KR101981692B1

KR101981692B1 - 희렴 추출물을 포함하는 피부진정, 피부보습 또는 피부염증 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101981692B1
Application number: KR1020170092898A
Authority: KR
Inventors: 이성진; 김수환; 우희문; 남한나
Original assignee: 주식회사 차메디텍
Priority date: 2017-07-21
Filing date: 2017-07-21
Publication date: 2019-05-23
Also published as: KR20190010299A

Abstract

본 발명은 피부진정, 피부보습 또는 피부염증 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 희렴 추출물 및 희렴 추출물로부터 단리된 카우란 골격을 갖는 디테르펜 화합물을 유효성분으로 포함함으로써 피부진정, 피부보습 또는 피부염증 개선 효능이 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

희렴 추출물을 포함하는 피부진정, 피부보습 또는 피부염증 개선용 화장료 조성물 {Cosmetic composition for comprising Siegesbeckia pubescens}

본 발명은 피부진정, 피부보습 또는 피부염증 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연물인 희렴의 추출물로부터 단리된 디테르펜 (diterpene) 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부진정, 피부보습 또는 피부염증 개선을 위한 화장료 조성물에 관한 것이다.

외부 환경을 접할 때 피부는 물리적, 화학적 자극 및 병원균으로부터 신체를 보호하는 매우 중요한 역할을 수행한다. 피부 단면은 표피, 진피, 피하조직의 3개의 층으로 나누어지는데, 그 중에서도 표피의 각질층은 약 10~20%의 수분을 함유하고 인체의 최외각에 존재하여 체내로부터의 수분 증발을 억제하는 한편 외부로부터의 물질 과잉 침투를 차단한다. 그러나 환경 변화, 생활습관, 사회 환경으로부터의 각종 스트레스와 공해물질로 인한 환경오염, 화장 습관에 따른 잦은 세안 및 노화에 따른 자연적인 피부 퇴화 등의 원인으로 피부가 건조해지고 표면이 거칠게 되며 피부가 윤기를 잃어 칙칙하게 보이는 등의 현상이 발생하게 되면서 피부건강에 관한 문제는 그 중요성이 점점 더 커지고 있다.

피부 스트레스로부터 피부 건강을 유지하는 방법으로, 피부 수분의 건조 방지 및 각질층에서의 수분 보유능 향상을 위한 보습용 소재 개발에 많은 공을 들여 왔다. 건조 피부가 형성되면 피부 표면의 방어 기능 (barrier function)이 소실되고 외부로부터의 자극물이나 알러젠의 피부 침입이 용이할 뿐만 아니라, 이러한 침입물에 대하여 피부가 거부 반응을 일으키기 때문이다.

피부의 거부반응은 표층 성분의 대다수를 구성하는 케라티노사이트 (keratinocyte)라는 각화 세포가 소수의 랑게르한스 (Langerhans), 멜라노사이트 (melanocyte) 등의 세포를 활성화시킴으로써, 이들 세포가 생산 및 방출하는 사이토카인 (cytokine)에 의한 염증 현상으로 나타난다. 상기 사이토카인은 염증 세포를 불러모으는 작용을 하고, 특히 피부의 구성 세포를 자극시켜 피부 상층을 중심으로 한 염증 반응을 일으키고 습진 반응을 형성하는데, 이를 비알러지성 피부병이라고 한다.

따라서, 피부진정 및 피부보습 효과가 강력한 물질은 항염효과까지 확장될 수 있는 잠재적 가능성이 있고, 반대로 항염효과가 있는 물질이 피부진정 및 피부보습에도 효과가 있을 것으로 예측할 수 있으나 실질적으로 이와 같은 천연소재를 찾는 것은 매우 어려운 과정을 거쳐야 하는 문제가 있어 왔다.

