 추출물 및 산구절초 추출물을 혼합하여 사용하는 경우에도 피부 보습 효과가 우수한 것으로 판단된다.

[ 실험예 9] 피부 장벽 개선 확인

제조예 2, 4, 실시예 1 및 2를 이용하여 화장료 조성물을 제조한 제형예 1 내지 4의 피부 장벽 개선 효능을 확인하기 위하여 건강한 피부를 가진 30세에서 40세(평균 36세)의 피험자 3명을 대상으로 하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

피험자들을 선정하여 피부 장벽을 테이프 스트리핑(Tape stripping) 방법을 이용하여 인위적으로 손상시킨 후, 1주간 1일 2회 전박의 지정된 부위에 제형예 1 내지 4를 각각 도포하도록 하였다. 측정시점으로는 테이프 스트리핑 직후, 도포 후 7일 각 시점에서 추출된 피부 각질 세포의 변화를 평가하였다. 각 시점에서 획득된 각질세포는 전처리 과정을 거쳐 공초점 현미경 측정을 통해 중성지질의 형태학적 분포 및 각질분화 단백질의 발현양상을 형광학적 이미지로 측정하였다.

측정된 이미지는 Image analyzer pro를 이용하여 Fluorescence intensity(형광 강도)를 정량적으로 분석하고 그 결과를 아래 표 7에 나타내었다.

(참고, Nile red는 세포 내 중성지질을 선택적으로 염색해주며, 일반적으로 각질세포가 성숙할수록 다각형의 선명한 모양을 수반한 강한 형광강도를 갖는다.)

	테이프 스트리핑 직후	7일
제형예 1	10.13	18.69
제형예 2	10.22	16.37
제형예 3	10.01	21.00
제형예 4	9.85	21.98

상기 표 7을 보면 알 수 있듯이, 제형예 1 내지 4 모두 테이프 스트리핑 직후 보다 형광강도가 높아진 것을 확인할 수 있었으나, 제형예 1 및 2보다 제형예 3 및 4가 7일 후 더 높은 형광 강도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.이에 따라, 제형예 1 및 2보다 제형예 3 및 4가 우수한 피부 장벽 개선 효능을 가지는 것으로 판단할 수 있다.

즉, 레몬그라스 추출물, 자소엽 추출물을 단독으로 사용하는 것 보다 혼합하여 사용할 경우 피부 장벽 개선 효과가 좀더 높은 것으로 판단된다.

또한, 레몬그라스 추출물, 자소엽 추출물, 곤달비 추출물 및 산구절초 추출물을 혼합하여 사용하는 경우에도 피부 장벽 개선 효과가 우수한 것으로 판단된다.

이상으로 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고 다른 구체적인 형태로 실시할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것이다.

Claims

페놀성화합물을 유효성분으로 하는 혼합 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물에 있어서,
상기 혼합 추출물은,
레몬그라스 추출물 및 자소엽 추출물을 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 레몬그라스 추출물은,
클로로겐산(Cholrogenic acid) 및 p-쿠마르산(p-Coumaric acid)을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 자소엽 추출물은,
로즈마린산(Rosmarinic acid) 및 커피산(Caffeic acid)을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 레몬그라스 및 자소엽 추출물은,
레몬그라스 및 자소엽을 각각 물 또는 유기용매 중 하나를 용매로 하여 추출한 것을 특징으로 하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 혼합 추출물은,
레몬그라스 추출물 및 자소엽 추출물을 1 내지 2 : 1 내지 2의 중량비로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 혼합 추출물은,
곤달비 추출물 및 산구절초 추출물을 더 포함하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
유액, 크림, 화장수, 에센스, 팩, 현탁액, 페이스트, 젤, 파우더, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 로션, 연고, 겔, 패취, 미용액, 클렌징 폼, 클렌징 크림, 클렌징 워터, 비누, 샴푸, 린스, 분무제의 제형인 것을 특징으로 하는 피부 보습 및 피부 장벽 개선 화장료 조성물.