한편, 본 발명자들은 국화과 (Compositae) 식물인 털 진득찰 또는 진득찰의 전초인 "희렴"으로부터 다양한 디테르펜 유도체를 분리한 바 있다 (조예경, 성상현, 희렴의 화학 성분 (Chemical Constituents of Sigesbeckia pubescens Herb), 석사학위논문, 서울대학교 대학원 약학과, Feb. 2009). 희렴은 40-100 ㎝ 높이로 자라는 한해살이 풀로 야산이나 들에서 흔히 볼 수 있으며, 전체에 짧은 털이 빽빽하게 나며, 끝이 뾰족하고 가장자리에 톱니가 있는 잎이 줄기에 마주 난다. 8-9월에 가지나 줄기 끝에 노란 꽃이 산방 꽃차례로 달리며, 열매를 둘러싸는 5개의 주걱 모양의 총포조각의 겉에 나있는 털에는 끈적거리는 액체가 묻어 있어서 다른 물체에 잘 달라붙는다. 예로부터 한방에서 풍습 (風濕)을 제거 (除去)하고, 근육과 뼈를 튼튼히 하며, 혈압을 낮추는 효능이 있어 사지마비 (四肢麻痺), 고혈압 (高血壓), 류마티스 등의 치료에 사용되고 있다.

그러나 희렴 추출물이 피부손상 개선이나, 주름촉진, 발모촉진용 등의 효과가 있다고만 알려져 있고, 피부진정, 피부보습 또는 피부염증 개선에 효과가 있음이 연구된 바가 없다.

본 발명자들은 천연물 유래의 다양한 화합물들을 대상으로 피부진정, 피부보습 또는 피부염증 효과를 지닌 물질을 검색하였다. 그 결과, 희렴의 추출물에 다양한 디테르펜 유도체 중 카우란 (kauran) 골격을 갖는 특정 디테르펜 유도체가 포함되어 있고, 이 물질들이 피부진정, 피부보습 또는 피부염증 개선 효과를 지니고 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 디테르펜 유도체를 유효성분으로 하는 희렴 추출물을 포함하는 피부진정, 피부보습 또는 피부염증 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 희렴 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부진정, 피부보습 또는 피부염증 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 희렴 추출물이 하기 화학식 1 내지 7로 표시되는 디테르펜 화합물 중 하나 이상을 포함하는 피부진정, 피부보습 또는 피부염증 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

<화학식 1> <화학식 2>

<화학식 3> <화학식 4>

<화학식 5> <화학식 6> <화학식 7>

또한 본 발명에서 상기 희렴 추출물은 희렴을 물, C₁-C₆ 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것이 바람직하고, 상기 디테르펜 화합물은 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 내지 20 중량%로 포함되는 것이 바람직하다.

상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 마스크팩, 마스크시트, 각질제거제, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도 등의 제형으로 제조될 수 있으며, 비타민 C, 레티노산, TGF (transforming growth factor), 동물 태반 유래의 단백질, 베툴린산 및 클로렐라 추출물 등 피부주름 개선 성분을 추가로 포함하여 화장품에 적용할 수 있다.

또 다른 일 실시예로, 본 발명은 상기 추출물 및/또는 디테르펜 화합물을 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부진정, 피부보습 또는 피부염증 개선용 화장료 조성물 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의해, 희렴 추출물 및 상기 추출물로부터 단리된 카우란 (kauran) 골격을 갖는 특정 디테르펜 유도체 즉, 화학식 1 내지 7로 표시되는 화합물이 화장료 조성물로 사용되어 피부진정, 피부보습 또는 피부염증을 개선하는 효과가 있다.

도 1은 희렴 추출물의 농도 대비 시간에 따른 수분 함유량을 나타낸다.
도 2는 희렴 추출물의 농도별 인간 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 생성량을 나타낸다.
도 3은 희렴 추출물의 농도별 멜라닌 억제 효능을 나타낸다.
도 4는 희렴 추출물의 농도에 따른 항알러지 활성을 나타낸다.
도 5는 희렴 추출물의 농도에 따른 세포독성을 나타낸다.

이하, 본 발명의 바람직한 구현 예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명자에 의해 희렴 추출물 및 상기 추출물로부터 단리된 카우란 계열의 디테르펜 화합물, 즉 화학식 1 내지 7의 화합물이 피부진정, 피부보습 또는 피부염증 개선 효능이 있다는 것이 밝혀졌다.

<화학식 1> <화학식 2>

<화학식 3> <화학식 4>

<화학식 5> <화학식 6> <화학식 7>

상기 희렴 추출물은 희렴을 물, C₁-C₆ 알코올, 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 물과 메탄올의 혼합용매로 추출하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 물과 메탄올의 혼합용매로는 예를 들어, 70 내지 90 부피%, 바람직하게는 약 80 부피%의 메탄올을 사용할 수 있다. 상기 추출방법은 통상의 방법으로 수행할 수 있으며, 예를 들어 실온에서 2 내지 5시간 동안 교반하면서 추출하거나, 2 내지 5시간 동안 고주파 추출기를 사용하여 추출할 수도 있다. 필요에 따라 상기 추출은 가온(예를 들어, 약 40℃ 내지 60℃)하면서 추출할 수 있으며, 상기 추출은 단 회 혹은 복수 회(예를 들어, 약 3회) 수행할 수도 있다. 얻어진 추출물은 통상의 건조방법, 예를 들어 감압건조, 열풍건조 등에 따라 건조될 수 있다.

상기 화학식 1 내지 7의 화합물은 공지의 물질로서, 희렴으로부터 공지의 방법에 따라 분리할 수 있다. 즉, 본 발명자들이 보고한 방법 (조예경, 성상현, 희렴의 성분 연구 (Chemical Constituents of Sigesbeckia pubescens Herb), 석사학위논문, 서울대학교 대학원 약학과, Feb. 2009) 또는 Jiang X, Yunbao M and Yunlong X (1992) Diterpenoids from Siegesbeckia pubescens. Phytochemistry 3 917-921, 또는 등록공개공보 제10-1026070호 등에 개시된 방법에 따라 화학식 1 내지 7의 화합물을 얻을 수 있다.

상기 디테르펜 화합물은 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 내지 20 중량%로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 화장료 조성물 형태로 제제화될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 상기 희렴 추출물 또는 상기 화학식 1 내지 7의 화합물을 포함하는 희렴 추출물을 유효성분으로 포함하며, 그 형태는 제한되지 않는다. 즉, 본 발명의 화장료 조성물의 형태는 크림, 팩, 로션, 에센스, 화장수, 파운데이션 및 메이크업베이스 등의 통상의 화장료 조성물 형태일 수 있으며, 상기 화장료 조성물은 화장료 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 함께 통상의 방법에 따라 제제화될 수 있다. 예를 들어, 통상의 방법에 따라 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 마스크팩, 마스크시트, 각질제거제, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도 등의 제형으로 제제화될 수 있다.

단위 화장료 조성물 중에 함유되는 상기 희렴 추출물 또는 상기 화학식 1 내지 7의 화합물을 포함하는 희렴 추출물의 함량은 추출물/화합물의 형태 등에 따라 상이할 수 있으며, 예를 들어 단위 화장료당 100 nM 내지 1 mM, 바람직하게는 1 내지 1000 μM의 범위일 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 200 μM의 범위일 수 있다.

또한, 비타민 C, 레티노산, TGF (transforming growth factor), 동물 태반 유래의 단백질, 베툴린산 및 클로렐라 추출물 등 피부주름 개선 성분을 추가로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 희렴 추출물 제조

건조된 희렴 5 ㎏을 70% 메탄올 (물:에탄올=30:70, v/v) 10 ℓ에 가한 후 실온에서 3시간 동안 고주파 추출기로 추출하였다. 추출액을 여과하여 여액을 얻은 후 나머지 잔류물에 다시 70% 에탄올을 가하여 상기와 동일한 방법으로 2회 반복하여 추출하였다. 여액을 모두 합하여 40℃에서 감압건조하여 희렴 추출물 433 g을 얻었다.

< 실시예 2> 피부보습 효능 평가

(1) 피부 전기용량 측정

본 발명에 따른 희렴 추출물의 피부보습 효과를 평가하기 위해 각질층의 전기용량 (capacitance)을 측정하여 각질층의 피부 수분량을 측정하였다. 건강한 피실험자를 선발하여 희렴 추출물을 첨가하지 않은 대조군과 희렴 추출물 2%, 3% 및 4% (v/v)를 첨가한 실험군을 전박에 도포한 후 4시간, 6시간이 지난 시점에 시간에 따른 피부의 전기용량을 moisture checker MY-808S (Scalar, Tokyo)를 이용하여 측정하였으며, 그 결과값을 수분 함유량 (%)으로 표시하였다.

하기 도 1 및 하기 표 1에 도시된 바와 같이, 희렴 추출물 3%를 첨가한 실험군의 4시간 및 6시간 후 수분 함유량은 각각 20% 및 18%로, 다른 실험군 및 대조군에 비해 대략 12% 정도 높은 우수한 보습효과를 나타내는 것을 확인하였다.

	4시간 후	6시간 후
Control	17	17
희렴 추출물 2%	16	15
희렴 추출물 3%	20	18
희렴 추출물 4%	17	16

(2) 수분측정기를 이용한 보습력 측정

본 발명에 따른 희렴 추출물의 보습효과를 평가하기 위하여 수분측정기 (Corneometer CM825, Courage +Khazaka, Germany)를 사용하여 보습력을 측정하였으며, 비교군으로 하수오 추출물, 대추 추출물, 황촉구 추출물을 사용하고 대조군으로 3차 증류수를 사용하였다. 20대 여성 10명을 대상으로 하여 각각의 시료당 상박부 2×2 ㎝², 8구획으로 나누어 구분하고, 물로 여러 차례 세정한 후 자극 없이 수분을 제거하였다. 15분 경과 후, 시료를 각각 2구획에 대하여 10 ㎕씩 고르게 도포하였으며, 2시간 경과 후 수분측정기를 이용하여 하나의 구획당 측정을 5회 실시하였다. 실험은 실내온도 21±2℃, 상대습도 50±5%의 항온상습실에서 실시하였다. 측정값은 5회 측정하여 얻어진 값의 평균값을 사용하였으며, 대상자 5명의 평균값을 하기 표 2에 나타내었다. 보습력과 보습력 증가율 계산식은 하기와 같다.

보습력 (corneometer value) = S - ΔS

(S: 시료 도포 전 corneometer value, ΔS: 시료 도포 2시간 경과 후 corneometer value)

보습력 증가율 (%) = 실험군 보습력 - 대조군 보습력

실험 결과, 본 발명에 따른 희렴 추출물의 보습력이 42%로 가장 높았으며, 40%의 보습력 증가율을 보여 우수한 보습효과를 지님을 확인하였다.

	보습력 (%)	증가율 (%)
하수오 추출물	32.4	8
대추 추출물	35.3	18
황촉구 추출물	33.4	12
희렴 추출물	42	40
대조군 (증류수)	29.8	-

< 실시예 3> 콜라겐 생성 실험

인간 피부 섬유아세포 (human dermal fibroblasts, neonatal; HDFn)를 48 well plate에 5×10⁴ cells/well의 농도로 배양 배지에 0.3 ㎖를 접종한 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 24시간 경과 후 희렴 추출물을 농도별 (10, 50, 100 ㎍/㎖)로 포함한 새로운 배지에 24시간 동안 배양한 후 배양액을 모아 Takara 사의 enzymes-linked immunoassay kit를 이용하여 콜라겐 전구체의 C-말단의 양을 측정하였다. 콜라겐 용액 640 ㎍/㎖를 이용하여 콜라겐 농도 0 ㎍/㎖-640 ㎍/㎖ 사이의 standard curve를 얻어 배지에 있는 콜라겐의 양을 계산하였으며, 그 결과를 하기 도 2 및 표 3에 나타내었다.

실험 결과, 희렴 추출물 100 ㎍/㎖의 농도에서 콜라겐 생성을 23% 증가시키는 효능을 나타내어 본 발명에 따른 희렴 추출물이 주름개선 효과가 뛰어남을 확인하였다.

	control	10 ㎍/㎖	50 ㎍/㎖	100 ㎍/㎖
C-말단 peptide (PIP, % of control)	100	103	114	123
Viability (% of control)	99	99	99	99

또한, 추가로 희렴으로부터 추출된 카우란 계열의 디테르펜 화합물에 대한 주름개선 효능을 평가하기 위해, 상기 희렴 추출물과 동일한 방법으로 콜라겐 생성 실험을 실시하였다. 이때 디테르펜 화합물 (상기 화학식 1 내지 7)의 농도는 100 ppm으로 하였으며, 실험 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 그 결과, 디테르펜 화합물은 콜라겐 생성을 대략 39% 정도 증가시키는 효능을 나타내어 본 발명에 따른 디테르펜 화합물이 주름개선 효과가 뛰어남을 확인하였다.

	control	화학식 1	화학식 2	화학식 3	화학식 4	화학식 5	화학식 6	화학식 7
C-말단 peptide (PIP, % of control)	100	143	138	140	142	135	137	141
Viability (% of control)	99	99	99	99	99	99	99	99

< 실시예 4> 미백 효능 평가

B16-F1 murine melanoma 세포를 10 중량% FBS (fetal bovine serum)가 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 이용하여 6 well plate에 1×10⁵ cells/well의 농도로 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 세포가 well 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 희렴 추출물을 농도별 (10, 50, 100 ㎍/㎖)로 배지에 희석하여 교체한 후 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양 후 배지를 제거한 후 배지가 제거된 세포를 PBS (phosphate buffered saline)로 세척하고 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포는 hematocytometer를 이용하여 세포 수를 측정한 후 5,000-10,000 rpm으로 10분간 원심분리하고 상등액을 제거하여 pellet을 얻었다. 상기 세포 pellet을 60℃ 드라이 오븐에서 건조한 후 10 중량% DMSO가 함유된 1 M 수산화나트륨액 100 ㎕ 또는 cell lysis buffer를 넣어 60℃ 항온조에서 세포 내 멜라닌을 얻었다. 상기 멜라닌 용해액을 마이크로플레이트 측정기로 405 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포 일정 수당 멜라닌의 양 또는 일정 단백질당 멜라닌의 양을 구하였으며, 그 결과를 하기 도 3 및 표 5에 나타내었다.

실험 결과, 희렴 추출물의 농도가 높을수록 멜라닌 생성이 감소하였으며, 하기 도 3에 도시된 바와 같이, 희렴 추출물의 농도가 100 ㎍/㎖일 때 멜라닌 형성이 20% 저해되어 본 발명에 따른 희렴 추출물은 미백효과가 뛰어남을 확인하였다.

	control	10 ㎍/㎖	50 ㎍/㎖	100 ㎍/㎖
Intra-Melanin (% of control)	100	99	90	80
Viability (% of control)	100	101	102	100

또한, 추가로 희렴으로부터 추출된 카우란 계열의 디테르펜 화합물에 대한 미백 효능 평가를 상기 희렴 추출물과 동일한 방법으로 실시하였다. 이때 디테르펜 화합물 (상기 화학식 1 내지 7)의 농도는 100 ppm으로 하였으며, 실험 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 그 결과, 디테르펜 화합물에서 멜라닌 형성이 대략 28% 정도 저해되어 본 발명에 따른 디테르펜 화합물의 미백 효능이 뛰어남을 확인하였다.

	control	화학식 1	화학식 2	화학식 3	화학식 4	화학식 5	화학식 6	화학식 7
Intra-Melanin (% of control)	100	73	71	74	72	71	71	72
Viability (% of control)	100	100	100	101	100	102	100	101

< 실시예 5> 항알러지 효능 평가

RBL-2H3 cell을 10 중량% FBS를 함유한 DMEM에 현탁시킨 후 24 well plate에 2×10⁵ cells/well의 농도로 접종하였다. 각 well당 mouse monoclonal IgE 100 ㎍/㎖로 감작시킨 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 동안 배양하였다. 세포를 well당 tyrode's buffer 500 ㎕로 세척하고 희렴 추출물을 농도별 (10, 50, 100 ㎍/㎖)로 처리하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 15분간 배양한 후 1시간 동안 DNP-BSA 100 ㎍/㎖로 처리하였다. 상층액에 1 mM p-nitrophenyl-N-acetyl-의 substrate를 50 ㎕ 처리한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 1시간 동안 배양하고 ELISA reader를 사용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과, 하기 도 4 및 표 7에 도시된 바와 같이, 희렴 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 본 발명에 따른 희렴 추출물을 100 ㎍/㎖ 처리한 군에서 21%의 항알러지 생성 억제 효과가 나타났다.

	control	10 ㎍/㎖	50 ㎍/㎖	100 ㎍/㎖
β-hexosaminidase release (% of control)	100	99	90	80

< 실시예 6> 항염증 세포독성 검정

항염증 세포독성 검정을 위해 인간피부세포인 human dermal fibroblast (HDF)를 대상으로 MTT 분석법을 수행하였으며, 570 ㎚~690 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 먼저, 섬유아세포를 96 well plate의 각 well에 1×10⁴ cells/well의 농도로 접종하고, DMEM 배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어, 희렴 추출물의 농도를 0.5%, 1%, 2%, 4%로 하여 혈청이 2.5% 함유되어 있는 DMEM 배지로 교체한 실험군과 혈청이 없는 DMEM 배지로 교체한 대조군을 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 세포의 생존율 비교를 위해 MTT solution (3 ㎎/㎖)을 첨가하여 흡광도를 측정하였으며, 세포독성은 하기 식을 통해 계산하였다.

세포독성 (%) = (희렴 추출물 처리시 흡광도/대조군 흡광도)×100 (%)

하기 도 5 및 하기 표 8에 나타낸 바와 같이, 희렴 추출물의 농도 (0.5%, 1%, 2%, 4%)에 따른 인간피부세포에 대한 세포독성 검정 결과, 희렴 추출물 2%까지 세포독성이 전혀 없는 것을 확인하였다.

	추출물 농도
	세포	0.5% E	1.0% E	2% E	4% E
세포독성 (%)	0	-70	-48	89	68

< 실시예 7> 피부진정 효능 평가

희렴으로부터 추출된 카우란 계열의 디테르펜 화합물에 대한 피부진정 효능을 평가하기 위해 인체 피부각질 형성세포인 HaCaT cell (human keratinocyte cell)에서 염증성 사이토카인 (IL-1α) 발현억제 효과를 분석하였다.

HaCaT cell을 24 well plate에 2×10⁵ cells/well의 농도로 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지로 접종하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 plate에서 배지를 제거한 후 PBS (phosphate buffered saline)로 1회 세척하고, FBS가 첨가되지 않은 무혈청 (Serum-free) DMEM 배지로 교환한 후, 상기 화학식 1 내지 7의 디테르펜 화합물을 각각 100 ppm으로 처리하여 24시간 동안 배양하고, SDS (sodium dodecyl sulfate)를 처리하여 4시간 더 배양하였다. 4시간 후 배양액 일부를 취해서 IL-1α 정량과 단백질 정량에 사용하였다. IL-1α 정량은 엔도젠 사의 human IL-1α kit를 사용하여 kit의 IL-1α 정량법에 따라 수행하였으며, 단백질 정량은 시그마 사의 BCA 방법으로 수행하여 정량한 IL-1α를 단백질 양으로 보정하여 단위 단백질당 IL-1α 분비량을 측정하였다. 양성 대조군으로는 피부자극완화 물질로 기존에 사용되고 있던 케토프로펜 (Ketoprofen)을 사용하였으며, 최종적인 IL-1α 생성률 (%)은 하기의 식으로 산출하였다. 이는 피부 세포에 SDS만을 처리했을 때의 IL-1α 양을 100으로 하였을 때 각 시료들의 IL-1α 생성량을 구해 이를 백분율화 한 것이며, 하기 표 9에 결과를 나타내었다.

IL-1α 생성률 (%) = (시료의 IL-1α 생성량/SDS만 처리한 시료의 IL-1α 생성량)×100 (%)

본 시험은 SDS 처리를 통하여 피부에 홍반을 일으킬 수 있는 IL-1α의 생합성을 분석한 것으로서, 상기 화학식 1 내지 7에 해당하는 디테르펜 화합물에서 IL-1α 생성량이 양성 대조군인 케토프로펜의 IL-1α 생성량과 유사함을 확인할 수 있었다. 이를 통해 피부에 발생하는 홍반 등의 트러블을 완화시켜 주는 효과가 큼을 알 수 있으며, 이는 즉, 피부진정 효과가 우수함을 의미한다.

	IL-1α 생성률 (%)
대조군	34.42±1.78
SDS만 처리한 시료	100.00
화학식 1	68.11±3.63
화학식 2	67.05±4.80
화학식 3	68.83±3.65
화학식 4	70.01±4.92
화학식 5	69.21±5.03
화학식 6	67.17±3.05
화학식 7	69.64±2.89
케토프로펜	64.12±4.66

< 실시예 8> 화장품 제조

(1) 스킨로션 제조

희렴 추출물 0.1 중량%, 베타-1,3-글루칸 1.0 중량%, 부틸렌글리콜 2.0 중량%, 프로필렌글리콜 2.0 중량%, 카르복시비닐폴리머 0.1 중량%, 피이지-12 노닐페닐에테르 0.2 중량%, 폴리솔베이트80 0.4 중량%, 에탄올 10.0 중량%, 트리에탄올아민 0.1 중량%, 방부제 0.05 중량%, 향료 0.1 중량%, 정제수 잔량을 혼합하여 통상의 방법에 따라 스킨로션을 제조하였다.

(2) 영양크림 제조

희렴 추출물 0.2 중량%, 베타-1,3-글루칸 5.0 중량%, 부틸렌글리콜 3.0 중량%, 프로필렌글리콜 3.0 중량%, 트리에탄올아민 0.2 중량%, 밀납 10.0 중량%, 폴리솔베이트60 1.5 중량%, 피이지 60 경화피마자유 2.0 중량%, 솔비탄세스퀴올레이트 0.5 중량%, 유동파라핀 10.0 중량%, 스쿠알란 5.0 중량%, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 5.0 중량%, 글리세린 5.0 중량%, 방부제 0.05 중량%, 향료 0.1 중량%, 정제수 잔량을 혼합하여 통상의 방법에 따라 영양크림을 제조하였다.

이상의 설명은 본 발명을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로, 본 발명에 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 사상과 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 기술은 본 발명의 권리범위에 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

하기 화학식 1 내지 7로 표시되는 디테르펜 화합물 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하고,
상기 화합물은 희렴을 물, C₁-C₆ 알코올, 또는 이들의 혼합용매로 추출한 희렴 추출물에서 분리한 것을 특징으로 하는 피부진정 및 피부보습용 화장료 조성물
<화학식 1> <화학식 2>

<화학식 3> <화학식 4>

<화학식 5> <화학식 6> <화학식 7>
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 디테르펜 화합물은 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 내지 20 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 마스크팩, 마스크시트, 각질제거제, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형으로 제조된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 비타민 C, 레티노산, TGF (transforming growth factor), 동물 태반 유래의 단백질, 베툴린산 및 클로렐라 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 피부주름 개선 성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물
희렴추출물로 부터 하기 화학식 1 내지 7로 표시되는 디테르펜 화합물을 분리하는 단계;
하기 화학식 1 내지 7로 표시되는 디테르펜 화합물 중 하나 이상을 유효성분으로 첨가하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부진정 및 피부보습용 화장료 조성물의 제조방법
<화학식 1> <화학식 2>

<화학식 3> <화학식 4>

<화학식 5> <화학식 6> <화학식 7>
제7항에 있어서,
상기 디테르펜 화합물은 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 내지 20 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법
제7항에 있어서, 상기 첨가하는 단계 이후에 비타민 C, 레티노산, TGF (transforming growth factor), 동물 태반 유래의 단백질, 베툴린산 및 클로렐라 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 피부주름 개선 성분을 추가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법